專利名稱：避免連續(xù)多次注射鹽酸表阿霉素peg化脂質(zhì)體加速血液清除現(xiàn)象的方法
技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及首次注射空白脂質(zhì)體及鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體對二次注射鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體中鹽酸表阿霉素藥動學(xué)行為的影響，以及連續(xù)多次注射PEG化脂質(zhì)體的加速血液清除(Accelerated Blood Clearance, ABC)現(xiàn)象,并提供減輕或避免ABC現(xiàn)象的鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體的給藥劑量。
背景技術(shù)：
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常規(guī)的普通(經(jīng)典/傳統(tǒng))靜脈給藥系統(tǒng)，如普通脂質(zhì)體，易被單核巨噬細胞系統(tǒng)(MPS)吞噬，靜脈注射后迅速分布至肝、脾等器官，導(dǎo)致脂質(zhì)體血液循環(huán)時間短、靶向性差。為了解決此類問題，研究人員利用聚乙二醇(PEG)類脂質(zhì)衍生物對脂質(zhì)體表面進行修飾，利用PEG兼有親水性、柔順性的特點，延長脂質(zhì)體體內(nèi)循環(huán)時間，減少MPS器官/組織的分布量，增加靶向性，也大大提高了載體及藥物的物理、化學(xué)和生物學(xué)穩(wěn)定性。此項技術(shù)被稱為PEG化，利用該技術(shù)制備的脂質(zhì)體為PEG化脂質(zhì)體，亦稱為空間穩(wěn)定脂質(zhì)體(StericallyStabilized Liposomes)。以PEG化技術(shù)制備的阿霉素脂質(zhì)體,極大地延長了阿霉素在血液中的循環(huán)時間，降低了心臟毒性，并增加其在腫瘤中的分布量，提高抑瘤率。該項研究成果在 Nature 雜志上發(fā)表(Lasic DD.Doxorubicin in sterically stabilized liposomes[J].Nature, 1996，380: 561 - 562)，由此掀起PEG化脂質(zhì)體研究的熱潮，并取得了較好的成果，如PEG化阿霉素脂質(zhì)體(Doxil)獲得FDA批準用于卡波氏肉瘤、卵巢癌等疾病的治療；PEG化順鉬脂質(zhì)體的半衰期由原來普通脂質(zhì)體的20分鐘延長至5天等，目前尚有多種PEG化脂質(zhì)體制劑在臨床試驗中。鑒于PEG化給藥系統(tǒng)具有獨特的長循環(huán)性與靶向性，研究者們嘗試各種方法/手段，在PEG化載體表面上連接配體(如RGD肽、APRPG肽、半乳糖配體、甘露糖配體、葡 萄糖、低密度脂蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、葉酸、血管活性腸收縮肽、細胞膜穿透肽等)和/或抗體，達到主動祀向遞藥目的,在治療、診斷(量子點、納米金、納米鐵、磁流體、同位素、熒光、光化療和放療)、預(yù)防等領(lǐng)域中前景廣闊?；谂R床需要多次給藥的考慮，Dams等(Dams ETM, Laverman P, Oyen WJG,et al.Accelerated blood clearance and altered biodistribution of repeatedinjections of sterically stabilized liposomes [J].J Pharmacol exp Therj 2000，292: 1071 - 1079)以99mTc標記脂質(zhì)體，研究大鼠重復(fù)注射PEG化脂質(zhì)體后的藥動學(xué)參數(shù)和組織分布變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第二次注射的脂質(zhì)體血漿水平表現(xiàn)出極大降低(20分鐘時的濃度約為首次注射的10%)，且肝攝取量從8.1 ±0.8%驟升至46.2 ±9.8%，此即為ABC現(xiàn)象。2005年，Wang等正式提出ABC現(xiàn)象的定義，即“同一大鼠，以一定的時間間隔兩次注射PEG化脂質(zhì)體，二次注射的PEG化脂質(zhì)體被快速清除的現(xiàn)象”(Wang XY, IshidaTj Ichihara Mj et al.1nfluence of the physicochemical properties of liposomeson the accelerated blood clearance phenomenon in rats [J].J Control Release,2005，104: 91 - 102)，此定義僅局限于大鼠。2008年，Ishida等將此定義修正為“當同一動物以一定時間間隔兩次注射PEG化脂質(zhì)體，二次注射的PEG化脂質(zhì)體喪失長循環(huán)特性的現(xiàn)象” (Ishida T, Kashima S，Kiwada H.The contribution of phagocytic activityof liver macrophages to the accelerated blood clearance (ABC) phenomenon ofPEGylated liposomes in rats [J].J Control Release, 2008, 126(2): 162 - 165)。脂質(zhì)體作為藥物載體具有增加藥物穩(wěn)定性、延緩藥物釋放、降低藥物毒性、增強藥物靶向性以及提高藥物療效等優(yōu)勢。近年來，將細胞毒藥物裝載入脂質(zhì)體以增加藥物抗腫瘤效果，降低藥物毒性的相關(guān)研究越來越多。2006年，Ishida等(Ishida T,Atobe K, et al.Accelerated blood clearance of PEGylated liposomes uponrepeated injections: Effect of doxorubicin—encapsulation and high—dose firstinjection [J], J Control Release, 2006, 115: 251 - 258)以 3H 標記的膽固醇十六烷基醚作為二次注射脂質(zhì)體的脂質(zhì)相標記物，研究了首次注射PEG化鹽酸阿霉素脂質(zhì)體對二次注射PEG化空白脂質(zhì)體ABC現(xiàn)象的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當首次注射PEG化鹽酸阿霉素脂質(zhì)體中阿霉素的劑量達到0.16 mg/kg時(相應(yīng)磷脂劑量為I μ mol/kg),即可消除二次注射PEG化空白脂質(zhì)體的ABC現(xiàn)象。目前認為該現(xiàn)象的出現(xiàn)主要是首次注射的鹽酸阿霉素脂質(zhì)體對脾臟邊緣區(qū)B細胞具有一定的殺傷作用，影響了抗PEG的IgM的產(chǎn)生。該實驗僅僅采用放射性標記研究了首次注射鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體對二次注射空白脂質(zhì)體ABC現(xiàn)象的影響，并沒有對重復(fù)注射鹽酸阿霉素脂質(zhì)體的ABC現(xiàn)象進行研究。2001年，Laverman等(Laverman P, Myrra G, et al.Factors Affecting the Accelerated Blood Clearanceof Polyethylene Glycol-Liposomes upon Repeated Injection[J].J Pharmacology andExperimental Therapeutics, 2001, 298(2): 607 - 612)以 111In 標記鹽酸阿霉素脂質(zhì)體偕萊(Caelyx),首次分別給予5 μ mol磷脂/kg的空白脂質(zhì)體和未進行放射性標記的偕萊(相應(yīng)阿霉素的給藥劑量為0.7 mg/kg)，二次給予111In標記的楷萊。結(jié)果發(fā)現(xiàn)重復(fù)注射楷萊并沒有引起ABC現(xiàn)象，值得注意的是該研究中并沒有對二次注射楷萊后鹽酸阿霉素的藥動學(xué)行為進行研究。目前，對于ABC現(xiàn)象的研究主要是通過對載體進行放射性標記，以考察二次或多次注射后載體的藥動學(xué)行為及組織分布的改變。2008年，Cui等(Cui JX，Li CL, etal.Repeated injection of pegylated liposomal antitumour drugs induces thedisappearance of the rapid distribution phase [J].J Pharmacy and Pharmacology,2008, 60: 1651 - 1657)以小鼠為實驗動物對重復(fù)注射鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體和鹽酸米托蒽醌脂質(zhì)體的ABC現(xiàn)象進行了研究。與上述以放射性元素標記載體不同的是該實驗主要對二次注射后鹽酸阿霉素和鹽酸米托蒽醌藥動學(xué)和組織分布的改變進行了研究。實驗過程中鹽阿霉素和鹽酸米托蒽醌的給藥劑量分別為8 mg/kg和4 mg/kg，相應(yīng)的磷脂劑量約為80μ mol磷脂/kg。實驗發(fā)現(xiàn)在此給藥劑量下并未引起二次注射脂質(zhì)體的ABC現(xiàn)象,這一結(jié)果的出現(xiàn)可能有以下兩個原因:首次注射的高劑量藥物抑制了脾臟邊緣區(qū)B細胞的增殖；同時首次注射的高劑量磷脂也會使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生耐受。遺憾的是該實驗并未對首次注射空白以及載藥脂質(zhì)體的劑量(磷脂劑量以及藥物劑量)對二次注射載藥脂質(zhì)體后藥物藥動學(xué)和組織分布的變化進行研究。低劑量連續(xù)給藥具有降低藥物毒性，避免腫瘤細胞產(chǎn)生的多藥耐藥性等優(yōu)勢，近些年來得到了較廣泛的應(yīng)用。值得注意的是，脂質(zhì)體的連續(xù)低劑量注射可能會導(dǎo)致ABC現(xiàn)象的產(chǎn)生。因此，我們在國家自然科學(xué)基金資助下(No 81072602)對首次注射空白脂質(zhì)體的磷脂劑量以及首次注射鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體中鹽酸表阿霉素的劑量對二次注射鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體中鹽酸表阿霉素藥動學(xué)行為的影響，以及連續(xù)多次注射PEG化脂質(zhì)體的加速血液清除現(xiàn)象進行了研究。本發(fā)明還提供了解決連續(xù)多次注射低劑量PEG化脂質(zhì)體時產(chǎn)生ABC現(xiàn)象的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是以鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體為模型，研究首次注射空白脂質(zhì)體及鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體對二次注射鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體中鹽酸表阿霉素藥動學(xué)行為的影響，并對連續(xù)多次注射PEG化脂質(zhì)體的加速血液清除現(xiàn)象進行了考察，在此基礎(chǔ)上提供減輕或避免加速血液清除鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體時可能產(chǎn)生ABC現(xiàn)象的方法。脂質(zhì)體、 納米粒、納米乳等作為一類常用的納米給藥載體，其主要作用是將藥物被動或者主動轉(zhuǎn)運至病變部位，如炎癥部位和腫瘤組織。在藥物傳遞系統(tǒng)中，載體僅僅作為一種運輸工具，藥物作為治療疾病的主體，在這一工具的協(xié)助下而發(fā)生的自身體內(nèi)藥動學(xué)行為的改變應(yīng)該作為我們研究的重點。雖然本發(fā)明僅以鹽酸表阿霉素為藥物，以脂質(zhì)體為載體來研究二次注射后藥物體內(nèi)藥動學(xué)行為的變化，但是該發(fā)明并不僅僅局限于此。本發(fā)明的研究結(jié)果同樣可用于指導(dǎo)脂質(zhì)體以外的其它載體(納米粒、納米乳、碳納米管等)中藥物代謝動力學(xué)的研究。其中上述載體中裝載的藥物包括但不限于下列藥物:
如蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，包括鹽酸表阿霉素、鹽酸表阿霉素和吡柔比星；長春花屬生物堿，包括長春瑞濱、長春新堿、長春花堿和長春地辛；喹諾酮類抗生素，如環(huán)丙沙星、氟哌酸、氧氟沙星、依諾沙星、甲氟沙星、恩諾沙星、洛美沙星、氟羅沙星、加替沙星、司帕沙星、莫西沙星、克林沙星和吉米沙星等。如各種氨基酸、羅丹明B或其類似物、依沙吖啶(利凡諾)或其類似物、吖啶橙(堿性橙14、3，6-雙(二甲基氨基)吖啶氯化鋅鹽酸鹽)或其類似物；5-羥色胺受體拮抗劑，包括昂丹司瓊、托烷司瓊、格拉司瓊、帕洛諾司瓊、雷莫司瓊等。如局部麻醉藥包括鹽酸阿替卡因、普魯卡因、可卡因、利多卡因、麻卡因、卡波卡因、丙胺卡因等；大環(huán)內(nèi)酯類藥物，如阿奇霉素及其鹽。如噻嗎洛爾及其鹽、美托洛爾及其鹽、比索洛爾及其鹽、普萘洛爾及其鹽、索他洛爾及其鹽、伏立康唑及其鹽等。如荷電大分子物質(zhì)，RNA干擾，即核苷酸、DNA脫氧核糖核酸、siRNA、蛋白質(zhì)、酶、荷電多糖、甲殼胺、阿拉伯膠、海藻酸、羧甲基纖維素、琥珀明膠；荷電大分子聚合物，如樹枝狀物質(zhì)中的PAMAM。其它藥物:如曲馬多及其鹽、芬太尼及其鹽、舒芬太尼及其鹽、氨溴索及其鹽、氯諾昔康及其鹽、甲磺酸二氫麥角堿、鹽酸川丁特羅(特羅類)、多巴酚丁胺、鹽酸洛哌丁胺、阿替洛爾酒石酸美托洛爾、氯苯丁胺、麥角胺、PEI (聚乙胺)、表皮生長因子(FGF)、蜂毒肽等。如生物堿，包括植物、海洋生物、微生物、真菌及昆蟲來源。生物堿一般按化合物結(jié)構(gòu)類型或生物合成途徑進行分類。一些常見的生物堿結(jié)構(gòu)類型如下:
1、異喹啉類生物堿
異喹啉類生物堿是生物堿中最大的一類，以異喹啉或四氫異喹啉為母核，根據(jù)連接基團的不同，又可分為九類:(I)單異喹啉類生物堿，如鹿尾草中的降血壓成分鹿尾草堿；
(2)芐基異喹啉類生物堿，異喹啉核的I位接有芐基，如阿片中的解痙成分罌粟堿；(3)雙芐基異喹啉類生物堿，兩個芐基異喹啉在酚羥基位置以醚鍵方式相連，如蓮子芯中的蓮心堿；
(4)阿撲芬類生物堿，芐基異喹啉類生物堿的兩個苯環(huán)相連組成的四環(huán)化合物，如千金藤堿；
(5)原小蘗堿類生物堿，為兩個異喹啉的稠合，如黃連中所含的抗菌成分黃連素；
(6)普魯托品類生物堿，含羰基的小蘗堿開環(huán)化合物，如延胡索中的普魯托品；
(7)吐根堿類生物堿，異喹啉環(huán)帶苯駢喹啉啶環(huán)，如吐根中治療阿米巴痢疾的有效成分吐根堿；
(8)α -萘菲啶類生物堿，如搏落回中的血根堿；
(9)嗎啡類生物堿。2、喹啉類生物堿
喹啉類生物堿的母核是喹啉環(huán)，其中最重要的一類是金雞納生物堿。3、吡咯烷類生物堿
(1)簡單的吡咯烷生物堿，如古柯葉中分離出的液體生物堿古豆堿、新疆黨參中的黨參
堿； (2)雙稠吡咯烷類生物堿，由叔氮稠合兩個吡咯烷而成，如闊葉千里光中分得的闊葉千里光堿；
(3)吲哚里西定類生物堿，以叔氮稠合吡咯烷與哌啶環(huán)而組成的吲哚里西定環(huán)，如白牽牛喊；
(4)莨菪烷類生物堿，由吡咯烷與哌啶駢合而成的雜環(huán)，常見的是與有機酸成酯的阿托品類生物喊；
(5)百部生物堿，百部根中分離得到的生物堿大多含有吡咯環(huán)，因此也納入吡咯烷類生物堿。4、吲哚生物堿
以口引噪環(huán)為母核的生物喊，如治療白血病的聞效藥物長春新喊等。

本發(fā)明的目的之一是闡明首次注射空白脂質(zhì)體和鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體對二次注射鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體后鹽酸表阿霉素藥動學(xué)行為改變的關(guān)系。為實現(xiàn)該目的，發(fā)明人提供如下技術(shù)方案。以大鼠為實驗動物，首次注射不同磷脂劑量的PEG化空白脂質(zhì)體和鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體，第7天眼眶靜脈叢取血，分離血清。將鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體與血清進行孵育，以考察不同時間鹽酸表阿霉素從脂質(zhì)體中的釋放率。本發(fā)明的目的之二是提供首次注射時鹽酸表阿霉素的劑量范圍，以達到減輕或消除重復(fù)注射鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體的ABC現(xiàn)象。為實現(xiàn)該目的，發(fā)明人提供如下技術(shù)方案。一種鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體，在所述的給藥劑量下能夠減輕或完全消除重復(fù)注射鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體而產(chǎn)生的ABC現(xiàn)象。作為優(yōu)選方案，其中所述的鹽酸表阿霉素給藥劑量范圍為大于0.1 mg/kg。作為更優(yōu)選方案，其中所述的鹽酸表阿霉素給藥劑量范圍為0.2-5.0 mg/kg。作為最優(yōu)選方案，其中所述的鹽酸表阿霉素給藥劑量范圍為0.3-2.0 mg/kg。其中所述的鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體中鹽酸表阿霉素與磷脂的質(zhì)量比為0.025:1 1:1，優(yōu)選為 0.05:Γ0.5:1，更優(yōu)選為 0.1: Γθ.25:1。本發(fā)明的目的之三是對PEG化脂質(zhì)體連續(xù)給藥時的ABC現(xiàn)象進行研究，同時提供解決連續(xù)多次注射PEG化脂質(zhì)體的加速血液清除現(xiàn)象的方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
1、以藥物本身藥動學(xué)和組織分布的改變研究重復(fù)注射脂質(zhì)體的ABC現(xiàn)象，為指導(dǎo)臨床用藥提供更加合理的依據(jù)。2、對ABC現(xiàn)象中伴隨的藥物從載體釋放情況的闡明，為ABC現(xiàn)象的研究開辟了新的思路。


圖1為實施例2中首次注射空白脂質(zhì)體與鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體后二次注射鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體的藥時曲線。其中“”、“ —”、
“ - ”、“ ”、“ -4-、“ 一^ ”、“ -1- ”、一.~ ”、‘ -Φ-，，和 “ ，，分別代表
首次注射5%葡萄糖溶液、I μ mol磷脂/kg空白脂質(zhì)體、5 μ mol磷脂/kg空白脂質(zhì)體、10 μ mol磷脂/kg空白脂質(zhì)體、15 μ mol磷脂/kg空白脂質(zhì)體、50 μ mol磷脂/kg空白脂質(zhì)體、I μ mol憐脂/kg鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體、5 μ mol憐脂/kg鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體、10μ mol憐脂/kg鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體和15 μ mol憐脂/kg鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體。圖2為實施例2首次注射空白脂質(zhì)體與鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體后二次注射鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體的肝脾分布情況。圖3為實施例3中首次注射空白脂質(zhì)體與鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體后第7天血清中抗PEG的IgM含量。圖4為實施例4中首次注射空白脂質(zhì)體與鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體后第7天的血清與鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體孵育的藥物釋放曲線。其中“”、“ ”、“，、“ —f— ”、“ ”、“ —I— ”、“ —”、
”、“一和“一分別代表首次注射5%葡萄糖溶液、I μπιο 磷脂/kg空白脂質(zhì)體、5 μ mol憐脂/kg空白脂質(zhì)體、10 μ mol憐脂/kg空白脂質(zhì)體、15 μ mol憐脂/kg空白脂質(zhì)體、50 μ mol磷脂/kg空白脂質(zhì)體、I μ mol磷脂/kg鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體、5 μ mol磷脂/kg鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體、10 μ mol磷脂/kg鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體和15 μ mol磷脂/kg鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體。圖5為實施例5中首次注射不同磷脂劑量鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體，二次注射5 μ mol磷脂/kg的鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體的藥時曲線。其中“ —”、“ ”、“ Sr- ”、“ 一f一 ”、“ 一 — ” 和“ 一 — ” 分別代表首次注
射5%葡萄糖溶液、以及藥脂比為0.2,0.1,0.05,0.02和0.01的鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體。圖6為實施例6中連續(xù)注射低劑量鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體中最后一次注射鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體的藥時曲線。其中“”、“，、“ -^ir- ”、“ —r- ”、“ -4-、“ —”、“ —I— ”、“ —
”、“ 一*一”和“ ~Φ~ ”分別代表連續(xù)1、2、3、4、5、6、7、8、9和10天注射鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體。圖7為實施例7中連續(xù)注射不同劑量的鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體，第7次注射鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體的藥時曲線。其中一_一 ”和“ ”分別代表連續(xù)7天注射0.75、1.0和1.25 mg/
kg的鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)當理解，本發(fā)明的實施并不局限于下面的實施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護范圍。在本發(fā)明中，若非特指，所有的設(shè)備和原料等均可從市場購得或是本行業(yè)常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。實施例1鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體的制備 處方為:
HSPC3.0 g
CHl.0g
MPEg2000-DSPE 1.0 g制備工藝為: 65 1:下，用5%乙醇(v/v)溶解處方量膜材，注入60 mL預(yù)熱至相同溫度的水化介質(zhì)(200 mmol噸4 (NH4)2S04溶液)，孵育20 min，制得脂質(zhì)體初品，經(jīng)微射流處理(壓力為14000psi)，將粒徑減小至100 nm，依次通過0.8、0.45和0.22 μ m的微孔濾膜，即得空白脂質(zhì)體。梯度建立:取空白脂質(zhì)體，與混合樹脂(732鈉型陽離子交換樹脂與717氯型陰離子交換樹脂的混合比例為濕視體積1:2)混合放置5 min后,在2000 rpm下離心4 min,建立梯度。載藥:按照藥脂比1:10 (w/w)向梯度脂質(zhì)體中加入鹽酸表阿霉素溶液，60 °C下載藥20 min，得鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體，包封率大于95%。實施例2首次注射空白脂質(zhì)體和鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體對二次注射鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體ABC現(xiàn)象的影響
I血漿及組織樣品的處理
1.1血漿樣品的處理:取大鼠血漿0.1 mL，置7 mLEp管中，加入含0.3 mol.Γ1 HCl的甲醇-水(50:50, v/v)溶液4.9 mL,潤旋30 s混勻?；鞈乙?0000 rpm離心10 min,取
上清液測定熒光值。1.2組織樣品的處理:取0.5 g組織于7 mLEp管中，加入I mL生理鹽水高速分散勻漿，精密移取組織勻漿液0.2 mL，加入含0.3 mol.Γ1 HCl的甲醇-水(50:50，v/v)溶液4.8 mL，渦旋30 s混勻?；鞈乙?0000 rpm離心10 min，取上清液測定熒光值。2熒光分光光度體內(nèi)分析方法的建立
用滅菌注射用水分別配制濃度為1.0,2.0,4.0,8.0、16、32、64 μg.mL—1的系列鹽酸表阿霉素貯備溶液，分別取0.1 mL加入大鼠血漿和組織勻漿液，按“I”的方法處理，配制得濃度為0.02,0.04,0.08,0.16,0.32,0.64、1.28 μδ.mL—1的鹽酸表阿霉素標準溶液。用熒光分光光度計(Ex = 502 nm，Em = 562 nm)測定熒光強度F，樣品F值減去空白血漿及組織樣品F值，得到AF值，并以此AF值對鹽酸表阿霉素濃度C (Pg ^mL-1)進行線性回歸，結(jié)果見表I。表I標準曲線方程(AF-C)
I標準曲線方程I線性范圍WgiL/1)Ir2
血漿 A F=700.17C+8.08 0.02~1.28_0.9997
F~ AF=685.23C-12.16 —0.02~1.280.9989~
卑 I AF=674.651C-7.84 |θ.02~1.28|θ.9991
方法回收率、精密度均符合要求。3給藥方案
取雄性Wistar大鼠，體重21(T240 g，隨機分組，每組三只動物，尾靜脈注射給藥，按表2進行實驗，間隔7天以5 μ mol磷脂/kg的劑量二次注射鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體，并于二次注射前一天經(jīng)眼眶靜脈叢取血，分離血清。二次給藥后分別于0.083、0.25、0.5、1、2、4 h經(jīng)眼眶靜脈叢取血，4000 rpm離心10 min獲取血漿，4 h取血后將大鼠脫頸處死，取出肝脾，生理鹽水洗去殘留血液后以濾紙吸干水分。按“I”的方法處理，于熒光分光光度計上測定F值，樣品F值減去空白血漿及組織F值得Λ F值，由標準曲線計算各時間點血漿及組織中藥物濃度，結(jié)果見圖1和圖2。由圖1可知，首次注射葡萄糖溶液，二次注射鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體呈現(xiàn)出長循環(huán)特性。與對照組相比，首次注射 空白脂質(zhì)體劑量為I μ mol磷脂/kg時ABC現(xiàn)象最嚴重，二次給藥后5 min，鹽酸表阿霉素含量已降至注射劑量的10%以下。隨著首次注射空白脂質(zhì)體磷脂劑量的增加ABC現(xiàn)象逐漸減弱，當注射劑量達到50 μ mol磷脂/kg時ABC現(xiàn)象完全消失。首次注射鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體中鹽酸表阿霉素劑量達到1.2 mg/kg時ABC現(xiàn)象才完全消失。這一結(jié)果與文獻關(guān)于阿霉素脂質(zhì)體ABC現(xiàn)象(Ishida T, Atobe K, et al.Accelerated blood clearance of PEGylated liposomes upon repeated injections:Effect of doxorubicin-encapsulation and high-dose first injection[J].J ControlRelease, 2006, 115: 251 - 258)的報道不符，于是我們對載有阿霉素脂質(zhì)體的制劑進行了 ABC現(xiàn)象研究，得到的結(jié)果與鹽酸阿霉素脂質(zhì)體幾乎一致(數(shù)據(jù)未給出)。為了進一步驗證鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體的ABC現(xiàn)象，我們對二次給藥后的肝脾聚集量進行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對于ABC現(xiàn)象最為強烈的一組即首次注射空白脂質(zhì)體劑量為Iμ mol磷脂/kg，其肝臟的藥物聚集量僅僅為對照組的2倍，這與文獻報道的5倍相差較大。上述實驗結(jié)果給我們一個很重要的提示:我們的實驗結(jié)果與文獻不符的一個可能原因是我們采用藥物作為標記，文獻則直接對載體進行放射性標記。也就是說我們是在考察首次注射不同劑量空白及載藥PEG化脂質(zhì)體對二次注射脂質(zhì)體中藥物藥動學(xué)行為的影響，文獻則是在考察首次注射不同劑量空白及載藥PEG化脂質(zhì)體對二次注射脂質(zhì)體載體藥動學(xué)行為的影響。如果二次注射的脂質(zhì)體與首次注射脂質(zhì)體產(chǎn)生的IgM結(jié)合導(dǎo)致藥物的釋放，那么實驗過程中出現(xiàn)與文獻報道不一致的現(xiàn)象也就不足為奇了。表2首次注射空白脂質(zhì)體和鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體給藥方案
IF組I首次注射—
A_ 5%葡萄糖溶液_
B_I U mol _月旨/kg S白月旨Mi本_
C_5 μ mol _月旨/kg S白月旨Mi本_
權(quán)利要求
1.避免連續(xù)多次注射鹽酸表阿霉素PEG化脂質(zhì)體產(chǎn)生加速血液清除現(xiàn)象的方法，其特征在于，所述的鹽酸表阿霉素給藥劑量大于0.1 mg/kg。
2.如權(quán)利要求1所述的避免連續(xù)多次注射鹽酸表阿霉素PEG化脂質(zhì)體產(chǎn)生加速血液清除現(xiàn)象的方法，其特征在于，所述的鹽酸表阿霉素給藥劑量為0.2-5.0 mg/kg。
3.如權(quán)利要求1所述的避免連續(xù)多次注射鹽酸表阿霉素PEG化脂質(zhì)體產(chǎn)生加速血液清除現(xiàn)象的方法，其特征在于，所述的鹽酸表阿霉素給藥劑量為0.3-2.0 mg/kg。
4.如權(quán)利要求1-3任何一項所述的避免連續(xù)多次注射鹽酸表阿霉素PEG化脂質(zhì)體產(chǎn)生加速血液清除現(xiàn)象的方法，其特征在于，所述的鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體中鹽酸表阿霉素與磷脂的質(zhì)量比為0.025:1 1:1。
5.如權(quán)利要求4所述的避免連續(xù)多次注射鹽酸表阿霉素PEG化脂質(zhì)體產(chǎn)生加速血液清除現(xiàn)象的方法，其特征在于，所述的鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體中鹽酸表阿霉素與磷脂的質(zhì)量比為 0.05:1 0.5:1。
6.如權(quán)利要求4所述的避免連續(xù)多次注射鹽酸表阿霉素PEG化脂質(zhì)體產(chǎn)生加速血液清除現(xiàn)象的方法，其特征在于，所述的鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體中鹽酸表阿霉素與磷脂的質(zhì)量比為 0.1:1 0.25:1。
7.如權(quán)利要求1所述的避免連續(xù)多次注射鹽酸表阿霉素PEG化脂質(zhì)體產(chǎn)生加速血液清除現(xiàn)象的方法，其特征在于，通過提高首次或連續(xù)注射脂質(zhì)體的磷脂劑量減輕或消除抗腫瘤藥物脂質(zhì)體與其它藥物聯(lián)合化療時的加速血液清除現(xiàn)象。
8.如權(quán)利要求7所述的避免連續(xù)多次注射鹽酸表阿霉素PEG化脂質(zhì)體產(chǎn)生加速血液清除現(xiàn)象的方法，其特征在于，所述的首次注射脂質(zhì)體的磷脂劑量范圍為大于5 μ mol磷脂/kg ο
9.如權(quán)利要求7所述的避免連續(xù)多次注射鹽酸表阿霉素PEG化脂質(zhì)體產(chǎn)生加速血液清除現(xiàn)象的方法， 其特征在于，所述的首次注射脂質(zhì)體的磷脂劑量優(yōu)選10-50 μ mol磷脂/kg ο
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及避免連續(xù)多次注射PEG化脂質(zhì)體的加速血液清除現(xiàn)象的方法，具體涉及首次注射空白脂質(zhì)體及PEG化鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體對二次注射PEG化鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體中鹽酸表阿霉素藥動學(xué)行為的影響，以及連續(xù)多次注射PEG化脂質(zhì)體的加速血液清除現(xiàn)象。在此基礎(chǔ)上提供減輕或避免加速血液清除PEG化鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體的給藥劑量。本發(fā)明是通過改變首次或連續(xù)注射時鹽酸表阿霉素的劑量，達到避免藥物從脂質(zhì)體內(nèi)釋放同時減輕或消除加速血液清除現(xiàn)象的目的。
文檔編號A61K9/127GK103156871SQ20111042602
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月19日
發(fā)明者鄧意輝, 楊強, 宋艷志, 佘振南 申請人:沈陽藥科大學(xué)