專利名稱：一種胰島素生物增敏劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，涉及一種胰島素生物增敏劑及其應(yīng)用。具體的，是一種增加胰島素敏感性的多肽，以及該多肽在制備治療胰島素抵抗的藥物中的應(yīng)用。該多肽能特異地結(jié)合胰島素，把細(xì)胞外游離胰島素帶入體細(xì)胞內(nèi)，使得胰島素發(fā)揮功效，治療胰島素抵抗相關(guān)的疾病或綜合癥。
背景技術(shù)：
工業(yè)化提供豐富而廉價(jià)的食品和負(fù)擔(dān)得起的運(yùn)輸方式如汽車等，一直在穩(wěn)步改善和提高人們的生活水平。然而，人們往往吃得過多，體能活動(dòng)過少，從而導(dǎo)致能量攝入和消耗不平衡。多余的能量則轉(zhuǎn)化為多余的脂肪，其結(jié)果是肥胖。肥胖導(dǎo)致骨骼肌、脂肪組織及肝臟脂肪異位堆積，對(duì)胰島素的敏感性及反應(yīng)性降低或喪失，發(fā)展為胰島素抵抗。這時(shí)，胰島β細(xì)胞要分泌更多的胰島素，以彌補(bǔ)胰島素作用能力的不足，從而保證血糖水平正常，由此誘發(fā)β細(xì)胞功能受損，胰島素的分泌能力下降，出現(xiàn)糖耐量損害，直至發(fā)展為II型糖尿病，及其他代謝性疾病如高血壓、脂代謝紊亂、腹型肥胖、非酒精性脂肪肝、老年癡呆、哮喘、某些癌癥等。針對(duì)胰島素抵抗，人們已經(jīng)開發(fā)出數(shù)種胰島素化學(xué)增敏劑，以增加組織細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，使血中葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而減少胰島素的需要量，使現(xiàn)有的胰島素(包括自己分泌的和注射的)發(fā)揮更大的作用，并減少高胰島素血癥的副作用。胰島素化學(xué)增敏劑主要有二類①羅格列酮類Rosiglitazone,包括馬來酸羅格列酮RosiglitazoneMaleate (商品名文迪雅Avandia〈英國(guó)葛蘭素史克〉)，鹽酸羅格列酮(商品名維戈洛〈上海三維〉)，羅格列酮鈉(商品名太羅〈重慶太極〉)，等等。②吡格列酮類Pioglitazone，包括鹽酸吡格列酮(商品名艾可拓Actos〈日本武田〉、艾汀Actins〈北京太洋〉、卡司平〈杭州華東〉、瑞彤〈江蘇恒瑞、德源〉、安可妥〈四川迪康〉)，等等。羅格列酮可通過激活過氧化物酶增殖體受體來減輕胰島素抵抗，同時(shí)改善并保護(hù)胰島β細(xì)胞功能。對(duì)于肥胖或超重并伴有胰島素抵抗的II型糖尿病患者的血糖控制均有明顯效果。然而，Nissen和Wolski在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》上發(fā)表的文章引發(fā)了人們對(duì)羅格列酮心血管安全性的關(guān)注。該文稱服用羅格列酮增加了心肌梗死的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。這樣，被列為胰島素增敏劑的主打品種羅格列酮因長(zhǎng)時(shí)間服用會(huì)增加心肌梗死或中風(fēng)等缺血性心血管意外的風(fēng)險(xiǎn)而備受業(yè)界詬病。美國(guó)FDA權(quán)衡利弊之后在2010年作出了嚴(yán)格限制羅格列酮使用的決定。其實(shí)，這等于宣告了胰島素增敏劑需要重新研究與開發(fā)。盡管DPP-4類腸促胰素引領(lǐng)著II型糖尿病治療理念的變革，胰島素抵抗在II型糖尿病中不解決，促進(jìn)胰島素分泌和增加血液中胰島素的濃度的努力是徒勞無功的，難以達(dá)到預(yù)想的結(jié)果，反而這些措施會(huì)加重胰島素抵抗，最終會(huì)加重糖尿病及其并發(fā)癥。因此，減弱甚至去除胰島素抵抗是II型糖尿病的治療要點(diǎn)。目前全球市場(chǎng)已經(jīng)留下了空白，正等待著這一類新型、劃時(shí)代胰島素增敏類藥物的到來。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決背景技術(shù)中提到的治療胰島素抵抗的藥物的需求，本發(fā)明的技術(shù)目的在于提供一種新的胰島素生物增敏劑。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下。一、本發(fā)明的新的胰島素生物增敏劑的設(shè)計(jì)原理。胰島素自從胰島P細(xì)胞分泌后，進(jìn)入血液。在心臟搏 動(dòng)下，胰島素通過血液循環(huán)流動(dòng)到各個(gè)臟器組織。通過這些組織細(xì)胞表面的特殊蛋白受體(胰島素受體)，胰島素與之結(jié)合后激活胰島素信號(hào)傳達(dá)系統(tǒng)而發(fā)揮其生物活性效應(yīng)。胰島素受體是一種酪氨酸特異蛋白激酶。胰島素與其受體結(jié)合，可以促進(jìn)受體的自身磷酸化，也就是將高能磷酸化合物的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移并結(jié)合于￠-亞基的酪氨酸殘基上。此一活化的受體可以轉(zhuǎn)移信息到下游信號(hào)通路而放大其活性效應(yīng)。因此，靶細(xì)胞表面的胰島素受體決定著胰島素生物活性效應(yīng)的強(qiáng)弱。胰島素受體屬于受體酪氨酸激酶家族。胰島素受體(和有關(guān)的IGF-I受體)有一個(gè)二硫鍵相連的二聚體結(jié)構(gòu)，有兩個(gè)細(xì)胞外a亞基(含有胰島素結(jié)合區(qū)域)和兩個(gè)跨膜P亞基(含有酪氨酸激酶激活位點(diǎn))。胰島素受體是糖基化程度高的模塊化結(jié)構(gòu)。每個(gè)單體從N到C -末端先后含有兩個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)大領(lǐng)域(LI和L2，由富含半胱氨酸(CR)的區(qū)域聯(lián)系)，隨后三個(gè)III型纖維連接蛋白區(qū)(FnIII-1 to 3)。一個(gè)胰島素受體只高親和力地結(jié)合于一個(gè)胰島素分子，但另外至少有一個(gè)，也許有額外的兩個(gè)分子以低親和力結(jié)合。胰島素受體有兩個(gè)主要的胰島素結(jié)合位點(diǎn)站點(diǎn)I和站點(diǎn)2，分別位于LI和FnIII-I功能區(qū)域。FnIII-2的C-端(CT)的12種氨基酸小肽段有輔助結(jié)合位點(diǎn)I的作用，雖然它相距于a亞基主要序列甚遠(yuǎn)。這些功能區(qū)域在胰島素受體的非游離狀態(tài)下使胰島素能夠發(fā)揮正常功效。本申請(qǐng)發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，游離狀態(tài)的胰島素受體低親和力地結(jié)合胰島素。這種低親和力結(jié)合可能能夠降低胰島素的功效。故而，游離胰島素受體的增加似乎與糖尿病病人的血糖升高有關(guān)。本申請(qǐng)發(fā)明人最近的結(jié)果表明，細(xì)胞外段可溶性胰島素受體與免疫球蛋白的Fe(244個(gè)氨基酸)或伽瑪鏈(103個(gè)氨基酸)的C-端恒定區(qū)表達(dá)的融合蛋白明顯提高可溶性胰島素受體對(duì)胰島素的親和力。胰島素受體細(xì)胞外區(qū)域與來自于釀酒酵母轉(zhuǎn)錄激活因子GCN4的33亮氨酸殘基鎖鏈的融合表達(dá)，可使其與胰島素的親和力達(dá)到野生型胰島素受體相當(dāng)?shù)乃健Ｕf明細(xì)胞外區(qū)域的構(gòu)象變化決定其受體的高親和力。二、基于上述原理，本發(fā)明提供了一種新的胰島素生物增敏劑，具體是將胰島素結(jié)合序列InBPl或InBP2與人免疫球蛋白4的Fe片段融合表達(dá)得到的融合蛋白InBP-polyG-IgG4Fc ;其中所述的胰島素結(jié)合序列InBPl具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，其氨基酸序列示于SEQ ID N0:2;所述的胰島素結(jié)合序列InBP2具有SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列，其氨基酸序列示于SEQ ID N0:4。三、本發(fā)明所述的胰島素生物增敏劑的制備方法為
(I)為使游離胰島素受體能夠高親和力地結(jié)合胰島素，并讓游離胰島素發(fā)揮生物效應(yīng)，將胰島素受體的胰島素結(jié)合序列InBPl或InBP2與人免疫球蛋白4的Fe片段通過polyG連接并融合表達(dá)；在InBP的N-端融合加入人生長(zhǎng)激素(hGH)分泌信號(hào)前導(dǎo)肽，并且在InBP分子和IgG4Fc分子之間引入富含甘氨酸序列(PolyG)，以保證InBP與受體結(jié)合所需的空間，得到融合分子hGH-InBP-polyG-IgG4Fc (見附圖
I)。整個(gè)完整的多肽(hGH-InBPl-polyG-IgG4Fc)的核苷酸序列示于SEQ ID NO :5，其氨基酸序列如SEQ ID NO 6所示；同理，整個(gè)完整的多肽(hGH-InBP2-polyG-IgG4Fc)的核苷酸序列示于SEQ ID NO :7，其氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。其中，所述的InBPl和InBP2為
InBP I :Arg-Leu-Phe-Phe-Asn-Tyr-Ala-Leu-Val_IIe-PheοInBP 2 :Phe-Glu-Asp-Tyr-Leu-His-Asn-Val-Val-Phe-Val。其中，所述的人免疫球蛋白4的Fe片段為 Thr-Lys-Thr-Tyr-Thr-Cys-Asn-Val-Asp-His-Lys-Pro-Ser-Asn-Thr-Lys-Val-Asp-、Lys-Arg-Val-Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro-CyS-Pro-Ala-Pro-Pro-Ala-AIa-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys-Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-IIe-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Val-Thr-Cys-Val-Val-Val-Asp-Val-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-Val-Gln-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe-Ala-Ser-Thr-Tyr-Arg-Val-Val-Ser-Val-Leu-Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys-Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-IIe-Glu-Lys-Thr-IIe-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Met-Thr-Lys-Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Leu-Val-Lys-Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-Asn-Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Phe-Phe-Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phe-Ser-Cys-Ser-Val-Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Leu-Gly-Lys o其中，所述的hGH為
Met-Pro-Leu-Trp-Val-Phe-Phe-Phe-Val-Ile-Leu-Thr-Leu-Ser-Asn-Ser-Ser-His-CyS-Ser-Thr-Gly0其中，所述的poIyG為 Glu-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Glyο (2)融合分子hGH-InBP-polyG-IgG4Fc在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)分泌前其hGH前導(dǎo)肽被蛋白酶直接切除。因此，表達(dá)分泌后純化獲得的融合蛋白只有三個(gè)部分InBP-PolyG-IgG4Fc。胰敏素的三個(gè)部分的功能和效應(yīng)是各不相同的=InBP與胰島素結(jié)合；PolyG給予InBP空間結(jié)合胰島素；IgG4Fc可穩(wěn)定整個(gè)融合分子并與A蛋白特異親和，協(xié)助融合蛋白的分離純化。本發(fā)明所述的胰島素生物增敏劑InBP-PolyG_IgG4Fc可以從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中提取純化；可以提高胰島素進(jìn)入效應(yīng)細(xì)胞，改善胰島素的生物效應(yīng)?？梢詰?yīng)用于胰島素抵抗的治療。四、本發(fā)明所述的胰島素生物增敏劑在制備治療胰島素抵抗藥物中的應(yīng)用。其中，所述的治療胰島素抵抗藥物具體包括治療肥胖癥、I型糖尿病、II型糖尿病、心血管疾病、非酒精性脂肪肝、老年癡呆癥、癌癥以及老化加速的藥物。五、本發(fā)明所述的胰島素生物增敏劑修飾后在制備治療胰島素抵抗藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明所述的胰島素生物增敏劑InBP-PolyG_IgG4Fc命名為InSA(insulin signalingactivator，胰島素增敏素，簡(jiǎn)稱胰敏素)。本發(fā)明所述的胰敏素與胰島素結(jié)合，使胰島素繞過有胰島素抵抗的胰島素受體而進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，從而激活胰島素通路而使胰島素發(fā)揮正常功效。已經(jīng)檢測(cè)胰島素通路被胰敏素激活五倍以上，這樣就可以減少五倍以上的胰島素用量，從而消除胰島素誘導(dǎo)胰島素抵抗的副作用。胰敏素是三種人自身蛋白的組合，注射或口服入體內(nèi)后相互不脫離，可經(jīng)過正常代謝降解失效，因此，無毒副作用。
本發(fā)明所述的胰敏素有十大優(yōu)點(diǎn)與創(chuàng)新之處
I)胰敏素是本申請(qǐng)發(fā)明人經(jīng)過十余年的艱苦奮斗而制成的高、精、尖科研成果。它與胰島素結(jié)合，使胰島素繞過有胰島素抵抗的胰島素受體而進(jìn)入靶標(biāo)細(xì)胞內(nèi)，從而激活胰島素通路而使胰島素發(fā)揮正常功效。2)在胰島素缺乏的I型糖尿病病人，胰敏素與胰島素并用，顯著減少胰島素用量。而肥胖和II型糖尿病病人，因已有高胰島素血癥，不需要并用胰島素，單用胰島素增敏素就可以達(dá)到降低血糖的目的。3)胰敏素能很好控制血糖，能調(diào)控脂代謝紊亂、降血壓及改善血管內(nèi)皮功能、抗炎、抗凝等作用?？梢詼p少大血管病變的危險(xiǎn)因素，以降低糖尿病大血管病變的發(fā)生率，延緩2型糖尿病出現(xiàn)并發(fā)癥的時(shí)間，改善患者生活質(zhì)量。4)胰敏素能夠減少胰島素用量，這樣減少胰島素對(duì)機(jī)體細(xì)胞的危害作用，增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞的抗氧化及抗衰老機(jī)能。5)胰敏素減少胰島素的用量，減弱胰島素對(duì)異位脂肪堆積的刺激效果，從而降低胰島素抵抗的誘導(dǎo)效果，是II型糖尿病和肥胖理想的治療劑。6)胰敏素在治療多囊卵巢綜合征、降低尿白蛋白排泌等方面預(yù)期有強(qiáng)大的治療效果。7)效果好已經(jīng)檢測(cè)器官特異的胰島素通路被胰敏素激活五倍以上，這樣就可以減少五倍以上的胰島素用量。長(zhǎng)期使用無胰島素抵抗副作用的誘導(dǎo)發(fā)生。8)副作用無或低胰敏素是三種蛋白的組合，注射入體內(nèi)后相互不脫離，可經(jīng)過正常代謝降解失效。說明書附圖
圖I是本發(fā)明所述胰島素生物增敏劑的分子設(shè)計(jì)與構(gòu)建原理圖。圖2是本發(fā)明所述胰島素生物增敏劑增強(qiáng)肝細(xì)胞胰島素對(duì)Akt的激活作用。備注于lclc7細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入0. I nm胰島素和/或0. I nM本發(fā)明所述胰島素生物增敏劑作用I分鐘后，肝細(xì)胞裂解于4°C。4 20%梯度膠SDS-PAGE電泳分析檢測(cè)磷酸化和總Akt。圖3是本發(fā)明所述胰島素生物增敏劑明顯增強(qiáng)胰島素對(duì)肝細(xì)胞的激活作用。備注于肝腫瘤lclc7細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入0. Inm胰島素與胰敏素共同或單獨(dú)作用I分鐘后，肝細(xì)胞裂解于4°C。4 20%梯度膠SDS-PAGE電泳分析，掃描后，計(jì)算激活的Akt蛋白占總蛋白的相對(duì)含量。實(shí)驗(yàn)表明0. InM胰島素不明顯激活肝細(xì)胞Akt，然而，在O.InM胰敏素的共同作用下，O. InM胰島素激活A(yù)kt五倍左右(數(shù)據(jù)來自于三次類似的實(shí)驗(yàn)，P值小于O. 001,差別非常顯著)。圖4是本發(fā)明所述胰島素生物增敏劑降低高脂喂養(yǎng)鼠血糖。備注高脂飲食(Research Diets no. D12330:每100卡路里中有58. O卡來自于脂肪，16. O卡蛋白，26卡碳水化合物)喂養(yǎng)C57BL/6鼠4周，斷尾靜脈測(cè)血糖后繼續(xù)高脂喂養(yǎng)，同時(shí)腹腔內(nèi)注射胰敏素(10mg/kg，每日一次)連續(xù)14日，斷尾靜脈檢測(cè)血糖一次。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I胰敏素融合蛋白的表達(dá)I) hGH-InBP-polyG-IgG4Fc 整合質(zhì)粒的構(gòu)建
把人生長(zhǎng)激素分泌肽-胰島素高親和力結(jié)合序列-富含甘氨酸序列(PolyG)-人免疫球蛋白4的Fe片段融合表達(dá)的融合蛋白哺乳動(dòng)物表達(dá)體系。首先，體外合成人生長(zhǎng)激素分泌肽的正向鏈hGH-F和反向互輔鏈hGH-R。hGH-F
GCGGAATTCACCATGCCACTCTGGGTGTTCTTCTTTGTGATCCTCACCCTCAGCAACAGCTCCCACTGCTCCACCGGT。hGH-R
ACCGGTGGAGCAGTGGGAGCTGTTGCTGAGGGTGAGGATCACAAAGAAGAACACCCAGAGTGGCATGGTGAATTCCGC。其次，設(shè)計(jì)胰島素高親和力結(jié)合序列的正向鏈InBP-F和反向互輔鏈InBP-R。這二對(duì)重復(fù)寡核苷酸在體外進(jìn)行退火和磷酸化處理后，加上PolyG三片段連接入pEGFP-Nl (購(gòu)自Clontech)位點(diǎn)之間，構(gòu)建成功p208_InBP表達(dá)載體。InBP-F
GCTCCACCGGTTTTGAGGATTACCTGCACAACGTGGTTTTCGTCCTCGAGGGATCCGCG。InBP-R
CGCGGATCCCTCGAGGACGAAAACCACGTTGTGCAGGTAATCCTCAAAACCGGTGGAGCo)人免疫球蛋白4Fc段的表達(dá)
為構(gòu)建人免疫球蛋白4Fc段的表達(dá)載體，體外合成正向引物h4FcF和反向引物h4FcR。h4FcF
gcgGGATCCggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcACGAAGACCTACACCTGCAACG
TAG。h4FcR gcgGGTACCTCATTTACCCAGAGACAGGGAGAG。以來自于健康人的外周血淋巴細(xì)胞的cDNA (來自于南京醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系)為模版，應(yīng)用PCR法(條件為94°C 30秒，54°C 30秒，68°C 2. 5分，共50循環(huán))擴(kuò)增出人IgG4/Fc片段。IgG4/Fc擴(kuò)增片段用限制性內(nèi)切酶漢3ΜΠ和式酶切。同時(shí)，將p208-InBP表達(dá)載體用限制性內(nèi)切酶漢3ΜΠ和治I酶切。膠提純化后將雙酶切處理的PCR擴(kuò)增片段亞克隆到質(zhì)粒p208-InBP的和治位點(diǎn)之間。構(gòu)建成p208_InSA質(zhì)粒。至此胰敏素融合蛋白哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建完成。
實(shí)施例2胰敏素穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立
為獲得胰敏素(InSA)融合蛋白的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，本實(shí)施例首先將構(gòu)建的整合質(zhì)粒p208-InSA轉(zhuǎn)染入CHO-Kl細(xì)胞(購(gòu)自ATCC)中。哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO-Kl細(xì)胞在35 mm細(xì)胞培養(yǎng)板中在完全培養(yǎng)基(DMEM) 37°C和5%C02下培養(yǎng)過夜。利用Lipofectamine 2000 (購(gòu)買自Invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑，將p208-InSA質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入CHO-Kl細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到100 mm培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。然后，將培養(yǎng)基更換為G418 (1000 μ g/mL)篩選培養(yǎng)基。待對(duì)照組細(xì)胞無存活細(xì)胞后更換為低G418 (100yg/mL)培養(yǎng)基。維持培養(yǎng)2-4周后仔細(xì)挑選細(xì)胞克隆。細(xì)胞在12孔板中培養(yǎng)4周后，每孔抽取I μ L培養(yǎng)上清，應(yīng)用HRP標(biāo)記羊抗人IgG抗體，進(jìn)行Dot-blot免疫 印跡快速分析。挑選密度較低而斑點(diǎn)信號(hào)相對(duì)較強(qiáng)的孔中的細(xì)胞克隆作為穩(wěn)定、高效表達(dá)的細(xì)胞株。實(shí)施例3胰敏素融合蛋白的放大化制備方法
篩選出的穩(wěn)定高效表達(dá)細(xì)胞株繼續(xù)放大培養(yǎng)直到10 Cm培養(yǎng)皿中。液氮、-80°c分別保存后再放大培養(yǎng)直到IOc m培養(yǎng)皿中100%鋪滿。然后，將細(xì)胞以便I X 106/mL密度轉(zhuǎn)移到250 mL滾瓶培養(yǎng)瓶中，以37°C，5%C02，120轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到6 X IO6/mL后，細(xì)胞轉(zhuǎn)移到IL滾瓶培養(yǎng)瓶中，同樣條件下培養(yǎng)直至細(xì)胞不再明顯增長(zhǎng)為止(約一周左右)。低溫下離心細(xì)胞懸液，留存細(xì)胞培養(yǎng)上清，進(jìn)行SDS-PAGE和免疫印跡分析鑒定，同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清于_80°C條件下冷凍干燥保存。實(shí)施例4胰敏素融合蛋白的純化制備方法
將實(shí)施例3的冷凍干燥品在4°C下用PBS溶解，通過O. 45 μ m濾膜過濾。按I: I體積比與4°C預(yù)冷的抗體結(jié)合液體(I. 5 M Glycine/NaOH, 3 M NaCl, pH 9.0)制成30 L胰敏素融合蛋白粗制品。將所有粗制品以I mL/min的速度穩(wěn)定通過含有5mL蛋白A-瓊脂糖凝膠的抗體純化柱。再用相同體積洗滌液通過純化柱以充分洗滌使UV檢測(cè)洗滌峰值達(dá)到基本值。然后，用PH6. 8的溫和洗脫緩沖液洗脫抗體純化柱，同時(shí)，密切鑒測(cè)洗脫液的UV檢測(cè)峰值。在其峰值即將抬高時(shí)，以ImL每管收集洗脫峰值最大的洗脫液。合并后對(duì)PBS緩沖液，4°C條件下透析過夜，再脫水濃縮。然后，經(jīng)冷凍干燥，制成粉針劑。試驗(yàn)驗(yàn)證的設(shè)計(jì)
I)、胰敏素融合蛋白提高肝細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性
取IXlO6鼠lclc7肝細(xì)胞(購(gòu)自美國(guó)ATCC)鋪板于12孔板中，過夜后暴露于無血清培養(yǎng)基4小時(shí)。於lclc7細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入0. Inm胰島素和/或0. InM胰敏素作用I分鐘后，肝細(xì)胞裂解于4°C。4-20%梯度膠SDS-PAGE電泳分析檢測(cè)磷酸化和總Akt (圖2)。掃描后，計(jì)算激活的Akt蛋白占總蛋白的相對(duì)含量。實(shí)驗(yàn)表明0. InM胰島素不明顯激活肝細(xì)胞Akt，然而，在0. InM胰敏素的共同作用下，0. InM胰島素激活A(yù)kt升高五倍左右(資料來自于三次類似的實(shí)驗(yàn)，P值小于0. 001，差別非常顯著)(圖3)。2)胰敏素降低高脂喂養(yǎng)鼠血糖
C57BL/6小鼠(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院)(30個(gè)，n=9)飲用高脂飲食(Research Diets no.D12330:每100卡路里中有58. O卡來自于脂肪，16. O卡蛋白，26卡碳水化合物)4周，斷尾靜脈測(cè)血糖后繼續(xù)高脂喂養(yǎng)，同時(shí)腹腔內(nèi)注射胰敏素(10 mg/kg,每日一次)連續(xù)14日。斷尾靜脈檢測(cè)血糖一次。胰敏素融合蛋白注射DIO小鼠的血糖濃度顯著低于未處理組(P〈0. 01，Ρ〈0· 05)(圖 4)。
權(quán)利要求
1.一種胰島素生物增敏劑，其特征在于其是將胰島素結(jié)合序列InBPl或InBP2與人免疫球蛋白4的Fe片段融合表達(dá)得到的融合蛋白InBP-polyG-IgG4Fc ;其中所述的胰島素結(jié)合序列InBPl具有SEQ ID NO : I所示的核苷酸序列，其氨基酸序列示于SEQ ID NO :2 ;所述的胰島素結(jié)合序列InBP2具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，其氨基酸序列示于SEQ IDNO :4。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的胰島素生物增敏劑，其特征在于其制備方法為 (1)將胰島素受體的胰島素結(jié)合序列InBPl或InBP2與人免疫球蛋白4的Fe片段通過PolyG連接并融合表達(dá)；在InBP的N-端融合加入hGH分泌信號(hào)前導(dǎo)肽，并且在InBP分子和IgG4Fc分子之間引入PolyG，以保證InBP與受體結(jié)合所需的空間，得到融合分子hGH-InBP-polyG-IgG4Fc，其具有SEQ ID NO :5或者SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列，其氨基酸序列示于SEQ ID NO 6或者SEQ ID NO 8 ； (2)融合分子hGH-InBP-polyG-IgG4Fc在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)后直接切除hGH前導(dǎo)肽，得到InBP-polyG-IgG4Fc融合蛋白。
3.權(quán)利要求I所述的胰島素生物增敏劑在制備治療胰島素抵抗藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的治療胰島素抵抗藥物包括治療肥胖癥、I型糖尿病、II型糖尿病、心血管疾病、非酒精性脂肪肝、老年癡呆癥、癌癥以及老化加速的藥物。
5.權(quán)利要求I所述的胰島素生物增敏劑修飾后在制備治療胰島素抵抗藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，涉及一種胰島素生物增敏劑及其應(yīng)用。具體的，是一種增加胰島素敏感性的多肽，以及該多肽在制備治療胰島素抵抗的藥物中的應(yīng)用。該多肽能特異地結(jié)合胰島素，把細(xì)胞外游離胰島素帶入體細(xì)胞內(nèi)，使得胰島素發(fā)揮功效，治療胰島素抵抗相關(guān)的疾病或綜合癥。如糖尿病、肥胖、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、心臟病、老化、老年癡呆、癌癥等等。也可用于預(yù)防和延緩這些疾病或病癥的發(fā)生與發(fā)展。
文檔編號(hào)A61P1/16GK102718870SQ20111013475
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2011年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月24日
發(fā)明者劉輝宇, 鄒敏旭 申請(qǐng)人:南京美博生物科技有限公司, 馬鞍山中美德康生物科技有限公司