專(zhuān)利名稱(chēng)：與糖尿病中的mirna相關(guān)的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及葡萄糖介導(dǎo)的細(xì)胞損傷相關(guān)疾病中的微小RNA分子和微小RNA表達(dá)譜，包括糖尿病慢性病。
背景技術(shù)：
在本發(fā)明全文中，在方括號(hào)內(nèi)引用了多篇參考文獻(xiàn)以便更加完整的描述與本發(fā)明相關(guān)的背景技術(shù)。糖尿病視網(wǎng)膜病變幾乎所有的I型糖尿病患者和60%的II型糖尿病患者都會(huì)發(fā)展成視網(wǎng)膜病變。到2030年，預(yù)計(jì)全球糖尿病患者將會(huì)達(dá)到3. 66億。在加拿大，糖尿病患者數(shù)超過(guò)200萬(wàn)人，其中，約10%為I型糖尿病，約90%為II型糖尿病。在北美洲，糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是導(dǎo)致失明的最重要的系統(tǒng)性原因。已有研究證實(shí)糖尿病視網(wǎng)膜病變中有幾種蛋白質(zhì)分子發(fā)生改變。針對(duì)治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的個(gè)別蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)研究已開(kāi)展了很長(zhǎng)時(shí)間，但迄今為止所有的努力都沒(méi)有在臨床上取得成功。在所有的糖尿病慢性并發(fā)癥中，包括糖尿病視網(wǎng)膜病變，血管內(nèi)皮損傷是一個(gè)重要特征。內(nèi)皮細(xì)胞排列在血管壁上，它對(duì)葡萄糖的攝取不依賴(lài)于胰島素。當(dāng)糖尿病患者體內(nèi)血糖水平升高時(shí),葡萄糖流入到內(nèi)皮細(xì)胞中，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷。視網(wǎng)膜病變分為兩種類(lèi)型，或者說(shuō)兩個(gè)階段非增生性視網(wǎng)膜病變和增生性視網(wǎng)膜病變。在非增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變階段，眼睛中有些地方(微血管瘤)血管擴(kuò)張。也可能出現(xiàn)血管堵塞。可能有少量出血(視網(wǎng)膜出血)，和液體滲漏到視網(wǎng)膜內(nèi)。增生性視網(wǎng)膜病變階段是更晚期和更嚴(yán)重的疾病狀態(tài)。眼睛內(nèi)開(kāi)始生長(zhǎng)出新的血管(血管生成)。這些新的血管非常脆弱并可能流血(出血)。隨后視網(wǎng)膜和眼睛的其他部分(玻璃體)出現(xiàn)小塊疤痕。最終的結(jié)果是視力喪失，以及其他問(wèn)題。微小RNA微小RNA( “miRNA”)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的自然界中存在的分子。miRNA是小的RNA分 子(約由20-25個(gè)核苷酸組成)，其在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中起到重要作用I。miRNA通過(guò)RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄，形成帶有5’帽子結(jié)構(gòu)和多聚腺苷酸尾巴結(jié)構(gòu)的初級(jí)miRNA。初級(jí)miRNA在細(xì)胞核中加工成前體miRNA(由70-100個(gè)核苷酸組成的發(fā)夾結(jié)構(gòu))，是通過(guò)三種酶RNA酶II，Drosha和DGCR8調(diào)節(jié)的。前體miRNA形成后就通過(guò)核輸出蛋白-5輸出到細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，RNA酶III核糖核酸酶家族成員Dicer將前體miRNA進(jìn)一步加工成成熟miRNA，即功能活性形式1，2。成熟的miRNA與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC) —起結(jié)合到特定的mRNA靶上，引起特定的mRNA降解或者轉(zhuǎn)錄遏制1，2。一些研究者采用超表達(dá)實(shí)驗(yàn)證明了miRNA在多種細(xì)胞過(guò)程中的重要性。也有研究認(rèn)為miRNAs在控制組蛋白修飾方面也起到重要作用3。大量的miRNA編碼區(qū)位于蛋白編碼基因的內(nèi)含子區(qū)，并被認(rèn)為與它們的宿主基因被共同調(diào)控。不過(guò)，它們也有可能是被自己的啟動(dòng)子調(diào)控的。已從惡性腫瘤中識(shí)別出幾種miRNAs。研究表明它們可以調(diào)控多種因子，包括致癌基因(c-MYC)，轉(zhuǎn)錄因子(NFkB)和甲基化因子1，2。有關(guān)miRNA在多種疾病中的潛在治療應(yīng)用在科學(xué)界引起了相當(dāng)大的興趣。從機(jī)理的角度看，一種miRNA可以調(diào)控多種基因，因此，靶向于一種或少數(shù)幾種miRNAs提供了阻止多種基因表達(dá)的潛在的獨(dú)特機(jī)會(huì)。由于靶miRNAs作用的特異性，這種以RNA為基礎(chǔ)的療法是非常有吸引力的。miRNA表達(dá)的脫調(diào)節(jié)可能引起疾病，因此，檢查miRNA的表達(dá)可能成為一種有用的診斷手段。糖尿病中的miRNA
沒(méi)有研究文獻(xiàn)表明糖尿病個(gè)體視網(wǎng)膜中的特定miRNAs發(fā)生了顯著改變。然而，對(duì)其他糖尿病并發(fā)癥的研究表明miRNA已發(fā)生改變。比如，已有研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病中miR375的改變參與葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素基因表達(dá)過(guò)程4。研究發(fā)現(xiàn)，在2型糖尿病大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)miR320表達(dá)上調(diào)5。研究表明，MiR377通過(guò)調(diào)節(jié)P21-活化激酶和超氧化物歧化酶使得糖尿病腎病中纖維連接蛋白生成增加6。研究已發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病中mil92通過(guò)影響TGFii誘導(dǎo)的膠原蛋白表達(dá)而發(fā)生改變7。在糖尿病兔子心臟中發(fā)現(xiàn)miR133減少，從而調(diào)節(jié)HERG鉀離子通道引起QT波延長(zhǎng)8。此外，miRl參與葡萄糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程。申請(qǐng)人最近的研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病大鼠的心臟和暴露于葡萄糖的心肌細(xì)胞中都出現(xiàn)了 miR133a的下調(diào)，這直接關(guān)系到心肌細(xì)胞肥大9。在非糖尿病性心肌肥厚的其他研究中，也發(fā)現(xiàn)了 miRl和miR133的下調(diào)10，11。國(guó)際申請(qǐng)WO 2009/045356 (W0 ‘356)中公開(kāi)了通過(guò)施用miRNAs來(lái)改變血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)誘導(dǎo)細(xì)胞和組織響應(yīng)或改變的能力來(lái)治療疾病的方法。W0‘356還公開(kāi)了治療傷口痊愈和癌癥、炎癥和黃斑變性等疾病的方法。但是，WO ‘356中并沒(méi)有公開(kāi)暴露于葡萄糖的細(xì)胞中或者糖尿病受試者視網(wǎng)膜中哪些miRNAs發(fā)生了改變。本領(lǐng)域需要一種有效的治療方法來(lái)治療葡萄糖介導(dǎo)的細(xì)胞損傷相關(guān)的疾病，包括糖尿病慢性并發(fā)癥，比如糖尿病視網(wǎng)膜病變。本領(lǐng)域也需要一種健全的早期檢測(cè)糖尿病的方法。發(fā)明概述在一方面，本發(fā)明提供一種治療受試者的葡萄糖介導(dǎo)的細(xì)胞損傷相關(guān)疾病的方法，其特征在于，所述方法包括給受試者施用一種能夠調(diào)節(jié)所需受試者的一種或多種細(xì)胞中的一種或多種miRNAs表達(dá)的成分或成分的混合物。在另一方面，本發(fā)明提供一種治療葡萄糖介導(dǎo)的細(xì)胞損傷相關(guān)疾病的組合物，包括一種能夠調(diào)節(jié)所需一種或多種細(xì)胞中的一種或多種miRNAs表達(dá)的成分或成分的混合物，和藥學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明中，所述成分或成分的混合物能夠上調(diào)所需受試者的一種或多種細(xì)胞中的一種或多種miRNAs中的至少一種miRNA的表達(dá)。在一方面,所述一種或多種miRNAs中的至少一種 miRNA 選自 miR-1，miR-146a, miR200b 或者 miR-320。在本發(fā)明中，所述成分或成分的混合物包括一種寡核苷酸或寡核苷酸的混合物。在本發(fā)明中，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物以miRNA、其衍生物或類(lèi)似物、miRNA前體、成熟miRNA或者編碼所述至少一種miRNA的DNA分子的形式提供。在本發(fā)明中，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物以一種包括藥學(xué)上可接受的載體的組合物的形式提供。在本發(fā)明中，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物選自SEQ ID NOs. 1_4。在本發(fā)明中，所述成分或成分的混合物以不超過(guò)一種給藥載體的方式提供。在本發(fā)明中，所述給藥載體選自病毒載體，微球，脂質(zhì)體，膠體金顆粒，脂多糖，多肽，多糖，或聚乙二醇化病毒載體。在本發(fā)明中，所述成分或成分的混合物能夠下調(diào)所需的一種或多種細(xì)胞中的一種或多種miRNAs中的至少一種miRNA的表達(dá)。在一方面,所述一種或多種miRNAs中的至少一種 miRNA 選自 miR-144 或者 miR-450。 在本發(fā)明中，所述成分或成分的混合物包括所述的至少一種miRNA的抑制劑或抑制劑的混合物。在本發(fā)明中,所述抑制劑或抑制劑的混合物選自antagomir、反義RNA或者短干擾RNA。在本發(fā)明中，所述抑制劑或抑制劑的混合物以一種包括藥學(xué)上可接受的載體的組合物的形式提供。在本發(fā)明中，所述疾病是糖尿病慢性并發(fā)癥，包括糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病或者糖尿病大血管病變。在本發(fā)明中，所述成分或成分的混合物通過(guò)胃腸外給藥途徑或者局部給藥途徑施用。在本發(fā)明中，所述疾病是糖尿病視網(wǎng)膜病變，所述成分或成分的混合物通過(guò)眼內(nèi)給藥或者局部滴注到眼內(nèi)的方式施用。在本發(fā)明中，所述疾病是糖尿病視網(wǎng)膜病變，所述成分或成分的混合物通過(guò)眼部植入的方式施用。在另一方面，本發(fā)明提供一種治療受試者的糖尿病視網(wǎng)膜病變的方法，其特征在于，所述方法包括給受試者施用一種組合物，包括至少一種(a)祀向于miR-1, miR-146a,miR-200b或者miR-320的寡核苷酸，和(b)miR_144或者miR-450的抑制劑。在另一方面，本發(fā)明提供一種診斷受試者所患疾病的方法，所述疾病與葡萄糖介導(dǎo)的細(xì)胞損傷相關(guān)，其特征在于，所述方法包括檢測(cè)受試者樣本中的一種或多種miRNAs的表達(dá)譜，其中受試者樣本的miRNA表達(dá)譜與正常樣本或參考樣本的miRNA表達(dá)譜的差異就是葡萄糖介導(dǎo)的細(xì)胞損傷相關(guān)疾病的指征。在本發(fā)明的診斷疾病的方法的一方面，所述疾病是糖尿病慢性并發(fā)癥，包括糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病或者糖尿病大血管病變。在本發(fā)明的診斷疾病的方法的一方面，所述方法是診斷受試者糖尿病視網(wǎng)膜病變的方法。在本發(fā)明的診斷疾病的方法的一方面，所述一種或多種miRNAs選自miRl，miR146a, miR200b, miR320, miR144 或者 miR450。在本發(fā)明的診斷疾病的方法的一方面，與正常樣本或者參考樣本相比miRl，miR146a, miR200b和miR320的下調(diào)和miR144或者miR450的上調(diào)就是該疾病的指征。本發(fā)明具有如下優(yōu)勢(shì)(a)miRNAs是天然成分，當(dāng)作為藥物使用時(shí)是非常特異性的，
(b) miRNAs的合成非常容易，(C)HiiRNAs可以通過(guò)眼內(nèi)注射到玻璃體內(nèi)。玻璃體內(nèi)給藥是公認(rèn)的治療視網(wǎng)膜疾病的方法，和(d) miRNAs可用于診斷糖尿病和糖尿病并發(fā)癥，包括糖尿病視網(wǎng)膜病變。提供了一種早期診斷這類(lèi)疾病的新方法。附圖簡(jiǎn)述參考下列的詳細(xì)描述本發(fā)明將會(huì)被更好的理解，發(fā)明目的將變得清晰。描述參考附圖，其中圖I是miRNA陣列-散點(diǎn)圖，顯示出對(duì)照組與鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的(一種I型糖尿病模型)糖尿病組(處理組)大鼠視網(wǎng)膜中miRNA的改變情況。
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圖2a)是暴露于低濃度葡萄糖(LG)和高濃度葡萄糖(HG)的內(nèi)皮細(xì)胞中的miR320表達(dá)水平的實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)分析圖。圖b)_d)顯示內(nèi)皮細(xì)胞中的下列因子表達(dá)水平的實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)分析圖(b)纖維連接蛋白(FN)mRNA, (c)內(nèi)皮素-l(ET-l)mRNA和(d)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)mRNA，所述內(nèi)皮細(xì)胞分別暴露于高濃度葡萄糖(HG)，低濃度葡萄糖(LG)，暴露于高濃度葡萄糖并經(jīng)陰性mRNA轉(zhuǎn)染(HG+neg)，暴露于高濃度葡萄糖并經(jīng)miR320模擬物轉(zhuǎn)染(HG+miR320)。圖e)顯示了內(nèi)皮細(xì)胞中的有絲分裂原激活的蛋白激酶-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(MAPK(ERKl/2))的激活作用，所述內(nèi)皮細(xì)胞分別暴露于低濃度葡萄糖(LG)，高濃度葡萄糖(HG)，經(jīng)陰性轉(zhuǎn)染并暴露于低濃度葡萄糖或高濃度葡萄糖(LG+Neg，HG+Neg)，經(jīng)miR320模擬物轉(zhuǎn)染并暴露于低濃度葡萄糖或高濃度葡萄糖(LG+miR320，HG+miR320)。*代表與低濃度葡萄糖組(LG)相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異。圖3a)是分別暴露于25mmol/L葡萄糖和5mmol/L葡萄糖的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中，和暴露于25mmol/L葡萄糖并經(jīng)陰性miRNA轉(zhuǎn)染(25mM+Scram)或者經(jīng)miR146a模擬物轉(zhuǎn)染(25mM+miR146a)的內(nèi)皮細(xì)胞中的miRNA 146a表達(dá)水平的實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒?qRT-PCR)應(yīng)分析圖。圖b)_c)是人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中的下列因子表達(dá)水平的實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)分析圖和酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)分析圖，
b)纖維連接蛋白(FN)mRNA和c)纖維連接蛋白水平，所述人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞分別暴露于5mmol/L葡萄糖和25mmol/L葡萄糖，以及暴露于25mmol/L葡萄糖并經(jīng)陰性(序列打亂的)miRNA 轉(zhuǎn)染(25mM+Scram)或者經(jīng) miR146a 模擬物轉(zhuǎn)染(25mM+miR146a)。Scram 表不序列打亂的，*表示與5mM組或者5mM scram組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異；**表示與25mM組或25mM scram組相比具有顯著差異；miRNA的水平以RNU6B(U6)的比值的形式表達(dá)，并歸一化到低濃度葡萄糖組(LG組)的水平；mRNA的水平以18S RNA的比值的形式表示，并歸一化到LG組的水平。圖4a)顯示了鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠(D)視網(wǎng)膜組織中miR146a的水平與年齡和性別匹配的對(duì)照組(C)中miR146a的水平對(duì)比情況。圖b)顯示了玻璃體內(nèi)給藥的效率，其中，向玻璃體內(nèi)注射miR146a模擬物(D+146a)導(dǎo)致視網(wǎng)膜內(nèi)miR146a水平升高，而注射序列打亂的模擬物(D+SC)組并沒(méi)有出現(xiàn)miR146a水平升高的現(xiàn)象。圖c)_d)顯示鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中的纖維連接蛋白(FN) (c)mRNA水平和(d)蛋白質(zhì)水平。該圖顯示向玻璃體內(nèi)注射miR146a模擬物(D+miR146a)可以阻止糖尿病誘導(dǎo)的纖維連接蛋白(FN)mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的上調(diào)，而注射序列打亂的模擬物的對(duì)照組(D+Sc)并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象。數(shù)據(jù)以I，c) RNU6 (U6), d) 18S的比值的形式表示，*表示與對(duì)相應(yīng)的C組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異，η為5例/每組。圖5a)是基于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的(www. TargetScan. org, www. microrna. org, www.ebi.ac.ukl)纖維連接蛋白(FNl) 3’UTR序列與成熟miR146a序列的對(duì)比圖。圖b)_c)顯不miR146a與(b)人和(c)大鼠FNl啟動(dòng)子結(jié)合的突光素酶報(bào)告分析圖。**表不與單獨(dú)的載體組或者載體+序列打亂物組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異。圖6a)是對(duì)照大鼠視網(wǎng)膜組織的LNAtm-ISH研究的顯微照片，顯示了 miR146a的定位。圖(b)是(a)組的高倍顯微鏡照片，顯示了視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的陽(yáng)性染色(箭頭)。圖c)是鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織的LNAtm-ISH研究的顯微照片，顯示了miR146a在毛細(xì)血管內(nèi)(箭頭)的最小表達(dá)量(如果有的話(huà))。用堿性磷酸酶(ALK Pho)作為色原體，不加復(fù)染劑。
圖7顯示了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的核因子-KB(NF-KB)的活力。X軸顯示了下列條件人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞暴露于5mmol/L葡萄糖,25mmol/L葡萄糖,和暴露于25mmol/L葡萄糖并經(jīng)陰性miRNA轉(zhuǎn)染(25mM+Scram)或者經(jīng)miR146a模擬物轉(zhuǎn)染(25mM+miR146a)。*表示與其他組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異。數(shù)據(jù)歸一化到5mM葡萄糖組的水平。圖8顯示了 db/db糖尿病小鼠(db/db)( 一種2型糖尿病的模型)視網(wǎng)膜組織中的miR146a水平與年齡和性別匹配的對(duì)照組(C)的miR146a水平的對(duì)比圖。數(shù)據(jù)以RNU6(U6)比值的形式表達(dá)，*表示與其他組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異。圖9顯示了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)的微小RNA和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的變化情況。非糖尿病對(duì)照組和糖尿病組(鏈脲佐菌素誘導(dǎo)，患病I個(gè)月后)大鼠視網(wǎng)膜組織樣本的圖a)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)分析圖和圖b)酶聯(lián)免疫法分析圖都顯示糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA和蛋白質(zhì)水平都升高。圖c)是糖尿病大鼠與非糖尿病對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜中miR200b水平的實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)分析圖。miRNA的數(shù)據(jù)以RNU6B(U6)的比值的形式表示，并歸一化到對(duì)照組的水平；(mRNA的水平以18S RNA的比值的形式表示，并歸一化到對(duì)照組的水平。*表示與其他組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異。)

圖10顯示了葡萄糖誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR200b水平下調(diào)的影響。圖a)顯分別暴露于25mmol/L葡萄糖(HG), 5mmol/L葡萄糖(LG),和25mM L-葡萄糖(滲透對(duì)照，0SM)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中的miR200b的表達(dá)水平。圖b)顯示了人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA的表達(dá)水平，所述的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞分別暴露于低濃度葡萄糖(LG)、高濃度葡萄糖(HG)、25mM L-葡萄糖(OSM)、經(jīng)序列打亂的(scr)模擬物或者miR200b轉(zhuǎn)染并暴露于低濃度葡萄糖(LG+Scr ；LG+200b)或高濃度葡萄糖(HG+Scr ;HG+200b),和經(jīng) antagomirs 轉(zhuǎn)染[200b (A)]以及經(jīng) antagomirs 轉(zhuǎn)染并暴露于低濃度葡萄糖[LG+200b (A)]。圖c)中與經(jīng)序列打亂的(scr)模擬物組相比，經(jīng)miR200b模擬物轉(zhuǎn)染后暴露于高濃度葡萄糖的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR200b表達(dá)水平的增加顯示了 miR200b模擬物轉(zhuǎn)染的效率。圖d)顯示與人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞類(lèi)似，牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(BREC)中也顯示出葡萄糖誘導(dǎo)的miR200b水平下調(diào)。圖e)顯示，用miR200b模擬物(采用在PcDNA3. I載體中克隆的miR200b(V200b)，而不是通過(guò)空白載體(V))轉(zhuǎn)染牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠使得高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的VEGF mRNA表達(dá)的上調(diào)恢復(fù)正常。圖f)中與載體對(duì)照組相比，經(jīng)miR-200b模擬物轉(zhuǎn)染的牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-200b表達(dá)水平的提高程度顯示了 miR-200b模擬物在牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。(低濃度葡萄糖(LG) = 5mM葡萄糖,Scr =序列打亂的miRNA, 200b = miR200b模擬物,200b (A)=200b antagomir, OSM = 25mML葡萄糖[滲透對(duì)照]。*表示與LG組或LG scram組相比具有顯著差異，+表示與HG組或者HG scram組相比有顯著差異。miRNA的水平以RNU6B (U6)的比值的形式表達(dá)，并歸一化到低濃度葡萄糖組(LG)的水平。mRNA的水平以18S RNA的比值的形式表示，并歸一化到低濃度葡萄糖組(LG)的水平。圖11顯示由高濃度葡萄糖(HG)誘導(dǎo)的和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)介導(dǎo)的跨內(nèi)皮通透性增加可以通過(guò)miR200b模擬物轉(zhuǎn)染(200b)而被阻止，但不能通過(guò)序列打亂的(scr)模擬物轉(zhuǎn)染而被阻止，圖a)為時(shí)間依賴(lài)性數(shù)據(jù)，圖b)為終點(diǎn)數(shù)據(jù)。圖c)顯示，類(lèi)似地，葡萄糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞(EC)管腔形成可以通過(guò)miR200b模擬物轉(zhuǎn)染而被阻止，但不能通過(guò)序列打亂的(scr)模擬物轉(zhuǎn)染而被阻止。圖d)顯示了管形成實(shí)驗(yàn)的量化分析。 (低濃度葡萄糖(LG)= 5mM葡萄糖,Scr =序列打亂的miRNA, 200b = miR200b模擬物，200b (A) = 200b antagomir, OSM = 25mM L葡萄糖(滲透對(duì)照).*表示與LG組或者LGscram組相比具有顯著差異，+表示與HG組或者HG scram組相比具有顯著差異。miRNA的水平以RNU6B(U6)的比值的形式表達(dá)，并歸一化到低濃度葡萄糖組(LG)的水平；mRNA的水平以18S RNA的比值的形式表達(dá)，并歸一化到低濃度葡萄糖組(LG)的水平)。圖12a)顯不基于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的(www.TargetScan.org, www.microma.org，www.ebi.ac.ukl)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子3’ UTR序列(和突變的[mut]血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子3，-_與成熟miR200b序列的對(duì)比圖。圖b)(人)和圖c)(大鼠)是miR200b與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子啟動(dòng)子結(jié)合的熒光素酶報(bào)告分析圖，顯示了 miR200b與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子3’ UTR的劑量依賴(lài)性的結(jié)合。相關(guān)啟動(dòng)子的活性以發(fā)光單位歸一化為β_半乳糖苷酶表達(dá)水平的方式表達(dá)，*表示與單獨(dú)載體組或者載體+序列打亂物組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差
巳圖13顯示了 miR200b調(diào)節(jié)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的改變及其被miR200b阻止。圖a)和圖b)分別是經(jīng)過(guò)或者未經(jīng)過(guò)玻璃體內(nèi)注射miR200b模擬物(200b)和序列打亂的模擬物(Scr)的對(duì)照組(Cont)和糖尿病組(Diab)大鼠(鏈脲佐菌素誘導(dǎo))視網(wǎng)膜中的a)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA和b)蛋白水平的情況。圖c)中與注射序列打亂的模擬物組相比，玻璃體內(nèi)注射miR200b模擬物后視網(wǎng)膜中miR200b表達(dá)量的增加顯示了玻璃體內(nèi)給藥的效率。*表示與對(duì)照組或者Diabetic+scr組(右圖)相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異，+表示與糖尿病組(diabetic)比較有顯著差異。圖14的顯微照片顯示了 miR200b介導(dǎo)的糖尿病視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子改變的功能性結(jié)果。a)是對(duì)照大鼠視網(wǎng)膜組織的LNAtm-ISH研究的顯微照片，顯示了 miR200b在視網(wǎng)膜毛細(xì)管內(nèi)皮(箭頭)，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(楔形箭頭)，內(nèi)核層細(xì)胞(雙楔形箭頭，在神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元內(nèi))中的定位；插圖為帶有細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核miR200b定位的毛細(xì)管放大圖(箭頭)。圖b)是鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)的視網(wǎng)膜組織(與(a)組中的定位相似)的LNAtm-ISH研究的顯微照片，顯示了 miR200b的最小表達(dá)量(如果有的話(huà))。圖c)是用抗白蛋白抗體對(duì)對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色的顯微照片，顯示有血管內(nèi)白蛋白出現(xiàn)(箭頭)。圖d)是對(duì)糖尿病大鼠(鏈脲佐菌素誘導(dǎo))的視網(wǎng)膜進(jìn)行與(C)組類(lèi)似的免疫細(xì)胞化學(xué)染色的顯微照片，顯示出現(xiàn)血管內(nèi)反應(yīng)(箭頭)和視網(wǎng)膜的彌漫著色，說(shuō)明血管通透性增加。圖e)的顯微照片顯示鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜經(jīng)玻璃體內(nèi)注射miR200b之后，白蛋白染色僅出現(xiàn)在血管內(nèi)的間隔中(箭頭)。在LNAtm-ISH實(shí)驗(yàn)中，用堿性磷酸酶(ALK Pho)作為色原體，不加復(fù)染劑。在白蛋白染色中使用DAB色原體和蘇木精復(fù)染劑。圖15顯示mir200b調(diào)節(jié)糖尿病誘導(dǎo)的p300的變化。圖a)顯示在以下情況下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的p300mRNA水平上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分別暴露于5mmol/L葡萄糖(LG), 25mmol/L葡萄糖(HG),暴露于25mmol/L葡萄糖并經(jīng)陰性miRNA轉(zhuǎn)染(HG+Scram)或者經(jīng)miR200b模擬物轉(zhuǎn)染(HG+200b)。圖b)顯示了 miR200b在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。未觀(guān)察到p300siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)miR200b表達(dá)量的影響。圖c)顯示糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中P300mRNA的表達(dá)情況(與對(duì)照組比較)。*表示與對(duì)照組或者低濃度葡萄糖組(LG)相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異。+表示與糖尿病組(diabetic)或高濃度葡萄糖組(HG)相比具有顯著差異，scram =序列打亂的對(duì)照組。·圖16a)是來(lái)自非糖尿病的人視網(wǎng)膜的視網(wǎng)膜組織的LNAtm-ISH研究的顯微照片，顯示了 miR200b在視網(wǎng)膜毛細(xì)管(箭頭)和內(nèi)核層細(xì)胞(雙楔形箭頭)中的定位。插圖是帶有內(nèi)皮染色的毛細(xì)管(箭頭)的高清圖片。圖b)是糖尿病人視網(wǎng)膜(與(a)組中的定位相似)的顯微照片，顯示了 miR200b的最小表達(dá)量(如果有的話(huà))。圖c)是用抗白蛋白抗體對(duì)非糖尿病人的視網(wǎng)膜進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色的顯微照片，顯示有血管內(nèi)白蛋白出現(xiàn)(箭頭)。圖d)是糖尿病人視網(wǎng)膜的顯微照片，顯示血管內(nèi)白蛋白染色(箭頭)和視網(wǎng)膜的彌漫著色，說(shuō)明血管通透性增加。在LNAtm-ISH實(shí)驗(yàn)中，用堿性磷酸酶(ALK Pho)作為色原體，不加復(fù)染劑。在白蛋白染色中使用DAB色原體和蘇木精復(fù)染劑。圖17是對(duì)照組和糖尿病組(一種2型糖尿病的模型)(db/db)小鼠的視網(wǎng)膜中的miR200b表達(dá)水平的實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)分析圖。*表示與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異。圖18是對(duì)照組和糖尿病動(dòng)物組大鼠視網(wǎng)膜中的miRl表達(dá)水平的實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)分析圖。與正常(對(duì)照)組大鼠視網(wǎng)膜相比較，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的miRl表達(dá)水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著減少。*表示與對(duì)照組相比較P < O. 05。圖19a)是對(duì)照組和糖尿病組大鼠(鏈脲佐菌素誘導(dǎo)，I型糖尿病模型)視網(wǎng)膜組織樣本中miR144表達(dá)水平的實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)分析圖。圖b)是對(duì)照組和糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜組織樣本中miR450表達(dá)水平的實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)分析圖。*表示與對(duì)照組相比較P < O. 05。圖20是來(lái)自?xún)擅加性錾蕴悄虿∫暰W(wǎng)膜病變患者的玻璃纖維組織的擴(kuò)增曲線(xiàn)(實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)分析)，顯示了 miR146a和miR320的存在。在附圖中，本發(fā)明的實(shí)施方案是通過(guò)舉例的方式說(shuō)明的。應(yīng)當(dāng)明確理解的是，說(shuō)明書(shū)和附圖只用于說(shuō)明和幫助理解的目的，并不意味著對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。發(fā)明的詳細(xì)描述除非另有規(guī)定，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常已知的含義。此外，除非另有說(shuō)明，除了在權(quán)利要求書(shū)中，使用“或”時(shí)也包括“和”的意思，反之亦然。除非有明確規(guī)定或者在上下文清楚的另外指明，開(kāi)放式的術(shù)語(yǔ)不應(yīng)解釋成限制性的術(shù)語(yǔ)(例如“包括”，“含有”和“包含”通常表明“包括但不限于”)。除非另有明確規(guī)定，包括在權(quán)利要求書(shū)中使用的單數(shù)形式如“一”和該”也包括多個(gè)指代物。本發(fā)明將通過(guò)引用附圖對(duì)發(fā)明內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)的解釋。本發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)暴露于相對(duì)高濃度葡萄糖的細(xì)胞中和糖尿病受試者的視網(wǎng)膜中的微小RNA(miRNA)表達(dá)水平的改變。申請(qǐng)人:發(fā)現(xiàn)暴露于相對(duì)高濃度葡萄糖的細(xì)胞中和糖尿病受試者的細(xì)胞中，包括糖尿病受試者視網(wǎng)膜中的某些miRNAs的表達(dá)譜發(fā)生改變。申請(qǐng)人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，miRNAs表達(dá)的改變可能與一些已知的在糖尿病中起到重要作用的蛋白質(zhì)水平的上調(diào)或下調(diào)相關(guān)。此外，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)miRNA分子可用于使翻譯這些蛋白質(zhì)的mRNAs的水平基本恢復(fù)正常。本發(fā)明涉及治療受試者的葡萄糖介導(dǎo)的細(xì)胞損傷相關(guān)疾病的方法和組合物。所述方法包括給受試者施用能夠調(diào)節(jié)所需受試者的一種或多種細(xì)胞中的一種或多種miRNAs表達(dá)的成分或成分的混合物。所述組合物包括能夠調(diào)節(jié)所需的一種或多種細(xì)胞中的一種或多種miRNAs表達(dá)的成分或成分的混合物。因此，本發(fā)明涉及基于miRNA的組合物和基于miRNA的方法，所述組合物和方法能夠使得暴露于相對(duì)高濃度葡萄糖的細(xì)胞中和患有暴露于血糖水平相關(guān)疾病的受試者細(xì)胞中，如糖尿病患者，包括糖尿病受試者的視網(wǎng)膜中被上調(diào)或下調(diào)的mRNA的表達(dá)水平和蛋白質(zhì)的生成量基本恢復(fù)正常。本發(fā)明還涉及診斷方法，所述方法基于糖尿病相關(guān)疾病中miRNAs表達(dá)譜的差異。微小RNAmiRNAs與mRNAs的一部分或者一個(gè)或多個(gè)基因片段互補(bǔ)。而且，miRNAs與mRNA結(jié)合并不需要絕對(duì)的序列互補(bǔ)，使得它們能夠調(diào)節(jié)范圍廣泛的靶轉(zhuǎn)錄物。通常miRNAs結(jié)合 到靶序列時(shí)，在相匹配的核苷酸之間有縫隙。此處使用的術(shù)語(yǔ)“絕對(duì)的序列互補(bǔ)”的意思是用來(lái)描述兩段序列長(zhǎng)度上的每個(gè)核苷酸對(duì)都能無(wú)縫隙的結(jié)合，比如一種miRNA和一種靶基因或轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”的意思是描述兩段序列，其中至少有50%的核苷酸從一段序列反式結(jié)合到另一段序列上。miRNAs通常與mRNA轉(zhuǎn)錄物的:V UTR互補(bǔ)，然而，本發(fā)明中的miRNAs可以結(jié)合到靶mRNA的任何區(qū)域?；蛘哒f(shuō)，此外，miRNAs靶向于響應(yīng)編碼靶mRNAs的基因的甲基化基因組位點(diǎn)?；蚪MDNA的甲基化狀態(tài)部分決定了該DNA與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的容易程度。因此，DNA的甲基化和去甲基化分別調(diào)節(jié)基因的沉默和表達(dá)。本發(fā)明的miRNAs包括表I中的序列(SEQ ID NOs. 1-6)及其同源體和類(lèi)似物，miRNA的前體分子和編碼所述miRNAs的DNA分子。表I
miRlSEQ ID NO. I
miR146a SEQ ID NO. 權(quán)利要求
1.一種治療受試者的葡萄糖介導(dǎo)的細(xì)胞損傷相關(guān)疾病的方法，其特征在于，所述方法包括給受試者施用一種能夠調(diào)節(jié)所需受試者的一種或多種細(xì)胞中的一種或多種miRNAs表達(dá)的成分或成分的混合物。
2.權(quán)利要求I的方法，其特征在于，所述成分或成分的混合物能夠上調(diào)所需受試者的一種或多種細(xì)胞中的一種或多種miRNAs中的至少一種miRNA的表達(dá)。
3.權(quán)利要求2的方法,其特征在于,所述一種或多種miRNAs中的至少一種miRNA選自miR-1, miR-146a, miR200b 或者 miR-320。
4.權(quán)利要求2的方法，其特征在于，所述成分或成分的混合物包括一種寡核苷酸或寡核苷酸的混合物。
5.權(quán)利要求4的方法，其特征在于，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物以miRNA、其衍生物或類(lèi)似物、miRNA前體、成熟miRNA或者編碼所述至少一種miRNA的DNA分子的形式提供。
6.權(quán)利要求4的方法，其特征在于，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物以一種包括藥學(xué)上可接受的載體的組合物的形式提供。
7.權(quán)利要求4的方法，其特征在于，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物選自SEQIDNOs. 1-4。
8.權(quán)利要求4的方法，其特征在于，所述成分或成分的混合物以不超過(guò)一種給藥載體的方式提供。
9.權(quán)利要求8的方法，其特征在于，所述給藥載體選自病毒載體，微球，脂質(zhì)體，膠體金顆粒，脂多糖，多肽，多糖，或聚乙二醇化的病毒載體。
10.權(quán)利要求I的方法，其特征在于，所述成分或成分的混合物能夠下調(diào)所需的一種或多種細(xì)胞中的一種或多種miRNAs中的至少一種miRNA的表達(dá)。
11.權(quán)利要求10的方法,其特征在于,所述一種或多種miRNAs中的至少一種miRNA選自 miR-1444 或者 miR-450。
12.權(quán)利要求10的方法，其特征在于，所述成分或成分的混合物包括所述至少一種miRNA的抑制劑或抑制劑的混合物。
13.權(quán)利要求11的方法，其特征在于，所述抑制劑或抑制劑的混合物選自antagomir、反義RNA或者短干擾RNA。
14.權(quán)利要求12的方法，其特征在于，所述抑制劑或抑制劑的混合物以一種包括藥學(xué)上可接受的載體的組合物的形式提供。
15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述疾病是糖尿病慢性并發(fā)癥，包括糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病或者糖尿病糖尿病大血管病變。
16.權(quán)利要求I的方法，其特征在于，所述成分或成分的混合物通過(guò)胃腸外給藥途徑或者局部給藥途徑施用。
17.權(quán)利要求15的方法，其特征在于，所述疾病是糖尿病視網(wǎng)膜病變，其中成分或成分的混合物通過(guò)眼內(nèi)給藥或者局部滴注到眼內(nèi)的方式施用。
18.權(quán)利要求15的方法，其特征在于，所述疾病是糖尿病視網(wǎng)膜病變，其中成分或成分的混合物通過(guò)眼部植入的方式施用。
19.一種治療受試者的糖尿病視網(wǎng)膜病變的方法，其特征在于，所述方法包括給受試者施用一種組合物，包括至少一種(a)祀向于miR-l,miR-146a,miR-200b或者miR-320的寡核苷酸，和(b)miR-144或者miR-450的抑制劑。
20.一種診斷受試者所患疾病的方法，所述疾病與葡萄糖介導(dǎo)的細(xì)胞損傷相關(guān)，其特征在于，所述方法包括檢測(cè)受試者樣本中的一種或多種miRNAs的表達(dá)譜,其中受試者樣本的miRNA表達(dá)譜與正常樣本或參考樣本的miRNA表達(dá)譜的差異就是葡萄糖介導(dǎo)的細(xì)胞損傷相關(guān)疾病的指征。
21.權(quán)利要求20的診斷疾病的方法，其特征在于，所述一種或多種miRNAs選自miRl，miR146a, miR200b, miR320, miR144 或者 miR450。
22.權(quán)利要求21的診斷疾病的方法，其特征在于，與正常樣本或者參考樣本相比miRl，miR146a, miR200b和miR320的表達(dá)下調(diào)和miR144或者miR450的表達(dá)上調(diào)就是該疾病的指征。
23.根據(jù)權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)的診斷疾病的方法，其特征在于，所述疾病是糖尿病慢性并發(fā)癥，包括糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病或者糖尿病大血管病變。
24.一種治療葡萄糖介導(dǎo)的細(xì)胞損傷相關(guān)疾病的組合物，包括能夠調(diào)節(jié)所需的一種或多種細(xì)胞中的一種或多種miRNAs的表達(dá)的一種成分或成分的混合物，和藥學(xué)上可接受的載體。
25.權(quán)利要求24的組合物，其特征在于，所述成分或成分的混合物能夠上調(diào)所需的一種或多種細(xì)胞中的一種或多種miRNAs中的至少一種miRNA的表達(dá)。
26.權(quán)利要求25的組合物，其特征在于，所述至少一種miRNA選自miR-1，miR-146a,miR200b 或者 miR-320。
27.權(quán)利要求25的組合物，其特征在于，所述成分或成分的混合物包括一種寡核苷酸或寡核苷酸的混合物。
28.權(quán)利要求27的組合物，其特征在于，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物以miRNA、其衍生物或類(lèi)似物、miRNA前體、成熟miRNA或者編碼所述至少一種miRNA的DNA分子的形式提供。
29.權(quán)利要求27的組合物，其特征在于，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物選自SEQID NOs. 1-4。
30.權(quán)利要求25的組合物，其特征在于，所述成分或成分的混合物能夠下調(diào)一種或多種miRNAs中的至少一種miRNA的表達(dá)。
31.權(quán)利要求30的組合物，其特征在于，一種或多種miRNAs中的至少一種選自miR-1444 或者 miR-450。
32.權(quán)利要求30的組合物，其特征在于，成分或成分的混合物包括所述的至少一種miRNA的抑制劑或抑制劑的混合物。
33.權(quán)利要求32的組合物,其特征在于,抑制劑或抑制劑的混合物選自antagomir、反義RNA或者短干擾RNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療受試者的葡萄糖介導(dǎo)的細(xì)胞損傷相關(guān)疾病的方法，包括向所述受試者施用能夠調(diào)節(jié)受試者的一種或多種損傷細(xì)胞中的一種或多種miRNAs表達(dá)的成分。本發(fā)明還涉及治療葡萄糖介導(dǎo)的細(xì)胞損傷相關(guān)疾病的組合物，包括能夠調(diào)節(jié)一種或多種損傷細(xì)胞中的一種或多種miRNAs表達(dá)的成分。本發(fā)明還涉及診斷受試者的葡萄糖介導(dǎo)的細(xì)胞損傷相關(guān)疾病的方法，包括糖尿病視網(wǎng)膜病變的診斷。
文檔編號(hào)A61K31/7088GK102970994SQ201080057925
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月16日
發(fā)明者薩巴瑞塔·切卡拉克巴蒂, 馮表, 陳莎莉, 吳月修, 卡拉·麥克阿瑟 申請(qǐng)人:昆山市工業(yè)技術(shù)研究院小核酸生物技術(shù)研究所有限責(zé)任公司