專利名稱：香椿提取物作為制備治療痛風病藥物的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及香椿黃酮提取物，尤其是一種香椿提取物作為制備治療痛風病藥物的 應用。
背景技術：
痛風是常見的慢性嘌呤代謝障礙引起的疾病，在最近的30年患者越來越多，國內 痛風患者已達到1200萬人。痛風主要是由于尿酸在體內沉積引起的病理生理改變，主要表 現為高尿酸血癥，反復發(fā)作的痛風性急性關節(jié)炎、痛風石、尿酸性腎病，嚴重者呈關節(jié)畸形 及功能障礙。治療痛風分為三個階段治療急性痛風關節(jié)炎、預防再次發(fā)作、降低患者血尿酸 水平。其中治療急性痛風性關節(jié)炎的藥物是通過抑制環(huán)氧合酶_2(C0X1)達到緩解疼痛 效果。環(huán)氧合酶-2又稱前列腺素內過氧化合成酶，是一種膜結合蛋白，是機體催化C0X-2 反應底物一一花生四烯酸(AA)轉變?yōu)榍傲邢偎?2 (PGE2)的限速酶，前列腺素可介導炎 癥反應。傳統(tǒng)的止痛藥一一非留類抗炎藥在抑制環(huán)氧合酶_2(C0X-2)的同時也抑制了 環(huán)氧合酶-1 (C0X-1)，對腸胃功能有負面影響，新開發(fā)的特異性C0X-2抑制劑一賽樂昔布 (Celecoxib)上市后雖抗炎效果明顯卻被證實對心血管系統(tǒng)有嚴重威脅，到目前為止，安 全有效的C0X-2特異性抑制劑仍在研究開發(fā)中。除抗炎止痛外，患者還需服用抑制黃嘌呤 氧化酶(XO)活性的藥物從而控制體內尿酸的水平。降尿酸的經典藥物-別嘌呤醇藥效明 顯，但對腎臟損傷較大，其過敏癥也有致命危險。針對痛風性關節(jié)炎中兩種關鍵酶-環(huán)氧合 酶-2(C0X-2)和黃嘌呤氧化酶0(0)，開發(fā)安全、有效的雙靶點藥物非常必要。香椿(Toona sinensis Roem)為楝科(Meliaceae)多年生落葉喬木,在中國已有 2000多年的栽培歷史，此外，香椿的作用在書中也有記載。明代李時珍所著《本草綱目》“椿 木皮細而赤，嫩葉香甘可茹”，其根、皮、果實也都入藥用。香椿牙芳香醒脾，開胃進食，可以 主治胃和十二指腸潰瘍、慢性胃炎等。香椿具有較強的香氣和生理活性，含有多種化合物， 如黃酮類、多酚類化合物、萜類化合物等，它們是制藥工業(yè)、生物醫(yī)學及食品工業(yè)的常用物 質。在目前國內外研究中，已有關于黃酮單體對黃嘌呤氧化酶或動物模型抗炎效果的報道， 但尚未見有香椿黃酮具有以上功能的報道。此外，在同期植物中，香椿的總黃酮含量遠遠高 于銀杏和茶葉，香椿老葉提取物中含有多種類型的黃酮化合物，不同來源的各種黃酮類化 合物之間的比例和種類的差別可能具有協(xié)同促進作用。香椿是我國特色植物，其不可鮮食 的老葉是香椿種植業(yè)中產量較高的副產物，價格低廉，方便易得，目前，對香椿提取物的功 能研究主要集中在抗氧化、降血糖、抗癌等方面。因此，以香椿黃酮提取物作為抗痛風等領 域的藥物研究將具有重要的經濟效益和社會效益以及廣闊的應用前景。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種香椿提取物作為制備治療痛風病藥物的應用，開發(fā)了 香椿提取物在抗痛風、抗炎效果的應用，提出了香椿作為預防和治療痛風的雙靶點藥物的新用途。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現的香椿提取物作為制備治療痛風病藥物的應用。而且，所述香椿提取物為香椿的黃酮提取物。而且，所述抗痛風藥物包括治療高尿酸血癥藥物、治療急性炎癥藥物、治療炎證疼 痛藥物或特異性抑制環(huán)氧合酶-2的藥物。而且，所述香椿提取物為香椿葉提取物。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果如下1.本發(fā)明提供了香椿提取物的制備以及在抗痛風、抗炎效果上的應用，公開了香 椿提取物在預防和治療痛風中的用途，本提取物對黃嘌呤氧化酶的IC5tl為=95μ g/mL，對 環(huán)氧合酶-2的IC5tl = 77 μ g/mL，香椿提取物對兩種酶均有明顯的抑制作用，具有較好的抗 痛風、抗炎效果，可用于制備治療痛風的雙靶點藥物，除此之外，還可用于制備抗炎、止痛藥 物。2.本發(fā)明的材料為香椿老葉，已有長期的飲食歷史，純天然無毒無害，為抗痛風雙 靶點藥物、功能性食品的開發(fā)提供了天然資源。


圖1為本發(fā)明香椿提取物對黃嘌呤氧化酶抑制率的影響；圖2為本發(fā)明陽性對照別嘌呤醇對黃嘌呤氧化酶的抑制曲線；圖3為本發(fā)明香椿提取物對環(huán)氧合酶-2抑制率的影響；圖4為本發(fā)明陽性對照Dup-697對環(huán)氧合酶_2的抑制曲線。
具體實施例方式下面結合實施例，對本發(fā)明做進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性 的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。香椿葉的黃酮提取物均為現有技術，包括各種提取方法提取的總黃酮含量較高的 提取物，本實施例以采用香椿葉為例，采用水煎、聚酰胺過柱等步驟得到黃酮含量90%的香 椿提取物，其他以香椿為原料，提取物富含黃酮的方法，均可以為本發(fā)明所用，這里不再贅 述，以下述方法為例來說明，但不僅限于以下方法。一、香椿提取物的提取1.樹脂的預處理先用95 %的乙醇浸泡聚酰胺Mh，濕法裝柱(0100 mmx800 mm)后依次進行以下操作。醇洗用95%的乙醇洗到流出乙醇與水體積比為1 5的混合液不變混濁為止。酸洗用5倍柱體積的5%的鹽酸洗去酸溶性雜質。水洗用大量蒸餾水洗去殘留的酸液至中性。堿洗用5倍柱體積的5%的NaOH洗去堿溶性雜質。水洗用大量蒸餾水洗去殘留的堿液至中性，備用。2.上樣、洗脫
稱取200g香椿葉粉，以料液比1 10 (g/mL)的比例加入水，電爐上加熱煮沸Ih后 停止加熱，攪拌，使其快速冷卻，上清夜合并后eOOOr/min離心20min，取上清液上柱備用。 沉淀物加水重復煮沸三次，合并離心提取液備用。上樣將離心后的上清提取液上聚酰胺柱，使黃酮類化合物被充分吸附。水洗待上樣飽和后，用水洗去大量水溶性多糖和蛋白等雜質。至洗出液基本無 色，TLC點板展層，原點基本無色后停止水洗。上水洗液將水洗液上樣，使樹脂充分吸附泄漏的黃酮類化合物。醇洗用60%的乙醇對被吸附的黃酮類化合物進行洗脫，以TLC跟蹤檢測至黃酮 類化合物被洗脫完全，合并洗脫液。濃縮、凍干將合并后的洗脫液于70°C真空旋轉蒸發(fā)、濃縮得黃色浸膏狀物質，真 空冷凍干燥，得到淡黃色總黃酮粉末備用。按以上處理方法，制備得到3批香椿總黃酮，分 別測定其總黃酮含量為85% 90%。二、體外檢測香椿黃酮提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制率1.溶液配制80mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7. 5)，用緩沖液溶解并配制香椿葉黃酮提取物30， 75，150，300 μ g/mL四個濃度梯度，用磷酸鹽緩沖液配制黃嘌呤，黃嘌呤氧化酶，別嘌呤醇溶 液，根據需要稀釋至不同濃度。2.吸光值的測定依次加入225 μ L緩沖液(pH = 7.幻，加入不同濃度的黃酮提取物各50 μ L以及 100 μ L黃嘌呤氧化酶酶液(0. lU/mL)于1. 5mL離心管中，充分混勻，25°C下靜置15min，加 Λ 125 μ L黃嘌呤溶液(1. 5mmol/L)使反應開始，反應30min,加入100 μ L的HCl (lmol/L) 使反應終止，測定數值為B。其中以緩沖液代替黃酮提取物為空白對照，測得的數值為A。試 驗以別嘌呤醇AL作為陽性對照，每組3個平行。3.抑制率的計算XO的活性用抑制百分數表示，計算公式為(1-B/A) X 100%。4.結果由圖1可以看出，香椿提取物濃度對M)的抑制作用具有量效關系，即隨著提取物 濃度的提高，M)的抑制率不斷增加。經過曲線擬合，選置信度(R2值)最大的曲線，得到黃嘌 呤氧化酶抑制率y與香椿提取物濃度χ的關系，即y = 2X 1(Γ6χ3-0. 002x2+0. 5744x+ll. 495， 其中R2 = 1 ；將y = 50%代入上述關系式，計算得到IC5tl為95 μ g/mL,陽性對照別嘌呤醇的 IC50 = 1. 2 μ g/mL。雖然香椿提取物的IC5tl大于陽性對照，但95 μ g/mL的劑量已可以抑制 50%的黃嘌呤氧化酶，說明其抑制效果較好(IC5tl表示抑制50%酶活的藥物濃度，IC5tl越低 表示該物質抑制酶活的能力越強)。三、體外檢測香椿黃酮提取物對環(huán)氧合酶-2的抑制率1.溶劑的配制Assay Buffer 取 3mL Assay buffer,力口 入 27mL 去離子水，配成 IOOmmol/L Tris-HCl, pH = 8. 0，4°C 可保持 6 個月。取 40 μ L 血紅素(Heme)溶于 960 μ L 的 assay buffer中，室溫下可保存12h。C0X-2配制取50 μ L環(huán)氧合酶_2酶溶液，溶于550 μ L的assay buffer中，貯存
5于冰塊上，可以保存lh。分別加入100 μ L花生四烯酸和100 μ L的Κ0Η，漩渦混勻后，加入 800 μ L的去離子水，最終濃度達到2mmol/L。將熒光物(ADHP)粉末溶于100 μ L的DMSO中， 再溶于 900 μ L 的 assay buffer。 6 μ mol/L, 50 μ L ^ Dup-697 溶于 550 μ L 的 DMSO 中。2.操作步驟在空白對照孔中加入150 μ L的assay buffer，10 μ L的血紅素(heme)，10 μ L的熒 光物質(ADHP)，10 μ L 的 C0X-2 以及 10 μ L DMS0。背景孔中加入 160 μ L 的 assay buffer, 10 μ L的血紅素(heme)和10 μ L的熒光物質(ADHP)及10 μ L的DMS0。試驗孔中，每孔加 入 150 μ L 的 assay buffer, 10 μ L 的 heme, 10 μ L 的熒光物質，10 μ L 的 C0X-2 酶，10 μ L 的 抑制劑。抑制劑包括黃酮提取物，劑量分別為62. 5、125、250、500μ g/mL，每個劑量3復孔， 陽性對照物 Dup-697 為 10，25，50，100 μ mol/L。3.數值測定每孔迅速加入IOmL的花生四烯酸溶液，在室溫下孵育aiiin。放入熒光檢測器中， 設置激發(fā)波長為535nm，發(fā)射波長為590nm，讀數，計算抑制率。4.結果由圖3可以看出，香椿提取物對C0X-2的抑制作用具有量效關系，即隨著提 取物濃度的提高，C0X-2的抑制率不斷增加。在EXCEL中對數據進行曲線擬合，選置信 度(R2值)最大的曲線，得到環(huán)氧合酶-2抑制率y與香椿提取物濃度χ的關系，即y =-0. 0002x2+0. 1584x+38. 833，其中 R2 = 0. 999，將 y = 50%代入上述關系式，計算得到 IC50 為77 μ g/mL ；陽性對照Dup-697的IC5tl為14. 97 μ g/mL,說明香椿提取物對環(huán)氧合酶_2具 有良好的抑制效果。
權利要求
1.香椿提取物作為制備治療痛風病藥物的應用。
2.根據權利要求1所述的香椿提取物作為制備治療痛風病藥物的應用，其特征在于 所述香椿提取物為香椿的黃酮提取物。
3.根據權利要求1所述的香椿提取物作為制備治療痛風病藥物的應用，其特征在于 所述治療痛風病藥物包括治療高尿酸血癥藥物、治療急性炎癥藥物、治療炎證疼痛藥物或 特異性抑制環(huán)氧合酶-2的藥物。
4.根據權利要求1所述的香椿提取物作為制備治療痛風病藥物的應用，其特征在于 所述香椿提取物為香椿葉提取物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種香椿提取物作為制備治療痛風病藥物的應用，提取物采用水煎、聚酰胺過柱等步驟得到黃酮含量90％的香椿提取物，再將香椿提取物對痛風中兩種關鍵性酶黃嘌呤氧化酶和環(huán)氧合酶-2進行體外抑制試驗。本發(fā)明提供了香椿提取物的制備以及在抗痛風、抗炎效果上的應用，公開了香椿提取物在預防和治療痛風中的用途，本提取物對黃嘌呤氧化酶的IC50為＝95μg/mL，對環(huán)氧合酶-2的IC50＝77μg/mL，香椿提取物對兩種酶均有明顯的抑制作用，具有較好的抗痛風、抗炎效果，可用于制備治療痛風的雙靶點藥物，此外，還可用于制備抗炎、止痛藥物。
文檔編號A61P29/00GK102133267SQ201110057129
公開日2011年7月27日 申請日期2011年3月10日 優(yōu)先權日2011年3月10日
發(fā)明者李貞景, 李風娟, 梁寧, 王昌祿, 王玉榮, 陳勉華 申請人:天津科技大學