專利名稱：：一種雙重靶向腫瘤的納米脂質(zhì)體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開(kāi)了一種靶向腫瘤的納米脂質(zhì)體及其制備方法。
背景技術(shù)：
：近年來(lái)惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢(shì)，已經(jīng)成為威脅人類健康和生命的主要疾病。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)的報(bào)道顯示，1975年到2000年間，全球癌癥病例數(shù)增長(zhǎng)了一倍，每年新發(fā)病例約1200萬(wàn)，死亡患者超過(guò)700萬(wàn)。2010年癌癥將躍居為全球的首要死因，2030年腫瘤患者人數(shù)將為現(xiàn)在的三倍，新發(fā)病例數(shù)將增至2000-2600萬(wàn)?；熓菒盒阅[瘤綜合治療中的主要手段之一，合理的化療策略可顯著延長(zhǎng)腫瘤患者的生存時(shí)間，極大改善患者的生存質(zhì)量。但目前常用的各種化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞也可能造成巨大的損傷。毒副反應(yīng)的出現(xiàn)往往是限制藥物劑量和使用的直接原因，其產(chǎn)生主要與化療藥物缺乏靶向性有關(guān)，某些毒副反應(yīng)的產(chǎn)生也與藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)行為欠佳及藥物輔劑毒性相關(guān)。因此新型化療藥物的研發(fā)成為目前腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。脂質(zhì)體是一種主要由磷脂和/或膽固醇構(gòu)成的類似于生物膜雙分子層的囊泡狀結(jié)構(gòu)，由于磷脂分子具有一個(gè)親水性的頭部和兩條疏水性的尾部，因此脂質(zhì)體在水中平衡后具有雙親性質(zhì)，既可用于包封脂溶性藥物也可包封水溶性藥物。脂質(zhì)體有良好的組織相容性，且無(wú)毒無(wú)害，無(wú)免疫原性，因此其作為藥物載體的研究越來(lái)越受到重視，這方面的發(fā)展十分迅速。目前，許多學(xué)者開(kāi)始致力于腫瘤靶向給藥系統(tǒng)的研發(fā)。靶向給藥系統(tǒng)即靶向制劑，是指借助一定的載體將藥物通過(guò)局部、胃腸道或血液循環(huán)給藥而選擇性地濃集于靶器官、靶組織、靶細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的制劑。與普通制劑相比，腫瘤靶向制劑可以提高化療藥物的療效，降低藥物毒副作用，提高用藥的安全性、有效性和可靠性。針對(duì)腫瘤的特異性靶點(diǎn)眾多，其中腫瘤血管是目前公認(rèn)最佳的靶點(diǎn)，這與腫瘤及腫瘤血管的特性有關(guān)。實(shí)體瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有賴于血管的生成，腫瘤的生長(zhǎng)分為兩期無(wú)血管期和血管期。在無(wú)血管期，腫瘤主要依靠周?chē)M織的彌散來(lái)獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和排泄代謝產(chǎn)物，瘤體直徑一般不超過(guò)l-2mm;而到血管期，腫瘤內(nèi)出現(xiàn)新生血管，并獲得進(jìn)一步生長(zhǎng)的能力，腫瘤從而迅速生長(zhǎng)并可發(fā)生轉(zhuǎn)移。采用腫瘤新生血管作為靶點(diǎn)有諸多優(yōu)勢(shì)(Holig,P.，etal.，NovelRGDlipopeptidesforthetargetingofliposomestointegrin-expressingendothelialandmelanomacells.ProteinEngDesSel，2004.17(5):p.433-41)，如藥物可避開(kāi)內(nèi)皮細(xì)胞的屏障直接到達(dá)靶區(qū)，局部血管的破壞可影響依賴其血供的許多腫瘤細(xì)胞，腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞不易產(chǎn)生耐藥等。對(duì)于實(shí)體瘤來(lái)說(shuō)，藥物直接導(dǎo)入腫瘤組織非常困難(Hambley，Τ.W.andW.N.Halt,Isanticancerdrugdevelopmentheadingintherightdirection？CancerRes,2009.69(4)p.1259-62.)，原因與腫瘤血管功能失常，血液灌注不良及腫瘤組織中淋巴組織功能異常，月中瘤組織間壓增高(Jain,R.K.,Transportofmolecules,particles,andcellsinsolidtumors.AnnuRevBiomedEng，1999.1:p.241-63.)，影響了藥物從血管中的滲入有關(guān)。腫瘤血管的另一個(gè)特性是通透性增高，這在一定程度上似乎可以彌補(bǔ)藥物難以滲入腫瘤組織的問(wèn)題，但實(shí)際上這種方式并不十分有效，藥物通過(guò)通透性增高的血管內(nèi)皮進(jìn)入腫瘤組織是粒徑依賴性的，且不同的腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高的程度不同(Maeda，H.，etal.，Tumorvascu1arpermeabi1ityandtheEPReffectinmacromoleculartherapeuticsareview.JControlRelease，2000.65(1-2):p.271-84.，Iyer,A.K.，etal.，Exploitingtheenhancedpermeabilityandretentioneffectfortumortargeting.DrugDiscovToday,2006.11(17-18):p·812-8.，Sugahara，K.N.,etal.,Tissue-penetratingdeliveryofcompoundsandnanoparticlesintotumors.CancerCell,2009.16(6)p.510-20.)。主動(dòng)靶向血管的治療則可以避免上述問(wèn)題，進(jìn)入血液循環(huán)的靶向藥物可直接和靶點(diǎn)相結(jié)合，在腫瘤組織局部的血管中濃聚，局部增高的藥物濃度也進(jìn)一步有利于藥物滲入腫瘤組織的內(nèi)部。腫瘤血管破壞后，接受其血供的腫瘤細(xì)胞將繼發(fā)死亡，因而藥物無(wú)須進(jìn)入腫瘤組織的內(nèi)部即可發(fā)揮作用。同時(shí)，針對(duì)腫瘤血管的靶向分子許多也在腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，因此主動(dòng)靶向血管的藥物可同時(shí)對(duì)血管內(nèi)皮和腫瘤細(xì)胞起作用。由于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞在微環(huán)境的作用下呈異質(zhì)性，不同類型的腫瘤中其表達(dá)的抗原和受體種類和數(shù)量不同，相同的配體或抗體與不同類型腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的親和力也有較大的差異，目前尚未發(fā)現(xiàn)一種靶分子可以高特異性、高親和力地識(shí)別多種腫瘤。因此，設(shè)想采用雙靶點(diǎn)策略來(lái)進(jìn)一步提高多肽與血管內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的特異性識(shí)別和結(jié)合能力。理論上連接雙靶點(diǎn)多肽的藥物載體較連接單靶點(diǎn)多肽的藥物載體有諸多優(yōu)勢(shì)。由于細(xì)胞表面抗原或受體的數(shù)量決定了靶向藥物載體的定向釋藥能力(Park，J.W.，etal.，Anti-HER2immunoIiposomesenhancedefficacyattributabletotargeteddelivery.ClinCancerRes,2002.8(4):p.1172-81.)，雙靶點(diǎn)藥物載體能夠增加可識(shí)別的細(xì)胞數(shù)，進(jìn)而增加藥物載體與細(xì)胞的結(jié)合量；雙靶位同時(shí)結(jié)合可增強(qiáng)藥物載體與細(xì)胞間的結(jié)合能力，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)藥物的攝取；雙靶點(diǎn)策略可降低藥物對(duì)非靶向細(xì)胞的毒性(Saul，J.Μ.，Α.V.Annapragada，andR.V.Bellamkonda，Adual—ligandapproachforenhancingtargetingselectivityoftherapeuticnanocarriers.JControlRelease,2006.114(3)p.277-87.)；此外還可通過(guò)兩種不同的機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤的作用等。關(guān)于雙靶點(diǎn)藥物載體的研究甚少，能檢索到的文獻(xiàn)報(bào)道如下=McAteer等將血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1和P-選擇素連接于氧化鐵顆粒用于粥樣硬化動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的磁共振顯像(McAteer,Μ.A.，etal.，Magneticresonanceimagingofendothelialadhesionmoleculesinmouseatherosclerosisusingdual-targetedmicroparticlesofironoxide.ArteriosclerThrombVascBiol,2008.28(1):p.77-83.)0表面連接整合素配體和半乳凝素特異多肽的脂質(zhì)藥物載體可增強(qiáng)磁共振造影劑的顯像能力，還可用于提高抗腫瘤藥物的療效(Kluza,Ε.,etal.,Synergistictargetingofalphavbeta3integrinandgalectin—1withheteromultivalentparamagneticliposomesforcombinedMRimagingandtreatmentofangiogenesis.NanoLett,2010.10(1):p.52—8.)。3VEGF—2禾口^合素ανβ3抗體的微泡可增強(qiáng)卵巢癌移植瘤模型中腫瘤血管的超聲成像能力(Willmarm，J.K.,etal.,Dual-targetedcontrastagentforUSassessmentoftumorangiogenesisinvivo.Radiology,2008.248(3):p.936-44.)。連接葉酸分子和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體抗體的阿霉素脂質(zhì)體及連接aCD19和aCD20雙抗體的阿霉素脂質(zhì)體被證實(shí)具有很好的月中瘤細(xì)胞毒作用(Laginha，K.，D.Mumbengegwi,andΤ.Allen，Liposomestargetedviatwodifferentantibodies:assay，B—cellbindingandcytotoxicity.BiochimBiophysActa,2005.1711(1):p.25-32.)。上述試驗(yàn)均將制備的雙靶點(diǎn)藥物載體與單靶點(diǎn)藥物載體進(jìn)行比較，結(jié)果顯示雙靶點(diǎn)藥物有更好的腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合力，從實(shí)踐上證實(shí)了雙靶點(diǎn)策略的可行性。深入分析上述研究可以發(fā)現(xiàn)，上述雙靶點(diǎn)藥物載體有一共同點(diǎn)，即研究者均將不同的獨(dú)立的靶分子以一定比例混合后直接連接于藥物載體表面。由于靶分子的有效連接數(shù)量與載藥顆粒的靶向能力相關(guān)，故在載藥顆粒表面積有限的情況下，載體表面的靶分子數(shù)量有限。
發(fā)明內(nèi)容為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的發(fā)明人將兩個(gè)不同結(jié)構(gòu)的靶分子串聯(lián)后再與載藥顆粒相連，兩個(gè)靶分子連接后空間構(gòu)象互不影響，能維持各自原有的生物學(xué)活性，從而在功能上產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。本發(fā)明公開(kāi)了一種雙重靶向腫瘤的納米脂質(zhì)體，含有ARYCRGDCFDATWLPra多肽；本發(fā)明提供的雙重靶向腫瘤的納米脂質(zhì)體主要由三部分組成，ARYCRGDCFDATffLPPR多肽，脂質(zhì)連接物和脂質(zhì)體納米粒。本發(fā)明還公開(kāi)了上述雙重靶向腫瘤的納米脂質(zhì)體的制備方法，首先合成雙重靶向腫瘤的ARYCRGDCFDATWLPra多肽，然后合成多肽接枝物，制備雙重靶向腫瘤納米脂質(zhì)體。本發(fā)明還公開(kāi)了上述上述雙重靶向腫瘤的納米脂質(zhì)體在制備治療抗腫瘤藥物中的用途。首先，本發(fā)明采用固相合成法獲得雙重靶向腫瘤的多肽，所述多肽的氨基酸序列如下=ARYCRGDCFDATffLPPR0其中ARYCRGDCFDG其核心結(jié)構(gòu)為RGD三肽，即精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列，針對(duì)靶點(diǎn)是整合素αV家族。αV整合素為細(xì)胞黏附分子家族的重要成員之一，是一組跨膜糖蛋白受體，通過(guò)參與內(nèi)皮細(xì)胞的激活和遷移、介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、參與堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和VEGF誘導(dǎo)的血管生成、誘導(dǎo)環(huán)加氧酶2的產(chǎn)生等多種途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。αV整合素高表達(dá)于活化的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面，在生理狀態(tài)下靜止的血管內(nèi)皮細(xì)胞和正常組織器官內(nèi)呈低表達(dá)。藥物載體連接含RGD序列的短肽后可顯著增強(qiáng)其靶向腫瘤的能力。ATWLPra序列是從噬菌體肽庫(kù)中篩選出來(lái)的一個(gè)含有7個(gè)氨基酸殘基的短肽，針對(duì)的靶點(diǎn)為VEGFR2的共受體神經(jīng)內(nèi)皮素-1(Neuropilin-1，NRP-1)οVEGFR-2(VascularEndothelialGrowthFactorReceptor-2)是VEGF/VEGFR家族成員，主要識(shí)別低分子量的VEGF(含110-165個(gè)氨基酸殘基的VEGF)，在血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖、存活及血管通透性調(diào)節(jié)中起重要作用。NRP-I是一種非酪氨酸跨膜糖蛋白，是VEGFR-2的輔助受體，和VEGFR-2的共表達(dá)可顯著促進(jìn)VEGF165與VEGFR-2的結(jié)合，增強(qiáng)VEGF165介導(dǎo)的生物學(xué)作用，促進(jìn)血管內(nèi)皮的增殖。NRP-I亦高表達(dá)于活化的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面，在生理狀態(tài)下靜止的血管內(nèi)皮細(xì)胞和正常組織器官內(nèi)呈低表達(dá)。本發(fā)明采用Fmoc固相合成法合成了多肽配體-賴氨酸-甘氨酸-甘氨酸-棕櫚酸(lysine-glycine-glycine，KGG-pal)聯(lián)結(jié)物(結(jié)構(gòu)見(jiàn)附圖1)，連接新型多肽和脂質(zhì)體載藥納米粒。KGG序列是帶正電荷的疏水性三肽，研究證實(shí)其連接14碳的脂肪酸后可穩(wěn)定連于脂質(zhì)體表面。由于賴氨酸具有兩個(gè)氨基，故可同時(shí)與兩個(gè)棕櫚酸分子偶合，以模擬磷脂分子的兩條疏水性長(zhǎng)烴基鏈，插入脂質(zhì)體雙分子層后可顯著增加多肽連接的牢固性。本發(fā)明采用薄膜超聲分散法制備脂質(zhì)體載藥顆粒，采用薄膜過(guò)濾法或高壓均質(zhì)法控制脂質(zhì)體粒徑在60-200nm。小粒徑的納米粒作為抗腫瘤藥物載體有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。惡性腫瘤的侵襲性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有賴于血管的生成，雖然相對(duì)于正常血管來(lái)說(shuō)，腫瘤組織中血管對(duì)藥物的選擇性滲透力較弱，內(nèi)皮細(xì)胞間或細(xì)胞上的特異通道孔徑更大，但最大直徑仍不超過(guò)400nm。大粒徑的脂質(zhì)體在脾臟的截留更多，從血液中清除更快，到達(dá)腫瘤組織的脂質(zhì)體明顯減少。因此理論上小粒徑長(zhǎng)循環(huán)藥物脂質(zhì)體更易透過(guò)血管間隙發(fā)揮抗腫瘤的作用。細(xì)胞學(xué)研究證實(shí)，本發(fā)明的含有RGD及ATWLPI3R序列的雙重靶向腫瘤的多肽修飾的脂質(zhì)體納米粒。新型多肽分子量小，核心載藥顆粒粒徑控制在60-100nm，故易穿透內(nèi)皮細(xì)胞屏障進(jìn)入腫瘤組織。研究證實(shí)，RGD及ATWLPra序列連接后空間構(gòu)象互不影響，能維持序列各自原有的生物學(xué)活性，從而產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。相較于只含有RGD或ATWLPra序列的單靶向脂質(zhì)體納米粒，研發(fā)的雙重靶向腫瘤的脂質(zhì)體納米粒有顯著為優(yōu)的與新生血管內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的特異性結(jié)合力，可用于腫瘤顯像和治療領(lǐng)域。與無(wú)靶向及單靶向腫瘤的脂質(zhì)體藥物載體納米粒相比，雙重靶向腫瘤的脂質(zhì)體藥物載體納米粒有更強(qiáng)的與新生血管內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合能力。該藥物載體可用于荷載多種藥物如磁共振造影劑釓噴酸葡胺、抗腫瘤藥物多西紫杉醇、阿霉素、喜樹(shù)堿后，進(jìn)一步用于惡性腫瘤的早期診斷和靶向治療領(lǐng)域。圖1多肽配體-賴氨酸-甘氨酸-甘氨酸(lysine-glycine-glycine，KGG)-pal聯(lián)結(jié)物的結(jié)構(gòu)圖；圖2流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光標(biāo)記多肽與AM9、HUVEC的結(jié)合能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其中左起第一組線為FITC-P4=FITC-ATffLPPR(單靶點(diǎn)多肽)；第二組線為FITC-P2:FITC-ARYCRGDCFDG(單靶點(diǎn)多肽)；第三組線為FITC-P16FITC-ARYCRGDCFDAI￥LPPR(雙重靶向多肽)。圖3熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)FITC標(biāo)記多肽與A549細(xì)胞、HUVEC的結(jié)合能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其中FITC-Pl:FITC-ARYCRADCFDG(非血管靶向多肽)FITC-P2=FITC-ATffLPPR(單靶點(diǎn)多肽)FITC-P4=FITC-ATffLPPR(單靴向多肽)FITC-Pl6=FITC-ARYCRGDCFDATffLPPR(雙重靴向多肽)(*vsFITC-PlP<0.05；#vsFITC-P2<0.05；ΔvsFITC-P4P<0.05)圖4熒光倒置顯微鏡下觀察各熒光脂質(zhì)體與細(xì)胞結(jié)合力實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其中A_DA549細(xì)胞；E-H=HUVEC；A、E非靶向熒光脂質(zhì)體；B、F:ARYCRADCFDG-熒光脂質(zhì)體；C、GATffLPPR-熒光脂質(zhì)體；D、HARYCRGDCFDATffLPPR-熒光脂質(zhì)體。圖5粒度分析結(jié)果(5-1)，透射電鏡下粒徑結(jié)果(5-2)。具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)材料1.細(xì)胞和試劑HUVEC(HumanUmbilicalVeinEndothelialCells，HUVEC)及A549細(xì)胞(肺腺癌細(xì)胞系)由上海市肺科醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供；Dulbecco'sModifiedEagleMedia(DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基)購(gòu)自^witrogen公司；新生牛血清購(gòu)自?shī)W地利PAA公司；CoulterIsotonIII稀釋液購(gòu)自美國(guó)BECKMAN公司；青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶等購(gòu)自華美公司；熒光標(biāo)記多肽委托吉爾生化(上海)有限公司合成。2.溶液配制權(quán)利要求1.一種雙重靶向腫瘤的納米脂質(zhì)體，其特征在于含有ARYCRGDCFDATWLPra多肽。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙重靶向腫瘤的納米脂質(zhì)體，其特征在于主要由三部分組成ARYCRGDCFDATWLPPR多肽，脂質(zhì)連接物和脂質(zhì)體納米粒。3.權(quán)利要求1或2所述的雙重靶向腫瘤的納米脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于首先合成雙重靶向腫瘤的ARYCRGDCFDATWLPra多肽，然后合成多肽接枝物，最后制備雙重靶向腫瘤的納米脂質(zhì)體。4.權(quán)利要求1或2所述的雙重靶向腫瘤的納米脂質(zhì)體在制備治療抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開(kāi)了一種雙重靶向腫瘤的納米脂質(zhì)體，含有ARYCRGDCFDATWLPPR多肽，本發(fā)明還公開(kāi)了上述雙重靶向腫瘤的納米脂質(zhì)體的制備方法及其在制備治療抗腫瘤藥物中的用途。文檔編號(hào)A61P35/00GK102188380SQ20111009417公開(kāi)日2011年9月21日申請(qǐng)日期2011年4月14日優(yōu)先權(quán)日2011年4月14日發(fā)明者周彩存,周蔚,孟淑燕,宋胤,李瑋,粟波申請(qǐng)人:上海市肺科醫(yī)院