專利名稱：一種鯊魚糖蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及是一種鯊魚糖蛋白及其制備方法以及在抗腫瘤方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖蛋白(glycoprotein)是一類由糖類物質(zhì)(多為寡糖)與蛋白質(zhì)或多肽以共價(jià)鍵(O-糖苷鍵或N-糖苷鍵)連接而形成的結(jié)合蛋白，廣泛地存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)，是生物體內(nèi)一類非常重要的功能大分子。自20世紀(jì)60年代以來(lái)，生物化學(xué)、化學(xué)和藥學(xué)等領(lǐng)域的研究人員經(jīng)過(guò)廣泛和深入的研究，發(fā)現(xiàn)糖蛋白具有顯著的藥用價(jià)值和保健價(jià)值，具有抗腫瘤、提高免疫力、降血脂、抗糖尿病、抗氧化和防衰老等多種功能。目前已成功應(yīng)用于臨床并具有顯著生物活性的藥用蛋白制劑大都是糖蛋白。近年來(lái)，天然產(chǎn)物來(lái)源的糖蛋白，在生物化學(xué)、蛋白質(zhì)工程學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、藥物化學(xué)及功能食品等領(lǐng)域受到高度重視。特別是存在于動(dòng)、植物中的具有顯著生物活性的糖蛋白，在創(chuàng)新藥物及功能性食品開發(fā)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。鯊魚肉味甘、咸，性平，歸脾、肺經(jīng)。具補(bǔ)虛、健脾、利水、祛瘀消腫之功效。主治久病體虛、脾虛浮腫和創(chuàng)口久不愈合等病癥。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)鯊魚研究主要集中在軟骨抗腫瘤活性成分(多糖、蛋白質(zhì)、多肽)、鯊魚皮膠體蛋白、鯊魚肝臟的魚肝油(角鯊烯)等領(lǐng)域。魚肉主要作為食補(bǔ)材料，而其活性成分，特別是魚肉糖蛋白的制備工藝及其作為抗腫瘤物質(zhì)的應(yīng)用尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種鯊魚糖蛋白，對(duì)血管生成及腫瘤有明顯的抑制作用。

本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種鯊魚糖蛋白的制備方法。本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種鯊魚糖蛋白的應(yīng)用。本發(fā)明解決上述第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為:一種鯊魚糖蛋白，其特征在于該鯊魚糖蛋白的分子量為26.4Da，其中糖和蛋白含量分別為33.65%和66.35%，該鯊魚糖蛋白中單糖的組成包括L-巖藻糖、L-阿拉伯糖、L-半乳糖、D-葡萄糖和D-甘露糖，相應(yīng)比例為 1.00: 1.53: 7.27: 9.07: 2.09。作為優(yōu)選，所述鯊魚糖蛋白的分子量為26.4Da，其中糖和蛋白含量分別為33.65%和66.35%，所述鯊魚糖蛋白中單糖的組成包括L-巖藻糖、L-阿拉伯糖、L-半乳糖、D-葡萄糖和D-甘露糖，相應(yīng)比例為L(zhǎng) 00: 1.53: 7.27: 9.07: 2.09。作為改進(jìn)，所述鯊魚糖蛋白的組分在280nm處有蛋白質(zhì)特征吸收值，同時(shí)用苯酚-硫酸法檢測(cè)時(shí)，在490nm有多糖特征吸光值的組分。再改進(jìn)，所述鯊魚糖蛋白的糖肽的結(jié)合方式為N-糖肽鍵和O-糖肽鍵。 最后，所述鯊魚糖蛋白中有17種氨基酸，其中IOOg總氨基酸中含有丙酸酸10.4g，精氨酸5.9g，天冬氨酸8.3g，半胱氨酸0.1g,谷氨酸8.7g，甘氨酸15.6g，組氨酸0.2g，異亮氨酸1.2g，亮氨酸2.9g，賴氨酸2.2g，蛋氨酸0.9g，苯丙氨酸2.6g，脯氨酸9.5g，絲氨酸16.7g,蘇氨酸8.9g,酪氨酸0.3g,繳氨酸5.6g。本發(fā)明解決上述第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為:一種鯊魚糖蛋白的制備方法，其特征在于步驟為:I)勻漿:鯊魚肉于80% 95(v) %乙醇溶液中勻漿2 4min，勻漿液用0.5
1.5mol/LNa0H調(diào)pH值至8.5 9.5,用雙蒸水調(diào)乙醇濃度至50% 70 (V) %,于20 30°C水浴中保溫20 40min后，于3000 5000r/min離心10 20min,收集上清液；加NaCl將上清液的NaCl濃度調(diào)至5% IO(Wt) %，于20 30°C水浴中10 15小時(shí)，于3000 5000r/min離心10 20min，收集沉淀；2)脫脂:將I)所得沉淀物加入乙醚處理2 3小時(shí)，過(guò)濾得沉淀物，凍干得脫脂蛋白粉末；3)酶解:將2)所得脫脂蛋白粉末按照料液比1: 40 1: 60溶于雙蒸水中，用
0.5 1.5mol/LHCl調(diào)pH至5.5 6.5，按照脫脂蛋白粉末0.8 1.2 (wt) %的量加入木瓜蛋白酶，于50 60°C酶解2 4小時(shí)；將所得的酶解產(chǎn)物先經(jīng)滅酶處理，得酶解液，酶解液3000 5000r/min離心20 40min,取上清液脫鹽、濃縮和冷凍干燥,得糖蛋白粗品；4)精制:將3)所得糖蛋白粗品溶于雙蒸水中，經(jīng)陰離子交換樹脂柱層析，先用
0.09 0.llmol/L NaCl 洗脫，然后用 0.45 0.55mol/L NaCl 洗脫，收集0.45 0.55mol/L NaCl洗脫組分，即得粗糖蛋白組分；將所收集的粗糖蛋白組分再上葡聚糖凝膠柱，用去離子水洗脫，收集糖蛋白組分；將凝膠色譜收集的糖蛋白組分用高效液相色譜純化，收集洗脫峰，冷凍干燥得糖蛋白。 作為優(yōu)選,所述步驟3)中的木瓜蛋白酶的酶活力> lX106U/g。作為改進(jìn)，所述步驟3)中的滅酶處理為:將所得的酶解產(chǎn)物升溫至95 100°C，并于此溫度保持10 15min，再冷卻至10 20°C以終止酶反應(yīng)；所述步驟3)中的脫鹽過(guò)程為:將酶解液制成濃度10mg/ml 20mg/ml的溶液，進(jìn)行DlOl大孔樹脂脫鹽；脫鹽后的酶解液在不高于40°C的低溫下進(jìn)行真空濃縮，得到濃縮酶解液于低溫凍干。最后，所述步驟4)中的陰離子交換樹脂為DEAE-cellulose-52，葡聚糖凝膠為Sephadex G-100 ;高效液相色譜的條件為:色譜柱為Inertsil 0DS_3C18柱,流動(dòng)相為 乙腈-水，含0.1 (wt) %三氟乙酸梯度洗脫,流速為0.8 1.2mL/min。本發(fā)明解決上述第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為:一種鯊魚糖蛋白應(yīng)用于抗腫瘤藥物中或者作為一種新生血管抑制劑使用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明以鯊魚魚肉為原料，利用脫脂、酶解、離子交換樹脂柱層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜純化制備糖蛋白，不僅原料豐富，而且制備工藝簡(jiǎn)單、易操作，制得的鯊魚糖蛋白經(jīng)雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)新生血管具有顯著抑制作用，且呈現(xiàn)量效關(guān)系，體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)腫瘤細(xì)胞株P(guān)388(人白血病細(xì)胞株)、A-549(人肺腺癌)和BEL-7402 (肝癌細(xì)胞株)均顯示出明顯的抑制作用，并呈劑量依賴關(guān)系。本發(fā)明的鯊魚糖蛋白在臨床上可以作為一種新生血管抑制劑使用，可用于腫瘤等疾病的治療，具有廣闊的市場(chǎng)前景。


圖1鯊魚脫脂蛋白酶解物在DEAE-Cellulose-52層析柱上的洗脫曲線(0.5mol/LNaCl洗脫組分);圖2粗糖蛋白組分在Sephadex G-100層析柱上的洗脫曲線；圖3糖蛋白組分在RP-HPLC上的洗脫曲線；圖4鯊魚糖蛋白FT-1R圖；圖5糖蛋白的SDS-PAGE圖；其中第一欄:鯊魚糖蛋白；第二欄:由PNGase F酶解后的鯊魚糖蛋白降解物；圖6堿處理前后鯊魚糖蛋白的UV圖譜；圖7鯊魚糖蛋白的溫度降解曲線；圖8鯊魚糖蛋白抑制CAM血管生成的測(cè)定的結(jié)果，其PBS為陰性對(duì)照，CS為陽(yáng)性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例 對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。本發(fā)明所用的儀器設(shè)備:Agilent 1200高效液相色譜(美國(guó)Agilent公司)Mill1-Q system(美國(guó) Millipore 公司)DEAE-cellulose-52 和 Sephadex G-100 柱層析設(shè)備(瑞典 Pharmacia 公司)；FDU-1200小型冷凍干燥機(jī)(日本EYELA公司)DS-21高速組織搗碎機(jī)(上海標(biāo)本模型廠)；UV-22000型紫外分光光度計(jì)(尤尼柯儀器(上海)有限公司)；DYY-22C電泳儀(北京六一儀器廠)；He1-VAP旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(德國(guó)Heidolph公司)；BSZ-100型自動(dòng)部分收集器(上海琪特分析儀器有限公司)LXB型離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)；本發(fā)明所使用的試劑及原料:PNGase F(美國(guó) Sigma 公司)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品(上海源聚生物技術(shù)有限公司)牛血清白蛋白(上海源聚生物技術(shù)有限公司)其它試劑均為分析純，均由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。一種鯊魚糖蛋白的制備方法，制備工藝流程如下:鯊魚肉一組織搗碎一乙醚脫脂—木瓜蛋白酶酶解一陰離子交換層析一葡聚糖凝膠層析一高效液相色譜精制一理化性質(zhì)、活性分析。具體步驟為:1、勻衆(zhòng):灰星藍(lán)(Mustelus griseus)魚肉于90 (v) %乙醇溶液中勻衆(zhòng)3min,勻漿液用lmol/L NaOH調(diào)pH值至9.0，用雙蒸水調(diào)乙醇濃度至60(v) %，于25°C水浴中保溫30min后，于4000r/min離心15min，收集上清液，加NaCl將上清液的NaCl濃度調(diào)至5(wt) %，于25°C水浴中15小時(shí)，于4000r/min離心15min，收集沉淀。
2、脫脂:將所得沉淀物加入乙醚處理3小時(shí)，過(guò)濾得沉淀物，凍干得脫脂蛋白粉末。3、酶解:將步驟2所得的脫脂蛋白粉末按照料液比1: 50溶于雙蒸水中，用
0.lmol/L HCl調(diào)pH至6，按照脫脂蛋白粉末l(wt) %的量加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶的酶活力彡I X 106u/g,于55°c酶解3小時(shí)；將所得的酶解產(chǎn)物于100°C水域中IOmin滅酶處理，冷卻至10°C得酶解液，酶解液4000r/min離心25min，取上清液上DlOl大孔樹脂脫鹽、低于40°C溫度下進(jìn)行真空濃縮至原體積1/4，濃縮液冷凍干燥，得糖蛋白粗品。4、精制:將所得糖蛋白粗品溶于雙蒸水中，經(jīng)DEAE-cellulose-52陰離子交換樹脂柱層析，先用0.lmol/L NaCl洗脫，然后用0.5mol/L NaCl洗脫，收集0.5mol/L NaCl洗脫組分，即得粗糖蛋白組分；將所收集的粗糖蛋白組分再上葡聚糖Sephadex G-100凝膠柱，去離子水洗脫，收集糖蛋白組分；將凝膠色譜收集的糖蛋白組分用高效液相色譜，色譜柱為Inertsil 0DS-3 C18柱(250mmX 4.6mm, 5 μ m),流動(dòng)相為:乙腈-水(0.1%三氟乙酸)梯度洗脫，流速為lmL/min純化，收集洗脫峰，冷凍干燥得糖蛋白。下面對(duì)制得的糖蛋白進(jìn)行檢測(cè):1、所得的鯊魚糖蛋白組分是在280nm處有蛋白質(zhì)特征吸收值，同時(shí)用苯酚-硫酸法檢測(cè)時(shí)，在490nm又有多糖特征吸光值的組分。2、將制得的鯊魚糖蛋白采用KBr壓片法，在ΑΟΟΟαι^-δΟΟαιΓ1范圍內(nèi)掃描，得紅外圖譜，如附圖4所示，吸收峰位于350001^-28000^1之間，表明本發(fā)明提取物為糖類化合物，3367.5,2930.3，1652.3，1557.7，1406.5，1149.5，1077.5cm_1 處有明顯吸收峰，進(jìn)一步證明該樣品為糖蛋白。其中3367.5CHT1左右為多糖控基伸縮振動(dòng)吸收峰，2930.3cm^左右為糖C-H伸縮振動(dòng)吸收峰，1403CHT1為多糖C-O振動(dòng)吸收峰；1652.3cm—1和1557.1cm1處為酰胺基的N-H振動(dòng)吸收峰。

3、將鯊魚糖蛋白經(jīng)PNGase F酶解，分子量降低(圖5)，表明鯊魚糖蛋白中糖肽的結(jié)合方式有N-糖肽鍵；本發(fā)明所得的鯊魚糖蛋白配成0.5mol/L的水溶液和0.2mol/L的NaOH溶液，于45°C水浴處理2h，分別以水和0.2mol/L的NaOH溶液為空白，在200nm 400nm范圍內(nèi)掃描得紫外光譜圖，如附圖6所示,堿處理樣品的紫外光譜230nm 240nm間出現(xiàn)吸收，由此確定本發(fā)明所得的鯊魚糖蛋白中糖肽的結(jié)合方式有O-糖肽鍵。4、所述鯊魚糖蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分析分子量約為26.4kDa(圖5)。5、所述鯊魚糖蛋白經(jīng)高效液相色譜分析其半數(shù)降解溫度為74.7V (圖7)。6、所述鯊魚糖蛋白中糖和蛋白含量分別為33.65%和66.35% j5GC/MS測(cè)定，糖蛋白中單糖的組成包括L-巖藻糖、L-阿拉伯糖、L-半乳糖、D-葡萄糖和D-甘露糖，相應(yīng)比例為 1.00: 1.53: 7.27: 9.07: 2.09。7、將鯊魚糖蛋白經(jīng)氨基酸分析儀分析，糖蛋白由17中氨基酸組成，詳見表I。表1.鯊魚糖蛋白中氨基酸組成及含量
權(quán)利要求
1.一種鯊魚糖蛋白，其特征在于該鯊魚糖蛋白的分子量為26.4Da，其中糖和蛋白含量分別為33.65%和66.35%，該鯊魚糖蛋白中單糖的組成包括L-巖藻糖、L-阿拉伯糖、L-半乳糖、D-葡萄糖和D-甘露糖，相應(yīng)比例為1.0O: 1.53: 7.27: 9.07: 2.09。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鯊魚糖蛋白，其特征在于所述鯊魚糖蛋白中有17種氨基酸，其中IOOg總氨基酸中含有丙酸酸10.4g，精氨酸5.9g，天冬氨酸8.3g，半胱氨酸0.lg，谷氨酸8.7g，甘氨酸15.6g，組氨酸0.2g，異亮氨酸1.2g，亮氨酸2.9g，賴氨酸2.2g，蛋氨酸0.9g,苯丙氨酸2.6g,脯氨酸9.5g,絲氨酸16.7g,蘇氨酸8.9g,酪氨酸0.3g,繳氨酸5.6g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鯊魚糖蛋白，其特征在于所述鯊魚糖蛋白的組分在280nm處有蛋白質(zhì)特征吸收值，同時(shí)用苯酚-硫酸法檢測(cè)時(shí)，在490nm有多糖特征吸光值的組分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鯊魚糖蛋白，其特征在于所述鯊魚糖蛋白的糖肽的結(jié)合方式為N-糖肽鍵和O-糖肽鍵。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求1至4任一權(quán)利要求所述的鯊魚糖蛋白的制備方法，其特征在于步驟為: 1)勻漿:g魚肉于80% 95(V) %乙醇溶液中勻漿2 4min，勻漿液用0.5 1.5mol/L NaOH調(diào)pH值至8.5 9.5，用雙蒸水調(diào)乙醇濃度至50% 70 (V) %，于20 30°C水浴中保溫20 40min后，于3000 5000r/min離心10 20min,收集上清液；加NaCl將上清液的NaCl濃度調(diào)至5% IO(Wt) %，于20 30°C水浴中10 15小時(shí)，于3000 5000r/min離心10 20min,收集沉淀； 2)脫脂:將I)所得沉淀物加入乙醚處理2 3小時(shí)，過(guò)濾得沉淀物，凍干得脫脂蛋白粉末； 3)酶解:將2)所得脫脂蛋白粉末按照料液比1: 40 1: 60溶于雙蒸水中，用0.5 1.5mol/LHCl調(diào)pH至5.5 6.5，按照脫脂蛋白粉末0.8 1.2 (wt) %的量加入木瓜蛋白酶，于50 60°C酶解2 4小時(shí)；將所得的酶解產(chǎn)物先經(jīng)滅酶處理，得酶解液，酶解液3000 5000r/min離心20 40min,取上清液脫鹽、濃縮和冷凍干燥,得糖蛋白粗品； 4)精制:將3)所得糖蛋白粗品溶于雙蒸水中，經(jīng)陰離子交換樹脂柱層析，先用0.09 lmol/L NaCl 洗脫，然后用 0.45 0.55mol/L NaCl 洗脫，收集 0.45 0.55mol/L NaCl洗脫組分，即得粗糖蛋白組分；將所收集的粗糖蛋白組分再上葡聚糖凝膠柱，用去離子水洗脫，收集糖蛋白組分；將凝膠色譜收集的糖蛋白組分用高效液相色譜純化，收集洗脫峰，冷凍干燥得糖蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)中的木瓜蛋白酶的酶活力彡 lX106U/g。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)中的滅酶處理為:將所得的酶解產(chǎn)物升溫至95 100°C，并于此溫度保持10 15min，再冷卻至10 20°C以終止酶反應(yīng)；所述步驟3)中的脫鹽過(guò)程為:將酶解液制成濃度10mg/ml 20mg/ml的溶液，進(jìn)行DlOl大孔樹脂脫鹽；脫鹽后的酶解液在不高于40°C的低溫下進(jìn)行真空濃縮，得到濃縮酶解液于低溫凍干。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟4)中的陰離子交換樹脂為DEAE-cellulose-52，葡聚糖凝膠為Sephadex G-100 ;高效液相色譜的條件為:色譜柱為Inertsil 0DS-3 C18柱，流動(dòng)相為:乙腈-水，含0.1 (wt) %三氟乙酸梯度洗脫，流速為`0.8 L 2mL/min。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求1至4任一權(quán)利要求所述的鯊魚糖蛋白應(yīng)用于抗腫瘤藥物中或者作為一種新生血管抑制劑使用。`
全文摘要
本發(fā)明公開一種鯊魚糖蛋白及其制備方法和用途，本發(fā)明所述鯊魚糖蛋白是從鯊魚魚肉經(jīng)組織搗碎、脫脂、酶解、再經(jīng)DEAE-cellulose-52柱層析、Sephadex G-100柱層析和反相高效液相色譜純化，濃縮、再經(jīng)冷凍干燥步驟得到鯊魚糖蛋白。本發(fā)明的鯊魚糖蛋白的分子量約為26.4kDa，糖和蛋白含量分別為33.65％和66.35％，含有O-糖肽鍵和N-糖肽鍵，單糖的組成包括L-巖藻糖、L-阿拉伯糖、L-半乳糖、D-葡萄糖和D-甘露糖，相應(yīng)比例為1.00∶1.53∶7.27∶9.07∶2.09；蛋白質(zhì)由17中氨基酸組成。本發(fā)明的鯊魚糖蛋白在臨床上可以作為一種新生血管抑制劑使用，可用于腫瘤等疾病的治療，具有廣闊的市場(chǎng)前景。
文檔編號(hào)A61P35/00GK103113462SQ201110363289
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者王斌, 李忠瑞, 羅紅宇, 鄧尚貴, 馬佳卉, 栗麗 申請(qǐng)人:浙江海洋學(xué)院