專利名稱：一種BMP-2/bFGF雙基因殼聚糖納米微囊及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種BMP-2/bFGF雙基因殼聚糖納米微囊及其應(yīng)用，包裹的質(zhì)粒是分別由綠色和紅色熒光蛋白標(biāo)記的BMP-2(骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2)和 bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長因子)，該殼聚糖納米微囊包裹的BMP-2和bFGF雙基因能同時轉(zhuǎn)染入細(xì)胞并有效表達(dá)。
背景技術(shù)：
骨缺損常由外傷、感染及腫瘤等疾病引起，會造成嚴(yán)重的人體功能障礙和外貌畸形，給患者工作、生活、社交帶來巨大的影響，是臨床醫(yī)學(xué)面臨的一大難題。目前對骨缺損的治療主要有自體骨移植修復(fù)和各種材料充填兩種。前者的主要缺點(diǎn)在于供區(qū)損傷和供骨有限；后者的主要缺點(diǎn)在于移植物排斥和成骨性能不良等。當(dāng)前骨缺損治療的困境在于骨缺損治療仍然以傳統(tǒng)方法為主，且效果欠佳；基因治療骨缺損存在很多問題。這就有必要應(yīng)用多樣的技術(shù)，特別是多基因聯(lián)合治療的方法，對組織工程化人工骨的構(gòu)建進(jìn)行改良和完
口 ο基因治療是維持骨缺損局部生長因子有效治療濃度進(jìn)而提高療效最有希望的一種方法。其優(yōu)點(diǎn)在于保證基因產(chǎn)物的局部靶向釋放；可最大限度地增加局部治療效果，減少副作用；多種基因可分別轉(zhuǎn)導(dǎo)，并分別調(diào)控，內(nèi)源性合成的蛋白質(zhì)比外源性重組蛋白具有更強(qiáng)的生物活性。但是，骨缺損基因治療目前至少存在以下問題①研究多集中與單一基因方面，而事實(shí)上，在骨折愈合及骨生成過程中，有多個基因共同參與并協(xié)同表達(dá)；②基因轉(zhuǎn)染多采用病毒為載體，一般只轉(zhuǎn)載一個基因，同時存在免疫原性、安全性等很多問題；③種子細(xì)胞來源受限制，骨髓基質(zhì)細(xì)胞等的獲取繁瑣且難于被患者所接受。自 1965 年 Urist 首先發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenticproteins,BMPs) 具有骨誘導(dǎo)能力以來，骨的生長和修復(fù)受骨誘導(dǎo)因子的調(diào)控已被國內(nèi)外學(xué)者所公認(rèn)。BMPs 是唯一一類能夠啟動成骨分化，并作用于成骨整個過程的細(xì)胞因子。BMP-2是第一個在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證明具有誘骨活性的BMP分子，并且可作為誘骨的充分條件，即在只有單獨(dú)BMP-2存在的情況下即可誘導(dǎo)軟骨和骨組織的形成。在局部使用BMP-2蛋白或轉(zhuǎn)染了 BMP-2基因的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞用于治療骨缺損已經(jīng)獲得了一定的成功。然而，組織工程骨要得到理想的愈合效果，其再血管化是一個十分關(guān)鍵的環(huán)節(jié)?，F(xiàn)已證明堿性成纖維細(xì)胞生長因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)是體內(nèi)最為有效的血管形成因子之一，對新生血管形成過程中多個環(huán)節(jié)起作用，可刺激毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增生，形成毛細(xì)血管芽，同時能刺激纖溶酶原激活劑和膠原酶分泌，對創(chuàng)傷區(qū)域的細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行降解，使毛細(xì)血管向創(chuàng)面區(qū)域延伸。bFGF也是一種強(qiáng)大的促軟骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞有絲分裂因子，可促進(jìn)軟骨和骨組織的形成。與VEGF(Vascular endothelial growth factor，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子)相比，BMP_2、bFGF基因修飾(各基因分別單獨(dú)轉(zhuǎn)染)的種子細(xì)胞能夠更為有效地在骨組織工程中發(fā)揮作用。
Franceschi等用腺病毒分別表達(dá)BMP_2、4和7后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用時成骨能力提高。理論上BMP-2和bFGF的協(xié)同作用將取得更佳的成骨效果，這就需要去尋找能同時轉(zhuǎn)導(dǎo)多個基因的載體。目前基因轉(zhuǎn)染多采用病毒為載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒等，雖取得一定成功，但一個病毒載體一般只能轉(zhuǎn)載一個目標(biāo)基因，同時在表達(dá)時間、免疫源性反應(yīng)以及安全性方面仍存在很多問題。據(jù)Nature和Scinece和的報道，1999年9月，18歲的美國少年 Gelsinger J在腺病毒介導(dǎo)的基因治療臨床研究中不幸死亡。裸露質(zhì)粒由于轉(zhuǎn)染效率較低而未推廣，非病毒載體如陽離子脂質(zhì)體lipofectamine早在1987年就已研發(fā)，隨之一些合成聚合物載體如賴氨酸(PLL)、二氯乙基(DEAE)-葡聚糖、磷酸鈣和樹枝狀聚合物等均用于 DNA釋放，還包括一些控制釋放聚合物如乙烯-醋酸乙烯酯共聚物(EVAc)等。納米載體分為納米微囊和納米顆粒，殼聚糖載體是納米微囊結(jié)構(gòu)，它將基因包裹在內(nèi)部，納米顆粒則將基因結(jié)合在顆粒的表面。殼聚糖是由β-1-4鍵合葡糖胺和一部分 N-乙?；咸前方M成的天然線性陽離子多糖，為低毒性且生物相容性基因載體，因而可增加DNA/殼聚糖配合物劑量而提高其轉(zhuǎn)染率。Corsi等采用殼聚糖DNA納米載體轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、腎肉瘤細(xì)胞和人胎腎細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)殼聚糖DNA納米微囊在基因轉(zhuǎn)運(yùn)中具有毒性小、細(xì)胞型依賴性的特點(diǎn)。殼聚糖納米微囊(Nanosphere)包裹非病毒載體基因轉(zhuǎn)移技術(shù)是一種較為成熟的多基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。主要特點(diǎn)在于①納米微囊包裹可避免轉(zhuǎn)載物在受體內(nèi)被溶酶體酶降解； ②同時可包裹多個轉(zhuǎn)導(dǎo)基因；③由于采用可降解生物材料包裹，故明顯提高轉(zhuǎn)載基因的活性并具有長時間緩釋功能；④體內(nèi)及體外多種細(xì)胞系轉(zhuǎn)染證明其有較脂質(zhì)體優(yōu)越的基因轉(zhuǎn)移效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種BMP-2/bFGF雙基因殼聚糖納米微囊，微囊的基質(zhì)為殼聚糖，包裹的質(zhì)粒分別是綠色熒光蛋白標(biāo)記的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(pEGFP-N2-Hu-BMP-2) 和紅色熒光蛋白標(biāo)記的人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(pTagRFP-Cl-Hu-bFGF)。殼聚糖購自美國 Sigma 公司(low molecular weight, Sigma-Aldrich，脫乙酰度 75-85 %，貨號 448869-50G)，包裹的質(zhì)粒與殼聚糖的質(zhì)量比為1 1，其中BMP-2和bFGF各半(質(zhì)量比 1:1)。本發(fā)明所述微囊主要通過以下步驟制備(1)殼聚糖溶液的配制稱殼聚糖50mg，加入359ul乙酸，加滅菌去離子水(SDW) 至2. 5mL，37度過夜；次日力口 SDW至M5ml，調(diào)pH為5. 5，最后定容250mL，真空過濾(0. 22um 濾膜)除菌得a液的殼聚糖溶液，此時殼聚糖溶液的溶度為0. 2g/L ；O)DNA溶液的配制將質(zhì)量比1 1的pEGFP-N2-Hu-BMP-2和 pTagRFP-Cl-Hu-bFGF溶解于5mM的硫酸鈉鈉溶液中，配制成200 μ g/mL(0. 2g/L)質(zhì)粒溶液 (100 μ g/mL BMP-2 質(zhì)粒 +100 μ g/mL bFGF 質(zhì)粒)，得到 b 液；(3)殼聚糖納米微囊的制備將a液、b液分別加熱，55度水浴15min，按1 1混合，2500rpm攪拌30秒，即得lOOng/uL的BMP-2/bFGF雙基因殼聚糖納米微囊溶液，4攝氏
度保存。
本發(fā)明的另一個目的是提供所述微囊在制備基因治療骨缺損藥物中的應(yīng)用。綠色熒光蛋白標(biāo)記的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (pEGFP-N2-Hu-BMP_2)和紅色熒光蛋白標(biāo)記的人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(pTagRFP-Cl-Hu-bFGF)是從人成纖維細(xì)胞中分別提取BMP-2和bFGF，再分別與綠色熒光蛋白載體pEGFP-N2(Cl0ntech，美國)和紅色熒光蛋白載體pTagRFP-Cl (Evrogen，Moscow, Russia)連接構(gòu)建，具體構(gòu)建方法見實(shí)施例1。經(jīng)菌落 PCR、雙酶切鑒定以及測序三種方法，均表明pTagRFP-Hu-bFGF重組表達(dá)載體的構(gòu)建是正確的，而且Hu-bFGF和RFP (紅色熒光蛋白)以融合表達(dá)的方式在Kozak sequence的幫助下進(jìn)行高水平真核細(xì)胞的表達(dá)。原子力顯微鏡(SPI3800N)下觀察見殼聚糖納米微囊呈不規(guī)則球形，結(jié)構(gòu)緊密，粒徑約為100-200nm，大小較均一(圖1)。熒光顯微鏡下觀察可見轉(zhuǎn)染后同一細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)綠色和紅色(圖2)，說明分別標(biāo)記有綠色和紅色熒光蛋白的雙基因轉(zhuǎn)入同一細(xì)胞表達(dá)。本發(fā)明針對骨缺損基因治療方面的三方面不足設(shè)計BMP-2/bFGF雙基因殼聚糖納米微囊，采用納米微囊包裹非病毒載體多基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，轉(zhuǎn)染于脂肪干細(xì)胞(脂肪源性基質(zhì)細(xì)胞，Adipose Derived Stem Cells，ADSCs)，以取得更好的成骨性能。本發(fā)明微囊的基質(zhì)選用殼聚糖，包裹的質(zhì)粒是分別由綠色和紅色熒光蛋白標(biāo)記的BMP-2和bFGF。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該殼聚糖納米微囊包裹的BMP-2和bFGF雙基因能同時進(jìn)入細(xì)胞并有效表達(dá)，因此可在制備基因治療骨缺損藥物中的應(yīng)用。該微囊的制備方法簡單，條件溫和，效果良好，殼聚糖在體內(nèi)可以完全降解并代謝，其分解產(chǎn)物及代謝產(chǎn)物對人體健康無害，有良好的應(yīng)用前景。


圖1為原子力顯微鏡下的殼聚糖納米微囊。圖2為BMP-2/bFGF雙基因共轉(zhuǎn)染的熒光照片(a為綠色熒光激發(fā)，b為紅色熒光激發(fā)，c為雙色熒光合成照片)。圖3為殼聚糖納米微囊的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。圖4為原子力顯微鏡下的殼聚糖納米微囊(稀釋后放于云母片上)。圖5為原子力顯微鏡下殼聚糖納米微囊粒徑測量(稀釋后放于云母片上)。圖 6 為 Western Blotting 檢測。具體實(shí)施方法本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例ΙΒΜΡ-2/bFGF雙基因殼聚糖納米微囊的制備BMP-2/bFGF雙基因殼聚糖納米微囊的制備方法主要分為如下4個步驟①構(gòu)建綠色和紅色熒光蛋白分別標(biāo)記的BMP-2和bFGF 分別構(gòu)建 pEGFP-N2-Hu-BMP-2和pTagRFP-Cl-Hu-bFGF，并經(jīng)經(jīng)菌落PCR、雙酶切鑒定以及測序三種方法，均表明pTagRFP-Hu-bFGF重組表達(dá)載體的構(gòu)建是正確的，而且Hu-bFGF和RFP (紅色熒光蛋白)以融合表達(dá)的方式在Kozak sequence的幫助下進(jìn)行高水平真核細(xì)胞的表達(dá)。構(gòu)建方法如下。( 一)pEGFP-N2-Hu-BMP-2的構(gòu)建用總RNA提取試劑盒(杭州浩基生物科技有限公司)提取人成纖維細(xì)胞總RNA，再用superscript II RTase(Invitrogen)合成cDNA，然后進(jìn)行Hu VEGF ORF PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
PCR引物設(shè)計和合成根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫VEGF-A序列，采用I^rimer Premier 6. 0軟件進(jìn)行熒光引物的設(shè)計，然后由上海生物工程有限公司負(fù)責(zé)合成，引物序列如下正向引物Hu-Bmp2-F見 SEQ ID NO. 1。反向引物:Hu-Bmp2-R見 SEQ ID NO. 2。表IPCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種BMP-2/bFGF雙基因殼聚糖納米微囊，其特征在于，微囊的基質(zhì)為殼聚糖，包裹的質(zhì)粒分別是綠色熒光蛋白標(biāo)記的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和紅色熒光蛋白標(biāo)記的人堿性成纖維細(xì)胞生長因子，殼聚糖的脫乙酰度75-85%，包裹的質(zhì)粒與殼聚糖的質(zhì)量比為1:1，其中綠色熒光蛋白標(biāo)記的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和紅色熒光蛋白標(biāo)記的人堿性成纖維細(xì)胞生長因子質(zhì)量比1:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種BMP-2/bFGF雙基因殼聚糖納米微囊，其特征在于，所述微囊通過以下步驟制備(1)殼聚糖溶液的配制稱殼聚糖50mg，加入359 ul乙酸，加滅菌去離子水至2. 5 mL, 37度過夜，次日加滅菌去離子水至M5 ml，調(diào)pH為5. 5，最后定容250 mL，真空過濾除菌得殼聚糖溶液，為a液，殼聚糖溶液的溶度為0. 2g/L ；(2)DNA溶液的配制將質(zhì)量比 1 1 的 pEGFP-N2-Hu-BMP-2 和 pTagRFP-Cl-Hu_bFGF 溶解于5 mM的硫酸鈉鈉溶液中，配制成200 μ g/mL質(zhì)粒溶液，得到b液；(3)殼聚糖納米微囊的制備將a液、b液分別加熱，55度水浴15min，按1: 1混合， 2500 rpm攪拌30秒，即得100 ng/uL的BMP-2/bFGF雙基因殼聚糖納米微囊溶液，4攝氏度保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種BMP-2/bFGF雙基因殼聚糖納米微囊在制備基因治療骨缺損藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種BMP-2/bFGF雙基因殼聚糖納米微囊，微囊的基質(zhì)為殼聚糖，包裹的質(zhì)粒分別是綠色熒光蛋白標(biāo)記的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和紅色熒光蛋白標(biāo)記的人堿性成纖維細(xì)胞生長因子，質(zhì)粒與殼聚糖的質(zhì)量比為1:1。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明殼聚糖納米微囊包裹的BMP-2和bFGF雙基因能同時進(jìn)入細(xì)胞并有效表達(dá)，因此可在制備基因治療骨缺損藥物中的應(yīng)用。該微囊的制備方法簡單，條件溫和，效果良好，殼聚糖在體內(nèi)可以完全降解并代謝，其分解產(chǎn)物及代謝產(chǎn)物對人體健康無害，有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號A61K9/50GK102430129SQ201110425620
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月17日
發(fā)明者張夢媛, 李彩云, 楊虎, 范聰, 談偉強(qiáng), 陳強(qiáng) 申請人:浙江大學(xué)