專利名稱：抗結核桿菌的兒茶提取物組合物、其制備方法及含有它們的藥物制劑和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及天然藥物技術領域，尤其涉及一種抗結核桿菌的兒茶提取物組合物、 其制備方法及含有它們的藥物制劑和應用。
背景技術：
兒茶(catechu)為豆科金合歡屬植物兒茶樹[Acacia catechu(L. )Wilid.]的干枝加水煎汁濃縮而成的干浸膏。在《飲膳正要》、《本草綱目》、《本草求真》、《本草正義》等古籍以及歷版《中國藥典》中均有記載，具有清上隔熱，化痰生津，涂金瘡一切諸瘡，生肌定痛， 止血收濕等功效。用于潰瘍不斂，濕疹，口瘡，跌撲傷痛，外傷出血等疾病的治療。兒茶的現代研究表明其中的主要含有兒茶鞣酸、兒茶素、表兒茶素、赭樸鞣質、非瑟素、槲皮素、槲皮萬壽菊素、原兒茶鞣質和焦性沒食子酚鞣質、兒茶鞣質、兒茶熒光素、沒食子酸、鞣花酸、兒茶酚、兒茶紅等，還得到兒茶鉤藤堿A E以及鉤藤堿、異鉤藤堿、圓葉帽木堿、二氫柯楠因堿等化學成分。實驗研究表明與許多中藥相似，兒茶的藥理活性多種多樣，主要有抗菌、抗病毒、調血脂、降血糖、抗癌、抗血小板等藥理作用；同時，對心血管和腎臟也有一定影響。有關兒茶化學成及其藥理方面的研究可參見井玥，趙余慶，倪春雷，兒茶的化學、藥理與臨床研究，中草藥，2005，36 (5)，790-792 ；尹志萍張古英王建軍，兒茶及兒茶素的研究進展，河北醫(yī)藥，2008，30 (3)，360-361 ；李杏翠，王洪慶，劉超，陳若蕓，兒茶化學成分研究，中國中藥雜志，2010，35 (11)，1425-1427。以上文獻引入作為參考。盡管文獻報道了通過正相和反相硅膠進行反復多次色譜分離，從包括兒茶的多種植物中得到兒茶素和表兒茶素等單體化合物的方法，但是由于兒茶中化學成分復雜，而兒茶素和表兒茶素等黃烷類化合物結構中存在多個酚羥基，利用適合工業(yè)化生產的單次色譜分離技術富集高含量，總含量大于50 %，兒茶素和表兒茶素有較大難度，到目前止從未發(fā)現兒茶素和表兒茶素的兒茶植物提取物或者兒茶素和表兒茶素單體化合物或混合物具有抗結核桿菌，特別是抗臨床耐藥結核桿菌的文獻報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的問題是提供抗結核桿菌的兒茶提取物組合物、其制備方法及含有它們的藥物組合物，獲得了有效部位含量為50%以上的提取物，并將其應用于治療和輔助治療結核病，尤其肺結核病和愛滋病并發(fā)結核病等疾病的藥物中的用途，特別是在治療臨床耐藥結核病中。本發(fā)明所要解決的問題是通過以下技術方案來實現的—種抗結核桿菌的兒茶提取物，該提取物是從中藥兒茶膏或其基源植物兒茶中提取含量50%以上的有效部位，有效部位是以兒茶素和/或表兒茶素為主要成分的黃烷類化合物，所述黃烷類化合物的結構式為(I)和(II)
其中，R1, R2, R3, R4, &各自獨立地選自氫、C1-C6烷基、β _D_吡喃葡萄糖基、SO3 或 P03。所述的C1-C6烷基為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基或異丁基。所述_； L茶素和/或表_； L茶素的含量為60 % -99. 5 %。優(yōu)選所述」L茶素和/或表_； L茶素的含量為95 % -99. 5 %。所述的兒茶提取物的制備方法，包括以下步驟(1)將中藥兒茶即兒茶膏或其基源植物或同屬其他植物粉碎，然后用水或 50-95%的C1-C6烷醇的水溶液作為溶劑，在0°C至溶劑回流的溫度下提取，得到提取液，提取液經常壓或減壓濃縮得浸膏，或經冷凍干燥得到粉末；(2)將上述提取得到的浸膏或粉末用色譜方法精制，先用洗脫溶劑洗脫，收集富含有效成分的流份，濃縮、過濾、干燥、檢測并收集有效成分為含量50%以上的提取物；其中所述的色譜方法為大孔吸附樹脂柱色譜、正相硅膠、反相硅膠色譜或者其組
I=I O所述步驟O)中提取物用凝膠色譜進一步純化，得到有效成分為大于70%的兒茶提取物。所述洗脫溶劑為水，C1-C6烷基醇、鹵代烴、醚類溶劑、酮類溶劑、酯類溶劑或上述溶劑組成的混合溶劑。所述洗脫溶劑為水，C1-C6烷基醇，如甲醇、乙醇、異丙醇或正丁醇等，鹵代烴，如二氯甲烷、三氯甲烷等，醚類溶劑，如石油醚、乙醚、甲基叔丁醚等，酮類溶齊U，如丙酮、2-丁酮等，酯類溶劑，如乙酸乙酯、甲酸乙酯等，以及由上述溶劑組成的混合溶劑，其中優(yōu)選的洗脫溶劑為氯仿、乙酸乙酯、乙醇、甲醇和水中的一種或數種混合溶劑。當用苯乙烯型大孔吸附樹脂精制時，洗脫溶劑為水或10-75%的乙醇或甲醇水溶液；當用反相硅膠色譜精制時，洗脫溶劑為水或10-50%的乙醇或甲醇水溶液；當用正相硅膠精制時，洗脫溶劑為石油醚或乙酸乙酯和90-100%乙醇水溶液或甲醇組成的混合溶劑， 所述的乙酸乙酯和90-100%乙醇水溶液或甲醇比例為5 1-2 1。其中所述制備方法中，富含兒茶素和表兒茶素衍生物的流份是通過薄層色譜 (TLC)和高壓液相色譜(HPLC)等方法檢測的，其中優(yōu)選HPLC檢測方法。用以上提取和精制方法制備的兒茶提取物，其中有效成分-兒茶素和表兒茶素衍生物在提取物中的含量可達50%以上。其中大孔吸附樹脂法精制更適合于工業(yè)化生產。藥物組合物，其中含有上述的兒茶提取物組合物作為有效成分，并含有常規(guī)藥用載體的載體。利用本發(fā)明方法得到的兒茶提取物可以與藥物上可接受的載體一起制成藥物制齊U，例如片劑、膠囊、口服液、滴丸或注射劑等。利用本發(fā)明方法得到的兒茶提取物制備所需藥物的各種劑型時，可以按照藥學領域的常規(guī)生產方法制備。優(yōu)選本發(fā)明的這類藥物制劑可以被口服、腸胃外給藥。優(yōu)選制劑是口服或靜脈內給藥的。本發(fā)明藥物組合物可以按任意口服可接受的劑型口服給藥，包括但不限于膠囊齊U、片劑、水性混懸劑或溶液劑。在口用片劑的情況下，常用的載體包括乳糖和玉米淀粉。通常還加入潤滑劑，例如硬脂酸鎂。就按膠囊劑型口服給藥而言，有用的稀釋劑包括乳糖和干燥的玉米淀粉。當口用需要水性混懸劑時，活性成分是與乳化和懸浮劑聯用的。如果需要的話，還可以加入某些甜味劑、矯味劑或著色劑。本發(fā)明藥物組合物的無菌可注射形式可以是水性或油性混懸劑。這些混懸劑可以按照本領域已知的技術、利用適合的分散或潤濕劑和懸浮劑加以配制。無菌的可注射制劑還可以是在無毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液劑或混懸劑，例如在 1,3- 丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的載體和溶劑有水、林格氏溶液和等滲的氯化鈉溶液。另外，無菌的不揮發(fā)油也經常被用作溶劑或懸浮介質。為此，可以采用任何溫和的不揮發(fā)油，包括合成的單-或二-甘油酯。脂肪酸、例如油酸及其甘油酯衍生物可用于制備注射劑，它們是天然的藥學上可接受的油，例如橄欖油或蓖麻油，尤其是它們的聚氧乙基化形式。這些油溶液劑或混懸劑還可以含有長鏈醇稀釋劑或分散劑，例如羧甲基纖維素或相似的分散劑，它們普遍用于配制藥學上可接受的劑型，包括乳劑和混懸劑。出于制劑的目的， 還可以使用其他常用的表面活性劑，例如吐溫類、司盤類，和其他乳化劑或生物利用度增強齊U，它們普遍用在藥學上可接受的固體、液體或其他劑型的制造中。所述的兒茶提取物和藥物組合物在制備改善或治療各種結核病的藥物中的應用。所述的兒茶提取物藥物組合物在制備改善或治療肺結核病、治療潰瘍性骨結核、 愛滋病并發(fā)結核病中的應用以及治療臨床耐藥結核病中的應用；還可以外用治療肛門肛瘺。如果必要的話，一旦患者的條件有所改善，可以給以本發(fā)明化合物、組合物或組合的維持劑量。隨后，可以根據癥狀減少給藥的劑量或頻率或者劑量與頻率至已改善的條件得以保留的水平，當癥狀已經減輕至所需水平，應當停止治療。不過，一旦疾病癥狀有任何復發(fā)，患者可能需要在長期基礎上接受間歇性治療。本發(fā)明的藥物制劑中還可以包含其他用于治療結核病的活性劑或與其他治療結核病的藥物一起或順序給藥。本發(fā)明的兒茶提取物組合物采用色譜方法精制和純化有效含量高，可以達到 99.5%，該兒茶提取物組合物和其藥物組合物在制備改善或治療肺結核病、治療潰瘍性骨結核、愛滋病并發(fā)結核以及治療耐藥結核病，尤其對耐藥結核病和愛滋病并發(fā)結核有極好的治療效果，兒茶素和/或表兒茶素的含量越高療效越好，尤其含量在95%以上時，治療效果明顯提高。
具體實施例方式實施例1 1.提取中藥兒茶20g，粉碎后加入50%乙醇浸泡提取3次，每次M小時。合并提取液，回收乙醇并濃縮至稠浸膏，加入蒸餾水加熱溶解，過濾得澄清濾液。2.精制上述濾液通過經處理的HPD-100型大孔吸附樹脂，用水和lO^JO1^、 30%、40%、50%、75%的乙醇梯度洗脫，HPLC檢測，收集富含兒茶素和表兒茶素衍生物的流份，合并，減壓濃縮，冷凍干燥即得提取物9. 9g。按照《中華人民共和國藥典》標準方法，經過高效液相外標法測定，其中主要有效成分包括兒茶素和表兒茶素的總含量為53. 2%。兒茶素和表兒茶素用HPLC方法與化學對照品對照進行鑒定，具體情況見實施例12，下同。實施例2 1.提取中藥兒茶20g，粉碎后加入50%乙醇，50°C溫浸泡提取3次，每次6小時。 合并提取液，回收乙醇并濃縮至稠浸膏，加入蒸餾水加熱溶解，過濾得澄清濾液。2.精制上述濾液通過經處理的HP-20型大孔吸附樹脂，用水和10%、20%、30%、 40^^50^^75%的乙醇梯度洗脫，HPLC檢測，收集富含兒茶素和表兒茶素衍生物的流份，合并，減壓濃縮，冷凍干燥即得提取物8. 4g。按照《中華人民共和國藥典》標準方法，經過高效液相外標法測定，其中主要有效成分包括兒茶素和表兒茶素的總含量55. 6%。實施例3 1.提取中藥兒茶20g，粉碎后加入50%乙醇浸泡過夜后，加熱回流提取3次，每次3. 0小時。合并提取液，回收乙醇并濃縮至稠浸膏，加入蒸餾水加熱溶解，過濾得澄清濾液。2.精制上述濾液通過經處理的HP-20型大孔吸附樹脂，用水、10 %、20%、30 %、 40%、50%和75%濃度的甲醇依次梯度洗，HPLC檢測，收集富含兒茶素和表兒茶素衍生物的流份，合并，減壓濃縮，冷凍干燥即得植物提取物9. 2g。按照《中華人民共和國藥典》標準方法，經過高效液相外標法測定，其中主要有效成分包括兒茶素和表兒茶素的總含量 54. 4%。實施例4 1.提取中藥兒茶20g，粉碎后加入75%乙醇浸泡過夜后，加熱回流提取3次，每次3. 0小時。合并提取液，回收乙醇并濃縮至稠浸膏，加入蒸餾水加熱溶解，過濾得澄清濾液。2.精制上述濾液通過經處理的HP-20型大孔吸附樹脂，用水、lO^dO^JO1^、 40%、50%和75%濃度的甲醇依次梯度洗，HPLC檢測，收集富含兒茶素和表兒茶素衍生物的流份，合并，減壓濃縮，冷凍干燥即得植物提取物8. 6g。按照《中華人民共和國藥典》標準方法，經過高效液相外標法測定，其中主要有效成分包括兒茶素和表兒茶素的總含量 57. 1%。實施例5 1.提取中藥兒茶20g，粉碎后加入水浸泡過夜后，加熱回流提取3次，每次2.0小時。合并提取液，濃縮至稠浸膏，加入蒸餾水加熱溶解，過濾得澄清濾液。2.精制上述濾液通過經處理的HP-20型大孔吸附樹脂，用水、10 %、20%、30 %、 40%、50%和75%濃度的甲醇依次梯度洗，HPLC檢測，收集富含兒茶素和表兒茶素衍生物的流份，合并，減壓濃縮，冷凍干燥即得植物提取物10. 3g。按照《中華人民共和國藥典》 標準方法，經過高效液相外標法測定，其中主要有效成分包括兒茶素和表兒茶素的總含量 51. 8%。實施例6 1.提取中藥兒茶20g，粉碎后加入水，加熱至60度提取3次，每次3. O小時。合并提取液，濃縮至稠浸膏，加入蒸餾水加熱溶解，過濾得澄清濾液。2.精制上述濾液通過經處理的HP-20型大孔吸附樹脂，用水、10 %、20%、30 %、40%、50%和75%濃度的甲醇依次梯度洗，HPLC檢測，收集富含兒茶素和表兒茶素衍生物的流份，合并，減壓濃縮，冷凍干燥即得植物提取物9. Sg。按照《中華人民共和國藥典》標準方法，經過高效液相外標法測定，其中主要有效成分包括兒茶素和表兒茶素的總含量 52. 6%。實施例7 1.提取中藥兒茶20g，粉碎后加入水，加熱至80度提取3次，每次3.0小時。合并提取液，濃縮至稠浸膏，加入蒸餾水加熱溶解，過濾得澄清濾液。2.精制上述濾液通過經處理的SP-700型大孔吸附樹脂，用水、10%,20^^30%、 40%、50%和75%濃度的甲醇依次梯度洗，HPLC檢測，收集富含兒茶素和表兒茶素衍生物的流份，合并，減壓濃縮，冷凍干燥即得植物提取物8. 2g。按照《中華人民共和國藥典》標準方法，經過高效液相外標法測定，其中主要有效成分包括兒茶素和表兒茶素的總含量 60. 3%。實施例8:1.提取中藥兒茶20g，粉碎后加入水，加熱至60度提取3次，每次3.0小時。合并提取液，濃縮至稠浸膏，加入蒸餾水加熱溶解，過濾得澄清濾液。2.精制上述濾液通過經處理的SP-700型大孔吸附樹脂，用水、10%,20^^30%、 40%、50%和75%濃度的甲醇依次梯度洗，HPLC檢測，收集富含兒茶素和表兒茶素衍生物的流份，合并，減壓濃縮，冷凍干燥即得植物提取物8. 5g。按照《中華人民共和國藥典》標準方法，經過高效液相外標法測定，其中主要有效成分包括兒茶素和表兒茶素的總含量 57. 9%。實施例9 1.提取兒茶基源植物500g，粉碎后加入水，浸泡過夜后加回流提取3次，每次 3. 0小時。合并提取液，濃縮至稠浸膏，加入蒸餾水加熱溶解，過濾得澄清濾液。2.精制上述濾液通過經處理的SP-20型大孔吸附樹脂，用水、lO^dO^JO1^、 40%、50%和75%濃度的甲醇依次梯度洗，HPLC檢測，收集富含兒茶素和表兒茶素衍生物的流份，合并，減壓濃縮，冷凍干燥即得提取物28. 3g。按照《中華人民共和國藥典》標準方法，經過高效液相外標法測定，其中主要有效成分包括兒茶素和表兒茶素的總含量55. 6%。實施例10 1.提取中藥兒茶基源植物500g，浸泡過夜后加回流提取3次，每次3. O小時。合并提取液，濃縮至稠浸膏，加入蒸餾水加熱溶解，過濾得澄清濾液。2.精制濃縮液通過反相硅膠柱(C-18)，用水和10%甲醇水溶液洗脫后，再用 50%的甲醇水溶液洗脫，HPLC檢測，收集富含兒茶素和表兒茶素衍生物的流份，合并，減壓濃縮，干燥得提取物1.83g。經過高效液相外標法測定，其中主要有效成分包括兒茶素和表兒茶素的總含量96.7%。實施例11 1.提取中藥兒茶20g，浸泡過夜后加回流提取3次，每次3.0小時。合并提取液， 濃縮至稠浸膏，加入蒸餾水加熱溶解，過濾得澄清濾液。2.精制濃縮液通過硅膠柱，用石油醚和乙酸乙酯梯度，HPLC檢測，收集富含兒茶素和表兒茶素衍生物的流份，合并減壓濃縮，干燥得兒茶提取物1. 3g。經過高效液相外標法測定，其中主要有效成分包括兒茶素和表兒茶素的總含量93.7%。實施例12 兒茶提取物中主要成分的分離純化和結構鑒定上述實施例11中得到的兒茶提取物，用20毫升蒸餾水溶解后，注入中壓反相硅膠 (C-18)柱色譜，用H2O-甲醇(1 0-0 1)梯度洗脫，根據薄層色譜檢查，合并組成成分相似的洗脫液。減壓回收溶劑至干燥，得到2個主要分離部位ECEl (0. 48g)、ECE2(0. 24g)。 ECEl和ECE2分別用少量乙酸乙酯加熱溶解，室溫放置36小時，析出結晶，過濾得到，ECEl 和ECE2單體，經HPLC檢測岸歸一化法積分面積計算，含量分別為98. 1 %和97. 4%。并通過與從中國食品藥品檢定研究院購置的化學對照品比較，鑒定ECEl和ECE2分別為兒茶素 (批號:110877-201102)和表兒茶素(批號110878-200102)。具體檢測條件如下色譜柱Grace Previl C18 Q50 X 4. 6mm，5 μ m)，流動相A為水，流動相B為甲醇。 檢測波長^Onm.流速0. anl/min。
權利要求
1.一種抗結核桿菌的兒茶提取物組合物，所述兒茶提取物組合物含有純度50%以上的以兒茶素和/或表兒茶素為主要成分的黃烷類化合物，所述黃烷類化合物的結構式主要為(I)和(II)
2.根據權利要求1所述的抗結核桿菌的兒茶提取物組合物，所述的C1-C6烷基為甲基、 乙基、丙基、異丙基、丁基或異丁基。
3.根據權利要求1所述的抗結核桿菌的兒茶提取物組合物，所述兒茶素和/或表兒茶素的含量為60% -99.5%。
4.根據權利要求1所述的抗結核桿菌的兒茶提取物組合物，所述兒茶素和/或表兒茶素的最優(yōu)選含量為95% -99. 5%。
5.權利要求1-4之一所述的抗結核桿菌的兒茶提取物組合物的制備方法，包括以下步驟(1)將中藥兒茶或其兒茶植物或其同屬植物粉碎，然后用水或50-95%的C1-C6烷醇的水溶液作為溶劑，在0°C至溶劑回流的溫度下提取，得到提取液，提取液經常壓或減壓濃縮得浸膏，或經冷凍干燥得到粉末；(2)將上述提取得到的浸膏或粉末用色譜方法精制，先用洗脫溶劑洗脫，收集富含有效成分的流份，濃縮、過濾、干燥、檢測并收集有效成分為含量50%以上的提取物；其中所述的色譜方法為大孔吸附樹脂柱色譜、正相硅膠、反相硅膠色譜或者其組合。
6.根據權利要求4所述抗結核桿菌的兒茶提取物組合物的制備方法，所述步驟O)中提取物用凝膠色譜進一步純化，得到有效含量70% -99. 5%的兒茶提取物。
7.根據權利要求4所述抗結核桿菌的兒茶提取物組合物的制備方法，所述洗脫溶劑為水，C1-C6烷基醇、鹵代烴、醚類溶劑、酮類溶劑、酯類溶劑或上述溶劑組成的混合溶劑；當用苯乙烯型大孔吸附樹脂精制時，洗脫溶劑為水或10-75%的乙醇或甲醇水溶液； 當用反相硅膠色譜精制時，洗脫溶劑為水或10-50%的乙醇或甲醇水溶液；當用正相硅膠精制時，洗脫溶劑為石油醚或乙酸乙酯和90-100%乙醇水溶液或甲醇組成的混合溶劑，所述的乙酸乙酯和90-100%乙醇水溶液或甲醇比例為5 1-2 1。
8.藥物組合物，其中含有權利要求1-4之一所述的抗結核桿菌的兒茶提取物組合物， 并含有常規(guī)藥用載體；所述劑型為膠囊劑、片劑、注射劑、口服劑、混懸劑或溶液劑。
9.權利要求1-4之一所述的抗結核桿菌的孩兒茶提取物組合物和權利要求8所述的藥物組合物在制備改善或治療各種結核病的藥物中的應用。
10.權利要求9所述的兒茶提取物組合物及其藥物組合物在制備改善或治療肺結核病、潰瘍性骨結核、愛滋病并發(fā)結核病以及耐藥結核病中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗結核桿菌的兒茶提取物組合物、其制備方法及含有它們的藥物制劑和應用，所述兒茶提取物組合物含有純度50％以上的以兒茶素和/或表兒茶素為主要成分的黃烷類化合物，所述黃烷類化合物的結構式主要為(I)和(II)其中，R1，R2，R3，R4，R5各自獨立地選自氫、C1-C6烷基、β-D-吡喃葡萄糖基、SO3或PO3。本發(fā)明的兒茶提取物組合物采用色譜方法精制和純化有效含量高，可以達到99.5％，該兒茶提取物組合物和其藥物組合物在制備改善或治療肺結核病、治療潰瘍性骨結核、愛滋病并發(fā)結核病以及治療耐藥結核病，尤其對耐藥結核病和愛滋病并發(fā)結核病中有極好的治療效果。
文檔編號A61K36/48GK102526170SQ201110456939
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權日2011年12月31日
發(fā)明者許學志 申請人:許學志