專利名稱：抗體配制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明致カ于包含抗體的穩(wěn)定的含水藥物配制劑(aqueous pharmaceuticalformulation)。
背景技術：
在過去幾年里，生物技術的進步使之可能使用重組DNA技術來生產(chǎn)多種蛋白質(zhì)，供藥物應用。因為蛋白質(zhì)比傳統(tǒng)的有機和無機藥物更大且更復雜(例如在復雜的三維機構(gòu)之外還擁有多種官能團)，所以此類蛋白質(zhì)的配制劑提出了特殊問題。為了使蛋白質(zhì)維持生物學活性，配制劑必須至少使蛋白質(zhì)氨基酸的核心序列的構(gòu)象完整性保持完整，同時保護蛋白質(zhì)的多種官能團免于降解。蛋白質(zhì)的降解途徑可涉及化學不穩(wěn)定性(例如任何涉及通過鍵形成或切割來修飾蛋白質(zhì)，產(chǎn)生新化學實體的過程)或物理不穩(wěn)定性(例如蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)的變化)。化學不穩(wěn)定性可源自脫酰胺、外消旋、水解、氧化、^消除或ニ硫化物交換。物理不穩(wěn)定性可源自例如變性、聚集、沉淀或吸附。三種最常見的蛋白質(zhì)降解途徑為蛋白質(zhì)聚集、脫酸胺(deamidation)和氧化。Cleland et al Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems 10(4) :307-377(1993)。用于藥物應用的蛋白質(zhì)包括抗體。對治療有用的抗體的一個例子為結(jié)合VEGF的抗體。本領域需要適合治療用途的包含抗體(諸如抗VEGF抗體)的穩(wěn)定的含水藥物配制劑。發(fā)明概述本發(fā)明提供穩(wěn)定的含水藥物配制劑，其包含治療有效量的任選未進行在先凍干的抗體、維持PH在約4. 0至約6. 0的范圍中的緩沖液、和任選的表面活性剤，生成該配制劑的方法和使用該配制劑的方法。本發(fā)明的一個實施方案提供穩(wěn)定的含水藥物配制劑，該配制劑在pH 4. 0至6. 0的精氨酸緩沖液中含有治療有效量的抗體。在一些實施方案中，緩沖液為pH 4. 5至5. 5的精氨酸こ酸鹽緩沖液。在一些實施方案中，緩沖液為pH 4. 8至5. 4的精氨酸こ酸鹽緩沖液。在一些實施方案中，緩沖液為pH 5. 2的精氨酸こ酸鹽緩沖液。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約25mM至約250mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約50mM至約250mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約75mM至約250mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約IOOmM至約250mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約120mM至約240mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約150mM至約225mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約200mM。在一些實施方案中，配制劑進一歩包含表面活性剤。在ー些實施方案中，表面活性劑為聚山梨酷。在一些實施方案中，聚山梨酯為聚山梨酯20。在ー些實施方案中，表面活性劑濃度為0. 0001%至約I. 0%。在一些實施方案中，表面活性劑濃度為約0.01%至約0. 05%。在一些實施方案中，表面活性劑濃度為0. 04%。在一些實施方案中，抗體濃度為約10mg/ml至約250mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約25mg/ml至200mg/mlo在一些實施方案中，抗體濃度為約30mg/ml至175mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約25mg/ml至約100mg/ml。在一些實施方案中，抗體未進行在先凍干。在一些實施方案中，抗體結(jié)合VEGF。在一些實施方案中，抗體為單克隆抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體為全長抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體為IgGl抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體為人源化抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體為包含抗原結(jié)合區(qū)的抗體片段。在一些實施方案中，抗體片段為Fab或F(&ピ)2片段。在一些實施方案中，單克隆抗體結(jié)合VEGF。在一些實施方案中，抗體為貝伐單抗(bevacizumab)。在ー些實施方案中，單克隆抗體對聚集易感。在一些實施方案中，緩沖液為PH 5. 2的200mM精氨酸こ酸鹽，表面活性劑為量為約0.01-0. l%v/v的聚山梨酯且配制劑于約40° C的溫度穩(wěn)定至少28天。在一些實施方案中，配制劑是無菌的。在一些實施方案中，配制劑于約40° C保存至少28天時是穩(wěn)定的。在一些實施方案中，配制劑含水且對受試者施用。在一些實施方案中，配制劑用于靜脈內(nèi)(IV)、皮下(SQ)或肌肉內(nèi)(IM)施用。在一些實施方案中，配制劑 用于IV施用且抗體濃度為約10mg/ml至約250mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約25mg/ml至約175mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約IOmg/ml至約250mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約25mg/ml至約175mg/mlo在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/mlo在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IM施用且抗體濃度為約10mg/ml至約250mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IM施用且抗體濃度為約25mg/ml至約175mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IM施用且抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。本發(fā)明的另ー個實施方案提供制品，其包含裝有穩(wěn)定的含水藥物配制劑的容器，該穩(wěn)定的含水藥物配制劑包含治療有效量的抗體、約pH4. 5至約6. 0的精氨酸こ酸鹽緩沖液、和表面活性剤。在一些實施方案中，抗體濃度為約10mg/ml至約250mg/ml。在ー些實施方案中，抗體濃度為約25mg/ml至200mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約30mg/ml至175mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約25mg/ml至約100mg/ml。在一些實施方案中，抗體未進行在先凍干。在一些實施方案中，抗體結(jié)合VEGF。在一些實施方案中，抗體為單克隆抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體為全長抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體為IgGl抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體為人源化抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體為包含抗原結(jié)合區(qū)的抗體片段。在一些實施方案中，抗體片段為Fab或F(ab’)2K段。在一些實施方案中，單克隆抗體結(jié)合VEGF。在一些實施方案中，抗體為貝伐單抗。在一些實施方案中，單克隆抗體對聚集易感。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約25mM至約250mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約50mM至約250mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約75mM至約250mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約IOOmM至約250mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約120mM至約240mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約150mM至約225mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約200mM。在一些實施方案中，精氨酸こ酸鹽緩沖液具有約4. 5至約
5.5的pH。在一些實施方案中，精氨酸こ酸鹽緩沖液具有約4. 8至約5. 4的pH。在ー些實施方案中，精氨酸こ酸鹽緩沖液具有約5. 2的pH。在一些實施方案中，表面活性劑為聚山梨酷。在一些實施方案中，聚山梨酯為聚山梨酯20。在一些實施方案中，表面活性劑濃度為0. 0001%至約I. 0%。在一些實施方案中，表面活性劑濃度為約0. 01%至約0. 05%。在一些實施方案中，表面活性劑濃度為0.04%。在一些實施方案中，配制劑是無菌的。在ー些實施方案中，配制劑于約40° C保存至少28天時是穩(wěn)定的。在一些實施方案中，配制劑含水且對受試者施用。在一些實施方案中，配制劑用于靜脈內(nèi)(IV)、皮下(SQ)或肌肉內(nèi)(頂)施用。在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約10mg/ml至約250mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約25mg/ml至約175mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/ml。在一些實施方案中，配 制劑用于IV施用且抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約10mg/ml至約250mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約25mg/ml至約175mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IM施用且抗體濃度為約IOmg/ml至約250mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IM施用且抗體濃度為約25mg/ml至約175mg/mlo在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/mlo在一些實施方案中，配制劑用于IM施用且抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。 本發(fā)明的又一個實施方案提供在含水藥物配制劑中穩(wěn)定抗體的方法，其通過組合治療有效量的抗體、約PH 4. 5至約6.0的精氨酸こ酸鹽緩沖液、和表面活性劑來進行。在一些實施方案中，抗體濃度為約10mg/ml至約250mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約25mg/ml至200mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約30mg/ml至175mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約25mg/ml至約100mg/ml。在一些實施方案中，抗體未進行在先凍干。在一些實施方案中，抗體結(jié)合VEGF。在一些實施方案中，抗體為單克隆抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體為全長抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體為IgGl抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體為人源化抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體為包含抗原結(jié)合區(qū)的抗體片段。在一些實施方案中，抗體片段為Fab或F(ab' )2片段。在一些實施方案中，單克隆抗體結(jié)合VEGF。在一些實施方案中，抗體為貝伐單抗。在一些實施方案中，單克隆抗體對聚集易感。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約25mM至約250mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約50mM至約250mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約75mM至約250mM。在ー些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約IOOmM至約250mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約120mM至約240mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約150mM至約225mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約200mM。在一些實施方案中，精氨酸こ酸鹽緩沖液具有約4. 5至約5. 5的pH。在一些實施方案中，精氨酸こ酸鹽緩沖液具有約4. 8至約5. 4的pH。在一些實施方案中，精氨酸こ酸鹽緩沖液具有約5. 2的pH。在一些實施方案中，表面活性劑為聚山梨酷。在一些實施方案中，聚山梨酯為聚山梨酯20。在一些實施方案中，表面活性劑濃度為0.0001%至約1.0%。在ー些實施方案中，表面活性劑濃度為約0. 01%至約0. 05%。在一些實施方案中，表面活性劑濃度為0.04%。在一些實施方案中，配制劑是無菌的。在一些實施方案中，配制劑于40° C保存至少28天時是穩(wěn)定的。在一些實施方案中，配制劑含水且對受試者施用。在一些實施方案中，配制劑用于靜脈內(nèi)(IV)、皮下(SQ)或肌肉內(nèi)(IM)施用。在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約10mg/ml至約250mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約25mg/ml至約175mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約IOmg/ml至約250mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約25mg/ml至約175mg/mlo在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/ mlo在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IM施用且抗體濃度為約10mg/ml至約250mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IM施用且抗體濃度為約25mg/ml至約175mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IM施用且抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。本發(fā)明的又另ー個實施方案提供穩(wěn)定的含水藥物配制劑，其包含治療有效量的抗體、pH 5. 2的200mM精氨酸こ酸鹽緩沖液、和表面活性剤。在一些實施方案中，抗體濃度為約10mg/ml至約250mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約25mg/ml至200mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約30mg/ml至175mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約25mg/ml至約100mg/ml。在一些實施方案中，抗體未進行在先凍干。在一些實施方案中，抗體結(jié)合VEGF。在一些實施方案中，抗體為單克隆抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體為全長抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體為IgGl抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體為人源化抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體為包含抗原結(jié)合區(qū)的抗體片段。在一些實施方案中，抗體片段為Fab或F(ab' )2片段。在一些實施方案中，單克隆抗體結(jié)合VEGF。在一些實施方案中，抗體為貝伐單抗。在一些實施方案中，單克隆抗體對聚集易感。在一些實施方案中，表面活性劑為聚山梨酷。在一些實施方案中，聚山梨酯為聚山梨酯20。在一些實施方案中，表面活性劑濃度為0. 0001%至約I. 0%。在ー些實施方案中，表面活性劑濃度為約0. 01%至約0. 05%。在一些實施方案中，表面活性劑濃度為0.04%。在一些實施方案中，配制劑是無菌的。在一些實施方案中，配制劑于約40° C保存至少28天時是穩(wěn)定的。在一些實施方案中，配制劑含水且對受試者施用。在一些實施方案中，配制劑用于靜脈內(nèi)(IV)、皮下(SQ)或肌肉內(nèi)(IM)施用。在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約10mg/ml至約250mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約25mg/ml至約175mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約IOmg/ml至約250mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約25mg/ml至約175mg/mlo在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/mlo在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IM施用且抗體濃度為約10mg/ml至約250mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IM施用且抗體濃度為約25mg/ml至約175mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IM施用且抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。 本發(fā)明的又一個實施方案提供藥物配制劑，其包含(a)量為約lOmg/mL至約250mg/mL的對脫酰胺或聚集易感的全長IgGl抗體；(b)pH 4. 5至6. O的精氨酸こ酸鹽緩沖液；和(c)量為約0. 01%至約0. 1%的聚山梨酯20。在一些實施方案中，抗體濃度為約25mg/ml至200mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約30mg/ml至175mg/ml。在一些實施方案 中，抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約25mg/ml至約100mg/ml。在一些實施方案中，抗體未進行在先凍干。在一些實施方案中，抗體結(jié)合VEGF。在一些實施方案中，抗體為貝伐單杭。在一些實施方案中，抗體為人源化抗體。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約25mM至約250mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約50mM至約250mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約75mM至約250mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約IOOmM至約250mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約120mM至約240mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約150mM至約225mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約200mM。在一些實施方案中，精氨酸こ酸鹽緩沖液具有約4. 5至約5. 5的pH。在一些實施方案中，精氨酸こ酸鹽緩沖液具有約4. 8至約5. 4的pH。在一些實施方案中，精氨酸こ酸鹽緩沖液具有約5. 2的pH。在一些實施方案中，聚山梨酯20為約0. 01%至約0. 05%。在一些實施方案中，聚山梨酯20為0.04%。在一些實施方案中，配制劑是無菌的。在ー些實施方案中，配制劑于約40° C保存至少28天時是穩(wěn)定的。在一些實施方案中，配制劑含水且對受試者施用。在一些實施方案中，配制劑用于靜脈內(nèi)(IV)、皮下(SQ)或肌肉內(nèi)(頂)施用。在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約10mg/ml至約250mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約25mg/ml至約175mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約10mg/ml至約250mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約25mg/ml至約175mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IM施用且抗體濃度為約IOmg/ml至約250mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IM施用且抗體濃度為約25mg/ml至約175mg/mlo在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/mlo在一些實施方案中，配制劑用于IM施用且抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。
本發(fā)明的又另ー個實施方案提供藥物配制劑，其在pH約4. 5至約6. 0的精氨酸こ酸鹽緩沖液中包含結(jié)合VEGF的抗體，和表面活性剤。在一些實施方案中，抗體濃度為約10mg/ml至約250mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約25mg/ml至200mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約30mg/ml至175mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約25mg/ml至約100mg/ml。在一些實施方案中，抗體未進行在先凍干。在一些實施方案中，抗體為單克隆抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體為全長抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體為IgGl抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體為人源化抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體為包含抗原結(jié)合區(qū)的抗體片段。在一些實施方案中，抗體片段為Fab或F(ab’)2K段。在一些實施方案中，抗體為貝伐單抗。在一些實施方案中，單克隆抗體對聚集易感。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約25mM至約250mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約50mM至約250mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約75mM至約250mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約120mM至約240mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約150mM至約225mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約200mM。在 一些實施方案中，精氨酸こ酸鹽緩沖液具有約4. 5至約5. 5的pH。在一些實施方案中，精氨酸こ酸鹽緩沖液具有約4. 8至約5. 4的pH。在一些實施方案中，精氨酸こ酸鹽緩沖液具有約5. 2的pH。在一些實施方案中，表面活性劑為聚山梨酷。在一些實施方案中，聚山梨酯為聚山梨酯20。在一些實施方案中，表面活性劑濃度為0. 0001%至約I. 0%。在一些實施方案中，表面活性劑濃度為約0. 01%至約0. 05%。在一些實施方案中，表面活性劑濃度為0. 04%。在一些實施方案中，配制劑是無菌的。在一些實施方案中，配制劑于約40° C保存至少28天時是穩(wěn)定的。在一些實施方案中，配制劑含水且對受試者施用。在一些實施方案中，配制劑用于靜脈內(nèi)(IV)、皮下(SQ)或肌肉內(nèi)(IM)施用。在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約10mg/ml至約250mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約25mg/ml至約175mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約10mg/ml至約250mg/mlo在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約25mg/ml至約175mg/mlo在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IM施用且抗體濃度為約10mg/ml至約250mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IM施用且抗體濃度為約25mg/ml至約175mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IM施用且抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。本發(fā)明的另ー個實施方案提供降低治療性單克隆抗體聚集的方法，包括在pH 4. 5至6.0的精氨酸こ酸鹽緩沖液中配制該抗體。在一些實施方案中，抗體濃度為約10mg/ml至約250mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約25mg/ml至200mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約30mg/ml至175mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/mlo在一些實施方案中，抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。在一些實施方案中，抗體濃度為約25mg/ml至約100mg/ml。在一些實施方案中，抗體未進行在先凍干。在ー些實施方案中，抗體為單克隆抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體為全長抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體為IgGl抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體為人源化抗體。在ー些實施方案中，單克隆抗體為包含抗原結(jié)合區(qū)的抗體片段。在一些實施方案中，抗體片段為Fab或F(ab’)2K段。在一些實施方案中，單克隆抗體結(jié)合VEGF。在一些實施方案中，抗體為貝伐單抗。在一些實施方案中，單克隆抗體對聚集易感。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約25mM至約250mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約50mM至約250mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約75mM至約250mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約120mM至約240mM。在ー些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約150mM至約225mM。在一些實施方案中，緩沖液中的精氨酸こ酸鹽濃度為約200mM。在一些實施方案中，精氨酸こ酸鹽緩沖液具有約
4.5至約5. 5的pH。在一些實施方案中，精氨酸こ酸鹽緩沖液具有約4. 8至約5. 4的pH。在一些實施方案中，精氨酸こ酸鹽緩沖液具有約5. 2的pH。在一些實施方案中，配制劑是無菌的。在一些實施方案中，配制劑于約40° C保存至少28天時是穩(wěn)定的。在一些實施方案 中，配制劑含水且對受試者施用。在一些實施方案中，配制劑用于靜脈內(nèi)(IV)、皮下(SQ)或肌肉內(nèi)(IM)施用。在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約10mg/ml至約250mg/mlo在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約25mg/ml至約175mg/mlo在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IV施用且抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約10mg/ml至約250mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約25mg/ml至約175mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IM施用且抗體濃度為約10mg/ml至約250mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IM施用且抗體濃度為約25mg/ml至約175mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于SQ施用且抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/ml。在一些實施方案中，配制劑用于IM施用且抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/m丄。本發(fā)明的甚至又一個實施方案提供制品，其包含裝有本文所述任ー配制劑的容 器。本發(fā)明的還有又一個實施方案提供帶注射器可刺穿的塞子的管形瓶，其裝有本文所述任ー配制劑。在一些實施方案中，管形瓶保存于約2-8° C。在一些實施方案中，管形瓶為3cc、20cc或50cc管形瓶。本發(fā)明的另ー個實施方案提供不銹鋼罐，其在該罐內(nèi)部裝有本文所述任ー配制齊U。在一些實施方案中，配制劑是無菌的。本發(fā)明的又一個實施方案提供制備藥物配制劑的方法，包括(a)制備本文所述任一配制劑；并(b)評估在該配制劑中該抗體的物理穩(wěn)定性、化學穩(wěn)定性、或生物學穩(wěn)定性。本發(fā)明的還有另一個實施方案提供在受試者中治療疾病或病癥的方法，包括以有效治療該疾病或病癥的量對受試者施用本文所述任ー配制劑。在一些實施方案中，疾病為癌癥。在一些實施方案中，癌癥選自結(jié)腸直腸癌、肺癌、乳腺癌、腎癌、和成膠質(zhì)細胞瘤。 通過下面的詳述進一歩描述本發(fā)明的這些和其它方面。附圖
簡述圖I圖示在于40° C保存長達4周的抗VEGF配制劑(100mg/ml)中檢測到的總聚集物水平。圖2圖示在抗VEGF配制劑(0、50、100、和150mg/ml)中檢測到的總聚集物水平。圖3圖示在抗VEGF配制劑(100mg/ml)中檢測到的ニ聚體水平，與于40° C保存長達4周比較。圖4圖示抗VEGF配制劑在20° C的粘度，作為抗VEGF濃度(25、50、100、125、150、 或175mg/ml)的函數(shù)。發(fā)明詳述I.定義在詳細描述本發(fā)明之前，應當理解本發(fā)明不限于特定組合物或生物學系統(tǒng)，它們當然可以有所變化。還應理解本文中所使用的術語僅出于描述特定實施方案的目的，并非意圖對其進行限制。如本說明書和所附權(quán)利要求中使用的，単數(shù)形式“ー個”、“ー種”和“該”包括復數(shù)所指物，除非另有明確說明。如此，例如，提及“一個/種分子”任選包括兩個/種或更多個/種此類分子的組合，諸如此類。術語“藥物配制劑”指如下形式的制備物，使得容許活性組分的生物學活性有效，且不含別的對會施用配制劑的受試者有不可接受的毒性的成分。此類配制劑是無菌的?！八帉W可接受”賦形劑(媒介、添加剤)為那些可合理施用于受試哺乳動物以提供有效劑量的所采用的活性組分。“無菌”配制劑沒有活菌或者沒有或基本上沒有所有活的微生物及其孢子。在本文中，“冷凍”配制劑為ー種處于0° C以下的溫度的。一般地，冷凍配制劑不是冷凍干燥的，也未進行在先或后續(xù)凍干。在某些實施方案中，冷凍配制劑包含供貯藏的冷凍藥物物質(zhì)(在不銹鋼罐中)或冷凍藥物產(chǎn)品(在最終管形瓶構(gòu)造中)?！胺€(wěn)定”配制劑為ー種其中的蛋白質(zhì)在貯藏后基本上保留其物理穩(wěn)定性和/或化學穩(wěn)定性和/或生物學活性的。優(yōu)選地，配制劑在貯藏后基本上保留其物理和化學穩(wěn)定性，以及其生物學活性。貯藏期一般基于配制劑的預定架存期來選擇。多種用于測量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的分析技術是本領域可得的且綜述于例如Peptide and Protein DrugDelivery, 247-301, Vincent Lee Ed. , Marcel Dekker, Inc. , New York, N. Y. , Pubs. (1991)及 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90 (1993)。可測量在預定溫度!)&藏預定時間段后的穩(wěn)定性。在某些實施方案中，配制劑于約40° (穩(wěn)定至少約1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、或更多天。在某些實施方案中，配制劑于約40° C穩(wěn)定至少約1、2、3、4、5、6、7、8、或更多周。在某些實施方案中，配制劑于約25° C穩(wěn)定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、或更多個月。在某些實施方案中，配制劑于約5° C穩(wěn)定至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或更多個月。在某些實施方案中，配制劑于約-20。C穩(wěn)定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、或更多個月。在某些實施方案中，配制劑于5° C或-20° C穩(wěn)定至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、或更多個月。另外，配制劑優(yōu)選在冷凍(至例如-20° C或-70° C)和融化配制劑后(例如在1、2、3、4或5個循環(huán)的冷凍和融化后)穩(wěn)定?？梢远喾N不同方式定性和/或定量評估穩(wěn)定性，包括評估聚集(例如使用大小排阻層析、通過測量濁度、和/或通過視覺檢查);使用陽離子交換層析、圖像毛細管等電聚焦(icIEF)或毛細管區(qū)帶電泳評估電荷異質(zhì)性；氨基末端或羧基末端序列分析；質(zhì)譜分析；SDS-PAGE分析以比較還原型(reduced)和完整抗體；肽圖(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；評估抗體的生物學活性或抗原結(jié)合功能；等。不穩(wěn)定性可涉及下述ー項或多項聚集，脫酰胺(例如Asn脫酰胺)，氧化(例如Met氧化)，異構(gòu)化(例如Asp異構(gòu)化)，修剪/水解/片段化(例如鉸鏈區(qū)片段化)，琥珀酰亞胺形成，不配對的半胱氨酸，N端延伸，C端加工，糖基化差異，等。若在視覺檢查顏色和/或澄清度吋，或根據(jù)UV光散射或大小排阻層析的測量，蛋白質(zhì)顯示很少的聚集、沉淀和/或變性或沒有上述跡象的話，則它在藥物配制劑中“保留其物理穩(wěn)定性”。
若在給定時間的化學穩(wěn)定性使得蛋白質(zhì)被認定為仍然保留其生物學活性，如下文定義的，則蛋白質(zhì)在藥物配制劑中“保留其化學穩(wěn)定性”?；瘜W穩(wěn)定性可通過檢測和定量蛋白質(zhì)的化學改變形式來評估?；瘜W改變可涉及大小修飾(例如修剪)，這可使用例如大小排阻層析、SDS-PAGE和/或基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間質(zhì)譜術(MALDI/TOF MS)來評估。其它類型的化學改變包括電荷改變(例如因脫酰胺而發(fā)生的)，其可通過例如離子交換層析或icIEF來評估。若抗體在給定時間的生物學活性在制備藥物配制劑時的生物學活性的約10%之內(nèi)(在測定法的誤差之內(nèi))，如在例如抗原結(jié)合測定法中測定的，則抗體在藥物配制劑中“保留其生物學活性”。本文中下文詳述了用于抗體的其它“生物學活性”測定法。在本文中，單克隆抗體的“生物學活性”指抗體結(jié)合抗原的能力。它可進一歩包括抗體結(jié)合抗原并導致可測量的生物學應答，其可在體外或在體內(nèi)測量。此類活性可以是拮抗性的或激動性的?！懊擋０贰眴慰寺】贵w在本文中為它的ー個或多個天冬酰胺殘基已被衍生物成例如天冬氨酸或異天冬氨酸的單克隆抗體?！皩γ擋０芬赘械摹笨贵w為包含一個或多個發(fā)現(xiàn)傾向于脫酰胺的殘基的抗體。“對聚集易感的”抗體為發(fā)現(xiàn)與其它抗體分子聚集(尤其在冷凍和/或攪動時)的抗體?！皩ζ位赘械摹笨贵w為發(fā)現(xiàn)被切割成兩個或更多個片段(例如在其鉸鏈區(qū)處)的抗體。“降低脫酰胺、聚集、或片段化”意圖相當于在不同pH或在不同緩沖液中配制的單克隆抗體，阻止或降低脫酰胺、聚集、或片段化的量。配制的抗體優(yōu)選基本上純的且希望基本上同質(zhì)的(例如沒有污染性蛋白質(zhì)等)?！盎旧霞兊摹笨贵w表示基于組合物的總重量，組合物包含以重量計至少約90%、優(yōu)選以重量計至少約95%的抗體?！盎旧贤|(zhì)的”抗體表示基于組合物的總重量，組合物包含以重量計至少約99%的抗體。
“等張”表示感興趣的配制劑與人血液具有基本上相同的滲透壓。等張配制劑一般會具有約250至350m0sm的滲透壓。等張性可使用例如蒸氣壓或冰凍型滲透壓計來測量。如本文中使用的，“緩沖液”指通過其酸-堿配合成分的作用來抵抗pH變化的緩沖溶液。本發(fā)明的緩沖液優(yōu)選具有在約4. 5至約7. 0，優(yōu)選約4. 5至約6. 5，例如約4. 5至
6.0,4. 5 至 5. 9,4. 5 至 5. 8,4. 5 至 5. 7,4. 5 至 5. 6,4. 5 至 5. 5,4. 5 至 5. 6,4. 5 至 5. 5,4. 5至 5. 4,4. 5 至 5. 3,4. 5 至 5. 2,4. 5 至 5. 1,4. 5 至 5. 0,4. 5 至 4. 9,4. 5 至 4. 8,4. 5 至 4. 7、或4. 5至4. 6的范圍中的pH，。在一個實施方案中，緩沖液具有pH 4. 5、4.6、4. 7、4.8、4.8、5. 0,5. 1,5. 2,5. 3,5. 4,5. 5,5. 6,5. 7,5. 8,5. 9、或6. O。會控制pH在此范圍中的緩沖液的例子包括こ酸鹽、琥珀酸鹽、琥珀酸鹽、葡萄糖酸鹽、組氨酸、檸檬酸鹽、甘氨酰甘氨酸和其它有機酸緩沖液?！熬彼峋彌_液”為包含精氨酸離子的緩沖液。精氨酸緩沖液的例子包括精氨酸こ酸鹽、精氨酸氯化物、精氨酸磷酸鹽、精氨酸硫酸鹽、精氨酸琥珀酸鹽、等。在一個實施方案中，精氨酸緩沖液是精氨酸こ酸鹽。在一個實施方案中，精氨酸こ酸鹽緩沖液通過用こ 酸(液體)滴定L-精氨酸(游離堿，固體)來制備。在某些實施方案中，精氨酸緩沖液處于pH 4. 5 至 6. 0,4. 5 至 5. 9. 4. 5 至 5. 8,4. 5 至 5. 7,4. 5 至 5. 6,4. 5 至 5. 5,4. 5 至 5. 6,4. 5 至5. 5,4. 5 至 5. 4,4. 5 至 5. 3,4. 5 至 5. 2,4. 5 至 5. 1,4. 5 至 5. 0,4. 5 至 4. 9,4. 5 至 4. 8,4. 5至4. 7、或4. 5至4. 6。在一個實施方案中，緩沖液具有pH 4. 5、4. 6、4. 7、4. 8、4. 8、5. 0、5. I、
5.2、5. 3、5. 4、5. 5、5. 6、5. 7、5. 8、5. 9、或 6. 0。在本文中，“表面活性剤”指表面活性作用劑，優(yōu)選非離子型表面活性剤。本文中的表面活性劑的例子包括聚山梨酷(例如聚山梨酯20和聚山梨酯80) ；PoIoxamer (例如Poloxamer 188) ；Triton ;十ニ燒基硫酸鈉(SDS);月桂基硫酸鈉；辛基糖苷鈉；月桂基-、肉豆蘧基_、亞油基_、或硬脂酰基-磺基甜菜堿；月桂基_、肉豆蘧基_、亞油基_、或硬脂?；?肌氨酸；亞油基-、肉豆蘧基、或鯨蠟基-甜菜堿；月桂酰氨基丙基-、椰油酰氨基丙基-、亞油酰氨基丙基_、肉豆蘧酰氨基丙基_、棕櫚酰氨基丙基_、或異硬脂酰氨基丙基-甜菜堿(例如月桂酰氨基丙基);肉豆蘧酰氨基丙基_、棕櫚酰氨基丙基_、或異硬脂酰氨基丙基- ニ甲胺；甲基椰油基?；撬徕c或甲基油基牛磺酸ニ鈉；和M0NAQUAT 系列(Mona Industries,Inc. , Paterson, N. J.);聚こニ醇、聚丙ニ醇、及こニ醇和丙ニ醇共聚物(例如Pluronics、PF68等)；等。在一個實施方案中，本文中的表面活性劑為聚山梨酯20。在藥理學意義上，在本發(fā)明的語境中，抗體的“治療有效量”指有效預防或治療抗體可有效治療的病癥的量?！安“Y”為會受益于抗體處理的任何狀況。這包括慢性和急性病癥或疾病，包括那些使哺乳動物易患所討論病癥的病理狀況?！胺栏瘎睘槿缦碌幕衔铮淇扇芜x地包括在配制劑中以本質(zhì)上降低其中的細菌作用，如此便于生產(chǎn)例如多次使用配制劑。潛在防腐劑的例子包括十八烷基ニ甲基苯甲基氯化銨、氯己雙胺、苯扎氯銨(烴基苯甲基ニ甲基氯化銨的混合物，其中烴基是長鏈化合物)、和芐索氯銨。其它類型的防腐劑包括芳香醇諸如酚、丁醇和苯甲醇，烴基對羥基苯甲酸酯諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酷，鄰苯ニ酚，間苯ニ酚，環(huán)己醇，3-戊醇，和間甲酚。在ー個實施方案中，本文中的防腐劑為苯甲醇?！岸嘣肌睘榫哂卸鄠€羥基的物質(zhì)，而且包括糖(還原和非還原糖)、糖醇和糖酸。多元醇可任選地包括在配制劑中。在某些實施方案中，本文中的多元醇具有小于約600kD的分子量(例如在約120至約400kD的范圍中)?！斑€原糖”為含有能還原金屬離子或與蛋白質(zhì)中的賴氨酸和其它氨基共價反應的半縮醛基團的糖，而“非含有糖”為不具有還原糖的這些特性的糖。還原糖的例子有果糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖。非還原糖包括蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖和棉子糖。甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、蘇糖醇、山梨醇和甘油是糖醇的例子。至于糖酸，這些包括L-葡萄糖酸及其金屬鹽。在期望配制劑為凍融穩(wěn)定的情況中，多元醇優(yōu)選為在冷凍溫度(例如-20° C)不結(jié)晶的多元醇，使得它使配制劑中的抗體失穩(wěn)。在某些實施方案中，非還原糖諸如蔗糖和海藻糖是多元醇的例子，由于海藻糖的溶液穩(wěn)定性，優(yōu)選海藻糖勝過蔗糖。如本文中使用的，術語“VEGF”或“VEGF-A”指165個氨基酸的人血管內(nèi)皮細胞生長因子及相關的121個、189個和206個氨基酸的人血管內(nèi)皮細胞生長因子，如Leung etal. (1989) Science 246:1306;及 Houck et al. (1991)Mol. Endocrin. 5:1806 所述，及其天然存在等位基因形式和加工形式。術語“VEGF”還指來自非人物種諸如小鼠、大鼠或靈長類動物的VEGF。有時，來自特定物種的VEGF表示如下，hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示小鼠VEGF，等等。術語“VEGF”還用于指包含165個氨基酸的人血管內(nèi)皮細胞生長因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的截短形式多肽。本申請中可能通過例如“VEGF(8-109) ”、 "VEGF(1-109) ”或“VEGF165”來鑒別任何此類形式VEGF?！敖囟痰摹碧烊籚EGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示編號。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有與天然VEGF相當?shù)膶DR和Flt-I受體的結(jié)合親和力。“VEGF生物學活性”包括對任何VEGF受體的結(jié)合或任何VEGF信號傳導活性，調(diào)節(jié)諸如對正常的和異常的血管發(fā)生(angiogenesis)和脈管發(fā)生(vasculogenesis) (Ferrara和 Davis-Smyth(1997)Endocrine Rev.18:4-25;Ferrara(1999)J. Mol. Med. 77:527-543)；促進胚胎脈管發(fā)生和血管發(fā)生(Carmeliet et al. (1996) Nature 380:435-439; Ferrara etal. (1996)Nature 380:439-442);及調(diào)控雌性生殖道中的和為了骨生長和軟骨形成的周期性血管增通(Ferrara et al. (1998) Nature Med. 4:336-340; Gerber et al. (1999) NatureMed. 5:623-628)。在作為血管發(fā)生和脈管發(fā)生中的血管發(fā)生因子之外，VEGF，作為多效生長因子，在生理過程諸如內(nèi)皮細胞存活、血管通透性和血管舒張、單核細胞趨化性和鈣內(nèi)流中展現(xiàn)出多種生物學效應(Ferrara和Davis-Smyth (1997)，見上文；及Cebe-Suarez etal. Cell. Mol. Life Sci. 63:601-615 (2006))。此外，最近的研究報道了 VEGF對少數(shù)非內(nèi)皮細胞類型諸如視網(wǎng)膜色素上皮細胞、胰導管細胞、和許旺(Schwann)細胞的促有絲分裂效應(Guerrin et al. (1995)J. Cell Physiol. 164:385-394;Oberg-Welsh et al. (1997)Mol.Cell. Endocrinol. 126:125-132;Sondell et al. (1999)J. Neurosci. 19:5731-5740)?！癡EGF拮抗劑”或“VEGF特異性拮抗劑”指能夠結(jié)合VEGF，降低VEGF表達水平，或者中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF生物學活性(包括但不限于VEGF與ー種或多種VEGF受體的結(jié)合及由VEGF介導的血管發(fā)生和內(nèi)皮細胞存活或増殖)的分子。在本發(fā)明的方法中有用的VEGF特異性拮抗劑包括特異性結(jié)合VEGF的多肽、抗VEGF抗體及其抗原結(jié)合片段、特異性結(jié)合VEGF由此使其隔絕與ー種或多種受體結(jié)合的受體分子和衍生物、融合蛋白(例如 VEGF-Trap (Regeneron))、和 VEGF121-白樹毒素(Peregrine)。VEGF 特異性拮抗劑還包括VEGF多肽的拮抗性變體、針對VEGF的反義核堿基寡聚物、針對VEGF的小RNA分子、RNA適體、肽體、和針對VEGF的核酶。VEGF特異性拮抗劑還包括結(jié)合VEGF且能夠阻斷、抑制、消除、降低、或干擾VEGF生物學活性的非肽小分子。如此，術語“VEGF活性”明確包括VEGF介導的VEGF生物學活性。在某些實施方案中，VEGF拮抗劑將VEGF的表達水平或生物學活性降低或抑制了至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。“抗VEGF抗體”指以足夠親和カ和特異性結(jié)合VEGF的抗體。在某些實施方案中，所選擇的抗體通常會具有足夠的對VEGF的結(jié)合親和力，例如，該抗體可以以介于IOOnM-IpM之間的Kd值結(jié)合hVEGF?？贵w親和カ可通過例如基于表面等離振子共振的測定法(諸如PCT申請公開文本No. W02005/012359中所記載的BIAcore測定法)；酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA);和競爭測定法(例如RIA)來測定。在某些實施方案中，抗VEGF抗體可用作治療劑，用于靶向和干擾其中牽涉VEGF活性的疾病或疾患。還有，該抗體可進行其它生物學活性測定法，例如為了評估其作為治療劑的效力。此類測定法是本領域已知的，而且取決于抗體的靶抗原和預定用途。例子包括HUVEC抑制測定法；腫瘤細胞生長抑制測定法(如例如WO 89/06692中所記載的);抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)和補體介導的細胞毒性(CDC)測定法(美國專利5，500，362)； 及激動活性或造血測定法(參見WO 95/27062)?？筕EGF抗體通常不會結(jié)合其它VEGF同系物，諸如VEGF-B或VEGF-C，也不會結(jié)合其它生長因子，諸如P1GF、PDGF或bFGF。在一個實施方案中，抗VEGF抗體是與雜交瘤ATCC HB 10709所生成的單克隆抗VEGF抗體A4. 6. I結(jié)合相同表位的單克隆抗體。在另ー個實施方案中，抗VEGF抗體是依照Presta et al. (1997)Cancer Res. 57:4593-4599生成的重組人源化抗VEGF單克隆抗體，包括但不限于稱作貝伐單抗(Bevacizumab, BV ; AVASl IN )的抗體。抗VEGF 抗體“貝伐單抗(BV) ”，也稱作 “rhuMAb VEGF” 或“AVASTIN ” ,是ー種依照Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599生成的重組人源化抗VEGF單克隆抗體。它涵蓋突變的人IgGl框架區(qū)和來自鼠抗hVEGF單克隆抗體A. 4. 6. I (其阻斷人VEGF對其受體的結(jié)合)的抗原結(jié)合互補決定區(qū)。貝伐單抗大約93%的氨基酸序列，包括大部分框架區(qū)，衍生自人IgGl，而大約7%的序列衍生自小鼠抗體A4. 6. I。貝伐單抗具有約149，000道爾頓的分子量，而且是糖基化的。貝伐單抗和其它人源化抗VEGF抗體進ー步記載于2005年2月26日公告的美國專利No. 6，884，879，通過述及明確將其完整公開內(nèi)容收入本文。如本文中使用的，術語“B20系列多肽”指包括結(jié)合VEGF的抗體的多肽。B20系列多肽包括但不限于自B20抗體的序列衍生的抗體或美國公開文本No. 20060280747,美國公開文本No. 20070141065和/或美國公開文本No. 20070020267中記載的B20衍生抗體，通過述及明確將這些專利申請的內(nèi)容收入本文。在一個實施方案中，B20系列多肽是美國公開文本No. 20060280747,美國公開文本No. 20070141065和/或美國公開文本No. 20070020267中記載的B20-4. I。在另ー個實施方案中，B20系列多肽是美國專利申請60/991，302中記載的B20-4. I. 1，通過述及將其完整公開內(nèi)容收入本文。如本文中使用的，術語“G6系列多肽”指包括結(jié)合VEGF的抗體的多肽。G6系列多肽包括但不限于自G6抗體的序列衍生的抗體或美國公開文本No. 20060280747，美國公開文本No. 20070141065和/或美國公開文本No. 20070020267中記載的G6衍生抗體。美國公開文本No. 20060280747，美國公開文本No. 20070141065和/或美國公開文本No. 20070020267中記載的G6系列多肽包括但不限于G6_8, G6-23和G6-31。
對于別的抗體，參見美國專利No. 7，060，269，6，582，959，6，703，020; 6，054，297 ;W098/45332;W0 96/30046 ;W094/10202;EP 0666868B1;美國專利申請公開 No. 2006009360，20050186208，20030206899，20030190317，20030203409，和 20050112126;及 Popkov etal. , Journal of Immunological Methods 288:149-164(2004)。在某些實施方案中，其它抗體包括那些結(jié)合人 VEGF 上包含殘基 F17，M18, D19, Y21, Y25, Q89, 191，K101, E103,和 C104或者包含殘基F17，Y21, Q22, Y25, D63, 183和Q89的功能性表位的。還知道其它抗VEGF抗體，而且記載于例如Liang et al. , J Biol Chem281,951-961(2006)o“治療”指治療性處理和預防性或防范性措施二者。需要治療的受試者包括早就患有病癥的受試者以及要預防病癥的受試者?！安“Y”指將會從處理中獲益的任何疾患，包括但不限于慢性和急性病癥，或者包括那些使哺乳動物趨向于所討論病癥的病理狀況的疾病。病癥包括血管發(fā)生性病癥。如本文中使用的，“血管發(fā)生性病癥”指涉及異常血管發(fā)生 或異常血管通透性或滲漏的任何疾患。本文中要治療的血管發(fā)生性病癥的非限制性例子包括惡性和良性腫瘤；非白血病和淋巴樣惡性腫瘤；和特別是腫瘤(癌癥)轉(zhuǎn)移?！爱惓Ｑ馨l(fā)生”發(fā)生于病情中的或引起病情的新血管生長過度或其它方面不當(例如從醫(yī)學觀點看不良的血管發(fā)生位置、時機、程度、或啟動)吋。在一些情況中，過度的、失控的、或其它方面不當?shù)难馨l(fā)生發(fā)生于有促成病情惡化或引起病情的新血管生長時。新血管可供應患病組織，破壞正常組織，而且，在癌癥的情況中，新血管可容許腫瘤細胞逃入循環(huán)并停留在其它器官中(腫瘤轉(zhuǎn)移)。涉及異常血管發(fā)生的病癥的例子包括但不限于癌癥，尤其是血管化實體瘤和轉(zhuǎn)移瘤(包括結(jié)腸癌、肺癌(尤其是小細胞肺癌、或前列腺癌)，由眼部新血管形成引起的疾病尤其是糖尿病性失明、視網(wǎng)膜病變、原發(fā)性糖尿病性視網(wǎng)膜病變(primarily diabetic retinopathy)或老年性黃斑變性,脈絡膜新血管形成(CNV),糖尿病黃斑水腫，病理性近視，von Hippel-Lindau病，眼部組織胞漿菌病，視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(CRVO)，角膜新血管形成，視網(wǎng)膜新血管形成和發(fā)紅；銀屑病、銀屑病關節(jié)炎、成血管細胞瘤諸如血管瘤；炎性腎病，諸如腎小球腎炎，尤其是膜增生性腎小球腎炎、溶血性尿毒綜合征(haemolytic uremic syndrome)、糖尿病腎病或高血壓腎硬化；各種炎性疾病,諸如關節(jié)炎，尤其是類風濕性關節(jié)炎、炎性腸病、銀屑病、結(jié)節(jié)病、動脈硬化和移植后發(fā)生的疾病、子宮內(nèi)膜異位癥或慢性哮喘，及其它疾患。“異常血管通透性”發(fā)生于疾病狀態(tài)中的或引起疾病狀態(tài)的血管與血管外區(qū)室之間的流體、分子(例如離子和營養(yǎng)物)和細胞(例如淋巴細胞)的流動過度或其它方面不當(例如從醫(yī)學觀點看不良的血管通透性位置、時間、程度、或啟動)吋。異常血管通透性可導致過度的或其它方面不當?shù)碾x子、水、營養(yǎng)物、或細胞經(jīng)由血管系統(tǒng)“滲漏”。在有些情況中，過度的、失控的、或其它方面不當?shù)难芡ㄍ感曰蜓軡B漏加劇或誘發(fā)疾病狀態(tài)，包括例如與腫瘤(包括腦瘤)有關的水腫；與惡性腫瘤有關的腹水；梅格斯氏(Meigs)綜合征；肺部炎癥；腎病綜合癥征；心包積液；胸腔積液；與心血管疾病(諸如心肌梗死和中風后的疾患)有關的通透性等等。本發(fā)明涵蓋治療那些形成或有風險形成與異常血管通透性或滲漏有關的疾病和病癥的患者。術語“細胞増殖性病癥”和“增殖性病癥”指與一定程度的異常細胞增殖有關的病癥。在一個實施方案中，細胞增殖性病癥指癌癥。在一個實施方案中，細胞增殖性病癥是腫瘤。“腫瘤”在用于本文時指所有贅生性(neoplastic)細胞生長和増殖，無論是惡性的還是良性的，及所有癌前(pre-canceixms)和癌性細胞和組織。術語“癌癥”、“癌性”、“細胞増殖性病癥”、“增殖性病癥”和“腫瘤”在本文中提到時并不互相排斥。術語“癌癥”和“癌性”指向或描述哺乳動物中特征通常為細胞生長不受調(diào)節(jié)的生理疾患。癌癥的例子包括但不限于癌，淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌癥的更具體例子包括但不限于鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鱗癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌和胃腸基質(zhì)癌)、胰腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、黑素瘤、淺表擴散性黑素瘤、惡性雀斑樣痣黑素瘤、肢端黑素瘤、結(jié)節(jié)性黑素瘤、多發(fā)性骨髄瘤和B細胞淋巴瘤(包括低級/濾泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴細胞性(SL)NHL、中級/濾泡性NHL、中級彌漫性NHL、高級成免疫細胞性NHL、高級成淋巴細胞性NHL、高級小無核裂細胞性NHL、貯積病(bulky disease)NHL、套細胞淋 巴瘤、AIDS相關淋巴瘤、和瓦爾登斯特倫氏(Waldenstrom)巨球蛋白血癥)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、毛細胞性白血病、慢性成髓細胞性白血病、和移植后淋巴増殖性病癥(PTLD)、以及與瘢痣病(phakomatoses)、水腫(諸如與腦瘤有關的)和梅格斯氏(Meigs)綜合征有關的異常血管増殖、腦瘤和腦癌、以及頭頸癌、及相關轉(zhuǎn)移。在某些實施方案中，適合于通過本發(fā)明的抗體來治療的癌癥包括乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、腎細胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、軟組織肉瘤、卡波西(Kaposi)氏肉瘤、類癌癌(carcinoid carcinoma)、頭頸癌、卵巣癌、間皮瘤、和多發(fā)性骨髄瘤。在一些實施方案中，癌癥選自小細胞肺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、成神經(jīng)細胞瘤、黑素瘤、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌(CRC)、和肝細胞癌。還有，在ー些實施方案中，癌癥選自非小細胞肺癌、結(jié)腸直腸癌、成膠質(zhì)細胞瘤和乳腺癌，包括那些癌癥的轉(zhuǎn)移性形式。術語“抗癌療法”指在治療癌癥中有用的療法。抗癌治療劑的例子包括但不限于例如化療劑、生長抑制劑、細胞毒劑、放射療法中所使用的藥劑、抗血管發(fā)生劑、凋亡齊U、抗微管蛋白劑、和其它治療癌癥的藥劑，諸如抗ffiR-2抗體、抗CD20抗體、表皮生長因子受體(EGFR)拮抗劑(例如酪氨酸激酶抑制剤)、HER1/EGFR抑制劑(例如erlotinib(Tarceva ))、血小板衍生生長因子抑制劑(例如 Gleevec (Imatinib Mesylate) )、C0X-2抑制劑(例如celecoxib)、干擾素、細胞因子、結(jié)合一種或多種以下靶物的拮抗劑(例如中和性抗體)(ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR- ^、BlyS、APRIL、BCMA 或 VEGF 受體、TRAIL/Apo2)、和其它生物活性和有機化學剤，等。本發(fā)明還包括它們的組合?！把馨l(fā)生因子”或“血管發(fā)生劑”指涉及刺激血管發(fā)育，例如促進血管發(fā)生(angiogenesis)、內(nèi)皮細胞生長、血管穩(wěn)定性和/或血管生成(vasculogenesis)等的生長因子或其受體。例如，血管發(fā)生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成員及其受體(VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFRl、VEGFR2 和 VEGFR3)、P1GF、PDGF 家族、成纖維細胞生長因子家族び6 )、1'比配體(血管生成素、4如 1'1、4如 了2)、1'比1、1'1￡2、印111^11、8￥8、德爾塔樣配體4(DLL4)、Del-l、酸性(aFGF)和堿性(bFGF)成纖維細胞生長因子、FGF4、FGF9、BMP9、BMP10、卵泡抑素(Follistatin)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、GM-CSF、肝細胞生長因子(HGF)/ 散射因子(SF)、白介素-8(IL-8)、CXCL-12、L印tin、Midkine、神經(jīng)氈蛋白、NRPUNRP2、胎盤生長因子、血小板衍生內(nèi)皮細胞生長因子(H)-ECGF)、血小板衍生生長因子尤其是 PDGF-BB、PDGFR-a、或 PDGFR-0、Pleiotrophin (PTN)、Progranulin> Proliferin> 轉(zhuǎn)化生長因子-a 0^ -0)、轉(zhuǎn)化生長因子-@ (TGF-P)、腫瘤壞死因子-a (TNF-a )、Alkl、CXCR4、Notchl、Notch4> Sema3A、Sema3C、Sema3F、Robo4、等。它會進一步包括促進血管發(fā)生的因子，諸如ESMl和Perlecan。它還包括加速傷ロ愈合的因子，諸如生長激素、胰島素樣生長因子-I (IGF-I)、VIGF、表皮生長因子(EGF)、EGF樣域，多重7 (EGFL7)、CTGF及其家族的成員、及 TGF-a 和 TGF-旦。參見例如 Klagsbrun and D’Amore (1991) Annu. Rev.Physiol. 53:217-39;Streit and Detmar(2003)Oncogene 22:3172-3179;Ferrara&Alitalo(1999)Nature Medicine 5 (12):1359-1364;Tonini 等(2003)0ncogene22:6549-6556(例如列舉已知血管發(fā)生因子的表 I) ; Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206?！翱寡馨l(fā)生劑”或“血管發(fā)生抑制劑”指或直接或間接抑制血管發(fā)生(angiogenesis)、血管生成(vasculogenesis)、或不想要的血管通透性的小分子量物質(zhì)、多核苷酸(包括例如抑制性RNA (RNAi或siRNA))、多肽、分離的蛋白質(zhì)、重組蛋白、 抗體、或其偶聯(lián)物或融合蛋白。應當理解，抗血管發(fā)生劑包括那些結(jié)合并阻斷血管發(fā)生因子或其受體的血管發(fā)生活性的藥劑。例如，抗血管發(fā)生劑是上文定義的血管發(fā)生劑的抗體或其它拮抗劑，例如VEGF-A的或VEGF-A受體(例如KDR受體或Flt-I受體)的抗體、抗I3DGFR抑制劑、阻斷VEGF受體信號傳導的小分子(例如PTK787/ZK2284、SU6668、SUTENT /SUl 1248 (sunitinib malate)、AMG706、或那些記載于例如國際專利公開文本W(wǎng)O 2004/113304的)?？寡馨l(fā)生劑包括但不限于下述藥劑VEGF抑制劑諸如VEGF特異性拮抗劑、EGF抑制劑、EGFR抑制劑、Iirbituxi) (cetuximab, ImCloneSystems, Inc. , Branchburg, N. J ノ、VectlblX (panitumumab, Amgen, Thousand Oaks, CA)ヽTIE2抑制劑、IGFlR抑制劑、COX-II (環(huán)氧合酶II)抑制劑、MMP-2 (基質(zhì)金屬蛋白酶
2)抑制劑、和MMP-9(基質(zhì)金屬蛋白酶9)抑制劑、CP-547,632 (Pfizer Inc. , NY, USA)、Axitinib(Pfizer Inc. ;AG-013736)、ZD-6474(AstraZeneca)、AEE788(Novartis)、AZD-2171) ,VEGF Trap (Regeneron/Aventis)、Vatalanib (也稱作 PTK-787，ZK-222584:Novartis&Schering A G)、Macugen(pegaptanib octasodium, NX-1838, EYE-001, Pfizer Inc. /Gilead/Eyetech) > IM862 (Cytran Inc. of Kirkland, Wash. , USA);和 angiozyme (一種來自Ribozyme (Boulder, Colo.)和 Chiron (Emeryville, Calif.)的合成核酶)及其組合。其它血管發(fā)生抑制劑包括血小板反應蛋白I、血小板反應蛋白2、膠原IV和膠原XVIII。VEGF抑制劑披露于美國專利No. 6，534，524和No. 6，235，764，完整收錄二者用于所有目的。抗血管發(fā)生劑還包括天然血管發(fā)生抑制劑，例如血管他丁(angiostatin)、內(nèi)皮他丁(endostatin)、等。參見例如 Klagsbrun and Dj Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39; Streitand Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179 (例如列舉惡性黑素瘤中抗血管發(fā)生療法的表
3);Ferrara&Alitalo(1999)NatureMedicine 5(12):1359-1364;Tonini et al. (2003)Oncogene 22:6549-6556 (例如列舉已知抗血管發(fā)生因子的表2);及Sato (2003) Int.J. Clin. Oncol. 8:200-206(例如列舉臨床試驗中所使用的抗血管發(fā)生劑的表I)。術語“抗血管發(fā)生療法”指對于抑制血管發(fā)生有用的療法，其包括施用抗血管發(fā)生劑。術語“細胞毒劑”在用于本文時指抑制或防止細胞的功能和/或引起細胞死亡或破壞的物質(zhì)。該術語意圖包括放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素；化療劑，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、長春花生物堿類(vinca alkaloids)(長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅霉素(daunorubicin)或其它嵌入劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；和毒素，諸如小分子毒素或者細菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體；及下文披露的各種抗腫瘤藥或抗癌藥。下文記載了其它細胞毒劑。殺腫瘤藥引起腫瘤細胞的破壞?！岸舅亍敝改軌?qū)毎纳L或增殖產(chǎn)生有害效果的任何物質(zhì)?！盎焺敝缚捎糜谥委煱┌Y的化學化合物?；焺┑膶嵗瘎╊?alkylating agents),諸如塞替派(thiotepa)和環(huán)磷酰胺 (cyclophosphamide) (CYlOXAN );磺酸焼基酯類(alkyl sulfonates)，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙卩定類(aziridines)，諸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和烏瑞替派(uredepa)；乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemeIamine)、三乙撐憐酉先胺(triethylenephosphoramide)、三乙撐硫代憐酉先胺(triethylenethiophosphoramide)和三輕甲蜜胺(trimethylolomelamine);番蒸枝內(nèi)酯類(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));5_9-四氫大麻酷(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酌 (dronabinol), MARINOL )；￠ -拉帕醌(Iapachone)；拉帕醇(Iapachol);秋水仙素類(colchicines)；白樺脂酸(betulinic acid)；喜樹堿(camptothecin)(包括合成類似物托泊替康(topotecan) (HYCAMT1N )、CPT-Il (伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR ),乙酰喜樹堿、東莨菪亭(scopoletin)和9_氨基喜樹堿)；苔蘚抑素(bryostatin)；callystatin ;CC_1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinicacid);替尼泊苷(teniposide);隱藻素類(cryptophycins)(特別是隱藻素I和隱藻素8);多拉司他汀(dolastatin) ；duocarmycin (包括合成類似物，KW-2189和CBl-TMl);艾植塞洛素(eleutherobin) ；pancratistatin ；sarcodictyin ;海綿抑素(spongistatin);氮芥類(nitrogen mustards)，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽憐酸胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)憐酉先胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamineoxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽留醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲憐胺(trofosfamide)、尿啼 P定氮芥(uracil mustard);亞硝脲類(nitrosoureas)，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素YlI和加利車霉素coll (參見例如 Nicolaou et al.，Angew. Chem Intl. Ed. Engl. , 33:183-186(1994) ) ；CDP323, 一種口服a -4整聯(lián)蛋白抑制齊[I ;蒽環(huán)類抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A ;埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團和相關色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放線菌素 D (dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6_ 二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括ADRIAMYCIN⑩、嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射劑(DOXIL )、脂質(zhì)體多柔比星TLC D-99 (MYOCET )、peg化脂質(zhì)體多柔比星(CAELYX )、和脫氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcelIomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素 C、霉酷酸(mycophenolic acid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌 素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代謝物類，諸如甲氨蝶呤、吉西他濱(gemcitabine) ( GEMZAR )、替加氟(tegafur) ( UFTORAL )、卡培他濱(capecitabine) ( XELODA )、埃坡霉素(epothilone)和5_氟尿啼P定(5-FU);考布他汀(combretastatin);葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate) J票呤類似物，諸如氟達拉濱(f Iudarabine)、6_ 疏基票呤(mercaptopurine)、硫咪票呤(thiamiprine)、硫鳥 _呤(thioguanine);啼卩定類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(fIoxuridine);雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄焼(mepitiostane)、睪內(nèi)酉旨(testolactone);抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸(folinic acid);醋葡醒內(nèi)酯(aceglatone);醒磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside);氨基乙酉先丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿啼 P定(eniluracil)；安口丫 P定(amsacrine) ；bestrabucil ;比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地憐酉先胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine)；地口丫酉昆(diaziquone) ；elfornithine ；依利醋銨(elliptinium acetate) ；epothilone ；依托格魯(etoglucid);硝酸鎵；輕脲(hydroxyurea);香菇多糖(Ientinan);氯尼達明(Ionidamine);美登木素生物堿類(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)和安絲菌素(ansamitocin);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽酉昆(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol) ； 二胺硝口丫 P定(nitracrine);噴司他丁 (pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；卩比柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(Iosoxantrone) ；2~乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine) ； PSK⑩多糖復合物(JHS NaturalProducts，Eugene，OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西索菲蘭(sizofiran);螺旋錯(spirogermanium);細交鏈抱菌酮酸(tenuazonic acid);三亞胺醌(triaziquone)；2，2’，2"-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T_2毒素、疣孢菌素(verrucarin) A、桿抱菌素(roridin) A 和蛇行菌素(anguidin));烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine) ( ELDISINE , FILDES1N );達卡巴嗪(dacar bazine)；甘露醇氮芥(mannomustine) ; 二溴甘露醇(mitobronitol) ; 二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；哌泊溴焼(pipobroman) ；gacytosine ;阿糖胞苷(arabinoside) (“Ara_C”)；塞替派(thiotepa);類紫杉醇(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel) ( TAXOL ，Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J.)、清蛋白改造的納米顆粒劑型帕利他塞(ABRAXANE )和多西他塞(doxetaxel) (TAXOTFRF , Rhome-PouleneRorer，Antony，F(xiàn)rance);苯丁酸氮芥(chlorambucil) ;6_ 硫鳥_呤(thioguanine);巰基P票呤(mercaptopurine);甲氨蝶呤(methotrexate);鉬類似物，諸如順鉬(cisplatin)、奧沙利鉬(oxaliplatin)(例如ELOXATIN )和卡鉬(carboplatin);長春藥類(vincas)，其阻止微管蛋白聚合形成微管，包括長春堿(vinblastine) (VELBAN(S))、長春新減(vincristine) (ONCOVIN )、長春地辛(vindesine) (ELDISINE ,I ILDESIN )、和長春瑞濱(vinorelbine) (NAVELBINE );依托泊苷(etoposide)(VP-16);異環(huán)磷酰胺(ifosfamide);米托蒽酉昆(mitoxantrone);亞葉酸(Ieucovorin)；能滅瘤(novantrone);依達曲沙(edatrexate);道諾霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);伊本勝酸鹽(ibandronate);拓撲異構(gòu)酶抑制劑RFS 2000 ； 二氟甲基鳥氨酸(DMFO);類維A酸(retinoids)，諸如維A酸(retinoic acid)，包括貝沙羅汀(bexarotene) (I AR(. iRL I IN ^ )；...膦酸鹽類(bisphosphonates),諸如氯膦酸鹽(clodronate)(例如BONEFOS 或OSTAC )、依替膦酸鈉(etidronate) ( DIDROCAL )、NE-58095、唑來膦酸 / 唑來膦酸鹽(zoledronic acid/zoledronate) ( ZOMETA )、阿倫膦酸鹽(alendronate) ( FOSAMAX )、帕米膦酸鹽(pamidronate) ( AREDIA )、替魯膦酸鹽(tiludronate) ( SKEL1D )或利塞膦酸鹽(risedronate) ( ACTONEL .);以及曲沙他濱(troxacitabine) (I, 3_ 二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制牽涉異常細胞增殖的信號途經(jīng)中的基因表達的反義寡核苷酸，諸如例如PKC-a、Raf、H-Ras和表皮生長因子受體(EGF-R)(例如依洛替尼(erlotinib) (Tarceva ));和降低細胞增殖的VEGF-A ;疫苗，諸如THERATOPE⑩疫苗和基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN 疫苗、LEUVECTIN 疫苗和VAXID 疫苗；拓撲異構(gòu)酶I抑制劑(例如LURTOTECAN ); rmRH (例如ABARELIX );BAY439006 (sorafenib; Bayer) ;SU_11248 (sunitinib, SUTENT , Pfizer);哌立福辛(perifosine), C0X-2抑制劑(如塞來考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib)),蛋白體抑制劑(例如 PS341) ；bortezomib i V iiLCADLJi1 )； CCI-779 ；tipifarnib (R11577)；orafenib, ABT510 ;Bcl_2 抑制劑，諸如 oblimersen sodium ( GENASENSE );pixantrone ;EGFR抑制劑；酪氨酸激酶抑制劑；絲氨酸_蘇氨酸激酶抑制劑，諸如雷帕霉素(rapamycin) (sirolimus, RAPAIVIIjNL;.叫法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，諸如 lonafarnib (SCH6636, SARASARTM);及任何上述各項的藥學可接受鹽、酸或衍生物；以及兩種或更多種上述各項的組合，諸如CHOP (環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松龍聯(lián)合療法的縮寫)和FOLFOX (奧沙利鉬(ELOXATIN )聯(lián)合5-FU和亞葉酸的治療方案的縮寫)，及任何上述物質(zhì)的藥劑學可接受的鹽、酸或衍生物；以及兩種或多種上述物質(zhì)的組合。本文中所定義的化療劑包括“抗激素劑”或“內(nèi)分泌治療劑”，其作用于調(diào)節(jié)、降低、阻斷、或抑制能促進癌癥生長的激素的效果。它們自身可以是激素，包括但不限于抗雌激素類和選擇性雌激素受體調(diào)控物類(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括MJLY'ADiiX :1他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4_輕基他莫昔芬、曲沃昔芬(tr ioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和 FARTESTON+ 托瑞米芬(toremifene)；抑制在腎上腺中調(diào)節(jié)雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、MliGASiiS 醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMAS1N 依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIV1SOR. 伏羅唑(vorOZ0le)、FEMARA 來曲唑(letrozole)和’AR1MI—DEX 阿那曲唑(anastrozole);抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(Ieuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin);以及曲沙他濱(troxacitabine) (1，3_ 二氧戍環(huán)核苷胞喃唳類似物)；反義寡核苷酸,特別是抑制牽涉異常(abherant)細胞增殖的信號途經(jīng)中的基因表達的反義寡核苷酸，諸如例如PKC- a、Raf和H-Ras ;核酶，諸如VEGF表達抑制劑(例如ANGIOZYME 核酸)和HER2表達抑制劑;疫苗，諸如基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN 疫苗、LEUVECTIN 疫苗和VAX1D 疫苗；PROLEUKlN rIL-2 ;LURTOTECANf)拓撲異構(gòu)酶 I 抑制劑；AB AR Li LI X :K: rmRH ;長春瑞濱(Vinorelbine)和埃斯波霉素(Esperamicins)(見美國專利No. 4，675，187);及任何上述物質(zhì)的藥劑學可接受的鹽、酸或衍生物；以及兩種或多種上述物質(zhì)的組合。“生長抑制劑”在用于本文時指在體外或在體內(nèi)抑制細胞生長的化合物或組合物。在一個實施方案中，生長抑制劑是阻止或降低表達抗體所結(jié)合的抗原的細胞增殖的生長抑制性抗體。在另一個實施方案中，生長抑制劑可以是顯著降低處于S期的細胞百分比的藥劑。生長抑制劑的例子包括阻斷細胞周期行進(處于S期以外的位置)的藥劑，諸如誘導Gl停滯和M期停滯的藥劑。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長春藥類(vincas)(長春新堿(vincristine)和長春堿(vinblastine))、紫杉燒類(taxanes)、和拓撲異構(gòu)酶II抑制劑諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博來霉素(bleomycin)。那些阻滯Gl的藥劑也溢出進入S期停滯,例如DNA燒化劑類諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、達卡巴嗪(dacarbazine)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、順鉬(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5_ 氟尿喃唳(5-f IuorouraciI)和ara_C。更多信息可參見Mendelsohn和Israel編，《TheMolecular Basis of Cancer〉〉，第 I 章，題為 “Cell cycle regulation, oncogenes, andantieioplastic drugs，，,Murakaini 等人，WB Saunders, Philadelphia, 1995,例如第 13 頁。紫杉燒類(紫杉醇(paclitaxel)和多西他賽(docetaxel))是衍生自紫杉樹的抗癌藥。衍生自歐洲紫杉的多西他賽(IAXOI ERE , Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(IAXOL ,Bristol-Myers Squibb)的半合成類似物。紫杉醇和多西他賽促進由微管蛋白二聚體裝配成微管并通過防止解聚使微管穩(wěn)定，導致對細胞中有絲分裂的抑制?！胺派浏煼ā被颉胺暖煛敝甘褂枚ㄏ蛸ゑR射線或貝塔射線來誘發(fā)對細胞的足夠損傷，以限制細胞正常發(fā)揮功能的能力或全然破壞細胞。應當領會，本領域知道許多方式來確定治療的劑量和持續(xù)時間。典型的治療作為一次施用來給予，而典型的劑量范圍為每天10-200個單位(戈瑞(Gray))。用于治療目的的“哺乳動物”指歸入哺乳類的任何動物，包括人，家畜和牲畜，及動物園動物、體育運動用動物、或?qū)櫸飫游铮T如犬、馬、貓、牛等。優(yōu)選地，哺乳動物為人。本文中術語“抗體”以最廣義使用，明確覆蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學活性?！胺蛛x的”抗體指已經(jīng)鑒定且自其天然環(huán)境的成分分開和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指將會干擾該抗體的研究、診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和 其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在有些實施方案中，將抗體純化至(I)根據(jù)例如Lowry法的測定，抗體重量超過95%，而在有些實施方案中，重量超過99%，(2)足以通過使用例如轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE及使用例如考馬斯藍或銀染色，達到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分不會存在，那么分離的抗體包括重組細胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至少一個純化步驟來制備?！疤烊豢贵w”指通常由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重⑶鏈構(gòu)成的約150，000道爾頓的異四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數(shù)目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈間有變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規(guī)律的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在一端具有一個可變域(Vh)，接著是多個恒定域。每條輕鏈在一端具有一個可變域(')，而另一端是一個恒定域。輕鏈的恒定域與重鏈的第一恒定域排列在一起，而輕鏈的可變域與重鏈的可變域排列在一起。認為特定的氨基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形成界面。術語“恒定域”指免疫球蛋白分子中的如下部分，其相對于免疫球蛋白的其它部分，即含有抗原結(jié)合位點的可變域，具有更加保守的氨基酸序列。恒定域含有重鏈的Ch1、Ch2和Ch3域(合成CH)及輕鏈的CHL (或CL)域?？贵w的“可變區(qū)”或“可變域”指抗體重鏈或輕鏈的氨基末端結(jié)構(gòu)域。重鏈的可變域可以稱為“VH”。輕鏈的可變域可以稱為“VL”。這些結(jié)構(gòu)域一般是抗體的最易變部分且包含抗原結(jié)合位點。術語“可變的”指可變域中的某些部分在抗體間序列差異廣泛且用于每種特定抗體對其特定抗原的結(jié)合和特異性的實情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個可變域。它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作高變區(qū)(HVR)的三個區(qū)段。可變域中更加高度保守的部分稱作框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個FR區(qū)，它們大多采取￠-折疊片構(gòu)象，通過形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成￠-折疊片結(jié)構(gòu)一部分的三個HVR連接。每條鏈中的HVR通過FR區(qū)非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的HVR —起促成抗體的抗原結(jié)合位點的形成(參見 Kabat et al. , Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第 5 版，National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991))。恒定域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應器功能，諸如抗體在抗體依賴性細胞的細胞毒性中的參與。根據(jù)其恒定域的氨基酸序列，來自任何脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡帕(K)和拉姆達(入)。如本文中使用的，術語IgG “同種型”或“亞類”意指由其恒定區(qū)的化學和抗原特征定義的任何免疫球蛋白亞類。根據(jù)其重鏈恒定域的氨基酸序列，抗體(免疫球蛋白)可歸入不同的類。免疫球蛋白有五大類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進一步分為亞類(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。將與不同類的免疫球蛋白對應的重鏈恒定域分別稱作a、S、e、Y和ii。不同類別免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的，一般性描述于例如 Abbas et al. , Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W. B. Saunders, Co.，2000)。抗體可以是抗體與一種或多種其它蛋白質(zhì)或肽共價或非共價連接而形成的更大融合分子 的一部分。術語“全長抗體”和“完整抗體”在本文中可互換使用，指基本上完整形式的抗體，而非下文定義的抗體片段。該術語具體指重鏈包含F(xiàn)e區(qū)的抗體?！奥憧贵w(裸露的抗體)”為本發(fā)明目的指未偶聯(lián)細胞毒性模塊或放射性標記物的抗體。“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab' )2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段，稱為“Fab”片段，各自具有一個抗原結(jié)合位點，及一個剩余的“Fe”片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個F (ab’)2片段，它具有兩個抗原結(jié)合位點且仍能夠交聯(lián)抗原。“Fv”是包含完整抗原結(jié)合位點的最小抗體片段。在一個實施方案中，雙鏈Fv種類由緊密、非共價結(jié)合的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚體組成。在單鏈Fv(scFv)種類中，一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域可以通過柔性肽接頭共價相連接，使得輕鏈和重鏈可以在與雙鏈Fv種類類似的“二聚體”結(jié)構(gòu)中相結(jié)合。正是在這種構(gòu)造中，每個可變域的三個HVR相互作用而在Vh-' 二聚體表面上限定了一個抗原結(jié)合位點。六個HVR —起賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個可變域(或是只包含對抗原特異性的三個HVR的半個Fv)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，只是親和力低于完整結(jié)合位點。Fab片段包含重鏈和輕鏈可變域，而且還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CHl)。Fab’片段與Fab片段的不同之處在于重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab’ -SH是本文中對其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab’的稱謂。？(&13’)2抗體片段最初是作為在Fab’片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對Fab’片段生成的。還知道抗體片段的其它化學偶聯(lián)?！皢捂淔v”或“scFv”抗體片段包含抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。一般而言，scFv多肽在Vh與'結(jié)構(gòu)域之間進一步包含多肽接頭，其使得scFv能夠形成結(jié)合抗原的期望結(jié)構(gòu)。關于scFv的綜述參見例如Pliickthun,于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第 113 卷，Rosenburg 和 Moore 編，Springer-Verlag, New York, 1994,第 269-315 頁。術語“雙抗體”指具有兩個抗原結(jié)合位點的抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(Vh-Vl)中包含相連的重鏈可變域(Vh)和輕鏈可變域(')。通過使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對，從而產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。雙抗體可以是二價的或雙特異性的。雙抗體更完整的記載于例如 EP 404, 097;WO 1993/01161;Hudson et al.，Nat. Med. 9:129-134(2003);及 Hollingeret al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)。三抗體(Triabody)和四抗體(tetrabody)也記載于 Hudson et al.，Nat. Med. 9:129-134 (2003)。術語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，例如構(gòu)成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的突變，例如天然存在的突變。如此，修飾語“單克隆”表明抗體不是分立的抗體的混合物的特征。在某些實施方案中，此類單克隆抗體典型的包括包含結(jié)合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結(jié)合多肽序列是通過包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結(jié)合多肽序列在內(nèi)的過程得到的。例如，選擇過程可以是 從眾多克隆諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組DNA克隆的集合中選擇獨特克隆。應當理解，所選擇的靶物結(jié)合序列可進一步改變，例如為了提高對靶物的親和力、將靶物結(jié)合序列人源化、提高其在細胞培養(yǎng)物中的產(chǎn)量、降低其在體內(nèi)的免疫原性、創(chuàng)建多特異性抗體等，而且包含改變后的靶物結(jié)合序列的抗體也是本發(fā)明的單克隆抗體。與典型的包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，單克隆抗體制備物的每個單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。在它們的特異性外，單克隆抗體制備物的優(yōu)勢在于它們通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語“單克隆”表明抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應解釋為要求通過任何特定方法來生產(chǎn)抗體。例如，將依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過多種技術來生成，包括例如雜交瘤法(例如Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975) ; Hongo et al. , Hybridoma, 14(3):253-260(1995), Harlow et al. , Antibodies: A LaboratoryManual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press,第 2 版 1988);Hammerling et al.,于Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier, N. Y. , 1981))>重組DNA法(參見例如美國專利No. 4，816，567)、噬菌體展示技術(參見例如Clacksonet al. ,Nature352:624-628(1991);Marks et al.，J. Mol. Biol. 222:581-597(1992);Sidhuet al. , J. Mol. Biol. 338 (2) : 299-310 (2004) ; Lee et al. , J. Mol. Biol. 340 (5) : 1073-1093(2004) ;Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (34) : 12467-12472(2004) ;Lee etal. , J. Immunol. Methods 284 (1-2) : 119-132 (2004))、及用于在具有部分或整個人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動物中生成人或人樣抗體的技術(參見例如 WO 1998/24893;WO 1996/34096;WO 1996/33735;WO 1991/10741;Jakobovitset al.,Proc.Natl.Acad. Sci. USA 90:2551 (1993) ;Jakobovits et al., Nature362:255-258 (1993) ; Bruggemann et al. , Year in Immuno. 7:33 (1993);美國專利 No. 5，545, 807; 5, 545, 806; 5, 569, 825; 5, 625, 126; 5, 633, 425; 5, 661, 016; Marks et al. , Bio/Technology 10:779-783(1992);Lonberg et al. , Nature 368:856-859(1994);Morrison, Nature 368:812-813(1994);Fishwild et al. , Nature Biotechnol. 14:845-851 (1996);Neuberger, Nature Biotechnol. 14:826 (1996);Lonberg and Huszar, Intern. Rev.Immunol. 13:65-93(1995))。單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學活性(參見例如美國專利No. 4, 816, 567;Morrison et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。嵌合抗體包括“靈長類化”抗體，其中抗體的抗原結(jié)合區(qū)衍生自通過例如用感興趣抗原免疫獼猴而生成的抗體。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在一個實施方案中，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的HVR殘基用具有期望特異性、親和力和/或能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、家兔、或非人靈長類動物的HVR殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的FR殘基 用相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有找到的殘基?？梢赃M行這些修飾來進一步改進抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個、通常兩個基本上整個如下可變域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對應于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細節(jié)參見例如Joneset al. , Nature 321:522-525 (1986);Riechmann et al. , Nature 332:323-329(1988);和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)。還可參見例如 Vaswani andHamilton, Ann. Allergy, Asthma&Immunol. 1:105-115(1998);Harris, Biochem. Soc. Transactions23:1035-1038 (1995) ; Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994);及美國專利 No. 6，982，321 和 7，087，409?！叭丝贵w”指擁有與由人生成的抗體的氨基酸序列對應的氨基酸序列和/或使用本文所公開的用于生成人抗體的任何技術生成的抗體。人抗體的這種定義明確排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。人抗體可使用本領域已知的多種技術來生成，包括噬菌體展不文庫(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991) ;Marks et al. , J. Mol.Biol. 222:581 (1991))。還可用于制備人單克隆抗體的是以下文獻中記載的方法Cole etal. , Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77(1985);Boerner etal., J. Immunol. 147 (I) : 86-95 (1991)。還可參見 van Dijk and van de ffinkel, Curr. Opin.Pharmacol. , 5:368-74(2001)?？赏ㄟ^給已經(jīng)修飾以應答抗原性刺激而生成人抗體但其內(nèi)源基因組已經(jīng)失能的轉(zhuǎn)基因動物例如經(jīng)過免疫的異種小鼠(xenomice)施用抗原來制備人抗體(參見例如6，075，181和6，150，584，關于XEN0M0USE 技術)。還可參見例如Li etal. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)，關于經(jīng)人 B-細胞雜交瘤技術生成的人抗體?！拔锓N依賴性抗體”指對來自第一哺乳動物物種的抗原的結(jié)合親和力強于對來自第二哺乳動物物種的該抗原同系物的親和力的抗體。通常，物種依賴性抗體“特異性結(jié)合”人抗原(例如結(jié)合親和力(Kd)數(shù)值不超過大約1x10_7M，優(yōu)選不超過大約1x10_8M，且優(yōu)選不超過大約1x10_9M)，但是對來自第二非人哺乳動物物種的該抗原同系物的結(jié)合親和力比對人抗原的結(jié)合親和力弱至少大約50倍、或至少大約500倍、或至少大約1000倍。物種依賴性抗體可以是上文所定義的各種類型抗體中的任一種，但是優(yōu)選人源化抗體或人抗體。術語“高變區(qū)”、“HVR”或“HV”在用于本文時指抗體可變域中序列上高度可變和/或形成結(jié)構(gòu)上定義的環(huán)的區(qū)域。通常，抗體包含六個HVR :三個在VH中(HI、H2、H3)，三個在VL中(LI、L2、L3)。在天然抗體中，H3和L3展示這六個HVR的最大多樣性，而且認為特別是H3在賦予抗體以精密特異性中發(fā)揮獨特作用。參見例如Xu etal. , Immunity 13:37-45(2000);Johnson and Wu,于:Methods in Molecular Biology248:1-25 (Lo, ed. , Human Press, Totowa, NJ, 2003)。事實上，僅由重鏈組成的天然存在camelid抗體在缺乏輕鏈時是有功能的且穩(wěn)定的。參見例如Hamers-Casterman et al. Nature363:446-448, (1993);Sheriff et al. Nature Struct. Biol. 3:733-736, (1996)。本文中使用且涵蓋許多HVR的敘述。Kabat互補決定區(qū)(OTR)是以序列變異性為基礎的，而且是最常用的(Kabat et al. , Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothia 改為指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(Chothia and Lesk J. Mol.Biol. 196:901-917(1987)) o AbM HVR 代表 Kabat HVR 與 Chothia 結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗體建模軟件的使用?！敖佑|”HVR是以對可獲得的復合物晶體結(jié)構(gòu)的分析為基礎的。下文記錄了這些HVR中每一個的殘基。環(huán) KabatAbMChothia 接觸
義縁賴j— mi mm mm mmmm mm 痛 jiii mi mm縁嫌鑛 mm .1 mi mm 細嫌嫌痛mmmmmm mmmm mm mm .111 1111 mm mm.111 1111 mm mm mm-mt 嫌 mt ■_ mi
LIL24-L34L24-L34L26-L32L30-L36
LIL50-L56L50-L56L50-L52L46-L55
L3L89-L97L89-L97L91-L96L89-L96
HIH31-H35BM26-H35BH26-H32H30-H35B(ICabat編號)
ill H^l-H35 i!2(>-M35 ]12b-]i^2 ]!.>()-]
(ChotWa編號)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
U3 I f 102 I 卜).5-11102. H96-! i I (i I 11()3-1 MO!HVR 可包括如下“延伸的 HVR” VL 中的 24-36 或 24-34 (LI) ,46-56 或 50-56 (L2)和 89-97 或 89-96 (L3)及 VH 中的 26-35 (Hl) ,50-65 或 49-65 (H2)和 93-102,94-102 或95-102(H3)。對于這些定義中的每一個，可變域殘基是依照Kabat等，見上文編號的?！翱蚣堋被颉癋R”殘基指可變域中除本文中所定義的HVR殘基外的那些殘基。術語“依照Kabat的可變域殘基編號方式”或“依照Kabat的氨基酸位置編號方式”及其變化形式指Kabat et al.，見上文中的用于抗體重鏈可變域或輕鏈可變域編輯的編號系統(tǒng)。使用此編號系統(tǒng)，實際的線性氨基酸序列可包含較少或另外的氨基酸，對應于可變域FR或HVR的縮短或插入。例如，重鏈可變域可包含H2殘基52后的單一氨基酸插入(依照Kabat為殘基52a)及重鏈FR殘基82后的插入殘基(例如依照Kabat為殘基82a、82b和82c等)。給定抗體的Kabat殘基編號方式可通過將抗體序列與“標準”Kabat編號序列對比同源區(qū)來確定。Kabat編號系統(tǒng)一般在提及可變域中的殘基(大約是輕鏈殘基1_107和重鏈殘基 1-113)時使用(例如 Kabat et al. , Sequences of Immunological Interest. 5thEd.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) </‘EU編號系統(tǒng)”或“EU索引” 一般在提及免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)中的殘基時使用(例如Kabat etal.,見上文中報道的EU索引)?！叭鏚abat中的EU索引”指人IgGl EU抗體的殘基編號方式。表述“線性抗體”指Zapata 等(1995) Protein Eng, 8 (10) : 1057-1062 中所描述的抗體。簡言之，這些抗體包含一對串聯(lián)的Fd區(qū)段(Vh-ChI-Vh-ChI),該區(qū)段與互補的輕鏈多肽一起形成一對抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以是雙特異性的，或者是單特異性的。在用于本文時，“文庫”或“庫”指眾多抗體或抗體片段序列(例如本發(fā)明的多肽)，或者編碼這些序列的核酸，變異氨基酸組合方面不同的序列根據(jù)本發(fā)明方法導入這些序 列。“噬菌體展示”是一種將變體多肽作為與外殼蛋白至少一部分的融合蛋白展示在噬菌體(例如絲狀噬菌體)顆粒表面上的技術。噬菌體展示的效用在于能夠?qū)﹄S機化蛋白質(zhì)變體的大型文庫快速且高效分選那些能以高親和力與靶抗原結(jié)合的序列的實情。肽和蛋白質(zhì)文庫在噬菌體上的展示已經(jīng)用于對數(shù)以百萬計的多肽篩選那些具有特異性結(jié)合特性的多肽。多價噬菌體展示法已經(jīng)用于展示小隨機肽和小蛋白，其通過與絲狀噬菌體的基因III或基因 VIII 融合來實現(xiàn)。Wells and Lowman(1992)Curr. Opin. Struct. Biol. 3:355-362,及其中引用的參考文獻。在單價噬菌體展示中，將蛋白質(zhì)或肽文庫與基因III或其一部分融合，并在存在野生型基因III蛋白時以低水平表達，使得噬菌體顆粒展示一個拷貝的融合蛋白或者不展示融合蛋白。親合效應(avidity effect)相對于多價曬菌體得到了降低，使得分選基于內(nèi)在的配體親和力，而且使用曬菌粒載體，這簡化了 DNA操作。Lowman andWells (1991)Methods:A companion to Methods in Enzymology 3:205-0216?！笆删！笔蔷哂屑毦鷱椭破瘘c(例如ColEl)和一個拷貝的噬菌體基因區(qū)間的質(zhì)粒載體。噬菌?？衫萌魏我阎删w，包括絲狀噬菌體和X類噬菌體。質(zhì)粒一般也包含抗生素抗性的可選擇標志物。克隆入這些載體的DNA區(qū)段可以像質(zhì)粒一起而擴增。在給容納這些載體的細胞提供生成噬菌體顆粒所必需的所有基因時，質(zhì)粒的復制模式變成滾環(huán)復制，以生成質(zhì)粒DNA的一條鏈的拷貝，并包裝噬菌體顆粒。噬菌?？尚纬筛腥拘曰蚍歉腥拘允删w顆粒。此術語包括這樣的噬菌粒，它們包含與異源多肽基因連接成基因融合物的噬菌體外殼蛋白基因或其片段，使得異源多肽展示在噬菌體顆粒的表面上。II.用于實施本發(fā)明的方法本文中的發(fā)明涉及包含抗體的穩(wěn)定的含水配制劑。配制劑中的抗體使用本領域中用于生成抗體的可用技術來制備，下述各節(jié)更為詳細地描述了其例示性方法。抗體針對感興趣抗原。優(yōu)選地，抗原是生物學重要多肽，而且對罹患病癥的哺乳動物施用抗體可在該哺乳動物中導致治療好處。然而，也涵蓋針對非多肽抗原的抗體。在抗原是多肽的情況中，它可以是跨膜分子(例如受體)或配體，諸如生長因子。例不性抗原包括如下分子，諸如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) ；ox-LDL ；ox-ApoB100 ;腎素；生長激素，包括人生長激素和牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；a -I-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；黃體化激素；高血糖素；凝固因子，諸如因子VIIIC、因子IX、組織因子、和(馮)維勒布蘭德(von ffillebrand)氏因子；抗凝固因子，諸如蛋白C ;心房鈉尿因子；肺表面活性劑；纖溶酶原活化劑，諸如尿激酶或人尿型或組織型纖溶酶原激活劑(t-PA);林蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-a和-P ;腦啡肽酶；RANTES (活化時受到調(diào)節(jié)，正常情況由T-細胞表達和分泌)；人巨噬細胞炎性蛋白(MIP-1-a);血清清蛋白，諸如人血清清蛋白；穆勒(Muellerian)抑制性物質(zhì)；松弛素A-鏈；松弛素B-鏈；松弛素原；小鼠促性腺素相關肽；微生物蛋白質(zhì)，諸如P -內(nèi)酰胺酶；DNA酶；IgE ;細胞毒性T-淋巴細胞相關抗原(CTLA)，諸如CTLA-4 ;抑制素；活化素；激素或生長因子的受體；蛋白A或D ;類風濕因子；神經(jīng)營養(yǎng)因子，諸如骨衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、-4、-5、或-6 (NT_3、NT_4、NT-5、或NT-6)，或神經(jīng)生長因子，諸如NGF-P ;血小板衍生生長因子(TOGF);成纖維細胞生長因子，諸如aFGF和bFGF ;表皮生長因子(EGF);轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，諸如TGF- a和TGF- ^，包括 TGF-P I、TGF-P 2、TGF-P 3、TGF-P 4、或 TGF-P 5 ;胰島素樣生長因子-I 和-II (IGF-1和IGF-II) ；des (1-3)-IGF-I (腦IGF-I)，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白；CD蛋白，諸如CD3、⑶4、⑶8、⑶19和⑶20 ;紅細胞生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態(tài)生成蛋白(BMP);干 擾素，諸如干擾素-a、- P、和-Y ;集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSFjP G-CSF ；白介素(IL)，例如IL-I至IL-10 ;超氧化物歧化酶；T-細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，諸如例如AIDS被膜的一部分；運輸?shù)鞍?；歸巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；整聯(lián)蛋白，諸如 CDl la、CDl lb、CDl lc、CD18、I CAM、VLA-4 和 VCAM ;腫瘤相關抗原，諸如 HER2、HER3或HER4受體；和任何上文所列多肽的片段。在本發(fā)明的某些實施方案中，本發(fā)明所涵蓋的抗體的分子靶包括VEGF。在一個實施方案中，本文中的抗體為一種結(jié)合人VEGF的抗體。A.配制劑的制備在制備感興趣抗體之后(例如用于生產(chǎn)可如本文所述配制的抗體的技術會在下文中詳述且是本領域已知的)，制備包含它的藥物配制劑。在某些實施方案中，要配制的抗體未進行在先凍干，而且本文中的感興趣配制劑是含水配制劑。在某些實施方案中，抗體為全長抗體。在一個實施方案中，配制劑中的抗體為抗體片段，諸如F (ab’)2，在該情況中可能需要解決全長抗體可能不會發(fā)生的問題(諸如將抗體修剪成Fab)。考慮例如施用的期望劑量體積和模式來決定配制劑中存在的抗體的治療有效量。約0. lmg/mL至約250mg/mL、或約lOmg/mL至約200mg/mL或約50mg/mL至約175mg/mL是配制劑中的例示性抗體濃度。制備在pH緩沖溶液中包含抗體的含水配制劑。本發(fā)明的緩沖液具有在約4. 0至約6. 5的范圍中的pH。在某些實施方案中，pH在pH 4. 25至6. 25的范圍中，或在pH 4.5至6.0的范圍中，或在pH 4. 75至5. 75的范圍中，或在pH 5. 0至5. 5的范圍中，或在pH5. I至5. 4的范圍中。在本發(fā)明的某些實施方案中，配制劑具有5. 2或約5. 2的pH?？刂苝H在此范圍內(nèi)的緩沖液的例子包括乙酸鹽(例如精氨酸乙酸鹽或乙酸鈉)、琥珀酸鹽(諸如精氨酸琥珀酸鹽或琥珀酸鈉)、葡萄糖酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸緩沖液及其組合。緩沖液濃度可以為約ImM至約600mM，取決于例如配制劑的緩沖液和期望等張性。在某些實施方案中，緩沖液含有濃度為50mM至500mM、75mM至400mM、100mM至250mM、120mM至240mM、150mM至225mM、或175mM至210mM的精氨酸。在本發(fā)明的某些實施方案中，緩沖液含有濃度為200mM或約200mM的精氨酸。在一個實施方案中，緩沖液為精氨酸乙酸酯(例如200mM或約 200mM), pH 5. 2?？扇芜x地將表面活性劑添加至抗體配制劑。例示性表面活性劑包括非離子型表面活性劑，諸如聚山梨酯(例如聚山梨酯20、80等)或Poloxamer類(例如Poloxamer 188)。所添加的表面活性劑的量使得它降低所配制的抗體的聚集和/或使配制劑中的顆粒形成降至最低和/或降低吸附。例如，配制劑中存在的表面活性劑的量可以為約0. 001%至約0. 5%，約 0. 005% 至約 0. 2%,約 0. 01% 至約 0. 1%，或約 0. 02% 至約 0. 06%,或約 0. 03% 至約 0. 05%。在某些實施方案中，表面活性劑以0. 04%或約0. 04%的量存在于配制劑中。在一個實施方案中，配制劑不包含表面活性劑。在一個實施方案中，配制劑含有上文所述藥劑(例如抗體、緩沖液、和/或表面活
性劑)且基本上沒有一種或多種防腐劑，諸如苯甲醇、酚、間甲酚、氯丁醇和芐索氯銨。在另一個實施方案中，配制劑中可包括防腐劑，特別是配制劑為多劑配制劑的情況。防腐劑的濃度可以在約0. 1%至約2%，優(yōu)選約0. 5%至約1%的范圍中。配制劑中可包括一種或多種其它藥學可接受載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，諸如那些在Remington’s Pharmaceutical Sciences16th edition, Osol，A. Ed. (1980)中記載的，只要它們對配制劑的期望特征沒有不利影響?？山邮茌d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對接受者是無毒的，而且包括別的緩沖劑；共溶劑；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；螯合劑，諸如EDTA ;金屬復合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復合物)；生物可降解聚合物，諸如聚酯；和/或成鹽反荷離子。本文中的例示性藥學可接受載體進一步包括間質(zhì)藥物分散劑諸如可溶性中性活性透明質(zhì)酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明質(zhì)酸酶糖蛋白，諸如rHuPH20 (I IYLLNLX BaxterInternational, Inc.)。某些例示性sHASEGP及使用方法(包括rHuPH20)記載于美國專利公開文本No. 2005/0260186和No. 2006/0104968。在一個方面，sHASEGP與一種或多種別的糖胺聚糖酶諸如軟骨素酶組合。雖然本文中對螯合劑的各種描述常常集中于EDTA，但是要領會其它金屬離子螯合劑也涵蓋在本發(fā)明內(nèi)。金屬離子螯合劑是本領域技術人員公知的，而且包括但不必然限于氨基聚羧酸酯、EDTA (乙二胺四乙酸)、EGTA (乙二醇-二( P -氨基乙基醚)-N，N，N’，N’ -四乙酸)、NTA (氮川三乙酸)、EDDS (乙二胺二琥珀酸鹽)、PDTA (1，3-丙二胺四乙酸)、DTPA (二乙撐三胺五乙酸)、ADA (￠-丙氨酸二乙酸)、MGCA (甲基甘氨酸二乙酸)、等。另外，本文中的一些實施方案包含膦酸鹽/膦酸螯合劑。本文中的配制劑還可含有超過一種對所治療的特定適應證必需的蛋白質(zhì)，優(yōu)選那些具有互補活性的、對其它蛋白質(zhì)沒有不利影響的。例如，在抗體是抗VEGF抗體的情況中，可將它與另一藥劑(例如化療劑和抗腫瘤劑)組合。要用于體內(nèi)施用的配制劑應當是無菌的。這容易通過在制備配制劑之前或之后經(jīng)由無菌過濾膜過濾來實現(xiàn)。B.配制劑的施用依照已知方法將配制劑施用于需要用抗體治療的哺乳動物，優(yōu)選人，諸如靜脈內(nèi)施用，作為推注(bolus)或通過一段時間里的連續(xù)輸注，通過肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、表面、或吸入路徑。在一個實施方案中，通過靜脈內(nèi)施用將配制劑施用于哺乳動物。為了此類目的，可例如使用注射器或經(jīng)IV線注射配制劑。在一個實施方案中，通過皮下施用將配制劑施用于哺乳動物?？贵w的適宜劑量(“治療有效量”)將取決于例如要治療的狀況、狀況的嚴重性和過程、施用抗體是為了預防還是治療目的、先前的療法、患者的臨床史和對抗體的響應、所使用的抗體的類型、和主治內(nèi)科醫(yī)師的判斷。將抗體以一次或在一系列治療中合適地施用于患者，而且可在診斷后的任何時間施用于患者?？勺鳛槲ㄒ恢委熁蚺c在治療所討論的狀況中有用的其它藥物或療法聯(lián)合施用抗體。作為一般建議，所施用的抗體的治療有效量會在約0. I至約50mg/kg患者體重的范圍中，無論是通過一次或多次施用，所使用的抗體的典型范圍為約0. 3至約20mg/kg、優(yōu)選約0. 3至約15mg/kg，例如每日施用。然而，其它劑量方案也是有用的。在一個實施方案中，拮抗劑是抗VEGF抗體，以每1、2、3、或4周約100或400mg的劑量施用或以每1、2、3、或4周約1、3、5、7. 5、10、15、或20mg/kg的劑量施用。劑量可以作為單劑或作為多劑(例如2或3劑)施用，諸如輸注。此療法的進展容易通過常規(guī)技術來監(jiān)測。
C.抗體制備⑴抗原制備可溶性抗原或其片段(任選偶聯(lián)有其它分子的)可作為免疫原用于生成抗體。對于跨膜分子，諸如受體，它們的片段(例如受體的胞外結(jié)構(gòu)域)可用作免疫原。或者，表達跨膜分子的細胞可用作免疫原。此類細胞可衍生自天然來源(例如癌細胞系)，或者可以是經(jīng)重組技術轉(zhuǎn)化而表達跨膜分子的細胞。對于制備抗體有用的其它抗原及其形式對于本領域技術人員會是顯而易見的。(ii)某些基于抗體的方法多克隆抗體優(yōu)選通過在動物中多次皮下(SC)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關抗原和佐劑來生成。使用雙功能或衍生化試劑，例如馬來酰亞胺苯甲酰磺基琥珀酰亞胺酯(通過半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N=C=NR,其中R和R1是不同的烴基，將相關抗原與在待免疫物種中有免疫原性的蛋白質(zhì)偶聯(lián)可能是有用的，例如匙孔!戚血藍蛋白、血清清蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。通過將例如100 ii g或5 ii g蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物(分別用于兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混和并將該溶液皮內(nèi)注射于多個部位，將動物針對抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物進行免疫。一個月后，通過多個部位的皮下注射，用弗氏完全佐劑中初始量1/5-1/10的肽或偶聯(lián)物對動物進行加強免疫。7-14天后，采集動物的血液，并測定血清的抗體滴度。對動物進行加強免疫，直到滴度達到平臺(plateau)。優(yōu)選的是，將動物用相同抗原但與不同蛋白質(zhì)和/或通過不同交聯(lián)劑偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物進行加強免疫。偶聯(lián)物還可在重組細胞培養(yǎng)中作為蛋白質(zhì)融合物來制備。同樣，適當使用凝聚劑諸如明礬來增強免疫應答。本發(fā)明的單克隆抗體可使用雜交瘤方法來生成，其首先記載于Kohler etal. , Nature, 256:495 (1975)，并進一步記載于例如 Hongo et al. , Hybridoma, 14 (3)
:253-260 (1995), Harlow et al. , Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold SpringHarbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988) ;HammerIing et al., in : MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y. , 1981),和 Ni, XiandaiMianyixue, 26(4) :265-268(2006)，關于人-人雜交瘤。別的方法包括那些記載于例如U. S. Pat. No. 7, 189,826的，其關于自雜交瘤細胞系生成單克隆人天然IgM抗體。人雜交瘤技術(三兀雜交瘤(Trioma)技術)記載于 Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20 (3) :927-937 (2005)和 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings inExperimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)。關于各種雜交瘤技術，參見例如US 2006/258841 ；US 2006/183887 (完全人的抗體)；US 2006/059575 ；US 2005/287149 ；US 2005/100546 ；US2005/026229 ；和 U.S. Pat.Nos. 7，078，492和7，153，507。一種使用雜交瘤方法來生成單克隆抗體的例示性方案記載如下。在一個實施方案中，免疫小鼠或其它適宜宿主動物(諸如倉鼠)以引發(fā)生成或能夠生成會特異性結(jié)合用于免疫的蛋白質(zhì)的抗體的淋巴細胞。通過多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射本發(fā)明的多肽或其片段和佐劑諸如單磷脂酰脂質(zhì)A (MPL) /海藻糖二棒分枝菌酸酯(TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc.，Hamilton, MT),在動物中生成抗體。本發(fā)明的多肽(例如抗原)或其片段可使用本領域公知方法來制備，諸如重組方法，其中一些在本文中有進一步描述。對來自經(jīng)免疫動物的血清測定抗抗原抗體，并任選施用加強免疫。自生成抗抗原抗體的動物分離淋巴細胞?；蛘?，在體外免疫淋巴細胞。
然后使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以形成雜交瘤細胞。參見例如 Goding, Monoclonal Antibodies:Principles andPractice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)?？墒褂酶咝诤?、支持選定地抗體生成細胞穩(wěn)定地高水平生成抗體、且對培養(yǎng)基諸如HAT培養(yǎng)基敏感的骨髓瘤細胞。例示性的骨髓瘤細胞包括但不限于鼠骨髓瘤細胞，諸如那些衍生自M0PC-21和MPC-Il小鼠腫瘤(可得自索爾克(Salk)研究所細胞分發(fā)中心，San Diego, California USA)的，及SP-2或X63-Ag8-653細胞(可得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville, Maryland USA)的。人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系也記載用于生成人單克隆抗體(Kozbor，J.Immunol. , 133:3001 (1984) ;Brodeur et al., Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications, pp. 51-63(Marcel Dekker, Inc. , New York, 1987))。將如此制備的雜交瘤細胞在合適的培養(yǎng)基中接種和培養(yǎng)，例如含有抑制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的一種或多種物質(zhì)的培養(yǎng)基。例如，若親本骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基典型的會含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細胞生長。優(yōu)選地，使用無血清雜交瘤細胞培養(yǎng)方法來降低動物衍生血清的使用，諸如胎牛血清，如記載于例如Evenet al. , Trends in Biotechnology, 24(3)，105-108(2006)。作為提高雜交瘤細胞培養(yǎng)物生產(chǎn)力的工具的寡肽記載于Franek, Trends inMonoclonal Antibody Research, 111-122(2005)。具體地，標準培養(yǎng)基富含某些氨基酸(丙氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、脯氨酸)或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物級分，而且可通過由3-6個氨基酸殘基構(gòu)成的合成寡肽來顯著遏制凋亡。所述肽以毫摩爾或更高濃度存在?？蓪﹄s交瘤細胞正在其中生長的培養(yǎng)液測定結(jié)合本發(fā)明抗原的單克隆抗體的生成?？赏ㄟ^免疫沉淀或通過體外結(jié)合測定法，諸如放射免疫測定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)，測定由雜交瘤細胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過例如Scatchard分析來測定。參見例如Munson等，Anal.Biochem. 107:220(1980)。
在鑒定得到生成具有期望特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，該克隆可通過有限稀釋規(guī)程進行亞克隆并通過標準方法進行培養(yǎng)(參見例如Goding, supra)。適于這一目的的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細胞可以在動物中作為腹水瘤進行體內(nèi)培養(yǎng)。可通過常規(guī)免疫球蛋白純化規(guī)程,諸如例如蛋白A-Sepharose、輕磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析,將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)液、腹水或血清適當分開。一種用于自雜交瘤細胞分離蛋白質(zhì)的規(guī)程記載于US2005/176122和U. S. Pat. No. 6，919，436。該方法包括在結(jié)合過程中最低限度地使用鹽，諸如易溶鹽，而且優(yōu)選還在洗脫過程中使用少量的有機溶劑。(iii)某些文庫篩選方法本發(fā)明的抗體可以通過使用組合庫篩選具有期望活性的抗體來生成。例如，本領域知道用于構(gòu)建噬菌體展示庫及對此類文庫篩選具有期望的結(jié)合特性的抗體的多種方法。此類方法一般記載于 Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology178:1-37 (O’Brien et al. , ed. , Human Press, Totowa, NJ, 2001)。例如，一種產(chǎn)生感興趣抗 體的方法是經(jīng)由使用如Lee et al. , J. Mol. Biol. (2004)，340 (5) : 1073-93中所描述的噬菌體抗體文庫。原則上，通過篩選噬菌體文庫來選擇合成的抗體克隆，所述噬菌體文庫含有展示融合至噬菌體外殼蛋白的各種抗體可變區(qū)(Fv)片段的噬菌體。通過針對所需抗原的親和層析來淘選此類噬菌體文庫。表達能夠結(jié)合所需抗原的Fv片段的克隆被吸附至抗原，從而與文庫中不結(jié)合的克隆分開。然后將結(jié)合的克隆從抗原上洗脫，而且可以通過額外的抗原吸附/洗脫循環(huán)進一步富集。本發(fā)明的任何抗體可以如下獲得，即設計合適的抗原篩選規(guī)程來選擇感興趣的噬菌體克隆，接著使用來自感興趣的噬菌體克隆的Fv序列和 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，NIHPublication91-3242, Bethesda MD (1991),卷1-3中記載的合適的恒定區(qū)(Fe)序列來構(gòu)建全長抗體克隆。在某些實施方案中，抗體的抗原結(jié)合域由兩個約110個氨基酸的可變(V)區(qū)形成，分別來自輕鏈(VL)和重鏈(VH)，都呈現(xiàn)三個高變環(huán)(HVR)或互補決定區(qū)(CDR)?？勺冇蚩梢怨δ苄缘恼故驹谑删w上，或是作為單鏈Fv(ScFv)片段(其中VH和VL通過短的、柔性的接頭共價相連)，或者作為Fab片段(其中它們各自與恒定域融合且非共價相互作用)，如Winter 等,Ann. Rev. Immunol. , 12:433-455 (1994)所述。在用于本文時，編碼 scFv 的卩遼菌體克隆和編碼Fab的噬菌體克隆統(tǒng)稱為“Fv噬菌體克隆”或“Fv克隆”。VH和VL基因的全集可以通過聚合酶鏈式反應(PCR)分開克隆，并在噬菌體文庫中隨機重組，然后可以搜索抗原結(jié)合克隆，如Winter等，Ann. Rev.Immunol., 12:433-455(1994)所述。來自經(jīng)免疫來源的文庫提供對免疫原有高親和力的抗體，無需構(gòu)建雜交瘤?；蛘?，可以克隆未免疫的全集，用于為廣泛的非自身的及自身的抗原提供單一人抗體來源，無需任何免疫，如Griffiths等，EMBO J, 12:725-734(1993)所述。最后，未免疫的文庫還可以以合成方式來構(gòu)建，即從干細胞克隆未重排的V基因區(qū)段，并使用包含隨機序列的PCR引物來編碼高度可變的⑶R3區(qū)及用來在體外實現(xiàn)重排，如Hoogenboom和 Winter, J. Mol. Biol.，227:381-388(1992)所述。在某些實施方案中，通過與次要外殼蛋白pill融合，使用絲狀噬菌體來展示抗體片段。抗體片段可以展示為單鏈Fv片段，其中VH與VL結(jié)構(gòu)域通過柔性多肽間隔物在同一多肽鏈上相連，例如如Marks等，J. Mol. Biol.，222:581-597 (1991)所述，或者展示為Fab片段，其中一條鏈與pill融合，另一條鏈分泌入細菌宿主細胞周質(zhì)，在此裝配Fab-外殼蛋白結(jié)構(gòu)，其通過替換一些野生型外殼蛋白而展示在曬菌體表面上，例如如Hoogenboom等，Nucl. Acids Res.，19:4133-4137(1991)所述。一般而言，從收獲自人或動物的免疫細胞獲得編碼抗體基因片段的核酸。如果希望文庫偏向抗抗原克隆，那么可以給受試者免疫接種抗原以產(chǎn)生抗體應答，并回收脾細胞和/或循環(huán)B細胞或其它外周血淋巴細胞(PBL)用于文庫構(gòu)建。在一個實施方案中，如下得到了偏向抗抗原克隆的人抗體基因片段文庫，即在攜帶功能性人免疫球蛋白基因陣列(且缺乏功能性內(nèi)源抗體生成系統(tǒng))的轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生抗抗原抗體應答，使得抗原免疫接種產(chǎn)生生成針對抗原的人抗體的B細胞。生成人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠的生成在下文中有描述。可以如下獲得抗抗原反應性細胞群的進一步富集，即使用合適的篩選規(guī)程來分離表達抗原特異性膜結(jié)合抗體的B細胞，例如通過使用抗原親和層析進行的細胞分離或者細胞對熒光染料標記的抗原的吸附及后續(xù)的熒光激活細胞分選(flow-activated cell sorting, FACS)?；蛘?，來自未免疫供體的脾細胞和/或B細胞或其它PBL的使用提供了可能的抗體全集的更佳展現(xiàn)，而且還容許使用抗原在其中沒有抗原性的任何動物(人或非人的)物種構(gòu)建抗體文庫。對于構(gòu)建體外摻入抗體基因的文庫，從受試者收獲干細胞以提供編碼未重排抗體基因區(qū)段的核酸?？梢詮亩喾N動物物種(諸如人、小鼠、大鼠、兔類、luprine、犬、貓、豬、牛、馬和禽類物種等)獲得感興趣的免疫細胞。從感興趣的細胞回收編碼抗體可變基因區(qū)段(包括VH和VL區(qū)段)的核酸并擴增。就重排的VH和VL基因文庫而言，可以如下獲得所需DNA，即從淋巴細胞分離基因組DNA或mRNA，接著用與重排的VH和VL基因的5’和3’末端匹配的引物進行聚合酶鏈式反應(PCR)，如 Orlandi 等,Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)，86:3833-3837 (1989)所述，由此構(gòu)建多樣性V基因全集供表達?？梢詮腸DNA和基因組DNA擴增V基因，反向引物位于編碼成熟V結(jié)構(gòu)域的外顯子的5’末端，正向引物基于J區(qū)段內(nèi)部，如Orlandi等(1989)和 Ward 等，Nature, 341:544-546(1989)所述。然而，為了從 cDNA 進行擴增，反向引物還可基于前導外顯子內(nèi)，如Jones等,Biotechnol. , 9:88-89 (1991)所述，正向引物基于恒定區(qū)內(nèi)，如 Sastry 等,Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)，86:5728-5732 (1989)所述。為了使互補性最大化，引物中可以摻入簡并性，如Orlandi等(1989)或Sastry等(1989)所述。在某些實施方案中，如下將文庫多樣性最大化，即使用靶向每個V基因家族的PCR引物來擴增免疫細胞核酸樣品中存在的所有可獲得的VH和VL重排，例如如Marks 等,J. Mol. Biol. , 222:581-597 (1991)的方法中所述或 Orum 等,Nucleic AcidsRes. ,21:4491-4498(1993)的方法中所述。為了將所擴增的DNA克隆入表達載體，可以在PCR引物的一端引入罕見的限制性位點作為標簽，如Orlandi等(1989)所述，或者用帶標簽的引物進行進一步的PCR擴增，如Clackson等，Nature, 352:624-628(1991)所述。合成重排的V基因全集可以在體外從V基因區(qū)段衍生。大多數(shù)人VH基因區(qū)段已經(jīng)克隆和測序(Tomlinson 等，J. Mol. Biol.，227:776-798 (1992))，并定位(Matsuda等，Nature Genet. , 3:88-94 (1993));這些克隆的區(qū)段(包括Hl和H2環(huán)的所有主要構(gòu)造)可用于生成多樣性VH基因全集，用到編碼序列和長度多樣性的H3環(huán)的PCR引物，如 Hoogenboom 和 Winter, J. Mol. Biol.，227:381-388(1992)所述。VH 全集還可如下生成，所有序列多樣性集中于單一長度的長H3環(huán)，如Barbas等，Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 89:4457-4461 (1992)所述。人Vk和V入?yún)^(qū)段已經(jīng)克隆和測序(Williams和Winter, Eur. J. Immunol. , 23:1456-1461 (1993)),而且可用于生成合成輕鏈全集。基于一系列VH和VL折疊結(jié)構(gòu)及L3和H3長度的合成V基因全集將編碼具有可觀結(jié)構(gòu)多樣性的抗體。擴增編碼 V 基因的 DNA 后，依照 Hoogenboom 和 Winter, J. Mol. Biol.，227:381-388(1992)的方法，可以在體外重排種系V基因區(qū)段?？贵w片段全集可以如下構(gòu)建，即以數(shù)種方式將VH與VL基因全集聯(lián)合在一起?？梢栽诓煌d體中創(chuàng)建各個全集，并在體外重組載體，例如如Hogrefe等，Gene, 128:119-126 (1993)所述，或者在體內(nèi)通過組合感染來重組載體，例如Waterhouse 等，Nucl. Acids Res.，21:2265-2266 (1993)中記載的 IoxP 系統(tǒng)。體 內(nèi)重組方法利用Fab片段的雙鏈性質(zhì)來克服因大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率施加的庫容量限制。分開克隆未免疫的VH和VL全集，一個克隆入噬菌粒，另一個克隆入噬菌體載體。然后通過用噬菌體感染含噬菌粒的細菌使得每個細胞包含一種不同組合來聯(lián)合兩個文庫，庫容量只受細胞存在數(shù)的限制(約IO12個克隆)。兩種載體都包含體內(nèi)重組信號，使得VH與VL基因重組到單一復制子上，并共包裝成噬菌體病毒粒。這些巨型文庫提供了大量的具有優(yōu)良親和力OV1為約10_8M)的多樣性抗體?；蛘撸梢詫⑷蜇灴寺∪胪惠d體，例如如Barbas等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 88:7978-7982 (1991)所述，或者通過PCR裝配到一起，然后克隆，例如如Clackson等，Nature, 352:624-628(1991)所述。PCR裝配還可用于將VH和VL DNA與編碼柔性肽間隔物的DNA連接以形成單鏈Fv(ScFv)全集。在另一種技術中，“細胞內(nèi)PCR裝配”用于通過PCR在淋巴細胞內(nèi)聯(lián)合VH與VL基因，然后克隆所連接基因的全集，如Embleton等，Nucl.Acids Res.，20:3831-3837(1992)所述。未免疫文庫(天然的或合成的)生成的抗體可具有中等親和力(KtT1為約IO6-IO7M-1),但還可以如下在體外模擬親和力成熟，即構(gòu)建次生文庫并再次選擇，如Winter等(1994)，見上文所述。例如，在 Hawkins 等，J. Mol. Biol. ,226:889-896(1992)的方法或 Gram 等,Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:3576-3580 (1992)的方法中，使用易錯聚合酶在體外隨機引入突變(Leung等，Technique, 1:11-15(1989))。另外，可以通過隨機突變一個或多個CDR來進行親和力成熟，例如在選定的個別Fv克隆中使用攜帶跨越感興趣⑶R的隨機序列的引物進行PCR并篩選更高親和力的克隆。WO 9607754(公布于1996年3月14日)記載了用于在免疫球蛋白輕鏈的互補決定區(qū)中誘導誘變以創(chuàng)建輕鏈基因文庫的方法。另一種高效方法是將通過噬菌體展示選出的VH或VL結(jié)構(gòu)域與得自未免疫供體的天然存在V結(jié)構(gòu)域變體全集重組，并在數(shù)輪鏈改組中篩選更高親和力，如Marks等，Biotechnol.，10:779-783(1992)所述。此技術容許生成親和力約KT9M或小于KT9M的抗體和抗體片段。文庫的篩選可通過本領域已知的多種技術來實現(xiàn)。例如，抗原可用于包被吸附板的孔，在附著至吸附板的宿主細胞上表達，或用于細胞分選，或者偶聯(lián)至生物素以用鏈霉親合素包被的珠捕捉，或者用于淘選噬菌體展示庫的任何其它方法。
在適于至少部分噬菌體顆粒結(jié)合吸附劑的條件下，使噬菌體文庫樣品接觸固定化的抗原。正常情況下，選擇包括pH、離子強度、溫度等等的條件來模擬生理學條件。結(jié)合至固相的曬菌體進行清洗，然后用酸洗脫，例如如Barbas等，Proc.Natl. Acad. Sci USA, 88:7978-7982(1991)所述，或者用堿洗脫，例如如 Marks 等，J.Mol. Biol., 222:581-597(1991)所述，或者通過抗原競爭洗脫，例如在與Clackson等，Nature，352:624-628 (1991)的抗原競爭法類似的規(guī)程中。噬菌體在單輪選擇中可以富集20-1，000倍。此外，富集的噬菌體可以在細菌培養(yǎng)物中進行培養(yǎng)，并進行更多輪選擇。選擇的效率取決于許多因素，包括清洗過 程中解離的動力學，及單個噬菌體上的多個抗體片段是否能同時結(jié)合抗原。具有較快解離動力學(和弱結(jié)合親和力)的抗體可以通過使用短時間的清洗、多價噬菌體展示、及固相中的高抗原包被密度來保留。高密度不僅通過多價相互作用而穩(wěn)定了噬菌體，而且有利于已解離的噬菌體的再結(jié)合。具有較慢解離動力學(和強結(jié)合親和力)的抗體的選擇可以通過使用長時間的清洗和單價噬菌體展示(如Bass 等，Proteins, 8:309-314 (1990)和 WO 92/09690 所述)及低抗原包被密度(如 Marks等，Biotechnol.，10:779-783(1992)所述)來促進。有可能在對抗原具有不同親和力的噬菌體抗體之間進行選擇，甚至是親和力略有差異的。然而，選定抗體的隨機突變(例如如有些親和力成熟技術中所進行的)有可能產(chǎn)生許多突變體，多數(shù)結(jié)合抗原，少數(shù)具有更高的親和力。通過限制抗原，罕見的高親和力噬菌體能競爭勝出。為了保留所有較高親和力的突變體，可以將噬菌體與過量的生物素化抗原一起溫育，但是生物素化抗原的濃度以摩爾計低于抗原的目標摩爾親和常數(shù)。然后可以用鏈霉親合素包被的順磁珠捕捉高親和力的結(jié)合噬菌體。此類“平衡捕捉”容許依照結(jié)合親和力來選擇抗體，其靈敏性容許從大大過量的低親和力噬菌體中分離出親和力只有原值2倍的突變體克隆。還可以操作用于清洗結(jié)合至固相的噬菌體的條件來進行基于解離動力學的區(qū)分。抗抗原克隆可以基于活性進行選擇。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了結(jié)合天然表達抗原的活細胞或結(jié)合游離漂浮抗原或附著于其它細胞結(jié)構(gòu)的抗原的抗抗原抗體。對應于此類抗抗原抗體的Fv克隆可以如下選出(1)如上所述從噬菌體文庫分離抗抗原克隆，并任選通過在合適的細菌宿主中培養(yǎng)所分離的噬菌體克隆群來擴增該群體；(2)選出分別想要阻斷和不阻斷其活性的第二蛋白質(zhì)和抗原；(3)使抗抗原噬菌體克隆吸附至固定化的抗原；(4)使用過量的第二蛋白質(zhì)來洗脫任何不想要的、識別抗原結(jié)合決定簇(其與第二蛋白質(zhì)的結(jié)合決定簇交疊或共享)的克??；并(5)洗脫在步驟(4)后仍然吸附的克隆。任選的是，具有期望的阻斷/不阻斷特性的克隆可以通過一次或多次重復本文所述選擇規(guī)程來進一步富集。編碼本發(fā)明雜交瘤衍生單克隆抗體或噬菌體展示Fv克隆的DNA易于使用常規(guī)規(guī)程分離和測序(例如通過使用設計成自雜交瘤或噬菌體DNA模板特異性擴增感興趣的重鏈和輕鏈編碼區(qū)的寡核苷酸引物)。一旦分離，可將DNA置于表達載體中，然后將該表達載體轉(zhuǎn)染入原本不生成免疫球蛋白蛋白質(zhì)的宿主細胞，諸如大腸桿菌細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞，以在重組宿主細胞中獲得所需單克隆抗體的合成。關于編碼抗體的DNA在細菌中的重組表達的綜述性論文包括Skerra等，Curr. Opinion inImmunol. , 5:256 (1993)及 Pluckthun, Immunol. Revs, 130:151(1992)。
編碼本發(fā)明Fv克隆的DNA可以聯(lián)合編碼重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)的已知DNA序列(例如適宜的DNA序列可得自Kabat等，見上文)以形成編碼全長或部分長度重鏈和/或輕鏈的克隆。應當領會，任何同種型的恒定區(qū)都可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定區(qū)，而且此類恒定區(qū)可以得自任何人或動物物種。衍生自一種動物(諸如人)物種的可變域DNA，然后與另一動物物種的恒定區(qū)DNA融合以形成“雜合的”全長重鏈和/或輕鏈的編碼序列的Fv克隆包括在本文所用“嵌合”和“雜合”抗體的定義中。在某些實施方案中，衍生自人可變DNA的Fv克隆與人恒定區(qū)DNA融合以形成全長或部分長度人重鏈和/或輕鏈的編碼序列。還可以修飾編碼衍生自本發(fā)明雜交瘤的抗抗原抗體的DNA，例如通過替代，即用人重鏈和輕鏈恒定域的編碼序列替換衍生自雜交瘤克隆的同源鼠序列(例如如Morrison等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)中的方法)?？梢赃M一步修飾編碼雜交瘤或Fv克隆衍生抗體或片段的DNA，通過共價連接免疫球蛋白編碼序列和非免疫球蛋白多肽的整個或部分編碼序列?？梢砸栽摲绞街苽渚哂斜景l(fā)明的Fv克隆或雜交瘤克隆衍生抗體的結(jié)合特異性的“嵌合”或“雜合”抗體。
(iv)人源化抗體和人抗體本領域知道用于人源化非人抗體的多種方法。例如，人源化抗體具有一個或多個從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱為“輸入”殘基，它們通常取自“輸入”可變區(qū)?；旧峡勺裱璚inter及其同事的方法進行人源化(Jones et al. , Nature,321:522-525(1986);Riechmann et al. , Nature, 332:323-327(1988);Verhoeyen et al.,Science, 239:1534-1536(1988))，即用嚙齒類⑶R或⑶R序列替代人抗體的對應序列。因此，此類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利4，816，567)，其中顯著少于完整的人可變區(qū)用非人物種的相應序列替代。在實踐中，人源化抗體通常是如下人抗體，其中有些CDR殘基和可能的有些FR殘基用嚙齒類抗體類似位點的殘基替代。用于制備人源化抗體的人輕鏈和重鏈可變區(qū)的選擇對于降低抗原性是非常重要的。依照所謂的“最適(best-fit)”方法，用嚙齒類抗體的可變區(qū)序列對已知人可變區(qū)序列的整個文庫進行篩選。然后選擇與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的人框架(FR) (Sims et al. , J. TmmunoI. , 151:2296(1993);Chothia et al. , J.Mol. Biol. , 196:901 (1987))。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞類(subgroup)的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于幾種不同的人源化抗體(Carter et al. , Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89 : 4285 (1992) ; Presta et al. , J.ImmnoI.，151:2623(1993))。更為重要的是抗體在人源化后保留對抗原的高親和力和其它有利的生物學特性。為了達到此目的，依照該方法的一個實施方案，通過使用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物的過程來制備人源化抗體。通?？色@得免疫球蛋白三維模型，這是本領域技術人員所熟悉的。還可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機程序。通過檢查這些顯示圖像能分析殘基在候選免疫球蛋白序列發(fā)揮功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可以從受體序列和輸入序列中選出FR殘基并組合，從而得到期望的抗體特征，諸如對靶抗原的親和力升高。一般而言，高變區(qū)殘基直接且最實質(zhì)的涉及對抗原結(jié)合的影響。
本發(fā)明的人抗體可以通過如上所述聯(lián)合選自人衍生噬菌體展示庫的Fv克隆可變域序列與已知的人恒定域序列來構(gòu)建?；蛘?，可以通過雜交瘤方法來生成本發(fā)明的人單克隆抗體。用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系已有記載，例如Kozbor J. Tmmun01. , 133:3001(1984);Brodeur et al. , Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications, pp. 51-63(Marcel Dekker,Inc. , New York,1987);及Boerner et al. , J. Immunol. , 147:86(1991).例如，有可能生成在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫后生成人抗體完整全集的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)。例如，已經(jīng)記載了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合刪除導致內(nèi)源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉(zhuǎn)移大量人種系免疫球蛋白基因?qū)е略诳乖艉笊扇丝贵w。參見例如Jakobovits etal, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551(1993);Jakobovits et al. , Nature, 362:255-258 (1993);Bruggermann et al. , Year in Immuno.，7:33(1993);及 Duchosal et al. Nature355:258(1992)。
基因改組也可用于在體外自非人(例如嚙齒類)抗體衍生人抗體，其中人抗體具有與起始非人抗體相似的親和力和特異性。依照此方法，它也稱為“表位印記” Gpitopeimprinting)，如本文所述通過噬菌體展示技術得到的非人抗體片段的重鏈或輕鏈可變區(qū)用人V結(jié)構(gòu)域基因全集替換，產(chǎn)生非人鏈-人鏈scFv或Fab嵌合物群。用抗原進行的選擇導致非人鏈/人鏈嵌合scFv或Fab的分離，其中人鏈在一級噬菌體展示克隆中消除相應的非人鏈后恢復了抗原結(jié)合位點，即表位決定(印記，imprint)人鏈配偶體的選擇。在重復該過程以替換剩余非人鏈時，得到人抗體(參見PCT WO 93/06213，公開于1993年4月I日)。與傳統(tǒng)的通過CDR移植進行的非人抗體的人源化不同，此技術提供完全人的抗體，它們不含非人起源的FR或CDR殘基。(V)抗體片段抗體片段可以通過傳統(tǒng)手段來生成，諸如酶促消化，或者通過重組技術來生成。在某些情況中，使用抗體片段，而不是完整抗體有優(yōu)勢。片段的較小尺寸容許快速清除，而且可導致更易于到達實體瘤。某些抗體片段的綜述參見Hudson等(2003)Nat.Med. 9:129-134。已經(jīng)開發(fā)了用于生成抗體片段的多種技術。傳統(tǒng)上，通過蛋白水解消化完整抗體來衍生這些片段(參見例如 Morimoto 等，Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24:107-117(1992);及Brennan等，Science 229:81 (1985))。然而，現(xiàn)在可直接由重組宿主細胞生成這些片段。Fab、Fv和scFv抗體片段都可在大腸桿菌中表達和由大腸桿菌分泌，如此容許容易地生成大量的這些片段。可從上文討論的噬菌體抗體庫中分離抗體片段。或者，可直接從大腸桿菌回收Fab’-SH片段并化學偶聯(lián)以形成F(ab' )2片段(Carter等，Bio/Technology 10:163-167 (1992))。依照另一種方法，可直接從重組宿主細胞培養(yǎng)物分離F(ab’)2片段。包含補救受體結(jié)合表位殘基、具有延長的體內(nèi)半衰期的Fab和F(ab’)2片段記載于美國專利No. 5，869，046。用于生成抗體片段的其它技術對于熟練從業(yè)人員會是顯而易見的。在某些實施方案中，抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185;美國專利No. 5，571，894;及5，587，458。Fv和scFv是具有完整結(jié)合位點、缺少恒定區(qū)的唯一類型；如此，它們可能適于在體內(nèi)使用時降低非特異性結(jié)合?？蓸?gòu)建scFv融合蛋白以生成效應器蛋白質(zhì)在scFv的氨基或羧基末端的融合。參見Antibody Engineering, Borrebaeck編，見上文?？贵w片段還可以是“線性抗體”，例如如美國專利No. 5，641，870中所記載的。此類線性抗體可以是單特異性的或雙特異性的。(vi)多特異性抗體多特異性抗體具有對至少兩種不同表位的結(jié)合特異性，其中所述表位通常來自不同抗原。盡管此類分子通常只結(jié)合兩種不同表位(即雙特異性抗體，BsAb)，但是此表 述在用于本文時涵蓋具有額外特異性的抗體，諸如三特異性抗體?？蓪㈦p特異性抗體制備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab’ )2雙特異性抗體)。用于構(gòu)建雙特異性抗體的方法是本領域已知的。全長雙特異性抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)基于兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達，其中兩種鏈具有不同的特異性(Millstein等，Nature, 305:537-539 (1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物,其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過親和層析步驟進行的正確分子的純化相當麻煩且產(chǎn)物產(chǎn)量低。類似的規(guī)程披露于 W093/08829 及 Traunecker 等，EMBO J.，10:3655-3659(1991)。依照一種不同的方法，將具有期望結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點)的抗體可變域與免疫球蛋白恒定域序列融合。優(yōu)選的是，與包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定域進行融合。通常在至少一種融合物中存在包含輕鏈結(jié)合所必需的位點的第一重鏈恒定區(qū)(CHl)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和，在需要時，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達載體中，并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物體中。在用于構(gòu)建的三種多肽鏈比例不等時提供所期望的最佳產(chǎn)量的實施方案中，這為調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供了很大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比例表達導致高產(chǎn)量時或在該比例沒有特別意義時，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入一個表達載體。在該方法的一個實施方案中，雙特異性抗體由一個臂上具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個雙特異性分子中的存在提供了便利的分離途徑，因此發(fā)現(xiàn)這種不對稱結(jié)構(gòu)便于將期望的雙特異性復合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開。該方法披露于W094/04690。關于生成雙特異性抗體的進一步詳情參見例如Suresh等，Methods in Enzymology, 121:210 (1986)。依照W096/27011中記載的另一種方法，可改造一對抗體分子間的界面，以將從重組細胞培養(yǎng)物回收的異二聚體的百分比最大化。一種界面包含抗體恒定域的至少部分CH3結(jié)構(gòu)域。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個或多個小氨基酸側(cè)鏈用較大側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過將大氨基酸側(cè)鏈用較小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換，在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生與大側(cè)鏈相同或相似大小的補償性“空腔”。這提供了較之其它不想要的終產(chǎn)物諸如同二聚體提高異二聚體產(chǎn)量的機制。雙特異性抗體包括交聯(lián)的或“異源偶聯(lián)的”抗體。例如，可以將異源偶聯(lián)物中的一種抗體與親合素偶聯(lián)，而將另一種抗體與生物素偶聯(lián)。此類抗體已經(jīng)建議用于例如將免疫系統(tǒng)細胞靶向不想要的細胞(美國專利No. 4，676，980)和用于治療HIV感染(W0 91/00360, WO 92/200373,和EP 03089)。異源偶聯(lián)抗體可以使用任何方便的交聯(lián)方法來制備。合適的交聯(lián)劑連同許多交聯(lián)技術是本領域眾所周知的，而且披露于美國專利No. 4，676，980。文獻中還記載了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術。例如，可使用化學連接來制備雙特異性抗體。Brennan等，Science, 229:81 (1985)記載了通過蛋白水解切割完整抗體以生成F(ab’)2片段的規(guī)程。將這些片段在存在二硫醇絡合劑亞砷酸鈉的情況下還原，以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵的形成。然后將產(chǎn)生的Fab’片段轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼趸郊姿狨?TNB)衍生物。然后將Fab’-TNB衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢復成Fab’ -硫醇，并與等摩爾量的另一種Fab’ -TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。最新的進展便于從大腸桿菌直接回收Fab’-SH片段，這些片段可化學偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。也可以從大腸桿菌直接回收Fab’-SH片段，而且可以將這些片段化學偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。Shalaby等，J. Exp. Med.，175:217-225(1992)記載了完全人源化的 雙特異性抗體F(ab’)2分子的生成。由大腸桿菌分開分泌每種Fab’片段，并在體外進行定向化學偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。還記載了從重組細胞培養(yǎng)物直接生成和分離雙特異性抗體片段的多種技術。例如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。Kostelny等，J.Immunol.，148 (5) : 1547-1553 (1992)。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體的Fab’部分連接。抗體同二聚體在鉸鏈區(qū)還原以形成單體，然后重新氧化以形成抗體異二聚體。這種方法也可用于生成抗體同二聚體。Hollinger等，Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448(1993)記載的“雙抗體”技術提供了構(gòu)建雙特異性抗體片段的替代機制。該片段包含通過接頭相連的重鏈可變域(Vh)和輕鏈可變域(')，所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對。因此，迫使一個片段上的VH和VL結(jié)構(gòu)域與另一個片段上的互補\和Vh結(jié)構(gòu)域配對，由此形成兩個抗原結(jié)合位點。還報道了通過使用單鏈Fv(sFv) 二聚體構(gòu)建雙特異性抗體片段的另一種策略。參見Gruber等，J.Tmmun01. , 152:5368(1994)。設想了具有超過兩個效價的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tuft等，J.Immunol. , 147:60(1991)。(vii)單域抗體在有些實施方案中，本發(fā)明的抗體是單域抗體(single-domain antibody)。單域抗體是包含抗體的整個或部分重鏈可變域或者整個或部分輕鏈可變域的單一多肽鏈。在某些實施方案中，單域抗體是人單域抗體(Domantis, Inc. , Waltham, MA;參見例如美國專利No. 6，248，516B1)。在一個實施方案中，單域抗體由抗體的整個或部分重鏈可變域組成。(viii)抗體變體在有些實施方案中，涵蓋本文所述抗體的氨基酸序列修飾。例如，可能希望改進抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學特性。抗體的氨基酸序列變體可以是通過將適宜的變化引入編碼抗體的核苷酸序列或通過肽合成制備的。此類修飾包括例如抗體氨基酸序列內(nèi)的殘基刪除和/或插入和/或替代。可進行任何刪除、插入和替代組合以獲得最終的構(gòu)建物，倘若最終的構(gòu)建物具有期望的特征?？稍谥苽湫蛄袝r將氨基酸改變引入受試抗體的氨基酸序列。(ix)抗體衍生物
可進一步修飾本發(fā)明的抗體以包含本領域知道的且易于獲得的額外非蛋白質(zhì)性質(zhì)模塊。在某些實施方案中，適于抗體衍生化的模塊是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3- 二氧戊環(huán)、聚-1，3，6-三a惡烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或隨機共聚物)、右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。由于其在水中的穩(wěn)定性，聚乙二醇丙醛在生產(chǎn)中可能具有優(yōu)勢。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附著于抗體的聚合物數(shù)目可以變化，而且如果附著了超過一個聚合物，那么它們可以是相同或不同的分子。一般而言，可根據(jù)下列考慮來確定用于衍生化的聚合物的數(shù)目和/或類型，包括但不限于待改進抗體的具體特性或功能、抗體衍生物是否將用于指定條件下的治療等。(x)載體、宿主細胞、和重組方法也可以使用重組方法來生成抗體。為了重組生產(chǎn)抗抗原抗體，分離編碼抗體的核 酸，并將其插入可復制載體，用于進一步克隆(DNA擴增)或表達?？墒褂贸Ｒ?guī)規(guī)程容易的分離編碼抗體的DNA并測序(例如通過使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異結(jié)合的寡核苷酸探針)?？衫迷S多載體。載體構(gòu)件通常包括但不限于下列一種或多種信號序列、復制起點、一種或多種標志基因、增強子元件、啟動子、和轉(zhuǎn)錄終止序列。(a)信號序列構(gòu)件本發(fā)明的抗體不僅可以直接重組生產(chǎn)，而且可以作為與異源多肽的融合多肽，所述異源多肽優(yōu)選是成熟蛋白質(zhì)或多肽的N-末端處的信號序列或具有特異性切割位點的其它多肽。所選擇的異源信號序列優(yōu)選是受到宿主細胞識別并加工(例如受到信號肽酶切割)的。對于不識別和加工天然抗體信號序列的原核宿主細胞，所述信號序列用例如選自堿性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或熱穩(wěn)定腸毒素II前導序列的原核信號序列取代。為了酵母分泌，天然信號序列可以用例如酵母轉(zhuǎn)化酶前導序列、a因子前導序列(包括糖酵母屬和克魯維氏酵母屬a因子前導序列)、酸性磷酸酶前導序列、白色假絲酵母葡萄糖淀粉酶前導序列、或TO 90/13646中記載的信號取代。在哺乳動物細胞表達中，可以利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導序列，例如單純皰疫gD信號。(b)復制起點表達和克隆載體都包含能夠使載體在一種或多種所選擇的宿主細胞中復制的核酸序列。通常，在克隆載體中，這種序列是能夠使載體不依賴于宿主染色體DNA而復制的序列，包括復制起點或自主復制序列。眾所周知多種細菌、酵母和病毒的此類序列。來自質(zhì)粒PBR322的復制起點適合于大多數(shù)革蘭氏陰性細菌，質(zhì)粒起點適合于酵母，而各種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳動物細胞中的克隆載體。一般而言，哺乳動物表達載體不需要復制起點構(gòu)件(SV40起點的使用通常可能只是因為它包含早期啟動子)。(c)選擇基因構(gòu)件表達和克隆載體可包含選擇基因，也稱為選擇標志。典型的選擇基因編碼如下蛋白質(zhì)(a)賦予抗生素或其它毒素抗性，例如氨芐青霉素、新霉素、甲氨蝶呤、或四環(huán)素；(b)補足營養(yǎng)缺陷；或(C)提供不能由復合培養(yǎng)基獲得的關鍵營養(yǎng)物，例如編碼芽孢桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。選擇方案的一個實例利用藥物來阻滯宿主細胞的生長。用異源基因成功轉(zhuǎn)化的那些細胞生成賦予藥物抗性的蛋白質(zhì)，因而幸免于選擇方案。此類顯性選擇的實例使用藥物新霉素、霉酌'fe和潮霉素。適于哺乳動物細胞的選擇標志的另一個例子是能夠鑒定有能力攝取抗體編碼核酸的細胞的選擇標志，諸如DHFR、谷氨酰胺合酶(GS)、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I和-II優(yōu)選靈長類金屬硫蛋白基因、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。例如，通過將轉(zhuǎn)化子在含有甲氨蝶呤(Mtx) (DHFR的一種競爭性拮抗劑)的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)來鑒定經(jīng)DHFR基因轉(zhuǎn)化的細胞。在這些條件下，DHFR基因與任何其它共轉(zhuǎn)化的核酸一起擴增?？墒褂脙?nèi)源DHFR活性缺陷的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系(例如ATCCCRL-9096)。或者，通過將轉(zhuǎn)化子在含有L-甲硫氨酸亞砜亞胺(Msx) (L-methionine sulfoximine) (GS的一種抑制劑)的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)來鑒定經(jīng)GS基因轉(zhuǎn)化的細胞。在這些條件下，GS基因與任何其它共轉(zhuǎn)化的核酸一起擴增?？梢耘c上文描述的DHFR選擇/擴增系統(tǒng)組合地使用GS選擇/擴增系統(tǒng)?；蛘?，可以通過在含有針對選擇標志的選擇劑諸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素、或G418的培養(yǎng)基中的細胞生長來選擇經(jīng)編碼感興趣抗體、野生型DHFR基因、和另一種選擇標志諸如氨基糖苷3’-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)的DNA序列轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的宿主細胞(特別是包含內(nèi)源DHFR的野生型宿主)。參閱美國專利4，965，199。適用于酵母的選擇基因為存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的trpl基因(Stinchcomb etal. , Nature 282:39(1979))。trpl基因為缺乏在色氨酸中生長能力的酵母突變株，例如ATCC No. 44076 或 PEP4-1 提供了選擇標志。Jones, Genetics 85:12(1977).酵母宿主細胞基因組中存在trpl損害隨之提供了用于通過在不存在色氨酸下生長來檢測轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。類似的，用攜帶Leu2基因的已知質(zhì)粒補足Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20，622或38，626)。此外，衍生自^!!!!!環(huán)狀質(zhì)粒？! !的載體可用于轉(zhuǎn)化克魯維氏酵母屬酵母?；蛘?，報導了用于在乳酸克魯維氏酵母中大規(guī)模生產(chǎn)重組小牛凝乳酶的表達系統(tǒng)。Van denBerg, Bio/Technology 8:135(1990)。還披露了適用于通過克魯維氏酵母屬的工業(yè)菌株分泌成熟重組人血清清蛋白的穩(wěn)定多拷貝表達載體。Fleer et al. , Bio/Technology9:968-975(1991)。(d)啟動子構(gòu)件表達和克隆載體一般包含受到宿主生物體識別的啟動子，而且它與編碼抗體的核酸可操作連接。適用于原核宿主的啟動子包括PhoA啟動子、^ -內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)、堿性磷酸酶啟動子、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)、和雜合啟動子諸如tac啟動子。然而，其它已知的細菌啟動子也是合適的。用于細菌系統(tǒng)的啟動子還將包含與編碼抗體的DNA可操作連接的 Shine-Dalgarno (S. D.)序列。已知真核細胞的啟動子序列。事實上，所有真核基因都具有富含AT區(qū)，它位于起始轉(zhuǎn)錄的位點上游大約25至30個堿基處。在許多基因的轉(zhuǎn)錄起點上游70至80個堿基處找到的另一種序列是CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。在大多數(shù)真核基因的3’端是AATAAA序列，它可能是向編碼序列的3’端添加聚腺苷酸尾的信號。所有這些序列合適地插入真核表達載體。適用于酵母宿主的啟動子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動子，諸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡糖激酶。作為具有通過生長條件控制轉(zhuǎn)錄的額外優(yōu)點的誘導型啟動子的其它酵母啟動子是醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、及負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子區(qū)。適用于酵母表達的載體和啟動子進一步記載于EP 73，657。酵母增強子也可以有利的與酵母啟動子一起使用?？贵w在哺乳動物宿主細胞中自載體的轉(zhuǎn)錄可通過例如從病毒諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙肝病毒、猿猴病毒40(SV40)基因組，或從異源哺乳動物啟動子例如肌動蛋白啟動子或免疫球 蛋白啟動子，及從熱休克啟動子獲得的啟動子來控制，倘若此類啟動子與宿主細胞系統(tǒng)相容的話。方便的以SV40限制性片段的形式獲得SV40病毒的早期和晚期啟動子，該片段還包含SV40病毒復制起點。方便的以HindIII E限制性片段的形式獲得人巨細胞病毒的立即早期啟動子。美國專利No. 4，419，446中披露了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表達DNA的系統(tǒng)。美國專利No. 4，601，978中記載了該系統(tǒng)的一種改良。關于在小鼠細胞中在來自單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子的控制下表達人￠-干擾素cDNA還可參見Reyes et al. , Nature 297:598-601 (1982)?；蛘?，可以使用勞氏肉瘤病毒長末端重復序列作為啟動子。(e)增強子元件構(gòu)件常常通過將增強子序列插入載體來提高高等真核細胞對編碼本發(fā)明抗體的DNA的轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)在知道來自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰島素)的許多增強子序列。然而，通常使用來自真核細胞病毒的增強子。例子包括SV40復制起點晚期一側(cè)的增強子(bp 100-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒復制起點晚期一側(cè)的增強子、和腺病毒增強子。關于激活真核啟動子的增強元件還可參見Yaniv, Nature297:17-18 (1982)?？梢詫⒃鰪娮蛹艚拥捷d體中，位于抗體編碼序列的5’或3’位置，但是優(yōu)選位于啟動子的5’位點。(f)轉(zhuǎn)錄終止構(gòu)件用于真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細胞生物體的有核細胞)的表達載體還將包含終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。此類序列通?？梢詮恼婧嘶虿《綝NA或cDNA非翻譯區(qū)的5’端和偶爾的3’端獲得。這些區(qū)域包含在編碼抗體的mRNA的非翻譯部分中轉(zhuǎn)錄成聚腺苷酸化片段的核苷酸區(qū)段。一種有用的轉(zhuǎn)錄終止構(gòu)件是牛生長激素聚腺苷酸化區(qū)。參見WO 94/11026及其中披露的表達載體。(g)宿主細胞的選擇和轉(zhuǎn)化適于克隆或表達本文載體中的DNA的宿主細胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核細胞。適于此目的的原核生物包括真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科，諸如埃希氏菌屬(Escherichia)例如大腸埃希氏菌或大腸桿菌(E. coli)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella)例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌屬(Serratia)例如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescans)、志賀氏菌屬(Shigella)、以及芽孢桿菌屬(Bacilli)諸如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266，710中披露的地衣芽孢桿菌41P)、假單胞菌屬(Pseudomonas)諸如銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)、和鏈霉菌屬(Str印tomyces)。一種優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31，446)，盡管其它菌株諸如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)和大腸桿菌W3110 (ATCC 27, 325)也是合適的。這些例子是例示性的，而不是限制性的。可以在細菌中生產(chǎn)全長抗體、抗體融合蛋白、和抗體片段，特別是在不需要糖基化和Fe效應器功能時，諸如在將治療性抗體偶聯(lián)至自身在腫瘤細胞破壞方面顯示出效力的細胞毒劑(例如毒素)時。全長抗體在循環(huán)中具有較長的半衰期。大腸桿菌中的生成是較快的且較合算的。對于在細菌中表達抗體片段和多肽，參見例如U. S. 5，648，237 (Carteret. al. ),U. S. 5, 789, 199(Joly et al.)，U. S. 5，840，523 (Simmons et al.),其描述了使 表達和分泌優(yōu)化的翻譯起始區(qū)(TIR)和信號序列。還可參見Charlton, Methods in MolecularBiology,卷 248 (B. K. C. Lo,編,Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254，其描述了在大腸桿菌中表達抗體片段。表達后，可以在可溶性級分中自大腸桿菌細胞漿液分離抗體，并可以通過例如蛋白A或G柱(取決于同種型)來純化抗體。可以實施最終的純化，其類似于用于純化在例如CHO細胞中表達的抗體的工藝。在原核生物以外，真核微生物(諸如絲狀真菌或酵母)也是編碼抗體的載體的合適克隆或表達宿主。啤酒糖酵母或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常用的面包酵母在最常用的低等真核宿主微生物之中。然而，通常可獲得許多其它屬、種和菌株且可用于本發(fā)明，諸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe);克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主，諸如例如乳酸克魯維酵母(K. Iactis)、脆壁克魯維酵母(K. fragilis) (ATCC 12，424)、保加利亞克魯維酵母(K. bulgaricus) (ATCC 16，045)、威克克魯維酵母(K. wickeramii) (ATCC 24，178)、K. waltii (ATCC 56，500)、果蠅克魯維酵母(K. drosophilarum) (ATCC 36, 906)、耐熱克魯維酵母(K. thermotoIerans)和馬克思克魯維酵母(K. marxianus);亞羅酵母屬(Yarrowia) (EP 402, 226);巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris) (EP 183, 070);假絲酵母屬(Candida);瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234);粗糖脈抱菌(Neurospora crassa);許旺酵母屬(Schwanniomyces),諸如Schwanniomyces occidentalis ;和絲狀真菌，諸如例如脈抱菌屬(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、和曲霉屬(Aspergillus)宿主諸如構(gòu)巢曲霉(A. nidulans)和黑曲霉(A. niger)。關于討論酵母和絲狀真菌用于生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)的用途的綜述參見例如 Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)?？蛇x擇如下的某些真菌和酵母株，其中糖基化途徑已經(jīng)“人源化”，導致具有部分或完全人的糖基化樣式的抗體的生成。參見例如Li et al. ,Nat.Biotech. 24:210-215(2006)(記載了巴斯德畢赤氏酵母中糖基化途徑的人源化)；及Gerngross et al.,見上文。
適于表達糖基化抗體的宿主細胞也衍生自多細胞生物體(無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細胞的例子包括植物和昆蟲細胞。已經(jīng)鑒定了許多桿狀病毒株和變體及相應的允許昆蟲宿主細胞，它們來自諸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蜆(Drosophilamelanogaster)(果蜆)和家蠶(Bombyx mori)等宿主。公眾可獲得多種病毒株用于轉(zhuǎn)染，例如苜猜尺蠖 Autographa californica NPV 的 L-1 變體和家香 Bombyx mori NPV 的 Bm_5株，而且此類病毒可依照本發(fā)明用作本文中的病毒，特別是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細胞。還可利用棉、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄、浮萍(Lemnaceae)、苜蓿(M. truncatula)、和煙草的植物細胞培養(yǎng)物作為宿主。參見例如美國專利No. 5，959，177;6，040，498; 6，420，548; 7，125，978;和6，417，429 (描述用于在轉(zhuǎn)基因植物中生產(chǎn)抗體的PLANTIBODIES 技術)?？墒褂眉棺祫游锛毎鳛樗拗?，而且培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中脊椎動物細胞的繁殖已經(jīng)成為常規(guī)規(guī)程。有用哺乳動物宿主細胞系的例子是經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CVl系 (COS-7, ATCC CRL 1651);人胚腎系(293或為了在懸浮培養(yǎng)中生長而亞克隆的293細胞，Graham et al. , J. Gen Virol. 36:59 (1977));幼倉鼠腎細胞(BHK, ATCC CCL 10);小鼠塞托利(sertoli)細胞(TM4, Mather, Biol. R印rod. 23:243-251 (1980));猴腎細胞(CVljATCCCCL 70);非洲綠猴腎細胞(VER0-76, ATCC CRL-1587);人宮頸癌細胞(HELA, ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK, ATCC CCL 34);牛鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A, ATCC CRL1442);人肺細胞(W138, ATCC CCL 75);人肝細胞(Hep G2, HB 8065);小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL51) ;TRI 細胞(Mather et al. ,Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982) ;MRC5 細胞；FS4 細胞；和人肝瘤系(Hep G2)。其它有用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括 DHFR-CHO 細胞(Urlaub et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216(1980));和骨髓瘤細胞細胞系，諸如NSO和Sp2/0。關于適合于抗體生產(chǎn)的某些哺乳動物宿主細胞系的綜述參閱例如 Yazaki and ffu, Methods in Molecular Biology,卷 248 (B. K. C. Lo,編，HumanaPress, Totowa, NJ, 2003), pp. 255-268。用上文所述用于生產(chǎn)抗體的表達或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，并在為了誘導啟動子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴增編碼期望序列的基因而適當更改的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。(h)培養(yǎng)宿主細胞可以在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生產(chǎn)本發(fā)明抗體的宿主細胞。商品化培養(yǎng)基諸如 Ham 氏 FlO(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM, Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)、和 Dulbecco 氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)適于培養(yǎng)宿主細胞。另外，可以使用下列文獻中記載的任何培養(yǎng)基作為宿主細胞的培養(yǎng)基Ham et al.，Meth. Enz. 58:44(1979) ;Barneset al. , Anal. Biochem. 102:255 (1980);美國專利 No. 4，767，704 ;4，657，866 ;4，927，762 ；4，560，655 ;或 5，122，469 ；W0 90/03430 ；W0 87/00195 ;或美國專利 Re. 30，985。任何這些培養(yǎng)基可以根據(jù)需要補充激素和/或其它生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCIN 藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無機化合物)、和葡萄糖或等效能源。還可以以適宜濃度包含本領域技術人員知道的任何其它必需補充物。培養(yǎng)條件(諸如溫度、PH等)就是先前為表達而選擇用于宿主細胞的，這對于普通技術人員而言是顯而易見的。(xi)抗體的純化在使用重組技術時，可以在細胞內(nèi)、在周質(zhì)空間中生成抗體，或者直接分泌到培養(yǎng)基中。如果在細胞內(nèi)生成抗體，那么作為第一步，通過例如離心或超濾除去宿主細胞或裂解片段的微粒碎片。Carter et al.，Bio/TechnologylO: 163-167 (1992)記載了用于分離分泌到大腸桿菌周質(zhì)空間的抗體的規(guī)程。簡單的說，在存在乙酸鈉(pH 3. 5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)時使細胞糊融化約30分鐘?？赏ㄟ^離心除去細胞碎片。如果將抗體分泌到培養(yǎng)基中，那么一般首先使用商品化蛋白質(zhì)濃縮濾器，例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元濃縮來自此類表達系統(tǒng)的上清液。在任何上述步驟中，可以包括蛋白酶抑制劑諸如PMSF來抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素來防止外來污染物的生長?？梢允褂美缌u磷灰石層析、疏水相互作用層析、凝膠電泳、透析和親和層析來純化由細胞制備的抗體組合物，其中親和層析是優(yōu)選的純化步驟之一。蛋白A作為親和配體的適宜性取決于抗體中存在的任何免疫球蛋白Fe區(qū)的種類和同種型。蛋白A可用于純化基于人 y1、y2 或 Y 4 重鏈的抗體(Lindmark et al. , J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))。蛋白G推薦用于所有小鼠同種型和人Y 3 (Guss et al. , EMBO J. 5:1567-1575 (1986))。親和配體所附著的基質(zhì)最常用的是瓊脂糖，但是可以使用其它基質(zhì)。物理穩(wěn)定的基質(zhì)諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能夠獲得比瓊脂糖更快的流速和更短的加工時間。若抗體包含G3結(jié)構(gòu)域,則可使用Bakerbond ABX 樹脂(J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)進行純化。根據(jù)待回收的抗體，也可使用其它蛋白質(zhì)純化技術，諸如離子交換柱上的分級、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的層析、肝素SEPHAROSE 上的層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬氨酸柱)上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸銨沉淀。一般而言，用于制備供研究、測試、和臨床中使用的抗體的各種方法學是本領域完善建立的，與上文所述方法學一致，和/或是本領域技術人員認為適合于特定的感興趣抗體的。D.選擇生物學活性抗體可對如上所述生成的抗體進行一種或多種“生物學活性”測定法以選擇從治療觀點看具有有益特性的抗體。可對抗體篩選其結(jié)合生成它時所針對的抗原的能力。例如，抗VEGF抗體，如下文實施例所示，可在檢測結(jié)合VEGF的能力的測定法中評估抗體的抗原結(jié)合特性。在另一個實施方案中，可通過例如飽和結(jié)合；ELISA ;和/或競爭測定法(例如RIA)來測定抗體的親和力。還有，可對抗體進行其它生物學活性測定法，例如為了評估它作為治療劑的有效性。此類測定法是本領域已知的且依賴于抗體的靶抗原和預定用途。為了篩選結(jié)合感興趣抗原上的特定表位的抗體(例如那些阻斷例如抗VEGF抗體結(jié)合VEGF的)，可實施常規(guī)交叉阻斷測定法，諸如Antibodies, A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory, Ed Harlow 和 David Lane (1988)中記載的?；蛘撸蓪嵤┍砦蛔鲌D例如如Champe et al.，J. Biol. Chem. 270 :1388-1394 (1995)所述來測定抗體是否結(jié)合感興趣表位。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供制品，其包含裝有本發(fā)明含水藥物配制劑的容器，而且任選提供它的使用說明。合適的容器包括例如瓶、管形瓶和注射器。容器可用各種材料制成，諸如玻璃或塑料。一種例示性的容器為3-20CC—次使用的玻璃管形瓶?；蛘?，對于多劑配制劑，容器可以是3-lOOcc玻璃管形瓶。容器裝有配制劑，而且該容器上或關聯(lián)的標簽可指示使用說明。制品可進一步包括從商業(yè)和用戶立場看想要的其它材料，包括其它緩沖劑、稀釋劑、濾器、針頭、注射器、和印有使用說明的包裝插頁。通過參考下述實施例，會更加全面地理解本發(fā)明。然而，它們不應解釋為限制本發(fā)明的范圍。通過述及將所有文獻和專利引用收入本文。認為本說明書足以使得本領域技術人員實施本發(fā)明。根據(jù)上述描述，在本文所示和所述之外對本發(fā)明的各種更改對本領域技術人員會變得顯然，且落在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。通過述及將本文中引用的所有出版物、專利、和專利申請完整收入本文，用于所有目的。
實施例要理解，本文中描述的實施例和實施方案只是出于例示目的，而且根據(jù)它們，本領域技術人員會想到各種變更和變化，而且它們被包括在本申請的精神和范圍及所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。 實施例I :穩(wěn)定的抗VEGF抗體液體配制劑這個例子描述穩(wěn)定的液體配制劑的開發(fā)和穩(wěn)定性測試，該穩(wěn)定的液體配制劑以約20mg/mL-200mg/mL的范圍中的蛋白質(zhì)濃度在包含組氨酸、精氨酸、乙酸鹽、或氯化鈉的多種液體配制劑中包含抗VEGF抗體。將ImL每種配制劑在3cc玻璃管形瓶中保存于40° C并于1、2、和4周時評估穩(wěn)定性。通過數(shù)種測定法來監(jiān)測抗VEGF的穩(wěn)定性，包括UV (用于濃度和濁度)、大小排阻層析(SEC)(用于大小變體分析)、成像毛細管等電聚焦(icIEF)(用于電荷變體分析)、CE-SDS (用于大小分布)和結(jié)合測定法(用于活性)。4周的穩(wěn)定性測試后，我們的結(jié)果指示抗VEGF在200mM精氨酸乙酸鹽、150mM氯化鈉、0. 04%PS20、pH 5. 2中是穩(wěn)定的。在多種包含組氨酸、氯化鈉、精氨酸、和乙酸鹽的液體配制劑中研究了抗VEGF的穩(wěn)定性(例如聚集物形成、粘度、等)。通過數(shù)種測定法來監(jiān)測抗VEGF的穩(wěn)定性，包括大小排阻層析(SEC)(用于聚集物形成分析)。我們的結(jié)果指示抗VEGF在含有精氨酸的緩沖液中于約pH 5. 2是穩(wěn)定的。使用Slide-a-Lyzer 盒通過透析將抗VEGF配制入不同緩沖液以實現(xiàn)表I所列終濃度。用0. 22 y m Steriflip 濾器單元將每種配制劑無菌過濾并無菌填充入經(jīng)高壓滅菌的管形瓶，塞上塞子，并密封。將樣品放置于2-8° C、25° C、和40° C，并在選定溫度進行穩(wěn)定性研究。表I :配制劑配制劑A 5 ImM 磷酸鈉，159mM 海藻糖，0. 04%PS20, pH 6. 2B 200mM 精氨酸乙酸鹽，0. 04%PS20, pH 5. 2C 20mM 乙酸鈉，240mM 蔗糖，0. 04%PS20, pH 5. 2D 20mM組氨酸氯化物，200mM精氨酸氯化物，0. 04%PS20, pH 5. 2
方法pH :于環(huán)境溫度在I. 5ml Eppendorf管中放置200 U L體積的每種樣品并使用配備有ROSS 半微量電極的Thermo Orion pH計測量它們的pH。使用pH4. 0、5. 0和7. 0的Thermo Orion緩沖液標準校準pH計。粘度使用帶設定為0. 049mm高度的25mm椎體(CP 25-1)的Anton Paar PhysicaMCR300流變儀測量剪切粘度。于25° C將75 ii L每種樣品加載到Peltier板上，并以恒定剪切率10001/s每IOOs間隔測量10次。大小排陰-交換層析(SEC):實施大小排阻層析來定量總聚集物水平(注射原液)和緩慢解離聚集物水平(注射稀釋液)。稀釋液注射用流動相緩沖液(0. 20M磷酸鉀、0. 25M氯化鉀、pH 6. 2)稀釋至0. 5mg/mL。將所有樣品于30° C溫育24小時，之后分析。使用Agilent 1100 HPLC系統(tǒng)將10 y L每種原液樣品和100 u L每種稀釋液樣品注射到TSKG3000SWXL, 7. 8X300mm 柱(T0S0HAAS, part no. 08541)上。將自動采樣器保持于 30。C， 而將柱保持于環(huán)境溫度。流速為0. 5mL/min,且每個樣品的總運行時間為30分鐘。使用HPChemstation用280nm吸光度分析數(shù)據(jù)。離子交換層析(IEX):實施離子交換層析來定量羧肽酶B(CpB)消化樣品中的帶電荷變體。將樣品用溶劑A(20mM N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)緩沖液，pH 6.5)稀釋至lmg/mL,用l%w/w添加lmg/mL CpB處理,并于37° C溫育20分鐘。然后使用Agilent1100HPLC系統(tǒng)將50 ii L每種樣品注射到Dionex ProPac WCX-10, 4. 6X250mm柱上。自動采樣器溫度保持于2-8° C，而柱保持于40° C。流速為0. 5mL/min，在90分鐘里使用溶劑A和溶劑B (含200mM氯化鈉的溶劑A),如測試規(guī)程中所列。使用HP Chemstation用280nm樣品吸光度分析數(shù)據(jù)。濁度測定法為了監(jiān)測濁度，使用Agilent 8453 UV-VIS分光光度計于350nm測量每種配制劑的光密度。不稀釋就分析所有樣品，使用Icm光路長度石英杯。-20° C和凍融穩(wěn)定性研究將配制劑A-D無菌裝填入316L不銹鋼迷你罐(15mL/迷你罐)。將所有樣品于-20° C保持不同量的時間(例如24、48、72、或更多小時；4、5、6、7、或更多天；2、3、4、5、6、7、8、或更多周;3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或更多月)，并在層流通風櫥下持續(xù)無菌取樣。另外，將配制劑A-D裝填入6cc玻璃管形瓶并保存于-20° C。對每個管形瓶進行五次凍融循環(huán)，并使用SEC、IEC和濁度測定法分析。凍融循環(huán)要求于-20° C保存至少24小時，接著于5° C保存至少24小時。結(jié)果和討論此研究調(diào)查不同濃度的抗VEGF在基于精氨酸的配制劑中的穩(wěn)定性(例如聚集物形成、粘度、化學穩(wěn)定性、等)。使用SEC和IEC來監(jiān)測加壓和加速的保存條件下抗VEGF的穩(wěn)定性。測量抗VEGF的聚集和粘度，并列于下文表2及示于圖2和4。表2 :所研究的配制劑的物理特性
配制劑[蛋白質(zhì)](mg/ml) %總聚集物粘度(cP)
~25權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定的含水藥物配制劑，該配制劑在pH 4. O至6. O的精氨酸緩沖液中包含治療有效量的抗體。
2.權(quán)利要求I的配制劑，其中該緩沖液為pH4. 5至5. 5的精氨酸乙酸鹽緩沖液。
3.權(quán)利要求I的配制劑，其中該緩沖液為pH4. 8至5. 4的精氨酸乙酸鹽緩沖液。
4.權(quán)利要求I的配制劑，其中該緩沖液為pH5. 2的精氨酸乙酸鹽緩沖液。
5.權(quán)利要求2、3、或4的配制劑，其中該緩沖液中的精氨酸乙酸鹽濃度為約25mM至約250mMo
6.權(quán)利要求2、3、或4的配制劑，其中該緩沖液中的精氨酸乙酸鹽濃度為約50mM至約250mMo
7.權(quán)利要求2、3、或4的配制劑，其中該緩沖液中的精氨酸乙酸鹽濃度為約75mM至約250mMo
8.權(quán)利要求2、3、或4的配制劑，其中該緩沖液中的精氨酸乙酸鹽濃度為約IOOmM至約250mMo
9.權(quán)利要求2、3、或4的配制劑，其中該緩沖液中的精氨酸乙酸鹽濃度為約120mM至約240mMo
10.權(quán)利要求2、3、或4的配制劑，其中該緩沖液中的精氨酸乙酸鹽濃度為約150mM至約 225mM。
11.權(quán)利要求2、3、或4的配制劑，其中該緩沖液中的精氨酸乙酸鹽濃度為約200mM。
12.權(quán)利要求I的配制劑，其進一步包含表面活性劑。
13.權(quán)利要求12的配制劑，其中該表面活性劑為聚山梨酯。
14.權(quán)利要求13的配制劑，其中該聚山梨酯為聚山梨酯20。
15.權(quán)利要求12的配制劑，其中該表面活性劑濃度為0.0001%至約I. 0%。
16.權(quán)利要求12的配制劑，其中該表面活性劑濃度為約0.01%至約0. 05%。
17.權(quán)利要求12的配制劑，其中該表面活性劑濃度為0.04%。
18.權(quán)利要求I的配制劑，其中該抗體濃度為約10mg/ml至約250mg/ml。
19.權(quán)利要求I的配制劑，其中該抗體濃度為約25mg/ml至200mg/ml。
20.權(quán)利要求I的配制劑，其中該抗體濃度為約50mg/ml至約150mg/ml。
21.權(quán)利要求I的配制劑，其中該抗體濃度為約75mg/ml至約125mg/ml。
22.權(quán)利要求I的配制劑，其中該抗體未進行在先凍干。
23.權(quán)利要求I的配制劑，其中該抗體結(jié)合VEGF。
24.權(quán)利要求I的配制劑，其中該抗體為單克隆抗體。
25.權(quán)利要求24的配制劑，其中該單克隆抗體為全長抗體。
26.權(quán)利要求24的配制劑，其中該單克隆抗體為IgGl抗體。
27.權(quán)利要求24的配制劑，其中該單克隆抗體為人源化抗體。
28.權(quán)利要求24的配制劑，其中該單克隆抗體為包含抗原結(jié)合區(qū)的抗體片段。
29.權(quán)利要求28的配制劑，其中該抗體片段為Fab或F(ab’)2片段。
30.權(quán)利要求24的配制劑，其中該單克隆抗體結(jié)合VEGF。
31.權(quán)利要求30的配制劑,其中該抗體為貝伐單抗(bevacizumab)。
32.權(quán)利要求I的配制劑，其中該單克隆抗體對聚集易感。
33.權(quán)利要求2的配制劑，其中該緩沖液為pH5. 2的200mM精氨酸乙酸鹽，該表面活性劑為量為約0. 01-0. l%v/v的聚山梨酯，其中該配制劑在約40° C的溫度穩(wěn)定至少28天。
34.一種制品，其包含裝有如下的穩(wěn)定的含水藥物配制劑的容器，該穩(wěn)定的含水藥物配制劑包含治療有效量的抗體、約PH4. 5至約6. 0的精氨酸乙酸鹽緩沖液、和表面活性劑。
35.權(quán)利要求34的制品，其中該抗體結(jié)合VEGF。
36.權(quán)利要求35的制品，其中該抗體為貝伐單抗。
37.一種用于在含水藥物配制劑中穩(wěn)定抗體的方法，其通過組合治療有效量的抗體、約PH 4. 5至約6. 0的精氨酸乙酸鹽緩沖液、和表面活性劑來進行。
38.權(quán)利要求37的方法，其中該抗體結(jié)合VEGF。
39.權(quán)利要求38的方法，其中該抗體為貝伐單抗。
40.一種穩(wěn)定的含水藥物配制劑，其包含治療有效量的抗體、pH 5. 2的200mM精氨酸乙酸鹽緩沖液、表面活性劑。
41.權(quán)利要求40的配制劑，其中該抗體結(jié)合VEGF。
42.權(quán)利要求41的配制劑，其中該抗體為貝伐單抗。
43.一種制品，其包含裝有權(quán)利要求40-42任一項的配制劑的容器。
44.權(quán)利要求I的配制劑，其是無菌的。
45.權(quán)利要求I的配制劑，其于約40°C保存至少28天時是穩(wěn)定的。
46.權(quán)利要求I的配制劑，其是水性配制劑，且對受試者施用。
47.權(quán)利要求46的配制劑，其中該配制劑用于靜脈內(nèi)(IV)、皮下(SQ)或肌肉內(nèi)(IM)施用。
48.權(quán)利要求46的配制劑,其用于IV施用且該抗體濃度為約10mg/ml至約250mg/ml。
49.權(quán)利要求46的配制劑,其用于IV施用且該抗體濃度為約50mg/ml至約100mg/ml。
50.權(quán)利要求46的配制劑,其用于SQ施用且該抗體濃度為約25mg/ml至約250mg/ml。
51.權(quán)利要求46的配制劑,其用于SQ施用且該抗體濃度為約50mg/ml至約100mg/ml。
52.一種帶注射器可刺穿的塞子的管形瓶，在該管形瓶內(nèi)部裝有權(quán)利要求I的配制劑。
53.權(quán)利要求52的管形瓶，其保存于約2-8°C。
54.權(quán)利要求52的管形瓶,其為3cc、20cc或50cc管形瓶。
55.一種不銹鋼罐，在該罐內(nèi)部裝有權(quán)利要求I的配制劑。
56.權(quán)利要求55的罐，其中該配制劑是無菌的。
57.一種在受試者中治療疾病或病癥的方法，包括以有效治療該疾病或病癥的量對受試者施用權(quán)利要求I的配制劑。
58.權(quán)利要求57的方法，其中該抗體結(jié)合VEGF。
59.權(quán)利要求58的方法，其中該抗體為貝伐單抗。
60.一種藥物配制劑，其包含(a)量為約lOmg/mL至約250mg/mL的對脫酰胺或聚集易感的全長IgGl抗體；(b)pH 4. 5至6. 0的精氨酸乙酸鹽緩沖液；和(c)量為約0. 01%至約0.1%的聚山梨酯20。
61.權(quán)利要求60的配制劑，其中該抗體結(jié)合VEGF。
62.權(quán)利要求61的配制劑，其中該抗體為貝伐單抗。
63.一種用于降低治療性單克隆抗體聚集的方法，包括在pH 4. 5至6.0的精氨酸乙酸鹽緩沖液中配制該抗體。
64.權(quán)利要求63的方法，其中該抗體結(jié)合VEGF。
65.權(quán)利要求64的方法，其中該抗體為貝伐單抗。
66.一種藥物配制劑，其在pH約4. 5至約6. O的精氨酸乙酸鹽緩沖液中包含結(jié)合VEGF的抗體和表面活性劑。
67.權(quán)利要求66的配制劑，其中該抗體為貝伐單抗。
68.—種制備藥物配制劑的方法，包括 (a)制備權(quán)利要求I的配制劑；并 (b)評估在該配制劑中該抗體的物理穩(wěn)定性、化學穩(wěn)定性、或生物學穩(wěn)定性。
69.權(quán)利要求68的方法，其中該抗體結(jié)合VEGF。
70.權(quán)利要求69的方法，其中該抗體為貝伐單抗。
全文摘要
本發(fā)明提供一種穩(wěn)定的含水藥物配制劑，其包含治療有效量的任選未進行在先凍干的抗體、維持pH在約4.0至約6.0的范圍中的緩沖液、和任選的表面活性劑，制備此類配制劑的方法，及使用此類配制劑的方法。
文檔編號A61K9/00GK102770158SQ201080064451
公開日2012年11月7日 申請日期2010年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月21日
發(fā)明者H.劉, M.克倫威爾, M.李, T.J.卡莫澤爾, Y.R.戈卡恩 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司