專利名稱：龍芽草抗肝癌活性組分及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及一種治療肝癌的中藥組合物和治療癌癥的方法。本申請(qǐng)還涉及中藥活性組分及其在制備用于治療肝癌的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，死亡率極高。我國每年死于肝癌約11萬人，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%。我國原發(fā)性肝癌的90%以上為肝細(xì)胞癌。在香港地區(qū)，肝細(xì)胞癌是最常見的致死亡的十大癌癥之一。目前，肝癌的治療方法主要有化療、放療和手術(shù)切除等，但這些方法毒副作用大、預(yù)后較差、復(fù)發(fā)率高，因此治療肝癌的效果并不理想。傳統(tǒng)的中藥由于其較高的安全性也已用于肝癌的治療(Ho Jff, Leung YK, ChanCP. Herbal medicine in the treatment of cancer (治療癌癥的中草藥) Curr Med Chem·2002，2，209-214)。已知的此類藥物大多是由幾種或數(shù)十種中藥原料配制而成。這類中藥復(fù)方的成分復(fù)雜，作用機(jī)理不清楚，質(zhì)量監(jiān)控難度較大。目前很少有單味中藥用于肝癌的治療。而且，研發(fā)中藥的有效(活性)成分或部位具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
第一方面,提供了一種治療肝癌的龍芽草(Agrimonia piIosa Ledeb)活性組分。所述龍芽草活性組分的特征在于由包括下述步驟的方法得到(a)用水提取龍芽草，得到龍芽草的水提取液；(b)將龍芽草的水提取液干燥后，得到的干燥物加入第一有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，隨后去除第一有機(jī)溶劑，收集剩余的物質(zhì)；(C)將步驟(b)得到的物質(zhì)重懸于水中，加入第二有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，將水相過濾后收集濾液；以及(d)將步驟(C)得到的水相濾液，用第三有機(jī)溶劑提取，將水相過濾后收集濾液。在某些實(shí)施方案中，龍芽草活性組分含有齊墩果酸、熊果酸和脫鎂葉綠酸a甲酯(pheophorbide a),優(yōu)選地由上述成分組成。第二方面，提供了治療肝癌的中藥組合物，該組合物包含所述的龍芽草活性組分和藥學(xué)上可接受的載體。第三方面，提供了所述龍芽草活性組分以及包含龍芽草活性組分和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物的制備方法。第四方面，提供了前述的龍芽草活性組分在制備治療肝癌的藥物中的用途。此外，提供了一種治療肝癌的方法，該方法通過給予個(gè)體治療有效量的龍芽草活性組分來治療肝癌。


圖1顯示了正常和發(fā)生腫瘤的肝臟的大體標(biāo)本的肉眼特征。A圖是陰性對(duì)照，即正常肝臟；B圖是陽性對(duì)照，即未經(jīng)治療的肝癌標(biāo)本；C圖是龍芽草活性組分治療后的肝臟標(biāo)本。
圖2顯示了在大鼠肝癌發(fā)生的第4周，經(jīng)龍芽草活性組分治療24周后，大鼠肝臟組織切片的蘇木精-伊紅染色結(jié)果。A，陰性對(duì)照，顯示了正常肝臟的蘇木精-伊紅染色結(jié)果；B，陽性對(duì)照，顯示了未經(jīng)治療的肝癌的染色結(jié)果；C顯示了龍芽草活性組分治療組的染色結(jié)果。圖3顯示了在大鼠肝癌發(fā)生的第32周，經(jīng)龍芽草不同提取組分治療24周后，大鼠肝臟組織切片的蘇木精-伊紅染色結(jié)果。A，陰性對(duì)照，顯示了正常肝臟的蘇木精-伊紅染色結(jié)果；B，陽性對(duì)照，顯示了未經(jīng)治療的肝癌的染色結(jié)果；(顯示了龍芽草活性組分治療組的染色結(jié)果。圖4顯示了在大鼠肝癌發(fā)生的第4周，經(jīng)龍芽草活性組分治療24周后，大鼠肝臟組織切片的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST-P)免疫組化染色結(jié)果。A，陰性對(duì)照，顯示了正常肝臟的GST-P免疫組化染色結(jié)果；B，陽性對(duì)照，顯示了未經(jīng)治療的肝癌的染色結(jié)果；(顯示了龍芽草活性組分治療組的染色結(jié)果。圖5顯示了在大鼠肝癌發(fā)生的第32周，經(jīng)龍芽草活性組分治療24周后，大鼠肝臟組織切片的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST-P)免疫組化染色結(jié)果。A，陰性對(duì)照，顯示了正常肝臟的GST-P免疫組化染色結(jié)果；B，陽性對(duì)照，顯示了未經(jīng)治療的肝癌的染色結(jié)果；C顯示了龍芽草活性組分治療組的染色結(jié)果。圖6顯示了用龍芽草活性組分治療24周時(shí)，對(duì)大鼠血清中ALT和AST活性的影響。第I組為陰性對(duì)照組(正常組，η = 10);第II組為陽性對(duì)照組(患肝癌后，僅用淀粉處理組，η = 10);第III組為龍芽草活性組分治療組(η = 10)。圖7顯示了龍芽草活性組分的高效液相色譜結(jié)果，數(shù)字I指示齊敦果酸的峰；數(shù)字2指示熊果酸的峰；3指示脫鎂葉綠酸a甲酯的峰。圖8顯示了從龍芽草活性組分純化出的脫鎂葉綠酸a甲酯的質(zhì)譜圖。圖9顯示了從龍芽草活性組分純化出的脫鎂葉綠酸a甲酯的核磁共振圖譜。圖10顯示了從龍芽草活性組分純化出的脫鎂葉綠酸a甲酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖11顯示了通過膠束電動(dòng)力學(xué)毛細(xì)管色譜法測定尿中核苷的電泳圖。A，核酸標(biāo)準(zhǔn)品；B，正常對(duì)照；C，陽性對(duì)照；D，龍芽草活性組分治療組。A圖中的1-20的數(shù)字分別代表假尿嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷、5-甲基尿嘧啶核苷、3-甲基尿嘧啶核苷、次黃嘌呤核苷、5-甲基胞嘧啶核苷、2-0-甲基胞嘧啶核苷、N4-乙酰胞嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、內(nèi)標(biāo)、黃嘌呤核苷、N2，N2-二甲基鳥嘌呤核苷、N2-甲基鳥嘌呤核苷、2-0-甲基腺嘌呤核苷、N6-甲基腺嘌呤核苷、1-甲基腺嘌呤核苷、3-甲基胞嘧啶核苷和7-甲基鳥嘌呤核苷。圖12顯示了龍芽草活性組分對(duì)肝組織中的增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白表達(dá)的影響。A，正常對(duì)照組；B，陽性對(duì)照組；C，龍芽草活性組分。Exp I是大鼠肝癌發(fā)生24周時(shí)各組的蛋白表達(dá)；Exp II是大鼠肝癌發(fā)生28周時(shí)各組的蛋白表達(dá)；Exp III是大鼠肝癌發(fā)生56周時(shí)各組的蛋白表達(dá)。β -肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參。各組的蛋白水平通過Alphalmager 2200凝膠記錄系統(tǒng)來定量，以PCNA與β -肌動(dòng)蛋白的表達(dá)比來表示PCNA的表達(dá)水平。圖13顯示了龍芽草活性組分對(duì)肝組織中的p2raflMpl蛋白表達(dá)的影響。A，正常對(duì)照組；B，陽性對(duì)照組；C，龍芽草活性組分治療組。Exp I是大鼠肝癌發(fā)生24周時(shí)各組的蛋白表達(dá)；Exp II是大鼠肝癌發(fā)生28周時(shí)各組的蛋白表達(dá)；Exp III是大鼠肝癌發(fā)生56周時(shí)各組的蛋白表達(dá)。P -肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參。各組的蛋白水平通過Alphalmager 2200凝膠記錄系統(tǒng)來定量，以p21waflMpl與￠-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)比來量化p2raflMpl的表達(dá)水平。所有的數(shù)據(jù)表示為平均值土SD(n = 6)。與未經(jīng)治療的陽性對(duì)照組相比，#p < 0. 05。圖14顯示了龍芽草活性組分對(duì)肝組織中的野生型p53(wt-p53)蛋白表達(dá)的影響。A，正常對(duì)照組；B，陽性對(duì)照組；C，龍芽草活性組分治療組。Exp I是大鼠肝癌發(fā)生24周時(shí)各組的蛋白表達(dá)；Exp II是大鼠肝癌發(fā)生28周時(shí)各組的蛋白表達(dá)；Exp III是大鼠肝癌發(fā)生56周時(shí)各組的蛋白表達(dá)。各組的蛋白水平通過Alphalmager 2200凝膠記錄系統(tǒng)來定量，·3 -肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參。以wt-p53與P -肌動(dòng)蛋白的表達(dá)比來表示wt-p53的表達(dá)水平。所有的數(shù)據(jù)表示為平均值+SD (n = 6)。與未經(jīng)治療的陽性對(duì)照組相比，#p < 0. 05。
具體實(shí)施例方式本申請(qǐng)的第一方面提供了龍芽草(Agrimonia pilosa Ledeb)活性組分,其通過包括下述步驟的方法得到(a)用水提取龍芽草，得到龍芽草的水提取液；(b)將龍芽草的水提取液干燥后，得到的干燥物加入第一有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，隨后去除第一有機(jī)溶劑，收集剩余的物質(zhì)；(C)將步驟(b)得到的物質(zhì)重懸于水中，加入第二有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，將水相過濾后收集濾液；以及(d)將步驟(c)得到的水相濾液，用第三有機(jī)溶劑提取，將水相過濾后收集濾液。在本申請(qǐng)的實(shí)施方案中，第一有機(jī)溶劑是親水性有機(jī)溶劑。在本申請(qǐng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一有機(jī)溶劑是易揮發(fā)的親水性有機(jī)溶劑，優(yōu)選低級(jí)醇類有機(jī)溶劑，包括甲醇、乙醇、丙醇等。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本申請(qǐng)所述的第一有機(jī)溶劑是乙醇，優(yōu)選濃度為50% -100%的乙醇，更優(yōu)選75% -100%的乙醇，最優(yōu)選95%的乙醇。在本申請(qǐng)的實(shí)施方案中，第二有機(jī)溶劑是指由非極性或弱極性分子溶液組成的溶齊U，包括烷烴類如戊烷、己烷、異辛烷等，諸如甲苯的芳香烴類，諸如三氯乙烯的鹵代烴類，以及醚類如乙醚和石油醚等。在本申請(qǐng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二有機(jī)溶劑是醚類，優(yōu)選石油醚。在本申請(qǐng)的實(shí)施方案中，第三有機(jī)溶劑是親脂性的有機(jī)溶劑，且優(yōu)選其極性大于本申請(qǐng)的第二有機(jī)溶劑的極性。在本申請(qǐng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第三有機(jī)溶劑是二氯甲燒。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的龍芽草活性組分含有齊墩果酸、熊果酸和脫鎂葉綠酸a甲酯。在某些實(shí)施方案中，所述龍芽草活性組分為齊墩果酸、熊果酸和脫鎂葉綠酸a甲酯。在某些實(shí)施方案中，脫鎂葉綠酸a甲酯在活性組分中的含量最高。例如，在某些實(shí)施方案中，脫鎂葉綠酸a甲酯占龍芽草活性組分重量的約60 %。在某些實(shí)施方案中，齊墩果酸的含量占龍芽草活性組分重量的約20%。在某些實(shí)施方案中，熊果酸的含量占龍芽草活性組分重量的約20%。在某些實(shí)施方案中，發(fā)明人利用高效液相色譜鑒定了龍牙草活性組分中含有的幾種活性化合物，即齊墩果酸、熊果酸和脫鎂葉綠酸a甲酯。本申請(qǐng)所述的高效液相色譜為反相高效液相色譜。使用的色譜柱為硅膠柱，使用的檢測器為光電二級(jí)管陣列檢測器。在本申請(qǐng)的實(shí)施方案中，反相高效液相硅膠色譜分析使用的流動(dòng)相由甲醇和水組成，或由乙腈和水組成，或由甲醇、乙睛和水組成。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，流動(dòng)相為甲醇、乙睛和水。本申請(qǐng)的另一方面提供了制備龍芽草活性組分的方法，該方法包括如下步驟(a)用水提取龍芽草，得到龍芽草的水提取液；(b)將龍芽草的水提取液干燥后，得到的干燥物加入第一有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，隨后去除第一有機(jī)溶劑，收集剩余的物質(zhì)；(C)將步驟(b)得到的物質(zhì)重懸于水中，加入第二有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，將水相過濾后收集濾液；以及(d)將步驟(C)得到的水相濾液，用第三有機(jī)溶劑提取，將水相過濾后收集濾液。
在本申請(qǐng)的一些實(shí)施方案中，用于提取龍芽草的水的體積為龍芽草重量的5-50倍，優(yōu)選10-30倍，更優(yōu)選10-20倍，最優(yōu)選為15倍。在本申請(qǐng)的一些實(shí)施方案中，將龍芽草粉碎后，在水中浸泡15分鐘至6小時(shí)，優(yōu)選約I小時(shí)至約2小時(shí)，最優(yōu)選地浸泡約2小時(shí)。在本申請(qǐng)的一些實(shí)施方案中，將龍芽草浸泡一定時(shí)間后，在50°C至120°C的溫度下在水中加熱處理I小時(shí)至12小時(shí)，得到提取物溶液，過濾除去不溶于水的組分后即得到龍芽草的水提取液。在本申請(qǐng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，加熱溫度為80°C至100°C，加熱時(shí)間為I小時(shí)至4小時(shí)。在本申請(qǐng)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，將浸泡后的龍芽草在100°C的溫度下煮沸兩次，每次I小時(shí)。在本申請(qǐng)的實(shí)施方案中，加入的第一有機(jī)溶劑與待提取的干燥物的體積重量比為2-10，優(yōu)選為3-6，最優(yōu)選為5。步驟(c)中加入的第二有機(jī)溶劑與重懸物質(zhì)的水的體積比為2-10，優(yōu)選為3-5，最優(yōu)選為3。第三有機(jī)溶劑與待提取的水相濾液的體積比為2-10，優(yōu)選為3-5，最優(yōu)選為3。在本申請(qǐng)的實(shí)施方案中，加入有機(jī)溶劑進(jìn)行提取的次數(shù)為1-6次，優(yōu)選為2-5次，最優(yōu)選為2-3次。本申請(qǐng)的再一方面提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包含龍芽草活性組分和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述龍芽草活性組分通過包括下述步驟的方法得到(a)用水提取龍芽草，得到龍芽草的水提取液；(b)將龍芽草的水提取液干燥后，得到的干燥物加入第一有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，隨后去除第一有機(jī)溶劑，收集剩余的物質(zhì)；(C)將步驟(b)得到的物質(zhì)重懸于水中，加入第二有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，將水相過濾后收集濾液；以及(d)將步驟(C)得到的水相濾液，用第三有機(jī)溶劑提取，將水相過濾后收集濾液。另外地，得到上述龍芽草活性組分的方法還包括下述步驟(e)將步驟(d)得到的水相濾液過色譜柱，進(jìn)行高效液相色譜分析，收集活性成分。本申請(qǐng)所述的“藥學(xué)上可接收的載體”指不干擾活性成分的生物活性有效性的載體。本申請(qǐng)的藥學(xué)上可接受的載體可以為固體或液體，包括藥學(xué)上可接受的賦形劑、緩沖齊U、乳化劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、稀釋劑、封裝劑、填充劑等。例如，藥學(xué)上可接受的緩沖劑進(jìn)一步包括磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽以及碳酸鹽。本申請(qǐng)的藥物組合物可以呈現(xiàn)為單位劑量形式，并且可以通過任一制藥領(lǐng)域公知的方法制備。所有方法都包括將本申請(qǐng)的活性組分與一種或幾種藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合的步驟。通常，通過將活性組分與液體載體、固體載體或二者結(jié)合來制備組合物，隨后根據(jù)需要來定型制備的產(chǎn)物。適于口服的組合物可以是含有預(yù)先確定量的活性組分的諸如膠囊、片劑、錠劑等劑型。其他劑型包括水性懸浮液或諸如糖漿劑、酏劑或乳劑的非水性懸浮液。適于胃腸外給藥的組合物可以是包含活性組分的無菌水性或非水性制劑?？梢愿鶕?jù)已知的方法，使用合適的分散劑或濕潤劑以及懸浮劑制備上述制劑。在可接受的載體或溶劑中，可以使用水、林格氏液以及等滲的氯化鈉溶液。此外，無菌的非揮發(fā)油也可以被方便地用做溶劑或懸浮基質(zhì)。適于經(jīng)口、皮下、靜脈、肌內(nèi)等給藥方式的載體配方可參見雷明頓藥物學(xué)(Remington' s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co. ,Easton,PA)。本申請(qǐng)的另外方面提供了龍芽草活性組分在制備治療肝癌的藥物中的用途，其中所述龍芽草活性組分由包括下述步驟的方法得到(a)用水提取龍芽草，得到龍芽草的水提取液；(b)將龍芽草的水提取液干燥后，得到的干燥物加入第一有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，隨后去除第一有機(jī)溶劑，收集剩余的物質(zhì)；(C)將步驟(b)得到的物質(zhì)重懸于水中，加入第二有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，將水相過濾后收集濾液；以及(d)將步驟(C)得到的水相濾液，用第三有 機(jī)溶劑提取，將水相過濾后收集濾液。優(yōu)選地，還包括下述步驟(e)將步驟(d)得到的水相濾液過色譜柱，進(jìn)行高效液相色譜分析，收集活性成分。本申請(qǐng)還提供了龍芽草活性組分治療肝癌的方法，該方法包括給予患病個(gè)體治療有效量的龍芽草活性組分。本申請(qǐng)所述的“肝癌”指發(fā)生于肝臟的癌癥，包括原發(fā)性肝癌或轉(zhuǎn)移性肝癌。原發(fā)性肝癌按組織學(xué)類型又分為肝細(xì)胞型、膽管細(xì)胞型和混合型，其中肝細(xì)胞癌占我國原發(fā)性肝癌的90%以上。在本申請(qǐng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的肝癌是肝細(xì)胞癌。本申請(qǐng)的龍芽草活性組分或包含龍芽草活性組分與藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物可以通過經(jīng)口、靜脈內(nèi)、經(jīng)腹腔、肌注、經(jīng)直腸或透皮的方式給藥。在本申請(qǐng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，龍芽草活性組分或包含龍芽草活性組分與藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物經(jīng)口給藥。在本申請(qǐng)的實(shí)施方案中，龍芽草活性組分經(jīng)口給藥的日劑量可以是每千克個(gè)體體重5mg-100mg。優(yōu)選地,龍芽草活性組分經(jīng)口給藥的日劑量是每千克個(gè)體體重10mg-50mg。更優(yōu)選地，龍芽草活性組分經(jīng)口給藥的日劑量是每千克個(gè)體體重15mg-30mg，最優(yōu)選地，龍芽草活性組分經(jīng)口給藥的日劑量是每千克個(gè)體體重20mg。本文中，活性組分、活性成分、有效成分以及有效部位可以交替使用，除非另有所指。本申請(qǐng)所述的“個(gè)體”，是指哺乳動(dòng)物，包括但不限于靈長類動(dòng)物、牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓以及諸如大鼠和小鼠的嚙齒類動(dòng)物。貫穿本說明書的說明書和權(quán)利要求書中，詞語“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意圖排除其他部分、添加物、組分、或步驟。應(yīng)該理解，在本申請(qǐng)的特定方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├忻枋龅奶卣?、特性、組分或步驟，可適用于本文所描述的任何其他的方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├?，除非與之矛盾。上述公開內(nèi)容總體上描述了本申請(qǐng)，通過下面的實(shí)施例進(jìn)一步示例本申請(qǐng)。描述這些實(shí)施例僅為說明本申請(qǐng)，而不是限制本申請(qǐng)的范圍。盡管本文中使用了特殊的術(shù)語和值，這些術(shù)語和值同樣被理解為示例性的，并不限定本申請(qǐng)的范圍。實(shí)施例1龍芽草活性組分的提取
將2kg干燥的龍芽草(購自香港中草藥店)切碎，在15倍量(即30升)的水中浸泡2小時(shí)后，在100°C的溫度下于15倍量的水中煮沸兩次，每次I小時(shí)。將水提取液過濾得到的清液用液氮冷凍，并用凍干機(jī)凍干，儲(chǔ)存?zhèn)溆?。將上述得到的干燥物稱重后，加入5倍體積的95%乙醇在室溫下提取三次，合并三次提取液。在40°C下，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士 BUchi公司)將提取液濃縮至干。蒸發(fā)掉乙醇后，將殘留物溶解于水中，并用石油醚(石油醚與水溶液的體積比為3 I)提取兩次。將得到的水相過濾后，濾液再用二氯甲烷(二氯甲烷與與濾液的體積比為3 I)提取三次。將二氯甲烷提取得到的水相過濾后，收集得到的濾液，凍干備用，即為下文提及的龍芽草活性組分。實(shí)施例2肝癌動(dòng)物模型的建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SD大鼠，來自香港中文大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。每只大鼠用化學(xué)致癌劑二乙基亞硝胺每周腹腔注射一次，劑量為200mg/kg體重；同時(shí)用促癌劑四氯化碳每天腹腔注射一次，劑量為lml/kg體重。上述試劑腹腔注射持續(xù)20周，誘導(dǎo)大鼠肝癌的發(fā)生。實(shí)施例3龍芽草提取組分體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理下述所有實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組的動(dòng)物為正常大鼠，每只每天經(jīng)口給予1%的淀粉(lml/kg體重)一次，作為陰性對(duì)照。陽性對(duì)照組的動(dòng)物為患肝癌的大鼠，每只每天經(jīng)口給予1%的淀粉(lml/kg) —次，持續(xù)24周。用龍芽草活性組分治療組的動(dòng)物均為已發(fā)生肝癌的大鼠，經(jīng)口給予來自實(shí)施例1的龍芽草活性組分，一天一次，持續(xù)24周，日劑量為20mg/kg體重。除非特別說明，各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物均為10只。實(shí)驗(yàn)期間，所有動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水。2.樣本的收集和處理在實(shí)驗(yàn)期間，每周一次測量大鼠體重。24周后，通過氮?dú)庵舷⑻幩来笫?，收集血液用于分析血中的肝癌相關(guān)物質(zhì)的含量。用冷的Tris-蔗糖緩沖液快速灌注肝臟，隨后立即將其取出，沖洗后稱重。然后將肝臟切成2mm至3mm厚的切片，一部分迅速冷凍于液氮中，接著儲(chǔ)存在_80°C，用于測量DNA和RNA ;另一部分切片在4%的多聚甲醛溶液中固定24小時(shí)；其余的肝組織用液氮冷凍后儲(chǔ)存在-80°C用于其它分析。3.肝臟腫瘤的數(shù)目和大小通過測量大鼠肝癌發(fā)生24周、28周和56周時(shí)，用龍芽草提取組分治療或沒用龍芽草提取組分治療的大鼠的肝臟腫瘤數(shù)目，來評(píng)估龍芽草提取組分治療肝癌的有效性。大鼠發(fā)生肝癌的第O周、第4周和32周分別給予動(dòng)物淀粉和龍芽草活性組分處理24周，直到第24周、28周和56周時(shí)處死動(dòng)物，取出肝臟以檢測肝臟腫瘤數(shù)目和大小。如表I所示，發(fā)生肝癌的大鼠在僅給予淀粉處理時(shí)，其肝臟在28周時(shí)就出現(xiàn)了 0-5mm大小的腫瘤；56周時(shí)，0-5mm腫瘤的數(shù)目增加到26. 2+5. 8個(gè)，同時(shí)出現(xiàn)了 5_10mm大小的腫瘤5. 2±2· 3個(gè)，以及大于1Omm的腫瘤O. 8+0. 8個(gè)。而用龍芽草活性組分處理的大鼠的肝臟在28周時(shí)沒有出現(xiàn)0-5mm大小的腫瘤；在56周時(shí)，0-5mm腫瘤的數(shù)目僅為18. 2±4· 3個(gè)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于淀粉處理組的數(shù)目(P < O. 05)，同時(shí)5-10mm的腫瘤僅為2. 3±1. 4，也顯著低于淀粉處理組的數(shù)目(P < 0.05)。。
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，龍芽草活性組分治療肝癌的效果顯著，是龍芽草的抗肝癌活性組分。表I龍芽草活性組分對(duì)肝臟腫瘤數(shù)目和大小的影響
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，包含龍芽草(Agrimonia pilosa Ledeb)活性組分和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述龍芽草活性組分通過包括下述步驟的方法獲得(a)用水提取龍芽草，得到龍芽草的水提取液；(b)將龍芽草的水提取液干燥后得到的干燥物，加入第一有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，隨后去除第一有機(jī)溶劑，收集剩余的物質(zhì)；(C)將步驟(b)得到的物質(zhì)重懸于水中，加入第二有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，將水相過濾后收集濾液；以及(d)將步驟(c)得到的水相濾液，用第三有機(jī)溶劑提取，將水相過濾后收集濾液。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一有機(jī)溶劑是親水性的有機(jī)溶劑。
3.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述第一有機(jī)溶劑是低級(jí)醇類有機(jī)溶劑。
4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述第一有機(jī)溶劑是乙醇，優(yōu)選50%-100%的乙醇，更優(yōu)選75 % -100 %的乙醇，最優(yōu)選95 %的乙醇。
5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第二有機(jī)溶劑是弱極性或非極性的有機(jī)溶劑。
6.如權(quán)利要求1或5所述的組合物，其中所述第二有機(jī)溶劑是石油醚。
7.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第三有機(jī)溶劑是親脂性的有機(jī)溶劑。
8.如權(quán)利要求1或7所述的組合物，其中所述第三有機(jī)溶劑是二氯甲烷。
9.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中步驟a)所述提取龍芽草的水的體積為龍芽草重量的5-50倍，優(yōu)選10-30倍，更優(yōu)選10-20倍，最優(yōu)選為15倍。
10.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述第一有機(jī)溶劑與所述干燥物的體積重量比為2-10，優(yōu)選為3-6，最優(yōu)選為5。
11.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中步驟c)所述第二有機(jī)溶劑與重懸所述物質(zhì)的水的體積比為2-10，優(yōu)選為3-5，最優(yōu)選為3。
12.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述第三有機(jī)溶劑與所述水相濾液的體積比為2-10，優(yōu)選為3-5，最優(yōu)選為3。
13.如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述活性組分含有齊墩果酸、熊果酸和脫鎂葉綠酸a甲酯。
14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中脫鎂葉酸酸a甲酯的含量為所述活性組分重量的約60%。
15.龍芽草活性組分在制備治療肝癌的藥物中的用途，其中所述龍芽草活性組分通過包括下述步驟的方法獲得(a)用水提取龍芽草，得到龍芽草的水提取液；(b)將龍芽草的水提取液干燥后，得到的干燥物加入第一有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，隨后去除第一有機(jī)溶劑，收集剩余的物質(zhì)；(C)將步驟(b)得到的物質(zhì)重懸于水中得到水溶液，加入第二有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，將水相過濾后收集濾液；以及(d)將步驟(c)得到的水相濾液，用第三有機(jī)溶劑提取，將水相過濾后收集濾液。
16.如權(quán)利要求15所述的用途，其中所述肝癌是原發(fā)性肝癌或轉(zhuǎn)移性肝癌。
17.如權(quán)利要求16所述的用途，其中所述肝癌是肝細(xì)胞癌。
18.如權(quán)利要求15所述的用途，其中所述龍芽草活性組分以經(jīng)口、靜脈內(nèi)、經(jīng)腹腔、肌注、經(jīng)直腸或透皮的方式給藥。
19.如權(quán)利要求18所述的用途，其中所述龍芽草活性組分經(jīng)口給藥。
20.如權(quán)利要求19所述的用途，其中所述龍芽草活性組分經(jīng)口給藥的日劑量是每千克個(gè)體體重給予5mg-100mg。
21.如權(quán)利要求20所述的用途，其中所述龍芽草活性組分經(jīng)口給藥的日劑量為每千克個(gè)體體重給予20mg。
全文摘要
本申請(qǐng)涉及治療肝癌的龍芽草活性組分，以及包含龍芽草的活性組分和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。本申請(qǐng)還涉及所述活性組分和藥物組合物的制備方法以及所述活性組分在制備用于治療肝癌的藥物中的用途，其中所述活性組分優(yōu)選經(jīng)口給藥。
文檔編號(hào)A61K36/73GK102988517SQ201110273280
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2011年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月15日
發(fā)明者宋景政, 何永成 申請(qǐng)人:香港中文大學(xué)