專利名稱：一種免疫增強貽貝酶解多肽的制備方法及其相應片劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種由貽貝等軟體動物酶解制備免疫增強貽貝酶解多肽和相應片劑的方法。
背景技術(shù)：
貽貝屬軟體動物門、瓣鰓綱、貽貝目、貽貝科，貽貝屬，是海產(chǎn)雙殼貝類，俗稱青口、海紅，素有“海中雞蛋”之稱，其蛋白質(zhì)含有人體需要的 纈氨酸、亮氨酸等8種必需氨基酸，且含量遠高于雞蛋、雞、鴨、魚、奸和肉類。貽貝優(yōu)良的蛋白組成為貽貝深度開發(fā)提供了保證，如新西蘭從貽貝中提取治療風濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)的藥物，俄羅斯專門用貽貝生產(chǎn)一種防動脈粥樣硬化的食品。但是我國貽貝基本停留在帶殼鮮銷、加工成各種冷凍食品、油炸食品和貽貝油等方面，精深加工產(chǎn)品的開發(fā)利用極少。因此，與其它大宗海產(chǎn)品相比而言，貽貝的加工利用率極低，造成了高營養(yǎng)貽貝資源的極大浪費，從而限制了我國貽貝產(chǎn)業(yè)的持續(xù)快速發(fā)展。因此，高效開發(fā)利用貽貝蛋白資源具有廣闊的市場前景和重要的社會意義。近年來，國內(nèi)部分學者對貽貝酶解多肽的制備工藝進行了研究。如中國專利CN102020709A “一種厚殼貽貝抗菌肽及制備方法和用途”即研究了從厚殼貽貝制備抗菌肽的方法及其在飼料中做為添加劑的應用；中國專利CN 101991840A “抗前列腺癌貽貝酶解提取物的制備方法及應用”即研究了利用Alcalase制備抗前列腺癌貽貝酶解提取物的方法及其應用沖國專利CN 101991840A “酶解貽貝蛋白制備降血壓肽的方法”即研究了一種利用堿性蛋白酶酶解貽貝蛋白制備降血壓肽的方法。以上方法利用酶解工藝制備具有特定功效的多肽，但是由于單一酶酶解相對效率較低，從而具有特定功效的多肽得率極低，難以達到產(chǎn)業(yè)化需求。另外，中國專利CN 101991840A “貽貝活性多肽的制備方法”即研究了一種酸性條件下利用真空超聲波反應釜制備貽貝活性多肽的方法，該方法雖然具有工藝簡單，適于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)勢，但是所得酶解產(chǎn)物除含有多肽外，尚含有多糖等多種物質(zhì)，是多種成分的混合物，所得制備物不能直接用于純度要求高的用途中。申請人:在檢索過程發(fā)現(xiàn)我國以貽貝為原料，利用酶解技術(shù)制備免疫增強作用多肽的工藝研究處于空白階段，對于實際可行的酶解工藝尚沒有報道，而以此為原料制備免疫增強型多肽片的制備工藝及配方更是未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種免疫增強貽貝酶解多肽的制備方法，以貽貝為原料，資源豐富，同時制備工藝簡單、制得的免疫增強肽純度高、且具有較高的活性。本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種貽貝多肽片的制備方法，以貽貝蛋白免疫增強肽為原料進行制備，制得的片劑可作為老年人和體弱多病者的日常保健產(chǎn)品，亦可作為術(shù)后病人的醫(yī)用食品。本發(fā)明解決上述第一個技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種免疫增強貽貝酶解多肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟I)以貽貝干粉作為原料，將原料與pH為9. 5 10. 5的甘氨酸-NaOH緩沖液按照Ig 20ml Ig 25ml的重量體積比混合、勻漿，然后調(diào)節(jié)pH值至9. 5 10，得混合液；2)將混合液溫度升至50 55°C攪拌預熱15 20分鐘，按原料質(zhì)量的I. 0% I. 5%分別加入堿性蛋白酶和中性蛋白酶，酶解溫度為50 55°C，酶解時間2 4h ; 3)將所得的酶解產(chǎn)物先經(jīng)滅酶處理，得酶解液，再將酶解液依次經(jīng)脫鹽、濃縮和噴霧干燥，得到免疫增強貽貝酶解多肽。 作為優(yōu)選，所述的步驟I)中的貽貝為紫貽貝、厚殼貽貝或者翡翠貽貝。作為優(yōu)選，所述的步驟I)中的緩沖液的pH為10。再優(yōu)選，所述的步驟2)中的堿性蛋白酶的酶活力彡1.9X104U/g，中性蛋白酶的酶活力彡 4.9X104U/g/g。最后，所述步驟3)中的滅酶處理為將步驟2)所得的酶解產(chǎn)物升溫至95 100°C，并于此溫度保持10 15min，再冷卻至0 10°C以終止酶反應，然后離心，得酶解液；所述步驟3)中脫鹽、濃縮和噴霧干燥的具體過程為將酶解液制成濃度IOmg/ml 20mg/ml的溶液，進行大孔樹脂脫鹽；脫鹽后的酶解液在彡40°C的低溫下進行真空濃縮，得到濃縮酶解液的比重為I. 05 I. 15g/cm3 ;濃縮酶解液在進行溫度為160 200°C下進行噴霧干燥，出口溫度為65 110°C。獲得的貽貝酶解多肽經(jīng)SEC-HPLC試驗表明酶解產(chǎn)物平均分子量為385. 9kDa，分子量(80 2500u)含量為90. 89%。本發(fā)明解決上述第二個技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種免疫增強貽貝酶解多肽片劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟I)以貽貝干粉作為原料，采用上述的酶解技術(shù)制備免疫增強貽貝酶解多肽；2)將制得的酶解多肽與稀釋劑混合均勻，過60 80目篩，加入適量乙醇，將混合物制成軟材，過20 24目篩，制成顆粒狀，再在50 60°C條件下通風干燥，再過18 22目篩，得到制片顆粒；3)在所得制片顆粒中加入適量的崩解劑和潤滑劑，混合均勻，最后在壓片機上壓成片劑，包薄膜衣，即得免疫增強型貽貝多肽片。作為優(yōu)選，所述稀釋劑為微晶纖維和淀粉，所述酶解多肽與微晶纖維和淀粉按照質(zhì)量比I : 0.8 I : 0.3 0.6混合均勻。再優(yōu)選，所述崩解劑為干淀粉，所述潤滑劑為滑石粉；所用干淀粉的量為制片顆粒重量的2. 5% 3. 5%，所用滑石粉的量為制片顆粒重量的1% 2%。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于I、本發(fā)明工藝科學合理，操作簡單，選用堿性蛋白酶和中性蛋白酶作為酶解用酶，通過生物酶解法同時融合大孔樹脂脫鹽和噴霧干燥等手段進行制備，酶解過程易監(jiān)控，使免疫增強肽最大程度地釋放出來，提高原料的利用率，同時制得的免疫增強肽及其片劑具有較高的活性；
2、本發(fā)明采用的原料是貽貝，資源豐富，成本較低，同時可以有效提高貽貝的附加值，對貽貝產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義；3、本發(fā)明所制備的免疫增強肽是貽貝蛋白經(jīng)酶水解制得，安全、無毒副作用，并且免疫增強作用顯著，對老年人、體弱多病者和術(shù)后病人具有良好的保健作用，免疫增強肽可以作為藥品、保健食品、食品、食品添加劑等，本發(fā)明的免疫增強肽片劑可作為老年人和體弱多病者的日常保健產(chǎn)品，亦可作為術(shù)后病人的醫(yī)用食品。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。一種免疫增強貽貝酶解多肽的制備工藝及其片劑制備方法，制備工藝流程如下貽貝干粉一酶解一大孔樹脂脫鹽一噴霧干燥一免疫增強肽一片劑。 具體步驟為I、稱取貽貝脫脂干粉5. Og,加入pH為10的甘氨酸-NaOH緩沖液125mL，于組織搗碎機內(nèi)均質(zhì)5min，用lmol/L HCl將該混和物調(diào)pH值為9. 5，得混和液。2、將混合液溫度升至55°C攪拌預熱，并于攪拌狀態(tài)下保溫20min;然后加入0. 075g堿性蛋白酶(酶活力彡1.9X104U/g)和0. 050g中性蛋白酶(酶活力彡4. 9X IO4U/g)啟動酶解反應，酶解溫度為53 55°C，連續(xù)攪拌，保持反應體系的溫度及pH恒定(溫度為53 55 °C，pH為9. 5)，酶解時間為3h。得酶解產(chǎn)物。3、將步驟2)所得的酶解產(chǎn)物先經(jīng)滅酶處理，得酶解液，所述酶解液依次經(jīng)大孔樹脂脫鹽、濃縮和噴霧干燥，得免疫增強肽。具體實驗為①滅酶將酶解產(chǎn)物于95°C水浴中滅酶lOmin，然后冷卻至10°C ;從而終止酶反應，接著在5000r/min下離心15min,取上清液作為酶解液。②DlOl大孔樹脂脫鹽將酶解液制成質(zhì)量濃度為10mg/ml溶液，加入到DlOl大孔樹脂層析柱，以水洗除酶解液中的鹽及雜質(zhì)，然后用70%乙醇以2. OBV/h的流速將酶解物從DlOl大孔樹脂上解吸下來，低溫((40°C )真空濃縮得酶解液濃縮液。③噴霧干燥噴霧干燥時酶解液比重為I. lg/cm3,進行溫度應為175 180°C,出口溫度應為75 80°C。所得的貽貝酶解多肽經(jīng)SEC-HPLC試驗表明酶解產(chǎn)物平均分子量為385. 9kDa，分子量(80 2500u)含量為90. 89%。將制得的貽貝酶解多肽做小鼠機體的免疫增強作用實驗(對小鼠淋巴細胞增殖能力的影響、對小鼠血清溶血素的影響和對小鼠碳廓清能力的影響)，測定方法參照徐增萊，汪瓊，趙猛等“淮山藥多糖的免疫調(diào)節(jié)作用研究”[記載于《世珍國醫(yī)國藥》，2007年第5期(第I8卷)第1040-041頁]實驗結(jié)果表明貽貝酶解多肽能顯著增強小鼠淋巴細胞增殖能力、促進小鼠抗體生成、增強小鼠碳廓清能力，亦即貽貝酶解多肽對小鼠的體液免疫、細胞免疫功能、非特異性免疫功能都具有一定的增強作用。表I貽貝酶解多肽對小鼠淋巴細胞增殖能力的影響(n = 3)
權(quán)利要求
1.一種免疫增強貽貝酶解多肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟 1)以貽貝干粉作為原料，將原料與PH為9.5 10. 5的甘氨酸-NaOH緩沖液按照Ig 20ml Ig 25ml的重量體積比混合、勻漿，然后調(diào)節(jié)pH值至9. 5 10，得混合液； 2)將混合液溫度升至50 55°C攪拌預熱15 20分鐘，按原料質(zhì)量的I.0% I. 5%分別加入堿性蛋白酶和中性蛋白酶，酶解溫度為50 55°C，酶解時間2 4h ; 3)將所得的酶解產(chǎn)物先經(jīng)滅酶處理，得酶解液，再將酶解液依次經(jīng)脫鹽、濃縮和噴霧干燥，得到免疫增強貽貝酶解多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于所述的步驟I)中的貽貝為紫貽貝、厚殼貽貝或者翡翠貽貝。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于所述的步驟I)中的緩沖液的PH為10。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于所述的步驟2)中的堿性蛋白酶的酶活力彡1.9X104U/g，中性蛋白酶的酶活力彡4.9X104U/g/g。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)中的滅酶處理為將步驟2)所得的酶解產(chǎn)物升溫至95 100°C，并于此溫度保持10 15min，再冷卻至O 10°C以終止酶反應，然后離心，得酶解液； 所述步驟3)中脫鹽、濃縮和噴霧干燥的具體過程為將酶解液制成濃度10mg/ml 20mg/ml的溶液，進行大孔樹脂脫鹽；脫鹽后的酶解液在彡40°C的低溫下進行真空濃縮，得到濃縮酶解液的比重為I. 05 I. 15g/cm3 ;濃縮酶解液在進行溫度為160 200°C下進行噴霧干燥，出口溫度為65 110°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)中所得的貽貝酶解多肽的酶解產(chǎn)物平均分子量為385. 9Da，分子量80 2500Da的含量為90. 89%。
7.一種免疫增強貽貝酶解多肽片劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟 1)以貽貝干粉作為原料，采用權(quán)利I 5中任一的酶解技術(shù)方法制備免疫增強貽貝酶解多肽； 2)將制得的酶解多肽與稀釋劑混合均勻，過60 80目篩，加入適量乙醇，將混合物制成軟材，過20 24目篩，制成顆粒狀，再在50 60°C條件下通風干燥，再過18 22目篩，得到制片顆粒； 3)在所得制片顆粒中加入適量的崩解劑和潤滑劑，混合均勻，最后在壓片機上壓成片齊U，包薄膜衣，即得免疫增強型貽貝多肽片。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于所述稀釋劑為微晶纖維和淀粉，所述酶解多肽與微晶纖維和淀粉按照質(zhì)量比I : 0.8 I : O. 3 O. 6混合均勻。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于所述崩解劑為干淀粉，所述潤滑劑為滑石粉；所用干淀粉的量為制片顆粒重量的2. 5% 3. 5%，所用滑石粉的量為制片顆粒重量的1% 2%。
全文摘要
一種免疫增強貽貝酶解多肽及其相應片劑的制備方法，步驟為以貽貝干粉作為原料，與緩沖液按照1∶20～1∶25的重量體積比混合、勻漿，然后調(diào)節(jié)pH值至9.5～10，得混合液；將混合液溫度升至50～55℃預熱10～15分鐘，按照原料的1.0％～1.5％分別加入堿性蛋白酶和中性蛋白酶，酶解溫度為50～55℃，酶解時間2～4h；將所得的酶解產(chǎn)物先經(jīng)滅酶處理，得酶解液，所述酶解液依次經(jīng)脫鹽、濃縮和噴霧干燥，得免疫增強酶解多肽；本發(fā)明還公開了相關(guān)的免疫增強型貽貝多肽片。本發(fā)明的制備方法簡單，得到的免疫增強肽及其片劑具有較高的活性，同時原料資源豐富，具有較強的工業(yè)實施性。
文檔編號A61K9/20GK102952838SQ20111024664
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月23日
發(fā)明者王斌, 羅紅宇, 馬佳卉, 栗麗 申請人:浙江海洋學院