專利名稱：含有源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡的組合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡的組合物及利用上述細胞外小泡對炎癥性呼吸器官疾病等進行診斷、預防及/或者治療的方法。
背景技術(shù)：
室內(nèi)空氣的質(zhì)量(indoor air quality)是指包含建筑物(buildings)在內(nèi)的構(gòu)造物(structures)內(nèi)部與周邊空氣的質(zhì)量(air quality)，特別是，關(guān)聯(lián)著居住者或者是棲息者的健康及舒適的生活。室內(nèi)空氣中污染著對人體有害的氣體、細小灰塵、細菌、霉等。有害氣體包括苯、甲醛、五氯苯、乙酸丁酯、甲苯、二甲苯、苯乙烯等揮發(fā)性有機化合物 (volatile organic chemicals,VOC) IH Lt生(biological contaminants) 包括細菌、霉、病毒、塵螨、蟑螂、動物的皮屑、唾液及花粉等。特別是，當塵螨、霉、寵物 (pet)、蟑螂(cockroach)、細菌等分泌的物質(zhì)其大小等于或小于微米時，吸入后會誘導免疫反應并引發(fā)炎癥性呼吸器官疾病。室內(nèi)空氣中含有棲息于包括人、寵物、塵螨、蟑螂等在內(nèi)的多種生命體的皮膚、胃腸道、呼吸系統(tǒng)等的多種細菌及霉，同時，還含有棲息或流入于包括建筑物在內(nèi)的構(gòu)造物內(nèi)部及周邊的多種細菌及霉。棲息于室內(nèi)空氣中的公知的細菌包括芽孢桿菌5/7.)、金黃色葡萄球菌{,Staphylococcus atfre"· )、表皮葡萄球菌{,Staphylococcus epidermidis) > A^1 菌{Staphylococcus hominis)、其jf 氏/[叚單胞菌 iPseudomonas s tu tzeri)、淺黃/[叚單胞菌 (fseudomonas luteola) ^1]! {Streptomyce ￠5) >^|f |if{Corynebacteriaceae) > 大腸桿菌{Escherichia coli)等。另外，研究表明，在棲息于上述室內(nèi)空氣中的多種細菌或者源于其中的內(nèi)毒素 (lipopolysaccharide,LPS)或肽聚糖(ρ印tidoglycan)的作用下，誘導免疫細胞及肺表皮細胞生成炎癥性細胞因子。另外，革蘭氏陰性細菌經(jīng)常向外分泌細胞外小泡(outer membrane vesicles)，革蘭氏陰性細菌分泌的細胞外小泡由雙層磷脂構(gòu)成，形狀成球型，其大小為20-200 nm。上述細胞外小泡不僅含有LPS，而且還含有能夠?qū)λ拗鞯难装Y反應進行調(diào)節(jié)的外膜蛋白(outer membrane protein)。最近，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陽性細菌向外分泌細胞外小泡，通過蛋白質(zhì)組分析可知，小泡內(nèi)含有誘發(fā)炎癥的蛋白質(zhì)。炎癥性呼吸器官疾病大致分為在上呼吸道發(fā)生的鼻炎及鼻竇炎，在下呼吸道發(fā)生的哮喘及支氣管炎，在小呼吸道發(fā)生的毛細支氣管炎，在肺實質(zhì)發(fā)生的肺氣腫、肺炎等。在臨床上，作為導致呼吸道阻塞的疾病分為以可逆性呼吸道阻塞為特征的哮喘和以非可逆性呼吸道阻塞為特征的慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, C0PD), 作為慢性阻塞性肺病的源發(fā)性疾病，包括慢性阻塞性支氣管炎、慢性阻塞性毛細支氣管炎、 肺氣腫等。關(guān)于哮喘的源發(fā)性物質(zhì)，棲息于室內(nèi)空氣中的蛋白質(zhì)(過敏原)起重要作用，關(guān)于慢性阻塞性肺病的病因，吸煙等刺激性因素起重要作用。
現(xiàn)已知，關(guān)于哮喘與慢性阻塞性肺病的發(fā)生，炎癥具有重要作用，但是，炎癥的狀態(tài)卻各不相同。如果是哮喘，嗜酸性粒細胞性炎癥起重要作用，如果是慢性阻塞性肺病，非嗜酸性粒細胞性或者中性粒細胞性炎癥起重要作用。但是，對于重癥哮喘患者來說，反而是中性粒細胞性炎癥起重要作用，特別是，對于伴隨有非可逆性呼吸道阻塞的哮喘患者來說， 中性粒細胞性炎癥起重要作用。尤其是，當發(fā)生慢性肺炎時，呼吸道及肺實質(zhì)發(fā)生的免疫功能異常起重要作用。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，Th2免疫反應對嗜酸性粒細胞性炎癥的發(fā)生起重要作用，Thl及Thl7免疫反應對中性粒細胞性炎癥的發(fā)生起重要作用。另外，炎癥誘發(fā)癌癥的事實很早以前就已經(jīng)提出，最近研究發(fā)現(xiàn)，在針對源自棲息于腸道細菌的毒素的Thl7免疫反應作用下會誘發(fā)大腸癌，在共棲于胃內(nèi)的幽門螺桿菌 {Helicobacter /y^ori)作用下，不僅會誘發(fā)慢性胃炎，而且還會誘發(fā)胃癌。關(guān)于慢性阻塞性肺病與肺癌的病因，有人提出了是由相同致病因子引發(fā)疾病群的假設(shè)，最近，臨床研究表明，與吸煙無關(guān)，慢性阻塞性肺病本身是導致肺癌發(fā)生的重要危險因素。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)空氣中含有由各種細菌等分泌的細胞外小泡，當上述細胞外小泡被哺乳動物吸入時就會誘發(fā)炎癥性呼吸器官疾病，本發(fā)明人基于此而完成了本發(fā)明。本發(fā)明的目的在于，提供一種含有源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡的組合物及利用上述細胞外小泡對炎癥性呼吸器官疾病等進行診斷、預防及/或者治療的方法。具體地說，本發(fā)明的目的在于，提供一種將源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡注入動物構(gòu)建呼吸器官疾病動物模型并利用上述動物模型對預防或治療呼吸器官疾病的備選藥物進行篩選的方法。另外，本發(fā)明的目的在于，提供一種預防或治療呼吸器官疾病的疫苗及對呼吸器官疾病的致病物質(zhì)進行診斷的方法，為預防呼吸器官疾病的發(fā)生及惡化而抑制室內(nèi)空氣中細胞外小泡的活性或者除去上述細胞外小泡的方法，測定室內(nèi)空氣中細胞外小泡的濃度并對相關(guān)于呼吸器官疾病發(fā)生的室內(nèi)空氣質(zhì)量進行評估的方法等。但是，本發(fā)明所要解決的技術(shù)課題并不僅限于上面提到的課題，上面未提到的其它相關(guān)課題在以下的表述中都有所涉及，相關(guān)領(lǐng)域的工作人員可根據(jù)以下記載明確理解。技術(shù)方案
本發(fā)明的一方面，提供了一種含有源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡的組合物。依據(jù)上述本發(fā)明的一個實施例，上述細胞外小泡可以源于室內(nèi)灰塵、塵螨、霉、蟑螂、寵物的分泌物、花粉、人的皮屑、等，但并不僅限于此。依據(jù)上述本發(fā)明的另一實施例，上述細胞外小泡可以由棲息于室內(nèi)空氣中的細菌分泌，上述細菌包括棲息于室內(nèi)灰塵、塵螨、霉、蟑螂、寵物的分泌物、植物、人的皮屑等的細菌，但并不僅限于此。依據(jù)上述本發(fā)明的另一實施例，上述細胞外小泡可以是由2種以上細菌分泌的細胞外小泡的混合物。依據(jù)上述本發(fā)明的另一實施例，上述細菌包括葡萄球菌Staphylococcus)、 微球菌(Micrococcus)、腸球菌(Enterococcus)、假單胞菌(Pseudomonas)、鏈霉菌 (Streptomycetes)及棒狀桿菌(Corinebacterium)。
依據(jù)上述本發(fā)明的另一實施例，上述細菌包括金黃色葡萄球菌^Staphylococcus <3 Γ<9 5·)、人葡萄球菌{,Staphylococcus hominis)(Micrococcus lylae)、類 MlW-M {Enterococcus faecal is) > SifKIix-^-Ifilii (Pseudomonas stutzeri) > ^ltlix
菌{Pseudomonas luteola)及大腸木干菌{Escherichia coli)。依據(jù)上述本發(fā)明的另一實施例，上述細胞外小泡包括由室內(nèi)空氣中的霉分泌的細胞外小泡，上述霉分泌的細胞外小泡包括由棲息于室內(nèi)灰塵的霉分泌的細胞外小泡。依據(jù)上述本發(fā)明的另一實施例，源于上述細菌或者霉的細胞外小泡可以從細菌或者霉培養(yǎng)液中分離，上述細胞外小泡可以從細菌或者霉培養(yǎng)液中自然分泌或者人工分泌。本發(fā)明的另一方面，提供了一種將源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡注入動物而構(gòu)建的疾病模型。上述本發(fā)明的細胞外小泡如前面所述。依據(jù)上述本發(fā)明的一個實施例，上述動物模型可以是老鼠，但并不僅限于此。上述疾病包括鼻炎、鼻竇炎、鼻咽癌、哮喘、支氣管炎、慢性阻塞性肺病、毛細支氣管炎、肺炎及肺癌等。上述本發(fā)明的注入包括通過鼻腔、口腔及氣管(trachea)注入。本發(fā)明的另一方面，提供了一種利用源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡對預防或治療疾病的備選藥物進行篩選的方法。上述本發(fā)明的細胞外小泡如前面所述。上述本發(fā)明的疾病包括由室內(nèi)空氣中的細胞外小泡誘發(fā)或者導致惡化的鼻炎、鼻竇炎、鼻咽癌、支氣管炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、毛細支氣管炎、肺炎及肺癌等。依據(jù)上述本發(fā)明的一個實施例，上述篩選方法的特征在于，將備選藥物注入上述本發(fā)明的動物疾病模型。依據(jù)上述本發(fā)明的另一實施例，上述篩選方法的特征在于，將源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡從體外處理于細胞時處理備選藥物。上述細胞包括炎癥細胞、上皮細胞及成纖維細胞等。依據(jù)上述本發(fā)明的另一實施例，上述篩選方法包括將備選物質(zhì)與源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡一起注入后測定炎癥相關(guān)媒介的標準，但并不僅限于此。本發(fā)明的另一方面，為預防或者治療疾病而提供了一種含有源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡的疫苗。上述本發(fā)明的細胞外小泡如前面所述。上述本發(fā)明的疾病包括由源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡引發(fā)的鼻炎、鼻竇炎、鼻咽癌、哮喘、慢性阻塞性肺病、支氣管炎、支氣管擴張癥、毛細支氣管炎、肺炎、肺癌等。依據(jù)上述本發(fā)明的一個實施例，上述疾病包括由源于室內(nèi)空氣的細菌或霉引發(fā)的鼻竇炎、支氣管擴張癥、肺炎等。依據(jù)上述本發(fā)明的另一實施例，上述細胞外小泡可以基于增強效果或者減少副作用的目的而使用源于轉(zhuǎn)化的細菌或者霉的細胞外小泡，但并不僅限于此。依據(jù)上述本發(fā)明的另一實施例，上述細胞外小泡可以基于增強效果或者減少副作用的目的而使用源于經(jīng)化學物質(zhì)處理的細菌或者霉的細胞外小泡，但并不僅限于此。依據(jù)上述本發(fā)明的另一實施例，上述細胞外小泡可以基于增強效果或者減少副作用的目的而使用經(jīng)化學物質(zhì)處理的細胞外小泡，但并不僅限于此。依據(jù)上述本發(fā)明的另一實施例，上述細胞外小泡可以基于增強效果或者減少副作用的目的而與藥物并用注入，但并不僅限于此。本發(fā)明的另一方面，提供了一種預防或者治療感染的含有源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡的疫苗。上述本發(fā)明的細胞外小泡如前面所述。上述本發(fā)明的感染包括由源于室內(nèi)空氣的細菌或者霉引發(fā)的感染，作為一個實例，包括由源于醫(yī)院室內(nèi)空氣的細菌或者霉引發(fā)的感染。依據(jù)上述本發(fā)明的一個實施例，上述感染包括由細菌或者霉引發(fā)的鼻竇炎、支氣管炎、支氣管擴張癥、肺炎及敗血癥等。依據(jù)上述本發(fā)明的另一實施例，上述細胞外小泡可以基于增強效果或者減少副作用的目的而使用源于轉(zhuǎn)化的細菌或者霉的細胞外小泡，但并不僅限于此。依據(jù)上述本發(fā)明的另一實施例，上述細胞外小泡可以基于增強效果或者減少副作用的目的而使用源于經(jīng)化學物質(zhì)處理的細菌或者霉的細胞外小泡，但并不僅限于此。依據(jù)上述本發(fā)明的另一實施例，上述細胞外小泡可以基于增強效果或者減少副作用的目的而使用經(jīng)化學物質(zhì)處理的細胞外小泡，但并不僅限于此。依據(jù)上述本發(fā)明的另一實施例，上述細胞外小泡可以基于增強效果或者減少副作用的目的而與藥物并用注入，但并不僅限于此。本發(fā)明的另一方面，提供了一種利用源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡診斷上述細胞外小泡導致的疾病發(fā)生或者惡化相關(guān)的致病因子的方法。本發(fā)明的另一方面，提供了一種利用源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡診斷源于室內(nèi)空氣的細菌或者霉導致的感染發(fā)生或者惡化相關(guān)的致病因子的方法。上述本發(fā)明的細胞外小泡如前面所述。上述本發(fā)明的細胞外小泡引發(fā)的疾病包括由存在于室內(nèi)空氣的細胞外小泡引發(fā)的鼻炎、鼻竇炎、鼻咽癌、哮喘、慢性阻塞性肺病、支氣管炎、支氣管擴張癥、毛細支氣管炎、 肺炎及肺癌等。依據(jù)上述本發(fā)明的一個實施例，上述疾病包括由源于室內(nèi)空氣的細菌或者霉引發(fā)的鼻竇炎、支氣管擴張癥及肺炎等。上述細菌或者霉引發(fā)的感染包括鼻竇炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、支氣管擴張癥、 肺炎及敗血癥等。依據(jù)上述本發(fā)明的另一實施例，上述診斷方法包括對存在于室內(nèi)空氣的細胞外小泡所含遺傳物質(zhì)的堿基序列進行分析，但并不僅限于此。上述遺傳物質(zhì)包括16S rRNA,但并不僅限于此。依據(jù)上述本發(fā)明的另一實施例，上述診斷方法包括對存在于室內(nèi)空氣的細胞外小泡所含蛋白質(zhì)進行測定，但并不僅限于此。依據(jù)上述本發(fā)明的另一實施例，上述診斷方法包括對存在于室內(nèi)空氣的細胞外小泡的免疫反應進行測定，但并不僅限于此。上述免疫反應測定包括對存在于室內(nèi)空氣的細胞外小泡的抗體進行測定，但并不僅限于此。上述本發(fā)明的診斷可以利用室內(nèi)灰塵進行。另外，上述診斷可以利用源于痰的樣本、源于胸腔積液的樣本、源于鼻涕的樣本、源于小便的樣本及源于血液的樣本等。本發(fā)明的另一方面，為了預防疾病發(fā)生及惡化而提供了一種抑制室內(nèi)空氣中細胞外小泡的活性或者除去上述細胞外小泡的方法。上述本發(fā)明的疾病包括由源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡引發(fā)的鼻炎、鼻竇炎、鼻咽癌、哮喘、慢性阻塞性肺病、支氣管炎、支氣管擴張癥、毛細支氣管炎、肺炎及肺癌等。除去上述細胞外小泡的活性可通過將細胞外小泡經(jīng)熱處理或者將細胞外小泡經(jīng)有特殊作用的化學物質(zhì)進行處理，但并不僅限于此。上述化學物質(zhì)包括抑制細胞外小泡內(nèi)蛋白、LPS (Iipopolysaccharide)及肽聚糖活性的物質(zhì)等，上述LPS活性抑制化學物質(zhì)包括多粘菌素B (polymyxin B)。上述本發(fā)明的一個實施例，可以利用除去上述細胞外小泡活性的裝置。上述裝置可以利用將上述細胞外小泡經(jīng)熱處理或者將細胞外小泡經(jīng)有特殊作用的化學物質(zhì)進行處理的方法等，但并不僅限于此。上述本發(fā)明的另一實施例，可以利用除去上述細胞外小泡的裝置。上述裝置包括微濾器，其孔的大小(pore size)為10 nm至200 nm，但并不僅限于此。本發(fā)明的另一方面，作為對于相關(guān)呼吸器官疾病發(fā)生或者惡化的室內(nèi)空氣質(zhì)量進行評估的方法，提供了一種以測定室內(nèi)空氣中細胞外小泡的濃度為特征的方法。上述本發(fā)明的一個實施例，上述細胞外小泡的濃度測定可以通過測定細胞外小泡的遺傳物質(zhì)完成，上述遺傳物質(zhì)包括16S rRNA。上述本發(fā)明的另一實施例，上述細胞外小泡的濃度測定可以通過測定細胞外小泡的蛋白質(zhì)完成。上述本發(fā)明的另一實施例，上述細胞外小泡的濃度測定可以通過利用顯微鏡測定細胞外小泡的數(shù)量完成，上述顯微鏡可以利用高分辨率光學顯微鏡或者電子顯微鏡。本發(fā)明的另一方面，提供了一種包括將源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡注入哺乳動物的預防或者治療疾病的方法。上述本發(fā)明的細胞外小泡如前面所述。上述本發(fā)明的疾病包括由源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡引發(fā)的鼻炎、鼻竇炎、鼻咽癌、哮喘、慢性阻塞性肺病、支氣管炎、支氣管擴張癥、毛細支氣管炎、肺炎及肺癌等。依據(jù)上述本發(fā)明的一個實施例，上述疾病包括由源于室內(nèi)空氣的細菌或者霉引發(fā)的鼻竇炎、支氣管擴張癥、肺炎及敗血癥等。上述本發(fā)明的注入包括皮下注射及粘膜注入。技術(shù)效果
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)空氣中含有源于細菌等的細胞外小泡，當吸入上述細胞外小泡 (特別是，源于革蘭氏陰性細菌的細胞外小泡)時，就會誘發(fā)肺的Thl7及/或者Thl免疫反應，由此誘發(fā)中性粒細胞性肺炎，并導致發(fā)生重癥哮喘和慢性阻塞性肺病等呼吸器官疾病， 于是基于此完成了本發(fā)明。因此，應用本發(fā)明的源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡可以獲得如下多種效果。具體地說，本發(fā)明將存在于室內(nèi)空氣的細胞外小泡注入動物構(gòu)建呼吸器官疾病動物模型，利用上述動物模型可以對預防或者治療呼吸器官疾病的備選藥物進行篩選及發(fā)掘。即，為了研發(fā)預防或者治療疾病的藥物，準確把握致病物質(zhì)是非常重要的。例如將致病物質(zhì)從體外注入細胞的過程中，可以對備選藥物進行處理以檢驗其效果，可以將備選藥物注入上述動物模型以檢驗其效果。因此，本發(fā)明為了研發(fā)預防或者治療由源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡引發(fā)疾病的藥物，通過應用存在于室內(nèi)空氣的細胞外小泡的體外篩選系統(tǒng)及 /或者動物模型能夠有效地發(fā)掘預防或者治療由存在于室內(nèi)空氣的細胞外小泡引發(fā)的呼吸器官疾病的藥物。另外，本發(fā)明能夠準確診斷重癥哮喘、慢性阻塞性肺病、肺癌等呼吸器官疾病的致病因子。即，可以應用通過源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡的遺傳物質(zhì)堿基序列分析、蛋白質(zhì)分析或者免疫反應測定而診斷呼吸器官疾病的致病因子的方法。準確把握疾病的致病因子對于研發(fā)能夠預防或者治療疾病的疫苗是必不可少的。 就病毒性感染疾病而言，將致病病毒以弱毒化的形態(tài)注入體內(nèi)，誘發(fā)針對病毒的免疫反應， 從而研發(fā)預防疫苗?，F(xiàn)在，能夠利用預防疫苗有效地預防由病毒引發(fā)的疾病。本發(fā)明基于存在于室內(nèi)空氣的細胞外小泡是呼吸器官疾病的致病因子的事實，通過應用細胞外小泡調(diào)節(jié)在體內(nèi)引發(fā)的免疫反應，從而可以研發(fā)出有效的疫苗。另外，本發(fā)明基于源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡是呼吸器官疾病的致病因子的事實，通過測定源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡的濃度，可以對相關(guān)于導致呼吸器官疾病的發(fā)生或者惡化的室內(nèi)空氣質(zhì)量進行評估。另外，利用可進行熱處理或者化學物質(zhì)處理的空氣凈化裝置等，抑制室內(nèi)空氣中細胞外小泡的活性或者除去致病性細胞外小泡，從而可以預防或者治療呼吸器官疾病的發(fā)生及惡化。


圖1是從采集的室內(nèi)灰塵中分離細胞外小泡的過程的示意圖2是通過透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)對從室內(nèi)灰塵中分離的細胞外小泡的形狀及大小進行分析的示意圖3是將室內(nèi)灰塵通過老鼠的鼻腔注入而誘發(fā)炎癥性呼吸器官疾病(肺炎)的過程的示意圖4是將室內(nèi)灰塵通過老鼠的鼻腔注入時對支氣管肺泡灌洗液(BAL fluid)中炎癥細胞數(shù)量進行測定的示意圖5是將室內(nèi)灰塵通過老鼠的鼻腔注入而誘發(fā)炎癥性呼吸器官疾病(肺炎)時通過細胞內(nèi)細胞因子染色(intracellular cytokine staining)對肺組織中CD4+ T細胞的細胞因子表達進行測定的示意圖6是將老鼠巨噬細胞利用從室內(nèi)灰塵中分離的細胞外小泡(Dust-EV)與水溶性成份 (可溶灰塵Dust-soluble)進行處理后對分泌的細胞因子量通過酶聯(lián)免疫吸附試驗進行測定的示意圖7是將老鼠巨噬細胞利用從室內(nèi)灰塵中分離的細胞外小泡(Dust-EV)進行處理時 TNF-α與IL-6的分泌量隨著注入細胞外小泡用量的增加而增加的示意圖8是將存在于室內(nèi)空氣的細胞外小泡(Dust-EV)經(jīng)多粘菌素B (PMB)或者熱(heat) 處理后注入老鼠巨噬細胞時對TNF-α與IL-6的分泌量進行測定的示意圖9是對由存在于室內(nèi)空氣的細胞外小泡(Dust-EV)引發(fā)的體內(nèi)(in vivo)先天免疫反應進行評估的方案；圖10是為了根據(jù)圖9所示方案對由存在于室內(nèi)空氣的細胞外小泡(Dust-EV)引發(fā)的體內(nèi)(in vivo)先天免疫反應進行評估，從而對肺炎的指標即支氣管肺泡灌洗液(BAL fluid)中炎癥細胞數(shù)量進行測定的示意圖11是評估細胞外小泡及小泡內(nèi)LPS對反復注入存在于室內(nèi)空氣的細胞外小泡 (Dust-EV)誘發(fā)的體內(nèi)后天免疫反應及由此引發(fā)肺炎所起作用的方案；
圖12是根據(jù)圖11所示方案對將存在于室內(nèi)空氣的細胞外小泡(Dust-EV)及小泡經(jīng)多粘菌素B (PMB)處理引發(fā)肺炎進行評估，從而對肺炎的指標即支氣管肺泡灌洗液(BAL fluid)中炎癥細胞數(shù)量進行測定的示意圖13是為了根據(jù)圖11所示方案對將源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡(Dust-EV)及小泡經(jīng)多粘菌素B (PMB)處理引發(fā)的后天免疫反應進行評估，從局部淋巴結(jié)中分離免疫細胞并通過細胞內(nèi)細胞因子染色對免疫細胞中IFN-Y與IL-17的表達形式進行評估的示意圖14是根據(jù)圖11所示方案將源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡(Dust-EV)及小泡經(jīng)多粘菌素B (PMB)處理時通過ELISA方法測定針對從室內(nèi)灰塵中分離的小泡的血清內(nèi)特異抗體的示意圖15是顯示從室內(nèi)灰塵中分離的細胞外小泡(Dust-EV)中存在針對大腸桿菌的16s rRNA及源于大腸桿菌的小泡(E. coli-OMV)特異抗體發(fā)生反應的蛋白質(zhì)的示意圖16是將源于大腸桿菌的細胞外小泡按1次通過鼻腔注入時在支氣管肺泡灌洗液 (BAL fluid)中對炎癥性細胞因子的分泌進行測定的示意圖17是將源于大腸桿菌的小泡(EC-EV)反復注入3周時對引發(fā)的肺炎進行評估的方
案；
圖18是顯示將源于大腸桿菌的小泡(EC-EV)反復注入時的肺炎的指標即支氣管肺泡灌洗液(BAL fluid)中炎癥細胞數(shù)量的示意圖19是將源于大腸桿菌的高用量的細胞外小泡(EC-EV)反復注入4周時對組織學變化進行評估的方案；
圖20是根據(jù)19所示方案注入源于大腸桿菌的小泡(EC-EV)時誘發(fā)肺組織中以肺泡的破壞為特征的肺氣腫的示意圖21是對塵螨中的細胞外小泡進行分離的方案；
圖22是通過透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)和動態(tài)光散射法(dynamic light scattering, DLS)對從塵螨中分離的細胞外小泡的形狀及大小進行分析的示意圖23是將老鼠巨噬細胞利用源于塵螨的細胞外小泡(HDM-EV)進行處理時測定細胞因子量的示意圖M是為了對由源于塵螨的細胞外小泡(HDM-EV)引發(fā)的體內(nèi)先天免疫反應進行評估，對肺炎的指標即支氣管肺泡灌洗液(BAL fluid)中炎癥細胞數(shù)量進行測定的示意圖25是為了對由源于塵螨的細胞外小泡(HDM-EV)引發(fā)的體內(nèi)先天免疫反應進行評估，在支氣管肺泡灌洗液(BAL fluid)中對細胞因子的生成進行測定的示意圖26是為了對由源于塵螨的細胞外小泡(HDM-EV)引發(fā)的體內(nèi)后天免疫反應進行評估，對肺炎的指標即支氣管肺泡灌洗液(BAL fluid)中炎癥細胞數(shù)量進行測定的示意圖； 圖27是為了對由源于塵螨的細胞外小泡(HDM-EV)引發(fā)的體內(nèi)后天免疫反應進行評估，在支氣管肺泡灌洗液中對由Thl7細胞分泌的IL-17的生成進行測定的示意圖； 圖觀是在室內(nèi)灰塵中培養(yǎng)細菌和霉的示意圖； 圖四是對棲息于室內(nèi)灰塵中的細菌進行分離并鑒定的過程示意圖； 圖30是為了對由源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡(S-EV)及經(jīng)熱處理的小泡引發(fā)的體外先天免疫反應進行評估，向老鼠巨噬細胞注入上述細胞外小泡時對TNF-α與IL-6進行測定的示意圖31是對由源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡引發(fā)的體內(nèi)先天免疫反應進行評估的方案；
圖32是根據(jù)圖30所示方案將源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡(S-EV)通過鼻腔注入并對支氣管肺泡灌洗液(BAL fluid)中炎癥細胞數(shù)量進行測定的示意圖33是根據(jù)圖30所示方案對支氣管肺泡灌洗液(BAL fluid)中源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡(S-EV)誘發(fā)的IL-6分泌進行測定的示意圖34是評估小泡內(nèi)蛋白質(zhì)或者抗熱成份對源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡引發(fā)的免疫反應所起作用的方案；
圖35是根據(jù)圖33所示方案將源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡(S-EV)經(jīng)熱處理后通過鼻腔注入時對支氣管肺泡灌洗液(BAL fluid)中炎癥細胞數(shù)量進行測定的示意圖36是根據(jù)圖33所示方案將源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡(S-EV)經(jīng)熱處理后通過鼻腔注入時，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗對支氣管肺泡灌洗液(BAL fluid)中IL-6的量進行測定的示意圖37是將源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV) 1 μ g間隔1周通過腹腔注入3次的過程中對老鼠血液中小泡特異抗體的量進行測定的函數(shù)圖38是從體外向注入有源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV)疫苗的老鼠脾臟細胞中注入源于大腸桿菌的細胞外小泡處理時對分泌的IFN-g量進行測定的函數(shù)圖39是從體外向注入有源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV)疫苗的老鼠脾臟細胞中注入源于大腸桿菌的細胞外小泡處理時對分泌的IL-17量進行測定的函數(shù)圖40是顯示通過大腸桿菌(EC)感染構(gòu)建的敗血癥模型中老鼠致死率的示意圖； 圖41是顯示通過腹腔注入大腸桿菌(EC)構(gòu)建的敗血癥模型中源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV)疫苗對因敗血癥導致的致死率所起效果的函數(shù)圖42是顯示通過腹腔注入大腸桿菌(EC)構(gòu)建的敗血癥模型中血液內(nèi)大腸桿菌數(shù)量 (CFU)隨是否接種源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV)而變化的函數(shù)圖43是在接種了源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV)的老鼠中通過腹腔反復(3次) 注入高用量的源于大腸桿菌的細胞外小泡(5 μ g)后在6小時內(nèi)對老鼠血清中IL-6進行測定的示意圖。
具體實施例方式
當吸入室內(nèi)空氣中的有害物質(zhì)時會誘發(fā)呼吸器官疾病。過敏性反應的特征為免疫學過敏反應，雖然當單獨吸入蛋白質(zhì)時會誘發(fā)免疫耐受，但是，當代替依靠先天免疫反應的針對蛋白質(zhì)的免疫耐受而同時吸入誘導免疫反應的物質(zhì)與蛋白質(zhì)時，就會發(fā)生以對蛋白質(zhì)的記憶為特征的后天免疫反應(致敏)。如果誘導蛋白質(zhì)致敏作用，即使吸入低濃度的蛋白質(zhì)，也會通過針對蛋白質(zhì)的免疫反應誘發(fā)炎癥。在室內(nèi)空氣中的有害物質(zhì)中，就氣體而言， 雖然氣體本身的毒性會誘發(fā)炎癥，但是，不會誘發(fā)由后天免疫反應引起的炎癥。相反，室內(nèi)空氣中的生物性污染物的特征在于，同時帶有誘發(fā)先天免疫反應的物質(zhì)和蛋白質(zhì)，因此，能夠同時誘發(fā)先天免疫反應和后天免疫反應。但是，到目前為止，還沒有研究表明室內(nèi)空氣含有源于細菌等的細胞外小泡或者室內(nèi)空氣中的細胞外小泡是呼吸器官疾病的致病物質(zhì)。本發(fā)明人首次闡述，室內(nèi)空氣中含有源于細菌等的細胞外小泡，當將其吸入時就會誘發(fā)呼吸器官疾病，并基于此完成了本發(fā)明。另外，炎癥根據(jù)嗜酸性粒細胞的滲透與否區(qū)分為嗜酸性粒細胞性及非嗜酸性粒細胞性(或者中性粒細胞性)炎癥。慢性炎癥大多由以針對蛋白質(zhì)的過敏反應(后天免疫反應)為特征的免疫機能異常而引發(fā)，嗜酸性粒細胞性炎癥由針對蛋白質(zhì)的Th2免疫反應而引發(fā)，中性粒細胞性炎癥由Thl7及/或者Thl免疫反應而引發(fā)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當吸入室內(nèi)灰塵時會誘發(fā)中性粒細胞性炎癥，室內(nèi)灰塵的成份中細胞外小泡是誘發(fā)中性粒細胞性炎癥的主要致病因子，當利用抵抗源于革蘭氏陰性細菌的內(nèi)毒素(endotoxin或者脂多糖，LPS)活性的藥物(多粘菌素B)進行處理時，細胞外小泡的活性就會被抑制，基于此，最先闡述源于室內(nèi)空氣中革蘭氏陰性細菌的細胞外小泡是誘發(fā)以中性粒細胞性炎癥反應為特征的呼吸器官疾病的致病物質(zhì)。中性粒細胞性肺炎對于伴隨有非可逆性呼吸道阻塞的重癥哮喘和慢性阻塞性肺病的發(fā)生來說，是一種重要的病態(tài)生理。與吸煙無關(guān)，以中性粒細胞性炎癥為特征的慢性阻塞性肺病是誘發(fā)肺癌發(fā)生的重要危險因素，實際上，慢性阻塞性肺病患者的1/3是因肺癌而死亡。另外，研究人員通過動物實驗表明，Thl7免疫反應及由此引發(fā)的中性粒細胞性炎癥會誘發(fā)大腸癌。這意味著，肺部發(fā)生的Thl7免疫反應及/或者中性粒細胞性炎癥不僅是誘發(fā)重癥哮喘與慢性阻塞性肺病的重要病因，而且還與肺癌的發(fā)生有著密切的關(guān)聯(lián)。本發(fā)明提供了一種含有源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡的組合物及利用上述細胞外小泡對炎癥性呼吸器官疾病等進行診斷、預防及/或者治療的方法。在本發(fā)明中，所謂"室內(nèi)"是指包括建筑物(buildings)在內(nèi)的構(gòu)造物 (structures)內(nèi)部及其周邊，所謂"室內(nèi)空氣“不僅包括室內(nèi)灰塵，而且還包括棲息于室內(nèi)的塵螨、蟑螂、寵物、植物、人等分泌的物質(zhì)。在本發(fā)明中，所謂“源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡“是指存在于包括建筑物在內(nèi)的構(gòu)造物內(nèi)部及其周邊空氣中的細胞外小泡，例如，源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡既包括由棲息于室內(nèi)空氣中的細菌分泌的細胞外小泡，也包括由與棲息于室內(nèi)的存在于塵螨、蟑螂、寵物、植物、人等的細菌分泌而存在于室內(nèi)空氣中的細胞外小泡，其特征在于，大小比原來的細胞小，但并不僅限于此。室內(nèi)空氣中不僅棲息有多種細菌和霉，而且含有棲息于包括人、寵物、塵螨、蟑螂等在內(nèi)的多種生命體的皮膚、消化器官、呼吸器官等的多種細菌和霉，同時還含有棲息于或流入包括建筑物在內(nèi)的構(gòu)造物內(nèi)部及周邊的多種細菌和霉。室內(nèi)特別是床墊和地毯等處存在有大量的灰塵，灰塵中不僅棲息有大量的細菌和霉，而且還含有由塵螨等動物分泌的物質(zhì)。利用真空吸塵器獲得室內(nèi)灰塵后，再利用紗布將頭發(fā)等較大的物質(zhì)除去后進行培養(yǎng)。在這種情況下，室內(nèi)灰塵中培養(yǎng)有多種霉和細菌。另外，將除去較大物質(zhì)后的室內(nèi)灰塵溶于生理鹽水(phosphate buffer saline, PBS)后，經(jīng)過多次離心分離過程，提取出細胞外小泡。通過透射電子顯微鏡照片觀察，可以看到從室內(nèi)空氣中分離的細胞外小泡成大小為50-100 nm的球狀。另外，為了評估室內(nèi)的灰塵是否誘發(fā)炎癥性呼吸器官疾病，在3周內(nèi)通過鼻腔向 C57BL/6老鼠注入灰塵。最后一次通過鼻腔注入灰塵后間隔M小時后進行評估時，可以觀察到老鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalvelolar lavege fluid, BALF)中炎癥細胞數(shù)量增加，特別是，中性粒細胞的數(shù)量顯著增加。上述結(jié)果表明，室內(nèi)的灰塵會誘發(fā)以中性粒細胞滲透為特征的炎癥性呼吸器官疾病(肺炎)。為了評估誘發(fā)上述呼吸器官疾病的免疫學機制，通過流式細胞術(shù)(Flow cytometry)對T細胞表達的細胞因子進行了評估。由T細胞誘發(fā)的后天免疫反應大致分為由分泌IFN-Y的Thl細胞、分泌IL-4，IL-5，IL-13等的Th2細胞及分泌IL-17的Thl7 細胞誘發(fā)的免疫反應。由灰塵誘發(fā)的中性粒細胞性肺炎主要是以生成IL-17的CD4+T細胞 (Th 17細胞)和分泌IFN- γ的Thl細胞為媒介的炎癥反應。Thl及Thl7免疫反應對呼吸道及肺實質(zhì)發(fā)生的以中性粒細胞性炎癥為特征的炎癥性呼吸器官疾病(哮喘、慢性阻塞性肺病、支氣管擴張癥、肺炎等)及肺癌起著重要作用，特別是，Thl炎癥對肺氣腫的發(fā)生起重要作用，Thl7炎癥對肺癌的發(fā)生起重要作用。為了評估室內(nèi)灰塵中的細胞外小泡和水溶性成份對室內(nèi)灰塵誘發(fā)炎癥反應所起的作用，當向老鼠巨噬細胞(RAW 264. 7)注入從灰塵中分離的細胞外小泡和水溶性因子時，雖然TNF-α (alpha)的分泌全都增加，但是，IL_6的分泌主要在注入細胞外小泡時增加。這意味著，存在、于室內(nèi)空氣的細胞外小泡對基于IL-6的免疫反應及炎癥的發(fā)生起著重要作用。存在于室內(nèi)空氣的細胞外小泡可以由棲息于室內(nèi)空氣的細菌或者棲息于包括人、 寵物、塵螨、蟑螂等在內(nèi)的多種生命體或者棲息于包括建筑物在內(nèi)的構(gòu)造物內(nèi)部及周邊的多種細菌分泌。這種細胞外小泡含有細菌蛋白、LPS、肽聚糖等物質(zhì)，從而能夠誘發(fā)炎癥反應。為了對由存在于室內(nèi)空氣的細胞外小泡誘發(fā)的體外先天免疫反應進行評估，將老鼠巨噬細胞(RAW 264. 7)利用從室內(nèi)灰塵中分離的細胞外小泡進行處理。巨噬細胞分泌能夠誘發(fā)炎癥的TNF-α及IL-6等，利用上述細胞外小泡進行處理時，TNF-α及IL_6的量與細胞外小泡的用量成比例增加。IL(interleukin)-6作為發(fā)生炎癥反應時初期分泌的炎癥性細胞因子對初期炎癥反應起尺度作用，在通過Thl7細胞免疫反應誘發(fā)中性粒細胞性炎癥時，它是重要的媒介。 另外，IL-6使體內(nèi)細胞內(nèi)STAT3信號(signaling)增加而通過引發(fā)肺細胞的增殖、血管生成、免疫反應抑制等而與肺癌的發(fā)生相關(guān)，而且IL-6在針對抗原的T細胞后天免疫反應發(fā)生過程中對原態(tài)T (naive Τ)細胞分化為Thl7細胞起重要作用。因此，存在于室內(nèi)空氣的細胞外小泡使巨噬細胞中IL-6的量增加的事實意味著， 上述細胞外小泡誘導炎癥反應不僅能夠引發(fā)哮喘、慢性阻塞性肺病、支氣管擴張癥、肺炎等炎癥性呼吸器官疾病，而且還會弓I發(fā)肺癌等疾病。如上所述，存在于室內(nèi)空氣的細胞外小泡含有能夠誘導炎癥反應的多種蛋白質(zhì)和 LPS等物質(zhì)，因此，通過存在于室內(nèi)空氣的細胞外小泡誘導的炎癥反應可以對上述物質(zhì)的作用進行評估。
多粘菌素B的作用在于與LPS的功能團即脂質(zhì)A (lipid Α)反應而抑制LPS的功能。據(jù)此，當將老鼠巨噬細胞利用從灰塵中分離的細胞外小泡和多粘菌素B —起進行處理時，就會阻礙由細胞外小泡誘發(fā)的IL-6及TNF-α的分泌，這意味著，源于革蘭氏陰性細菌的細胞外小泡對于上述媒介的分泌起著重要作用。另外，細胞外小泡中含有多種蛋白質(zhì)，為了評估小泡中含有的蛋白質(zhì)的作用，利用在100°C條件下加熱20分鐘的細胞外小泡對老鼠巨噬細胞進行處理。上述小泡經(jīng)熱處理后，TNF(Tumor necrosis factor) -α (alpha)的分泌就會減少，但是，IL-6的分泌反而會增加。這意味著，對TNF-α (alpha)的分泌來說小泡內(nèi)蛋白質(zhì)起著重要作用，但是，對IL_6 的分泌來說具有耐熱性的小泡成份起著重要作用。另外，可以將從室內(nèi)空氣中分離的細胞外小泡注入實驗動物構(gòu)建呼吸器官疾病動物模型。與此相關(guān)，將從灰塵中分離的細胞外小泡注入老鼠并評估其對肺炎的發(fā)生及IL-6 的分泌產(chǎn)生的影響。當將多種濃度的細胞外小泡通過呼吸道注入老鼠時，可以確認隨著濃度的變化炎癥細胞的流入會增加，注入細胞外小泡的老鼠中IL-6的生成量也增加了。上述結(jié)果表明，體外實驗中在小泡作用下炎癥細胞中IL-6分泌增加的現(xiàn)象在體內(nèi)系統(tǒng)中也會再現(xiàn)。將從室內(nèi)灰塵中分離的細胞外小泡反復注入時評估是否發(fā)生炎癥性呼吸器官疾病。當將小泡通過呼吸道注入3周時，發(fā)生了中性粒細胞性炎癥。相反，當將多粘菌素B與小泡一起注入時，炎癥明顯受抑制。這意味著，源于革蘭氏陰性細菌的細胞外小泡對炎癥的發(fā)生起著重要作用。另外，對干預肺炎發(fā)生的免疫學病因進行評估的結(jié)果表明，當注入從灰塵中分離的小泡時，表達肺組織內(nèi)IFN-Y及IL-17的T細胞顯著增加，當將多粘菌素B與上述小泡一起注入時，上述細胞的滲透顯著減少。上述結(jié)果表明，灰塵中的細胞外小泡引發(fā)的中性粒細胞性肺炎通過Thl及Thl7免疫反應誘導，小泡內(nèi)LPS成份對其發(fā)生起著重要作用。另外，對源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡特異抗體進行測定的結(jié)果表明，當注入小泡時，小泡特異IgGl及IgGh抗體顯著增加，當將多粘菌素B與小泡一起注入時就顯著減少。 上述結(jié)果表明，當室內(nèi)灰塵中的細胞外小泡通過呼吸道吸入時，血清中生成小泡特異抗體， 小泡內(nèi)LPS成份對其生成起著重要作用。大腸桿菌作為革蘭氏陰性細菌棲息于腸道中，室內(nèi)灰塵中含有大腸桿菌，研究表明大腸桿菌分泌細胞外小泡。對從室內(nèi)灰塵中分離的細胞外小泡中是否含有源于大腸桿菌的細胞外小泡的情況進行了評估。當利用針對源于大腸桿菌的細胞外小泡中含有的特異 16S rRNA的引物對基因型進行分析時，可觀察到陽性評價。另外，制作針對源于大腸桿菌的細胞外小泡的抗體并利用它對從灰塵中分離的細胞外小泡蛋白質(zhì)實施免疫印跡(Western Blot)時，從灰塵中分離的細胞外小泡內(nèi)蛋白質(zhì)與源于大腸桿菌的小泡特異抗體相結(jié)合。上述結(jié)果表明，室內(nèi)灰塵中含有源于大腸桿菌的細胞外小泡。大腸桿菌是一種主要棲息于大腸內(nèi)的細菌，它棲息于塵螨、蟑螂、寵物、人等的腸道內(nèi)，持續(xù)分泌細胞外小泡。這意味著，塵螨等通過大便持續(xù)分泌源于大腸桿菌的細胞外小泡。當將源于大腸桿菌的細胞外小泡通過呼吸道注入1次并對體內(nèi)的炎癥媒介分泌進行評估時，TNF-α (alpha)與IL_6的分泌與細胞外小泡的注入量成比例增加。當將源于大腸桿菌的細胞外小泡反復注入時，為了評估是否引發(fā)炎癥性呼吸器官疾病，如果在3周內(nèi)每周通過鼻腔注入2次時，支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞的數(shù)量依賴源于大腸桿菌的細胞外小泡注入量的增加而增加。上述方法中，當將高用量(100 ng)的細胞外小泡反復注入4周并對肺氣腫的發(fā)生進行評估時，如果注入細胞外小泡的情況下，就會發(fā)生肺氣腫。這意味著，如果室內(nèi)灰塵中含有高濃度的如源于大腸桿菌的細胞外小泡的致病性小泡，而將其吸入時，就會誘發(fā)導致非可逆性呼吸道阻塞的肺氣腫。源于室內(nèi)灰塵的細胞外小泡也可以通過灰塵中的多種細菌而生成，棲息于包括室內(nèi)空氣中的塵螨、蟑螂、人、寵物等在內(nèi)的多種生命體內(nèi)的細菌可以分泌細胞外小泡。本發(fā)明人從棲息于室內(nèi)灰塵中的塵螨中分離細胞外小泡。為了對源于塵螨的細胞外小泡引發(fā)的體外免疫反應進行評估，利用細胞外小泡對老鼠巨噬細胞進行了處理。在巨噬細胞中TNF-α (alpha)與IL_6的分泌與小泡的濃度成比例增加。另夕卜，由小泡分泌的上述炎癥媒介通過抵抗LPS的多粘菌素B處理而被抑制。這意味著，源于塵螨的細胞外小泡可以誘發(fā)呼吸器官疾病，其中含有從革蘭氏陰性細菌分泌的細胞外小泡。如上所述，源于塵螨的細胞外小泡在體外實驗中可以誘發(fā)先天免疫反應。為了對其在體內(nèi)系統(tǒng)中的再現(xiàn)情況進行評估，將源于塵螨的細胞外小泡通過老鼠的呼吸道注入1 次，并評估先天免疫反應情況。肺部的炎癥細胞滲入依賴細胞外小泡的濃度的增加而增加， 同時，炎癥媒介即TNF-Y及IL-6的分泌也增加?；谏鲜鲶w內(nèi)系統(tǒng)的先天免疫反應結(jié)果，當源于塵螨的細胞外小泡被反復吸入時，對是否發(fā)生肺炎進行評估的結(jié)果表明，當將源于塵螨的細胞外小泡注入3周時，會誘發(fā)中性粒細胞性肺炎，同時，IL-17的分泌也增加。上述結(jié)果表明，在源于塵螨的細胞外小泡作用下會引發(fā)中性粒細胞性肺炎，這主要是由Thl7免疫反應作媒介而引發(fā)的現(xiàn)象。本發(fā)明人對棲息于室內(nèi)灰塵中的細菌進行分離，并鑒定革蘭氏陽性細菌的存在。 結(jié)果鑒定出，革蘭氏陽性細菌包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S. aureus), 人葡萄球菌(.Staphylococcus hominis)等。金黃色葡萄球菌作為革蘭氏陽性細菌，本發(fā)明人最近曾發(fā)表過最早發(fā)現(xiàn)其分泌細胞外小泡。為了對源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡引發(fā)的體外免疫反應進行評估，利用源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡對老鼠巨噬細胞進行處理。在源于金黃色葡萄球菌的小泡的作用下，巨噬細胞中TNF-α (alpha)與IL_6的分泌增加。上述結(jié)果表明，源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡能夠誘發(fā)炎癥性呼吸器官疾病及肺癌。如上所述，源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡在體外實驗中誘發(fā)先天免疫反應。 為了通過體內(nèi)系統(tǒng)對其進行確認，將源于互不相同濃度(1 Ugao μ g)的金黃色葡萄球菌的細胞外小泡通過呼吸道注入老鼠。隨著細胞外小泡注入量的增加，流入老鼠肺部的炎癥細胞也增加，特別是，中性粒細胞的過量流入。支氣管肺泡灌洗液中IL-6的分泌量也隨著細胞外小泡濃度的增加而增加。上述結(jié)果表明，源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡誘發(fā)肺炎的發(fā)生，同時，也可以預測其與IL-6引發(fā)Thl7后天免疫反應之間的關(guān)聯(lián)性。另外，為了確認體內(nèi)系統(tǒng)中源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡內(nèi)蛋白質(zhì)的作用， 將經(jīng)熱處理的細胞外小泡通過呼吸道注入老鼠。在這種情況下，對引發(fā)肺癌及蛋白質(zhì)特異Thl7后天免疫反應起核心作用的IL-6生成量全都減少。上述結(jié)果表明，對于吸入灰塵引發(fā) Thl7免疫反應而導致肺炎的發(fā)生而言，源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡內(nèi)蛋白質(zhì)的作用就是增加IL-6的生成。研究疾病的致病因子可以利用致病因子實施免疫調(diào)節(jié)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當吸入源于室內(nèi)空氣中大腸桿菌的細胞外小泡時，會誘發(fā)炎癥性呼吸器官疾病。當將源于大腸桿菌的細胞外小泡按低用量注射時，會生成細胞外小泡特異抗體，通過針對小泡的特異T細胞反應可以誘導分泌IFN-γ和IL-17的Thl及Thl7免疫反應。因此，將源于大腸桿菌的細胞外小泡作為疫苗事先注射后，當誘發(fā)大腸桿菌感染時，大腸桿菌感染就顯著受抑制。另外， 當事先注入上述小泡疫苗時，源于大腸桿菌的細胞外小泡通過血管吸收而引發(fā)的炎癥媒介的分泌就顯著受抑制。這意味著，因注射源于細菌的細胞外小泡而誘發(fā)免疫反應，通過該免疫反應不僅能夠有效地預防由室內(nèi)空氣中細胞外小泡引發(fā)的疾病，而且還能夠有效地預防由室內(nèi)空氣中細菌引發(fā)的感染。下面，為了有助于對本發(fā)明的理解，將提供理想的實施例。但是，以下實施例僅在于使受眾能夠更加容易地理解本發(fā)明，不能依據(jù)以下實施例限定本發(fā)明的內(nèi)容。
實施例實施例1.從室內(nèi)灰塵中提取細胞外小泡及研究特性
本發(fā)明人為了確認室內(nèi)空氣中是否存在細胞外小泡，實施了從室內(nèi)灰塵中分離細胞外小泡并進行鑒定的實驗。具體地說，使用真空吸塵器收集特定居住地寢具上的灰塵。再將真空吸塵器的過濾器內(nèi)的灰塵移入干凈的玻璃瓶中，并測定其質(zhì)量。將室內(nèi)灰塵5 g溶于裝有200 ml PBS的燒杯中在4°C條件下放置12小時。然后，利用紗布一次性地將較大的異物過濾，將過濾后的溶液分裝于高速離心管(fuge tube)內(nèi)，在4°C，10，000 χ g條件下連續(xù)2次實施高速離心分離(high speed centrifugation) 15分鐘。取180 ml左右的上層液按1次通過孔的大小為0.45 μ m的薄膜過濾器(membrane filter)，然后，分裝于70 ml容量的超速離心管(ultracentrifuge tube)中，在4°C，100，000 χ g的條件下超速離心分離 (ultracetrifugationM小時。除去上層液將離心管下部的沉淀物用PBS溶解，并提取細胞外小泡。為了研究源于室內(nèi)灰塵的細胞外小泡特性而分離細胞外小泡時，采用蔗糖墊法進行追加提煉。向35 ml容量的超速離心管內(nèi)依次放入0. 5 ml的2. 5 M蔗糖和1 ml的0. 8 M蔗糖、32 ml除去異物的溶液，在4°C，100,000 χ g的條件下超速離心分離4小時。超速離心分離后，細胞外小泡根據(jù)其密度位于2. 5 M蔗糖層與0.8 M蔗糖層之間。從離心管的上端開始除去溶液，分離出含有細胞外小泡的層。圖1是從室內(nèi)灰塵中采集細胞外小泡的過程的示意圖。圖2是通過透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)對源于室內(nèi)灰塵的細胞外小泡的形狀及大小進行拍攝的示意圖，可以看出，它由脂雙層構(gòu)成，大小為50-100 nm，大致成球型。上述結(jié)果表明，室內(nèi)灰塵中含有細胞外小泡，這意味著，室內(nèi)空氣中含有細胞外小泡。實施例2.由室內(nèi)采集的灰塵誘發(fā)的炎癥性呼吸器官疾病(肺炎)本發(fā)明人實施了評估從室內(nèi)采集的灰塵是否誘發(fā)哺乳動物發(fā)生炎癥性呼吸器官疾病的實驗。具體地說，將室內(nèi)灰塵或者通過40 μ m過濾器的室內(nèi)灰塵100 ng溶于30 μ 1 的PBS中。老鼠采用C57BL/6，6周齡雌性，每群5只，將溶于PBS (phosphate buffered saline)的灰塵在第0，1，7，8，14，15日時通過呼吸道注入，在第16日測定老鼠的肺炎。在這種情況下，將注入PBS的老鼠作為對照群，將注入上述灰塵的老鼠作為實驗群。將氯胺酮(ketamin)與甲苯噻嗪(xylaxine)混合形成的麻醉液注入老鼠腹腔實施麻醉后，切開胸部，露出氣管，將導管插入呼吸道并進行結(jié)扎。將無菌生理鹽水按每次注入1 ml共注入2次，對呼吸道進行灌洗，提取支氣管肺泡灌洗液。將支氣管肺泡灌洗液在 4°C條件下按800 χ g標準離心分離10分鐘后，將細胞顆粒(cell pellet)溶于PBS溶液中。將上述細胞顆粒通過細胞離心涂片器(cytospin)涂抹到載玻片上，實施迪芙-奎克 (Diff Quick)染色，在光學顯微鏡1000倍視野內(nèi)可以觀察到300個以上的炎癥細胞，按照巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞分類分別測定各炎癥細胞的數(shù)量。圖3是將室內(nèi)灰塵通過老鼠的鼻腔注入而誘發(fā)炎癥性呼吸器官疾病(肺炎)的過程的示意圖，圖4是測定支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞數(shù)量的示意圖。如圖4所示，如果將灰塵通過鼻腔注入，就會弓I發(fā)肺炎(BAL細胞增加)，特別是，中性粒細胞(neutrophil)滲透顯著增加。另外，當將灰塵通過40 μ m過濾器除去較大的物質(zhì)后通過鼻腔注入時(過濾灰塵filtered dust)，就會誘發(fā)以中性粒細胞滲透為特征的中性粒細胞性肺炎。這意味著，誘發(fā)中性粒細胞性肺炎的物質(zhì)是存在于室內(nèi)灰塵物質(zhì)中的40 μ m以下的成份。上述結(jié)果表明，當將從室內(nèi)采集的灰塵被哺乳動物吸入時，就會誘發(fā)以中性粒細胞性炎癥為特征的呼吸器官疾病。實施例3.從室內(nèi)采集的灰塵引發(fā)的中性粒細胞性肺炎的免疫學發(fā)生機制上述實施例2的結(jié)果表明，由室內(nèi)灰塵誘發(fā)哺乳動物發(fā)生中性粒細胞性肺炎，與此相
關(guān)，本發(fā)明人實施了闡述其免疫學機制的實驗。具體地說，通過上述實施例2的方法從老鼠中摘出誘發(fā)肺炎的肺。將摘出的肺組織利用刮臉刀片切碎后，添加IV型膠原酶(collagenase type IV)，在37°C條件下培養(yǎng)10 分鐘。然后，利用細胞濾網(wǎng)(cell strainer)將從組織中分離細胞，在4°C條件下按800 χ g標準離心分離10分鐘。將離心分離的肺細胞放置紅細胞溶解溶液中10分鐘，將紅細胞破壞。然后，再按上述條件進行離心分離。利用血細胞計數(shù)器(Hematocytometer)測定細胞數(shù)量，按2 χ IO6/ ml 的濃度溶于裝有 RPMI1640 和 10% FBS (fetal bovine serum)、抗生素(antibiotics) 的溶液中。在將細胞放入48孔板的一天前用PBS對48孔板上針對⑶3和⑶觀的抗體進行稀釋使其濃度分別達到1 μ g/ml，然后，向每個孔中放入250 μ ，保持4°C放置1(Γ18小時，將抗體包覆到孔上。將肺細胞按上述濃度準備好后，將包覆有抗體的48孔板用PBS進行灌洗，除去板底部未進行包覆而以自由形式分散的抗體。然后，放入肺細胞，經(jīng)過4小時后，放入10 μ g/ ml的阻礙向細胞外分泌蛋白質(zhì)等物質(zhì)的布雷菲德菌素A再培養(yǎng)2小時，使向細胞外分泌的細胞因子存放到細胞內(nèi)。完成培養(yǎng)的細胞利用帶有熒光的⑶4 (FITC)，⑶8 (PE-Cy5)，⑶3(APC)抗體對肺細胞表面的各種蛋白質(zhì)進行染色。30分鐘后在4°C條件下按800 χ g標準離心分離10分鐘，進行灌洗后，利用4%福爾馬林在細胞表面穿孔，使針對細胞因子的抗體能夠順利進入。利用福爾馬林處理10分鐘后，利用帶有熒光的IFN-γ (PE)，IL-4 (PE)， IL-IO (PE)，IL-17 (PE)抗體將細胞因子染色30分鐘。利用流式細胞儀(FACS Calibur) 測定流入肺內(nèi)的T細胞中細胞因子的表達。圖5是利用流式細胞術(shù)(Flow cytometry)測定按上述方法的⑶4+ T細胞的細胞因子表達量的示意圖。如上述實施例2所述，圖5中的過濾灰塵(filtered dust)使灰塵通過40 μ m過濾器。T細胞引發(fā)的后天免疫反應大致分為，由分泌IFN- γ的Thl細胞、分泌IL-4的Th2細胞及分泌IL-17的Thl7細胞引發(fā)的反應。如圖5所示，因灰塵引發(fā)肺炎的老鼠與對照群(PBS)相比，其肺組織中表達IFN-Y 和IL-17的⑶4+ T細胞增加了，如果將灰塵按40 μ m大小過濾，則表達IL-17的⑶4+ T 細胞進一步增加。這意味著，室內(nèi)灰塵引發(fā)的中性粒細胞性肺炎是由生成IFN-Y和IL-17 的⑶4+T細胞(Thl和Thl7細胞)誘發(fā)的。Thl和Thl7免疫反應不僅是誘發(fā)在呼吸道及肺實質(zhì)發(fā)生的炎癥性呼吸器官疾病即重癥哮喘、慢性阻塞性肺病、支氣管擴張癥、肺炎等疾病，而且還誘發(fā)肺癌，因此，它作為一種重要的免疫學過敏反應，Thl細胞分泌的IFN-γ對肺氣腫的發(fā)生起重要作用，Thl7細胞分泌的IL-17對肺癌的發(fā)生起重要作用。上述結(jié)果表明，室內(nèi)灰塵能夠誘發(fā)Thl及Thl7免疫反應，并導致以中性粒細胞性肺炎為特征的哮喘、慢性阻塞性肺病、支氣管擴張癥、肺炎等炎癥性呼吸器官疾病和肺癌的發(fā)生。實施例4.室內(nèi)空氣中細胞外小泡引發(fā)的體外先天免疫反應
在上述實施例1中，確認室內(nèi)灰塵即室內(nèi)空氣中含有細胞外小泡，并對從室內(nèi)灰塵中分離的細胞外小泡引發(fā)的體外先天免疫反應進行了評估。為此，將對老鼠巨噬細胞(RAW 264. 7)利用從室內(nèi)灰塵中分離的細胞外小泡進行了處理。首先，將室內(nèi)灰塵溶于PBS后，將細胞外小泡與水溶性成份分離。為了對上述小泡與水溶性成份引發(fā)的先天免疫反應進行評估，利用細胞外小泡和水溶性成份對老鼠巨噬細胞進行處理，收集上層液，測定細胞因子的量，其結(jié)果如圖6所示。具體地說，將老鼠巨噬細胞(RAW^64. 7)在M孔板上培養(yǎng)M小時使其達到1 χ IO50利用PBS進行灌洗后，將DMEM培養(yǎng)基分別利用從灰塵中分離的細胞外小泡(Dust_EV， 0. 1 /ml)及水溶性成份(Dust-s0luble，8 /ml)進行處理后，培養(yǎng)15小時。收集培養(yǎng)液，在4°C條件下按800 χ g標準離心分離10分鐘，收集上層液，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗 (enzyme linked immunosorbant assay, ELISA)方法測定細胞因子的量。如圖6所示，與從室內(nèi)灰塵中分離的小泡和水溶性成份導致TNF- α分泌增加的情況不同，IL-6的分泌主要由小泡誘導。這意味著，存在于室內(nèi)灰塵中的細胞外小泡對基于 IL-6的炎癥疾病的發(fā)生起著重要作用。另外，采用與上述相同的方法將細胞外小泡100 ng/ml和1 μ g/ml處理后，測定細胞因子的量，結(jié)果表明，隨著注入小泡的用量增加，TNF-α與IL-6的分泌量也增加(參照圖7)。另外，革蘭氏陰性細菌的外膜(outer membrane)中含有LPS，室內(nèi)灰塵中含有 LPS,已知LPS能夠誘發(fā)先天免疫反應。圖8是對從室內(nèi)灰塵中分離的細胞外小泡引發(fā)的免疫反應中LPS作用(LPS作用抑制劑；多粘菌素B，PMB)和蛋白質(zhì)作用(通過熱處理的破壞) 進行評估的示意圖。可以看出，小泡引發(fā)的TNF-α分泌在經(jīng)PMB或者熱處理的情況下全都顯著減少。相反，小泡引發(fā)的IL-6分泌在經(jīng)PMB處理的情況下雖然顯著減少，但在經(jīng)熱處理的情況下反而增加。實施例3的結(jié)果表明，室內(nèi)灰塵能夠誘導Thl7免疫反應并引發(fā)中性粒細胞性肺炎。另外，上述實施例4的結(jié)果表明，由室內(nèi)灰塵引發(fā)Thl7免疫反應誘發(fā)的中性粒細胞性肺炎與從室內(nèi)灰塵中分離的細胞外小泡引發(fā)IL-6分泌的增加相關(guān)，即室內(nèi)空氣中的細胞外小泡使對T細胞分化為Thl7起核心作用的細胞因子即IL-6的分泌增加，結(jié)果誘導Thl7 免疫反應，最終引發(fā)中性粒細胞性肺炎。另外，誘發(fā)這種炎癥性呼吸器官疾病的致病性小泡是含有LPS的小泡。實施例5.室內(nèi)空氣中的細胞外小泡引發(fā)的體內(nèi)先天免疫反應
本發(fā)明人在實施例4中確認的體外先天免疫反應的基礎(chǔ)上，還實施了對室內(nèi)空氣中細胞外小泡引發(fā)的體內(nèi)先天免疫反應進行評估的實驗，實驗方案如圖9所示。具體地說，用C57BL/6，6周齡雌性老鼠(每群4只)做實驗，將從室內(nèi)灰塵中分離的細胞外小泡0.01，0. 1，1 mg溶于PBS 30 中，通過鼻腔注入1次，間隔M小時后進行評估。在這種情況下，將注入PBS的老鼠作為對照群。根據(jù)上述方法用麻醉液將老鼠麻醉后， 提取支氣管肺泡灌洗液。將支氣管肺泡灌洗液在4°C條件下按800 χ g標準離心分離10分鐘后，將細胞顆粒(cell pellet)溶于PBS溶液中，測定流入的炎癥細胞數(shù)量。圖10是對肺炎的指標即支氣管肺泡灌洗液(BAL)中炎癥細胞數(shù)量進行測定的示意圖。如圖10所示，與對照群(PBS)相比，在注入細胞外小泡的情況下(Dust-EV)，支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞的數(shù)量與小泡用量成比例增加。另外，對于誘發(fā)Thl7免疫反應的核心細胞因子即IL-6來說，其分泌量與細胞外小泡注入量成比例增加。上述結(jié)果表明，體外系統(tǒng)及體內(nèi)系統(tǒng)中從室內(nèi)灰塵中分離的細胞外小泡誘發(fā)先天免疫反應，從室內(nèi)灰塵中分離的細胞外小泡促進IL-6的分泌，從而誘導Thl7免疫反應并引發(fā)以中性粒細胞性肺炎為特征的呼吸器官疾病。實施例6.室內(nèi)空氣中的細胞外小泡引發(fā)的體內(nèi)后天免疫反應
根據(jù)圖11所示方案，實施了對從室內(nèi)灰塵中分離的細胞外小泡引發(fā)的體內(nèi)后天免疫反應進行評估的實驗。具體地說，用C57BL/6，6周齡雌性老鼠(每群4只)做實驗，將從室內(nèi)灰塵中分離的細胞外小泡1 溶于PBS 30 中，通過鼻腔按每周注入2次注射3周，最后一次注入經(jīng)過對小時后進行評估。另外，為了對含有LPS的細胞外小泡的作用進行評估，將小泡利用 PMB處理后，同時實施注入實驗。圖12是顯示肺炎的指標即支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞數(shù)量的示意圖，可以看出，與對照群(PBS)相比，細胞外小泡注入群(Dust-EV)中炎癥細胞的數(shù)量顯著增加。另外， 當將從室內(nèi)灰塵中分離的細胞外小泡用PMB處理時(Dust-EV+PMB)，由小泡導致增加的炎癥細胞數(shù)量顯著減少。這意味著，當反復露出于室內(nèi)空氣中的小泡時，就會引發(fā)中性粒細胞性肺炎，含有LPS的小泡對其發(fā)生起著重要作用。另外，本發(fā)明人為了對與肺炎發(fā)生相關(guān)的免疫學發(fā)病機制進行評估，從局部淋巴結(jié)中分離免疫細胞，對免疫細胞中IFN-Y與IL-17的表達形式進行評估的結(jié)果如圖13所示。評估結(jié)果表明，如果注入從灰塵中分離的小泡，與注入PBS的情況相比，局部淋巴結(jié)內(nèi) T細胞數(shù)量顯著增加，特別是，表達IFN-Y與IL-17的T細胞顯著增加。另外，當將細胞外小泡利用PMB進行處理時，局部淋巴結(jié)內(nèi)T細胞的數(shù)量減少，表達IFN-Y和IL-17的T細胞數(shù)量也顯著減少。圖14是通過ELISA方法對血清中含有的從室內(nèi)灰塵中分離的小泡特異抗體進行測定的示意圖。結(jié)果表明，當注入從室內(nèi)灰塵中分離的小泡時，小泡特異IgGl及IgGh的量顯著增加，這意味著，當將小泡利用PMB處理時，其量的減少程度與注入PBS的群相似。上述結(jié)果表明，室內(nèi)空氣中細胞外小泡引發(fā)的肺炎以中性粒細胞性炎癥為特征， 這意味著，其由Thl及Thl7免疫反應引發(fā)，對此含有LPS的小泡起著重要作用。另外，當吸入室內(nèi)空氣中的小泡時，血清中小泡特異IgGl及IgGh抗體增加，因此，通過測定血清中小泡特異抗體就可以對反復暴露的致病性小泡進行診斷。實施例7.室內(nèi)空氣中的細胞外小泡中含有源于大腸桿菌的細胞外小泡
上述實施例5及實施例6的結(jié)果表明，含有LPS的小泡對室內(nèi)空氣中細胞外小泡誘導的體內(nèi)先天免疫反應及后天免疫反應的發(fā)生起著重要作用。LPS是一種存在于革蘭氏陰性細菌外膜中的物質(zhì)，顯然含有LPS的小泡源于革蘭氏陰性細菌。大腸桿菌作為革蘭氏陰性細菌，存在于室內(nèi)空氣中，它分泌含有LPS的細胞外小泡，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該小泡內(nèi)不僅含有LPS，而且還含有誘導免疫及炎癥反應的蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明人對從室內(nèi)灰塵中分離的細胞外小泡中含有源于大腸桿菌的細胞外小泡的情況進行了評估。為了評估從室內(nèi)灰塵中分離的細胞外小泡內(nèi)含有源于大腸桿菌的小泡，利用大腸桿菌特異性16s rRNA引物評估基因型。具體地說，將從灰塵中分離的細胞外小泡在100 °C 條件下加熱20分鐘，使其溶出DNA和RNA，將其利用模板(template)合成cDNA。將合成的 cDNA通過模板放入大腸桿菌特異性16s rRNA引物，將94 V (40秒)和72 V (40秒)條件以40次周期執(zhí)行兩步法聚合酶鏈反應(PCR)。結(jié)果表明，與源于大腸桿菌的細胞外小泡(E.coli-EV)相似，從室內(nèi)灰塵中分離的細胞外小泡(Dust-EV)中也含有大腸桿菌的16s rRNA(參照圖15)。另外，確認從室內(nèi)灰塵中分離的小泡中含有源于大腸桿菌的小泡所帶有的蛋白質(zhì)。為此，利用由源于大腸桿菌的小泡生成的抗體(anti-E. coli EV Ab)實施免疫印跡 (Western Blot)，結(jié)果表明，室內(nèi)灰塵中含有包括細菌等的顆粒成份和從室內(nèi)灰塵中分離的與源于大腸桿菌的小泡特異抗體反應的蛋白質(zhì)(參照圖15)。上述結(jié)果表明，室內(nèi)空氣中含有源于大腸桿菌的細胞外小泡。實施例8.源于大腸桿菌的細胞外小泡引發(fā)的體內(nèi)先天免疫反應
從實施例7中可知，室內(nèi)空氣含有源于大腸桿菌的細胞外小泡，基于此，對源于大腸桿菌的細胞外小泡引發(fā)的體內(nèi)先天免疫反應進行評估。源于大腸桿菌的細胞外小泡從大腸桿菌培養(yǎng)液中提取。具體地說，將大腸桿菌放入裝有3 ml LB溶液的試管內(nèi)在37 °C條件下培養(yǎng)4小時后，將其中的10 μ 1移入裝有 500 ml LB溶液的8個2L三角燒瓶中，在37 °C條件下培養(yǎng)4小時。將培養(yǎng)液分裝于12個 350 ml容量高速離心分離管中，然后在4 5,000 χ g條件下以15分鐘連續(xù)執(zhí)行2次。 將4 L左右的上層液1次通過帶有0. 45 μ m大小孔的薄膜過濾器(membrane filter)，再利用僅能讓100 kDa以下的分子通過的超濾系統(tǒng)(Quixstand system)將其濃縮至300 ml。將濃縮液1次通過帶有0.22 μ m大小孔的薄膜過濾器后，將其分裝于50 ml容量的超速離心管(ultracentrifuge tube)內(nèi)，在4°C，150,000 χ g條件下超速離心分離 (ultracetrifugati0n)3小時。除去上層液將離心管下部的沉淀物用PBS溶解，并提取源于腸道大腸桿菌的細胞外小泡。
為了測定免疫反應，用C57BL/6，6周齡雌性老鼠(每群4只)做實驗，將按上述方法提取的源于大腸桿菌的細胞外小泡1，10，100 ng溶于PBS 30 中，通過鼻腔注入1次后，間隔2，8，M小時后，對媒介的分泌進行評估。在這種情況下，將注入PBS的老鼠作為對照群。 根據(jù)上述方法利用麻醉液將老鼠麻醉后，提取支氣管肺泡灌洗液(BAL fluid)。圖16是對支氣管肺泡灌洗液中源于大腸桿菌的細胞外小泡引發(fā)的炎癥性細胞因子的分泌進行測定的示意圖。結(jié)果可以看出，在注入小泡的情況下，與對照群相比，第8小時的支氣管肺泡灌洗液中TNF-α與IL-6的量增加，這意味著，其量與小泡的用量成比例增加。實施例9.反復注入源于大腸桿菌的細胞外小泡引發(fā)的肺炎
在實施例8中，基于源于大腸桿菌的小泡按用量依賴性促進誘導Thl7免疫反應的IL-6 分泌的事實，通過反復注入源于大腸桿菌的小泡對肺炎進行評估。如圖17的方案所示，將源于大腸桿菌的細胞外小泡10，100 ng溶于PBS 30 中并通過鼻腔向C57BL/6，6周齡雌性老鼠(每群4只)注入，每周注射2次注射3周后，最后一次注入小泡后在第M小時時進行評估。圖18是對肺炎的指標即支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞數(shù)量進行測定的示意圖， 與對照群(PBS)相比，源于大腸桿菌的細胞外小泡注入群(EC-EV)中炎癥細胞數(shù)量增加，這意味著，其數(shù)量依賴小泡注入用量的增加而增加。實施例10.源于大腸桿菌的細胞外小泡引發(fā)的肺氣腫
在實施例9中，當將源于大腸桿菌的細胞外小泡通過呼吸道反復注入3周時，基于按用量依賴性引發(fā)肺炎的事實，將高用量的小泡反復注入4周并對其結(jié)構(gòu)性變化進行評估。如圖19的方案所示，將源于大腸桿菌的細胞外小泡100 ng溶于PBS 30 中并通過鼻腔向C57BL/6，6周齡雌性老鼠(每群4只)注入，每周注射2次注射4周后，在第M 小時時對其組織學變化進行評估。圖20是顯示肺組織中肺泡破壞情況的示意圖，可以看出，在注入源于大腸桿菌的小泡的情況下，與對照群相比，會引發(fā)以肺泡破壞為特征的肺氣腫，如果將其通過弦長 (chord length)進行定量，在注入小泡的情況下，與對照群相比，弦長顯著增加。上述結(jié)果表明，當將源于大腸桿菌的細胞外小泡按較高的濃度反復暴露時，就會引發(fā)導致非可逆性呼吸道阻塞的肺氣腫的發(fā)生。實施例11.通過棲息于室內(nèi)空氣中的塵螨構(gòu)建粗提取物(crude extract)及提取細胞外小泡及研究特性
為了確認棲息于室內(nèi)的塵螨(house dust mite, HDM)中是否含有細胞外小泡，本發(fā)明人實施了從塵螨中提取細胞外小泡并研究其特性的實驗。具體地說，延世大學醫(yī)用節(jié)肢動物素材庫中購入塵螨20 g，將其移入干凈的燒杯中，放入500 ml PBS后，在4°C條件下攪拌M小時。然后，將其分裝于高速離心分離管(high speed centrifuge tube)內(nèi)，在 4°C，10，000 χ g 條件下高速離心分離(high speed centrifugation)15分鐘，連接執(zhí)行2次。將450 ml左右的上層液1次通過帶有0.22 μ m大小孔的薄膜過濾器(membrane filter)，然后，將其分裝于70 ml容量的超速離心管(ultracentrifuge tube)內(nèi)，在4°C，100，000 χ g條件下超速離心分離 (ultracetrifugati0n)3小時。除去上層液，將離心管下部的沉淀物用PBS溶解，提取細胞外小泡。為了研究源于塵螨的細胞外小泡的特性，在將細胞外小泡進行分離時，利用碘克沙醇(opti-pr印)溶液進行追加提煉。向10 ml容量的超速離心管內(nèi)依次放入溶有分離的沉淀物的 4. 8 ml 的 50% opti-prep 溶液和 3 ml 的 40% 及 2. 5 ml 的 10% opti-prep 溶液， 在4°C，100，000 χ g條件下超速離心分離2小時。進行超速離心分離后，確認白色層位于 40% opti-pr印層和10% opti-pr印層之間。從離心管的上部開始每次按1 ml的量分裝后，為了將opti-pr印溶液除去，分別混合9 ml的PBS后，裝入10 ml容量的超速離心管內(nèi)， 在4°C，100,000 χ g條件下超速離心分離(ultracetrifugation) 2小時。除去上層液，將離心管下部的沉淀物再次溶于1 ml的PBS中，提取細胞外小泡。圖21是從塵螨中獲得細胞外小泡的過程的示意圖。圖22是利用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)及動態(tài)光散身寸法(dynamic light scattering,DLS)對源于塵螨的細胞外小泡的形狀及大小進行測定的示意圖，可以看出，它由脂雙層構(gòu)成，大小為100-200 nm，大致成球型。上述結(jié)果表明，塵螨提取物中含有細胞外小泡。實施例12.棲息于室內(nèi)空氣中源于塵螨的細胞外小泡引發(fā)的體外先天免疫反應在實施例11中，確認存在源于塵螨的細胞外小泡，并對源于塵螨的細胞外小泡引發(fā)的
體內(nèi)先天免疫反應進行了評估。為此，將老鼠巨噬細胞(RAW沈4. 7)利用源于塵螨的細胞外小泡進行處理。具體地說，將老鼠巨噬細胞(RAW^64. 7)在M孔板上培養(yǎng)M小時使其達到1 χ IO50用PBS進行灌洗后，將DMEM培養(yǎng)基分別利用從塵螨中分離的細胞外小泡(HDM-EV) 100 ng,l yg,10 μ g進行處理后，培養(yǎng)15小時。收集培養(yǎng)液，在4°C條件下按800 χ g標準離心分離10分鐘，收集上層液，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbant assay, ELISA)方法測定細胞因子的量。如圖23所示，從塵螨中分離的小泡可以誘導TNF- α和IL_6的分泌，隨著處理用量的增加，TNF-α和IL-6的生成也增加。實施例13.棲息于室內(nèi)空氣中源于塵螨的細胞外小泡引發(fā)的體內(nèi)先天免疫反應在實施例11中，確認存在源于塵螨的細胞外小泡，在實施例12中，確認源于塵螨的小
泡會引發(fā)免疫反應。基于此，對源于塵螨的細胞外小泡引發(fā)的體內(nèi)先天免疫反應進行了評估。具體地說，用C57BL/6，6周齡雌性老鼠(每群5只)做實驗，將源于塵螨的細胞外小泡0.1，1，10 yg溶于PBS 30 μ 1中，通過鼻腔注入，間隔12小時后，對炎癥細胞滲透和媒介的分泌進行了評估。在這種情況下，將注入PBS的老鼠作為對照群。根據(jù)上述方法利用麻醉液將老鼠麻醉后，提取支氣管肺泡灌洗液(BAL fluid)。圖M是對源于塵螨的細胞外小泡引發(fā)的炎癥進行評估的示意圖。它顯示了肺炎的指標即支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞的數(shù)量。如圖對所示，與對照群(PBQ相比，注入源于塵螨的細胞外小泡的群(EV)中炎癥細胞數(shù)量增加，這意味著，炎癥細胞數(shù)量與小泡的注入用量成比例增加。圖25是對支氣管肺泡灌洗液中細胞因子的分泌進行測定的示意圖。如圖25所示，在注入小泡的情況下，與對照群相比，支氣管肺泡灌洗液(BAL fluid)內(nèi)TNF-α和IL-6 的量增加，這意味著，其量依賴小泡用量的增加而增加。特別是，在注入10 ug小泡的群中， TNF-α和IL-6的量顯著增加。實施例14.反復注入棲息于室內(nèi)空氣中源于塵螨的細胞外小泡而引發(fā)的肺炎在實施例13中，確認源于塵螨的細胞外小泡會引發(fā)免疫反應，基于此，對源于塵螨的
細胞外小泡引發(fā)的體內(nèi)后天免疫反應進行了評估。具體地說，用C57BL/6，6周齡雌性老鼠(每群5只)做實驗，將在實施例13中確認有效的源于塵螨的細胞外小泡10 μ g按每天通過鼻腔注射1次注射3天，使其發(fā)生致敏，然后，在2周內(nèi)每周通過鼻腔注射2次。間隔M小時后，評估炎癥細胞滲透及炎癥媒介的分泌，在這種情況下，將注入PBS的老鼠作為對照群。根據(jù)上述方法用麻醉液將老鼠麻醉后，提取支氣管肺泡灌洗液(BAL fluid)。圖沈是顯示炎癥細胞滲透的示意圖，可以看出，在注入源于塵螨的小泡(HDM EV) 的情況下，與對照群(PBQ相比，支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞的數(shù)量大大增加，特別是， 中性粒細胞的數(shù)量顯著增加。圖27是為了對后天免疫反應的類型進行分析而通過酶聯(lián)免疫吸附試驗對支氣管肺泡灌洗液中細胞因子的生成量進行測定的示意圖，可以看出，Thl7細胞分泌的IL-17在注入源于塵螨的細胞外小泡作用下顯著增加。上述結(jié)果表明，當吸入塵螨中的細胞外小泡時，就會誘發(fā)以Thl7免疫反應為媒介的中性粒細胞性肺炎。實施例15.在室內(nèi)灰塵中培養(yǎng)細菌和霉及進行細菌鑒定
室內(nèi)空氣中的細胞外小泡可以由室內(nèi)灰塵中的多種細菌和霉而生成。本發(fā)明人利用真空吸塵器收集特定居住地的寢具上的灰塵。然后，將真空吸塵器過濾器中的灰塵移入干凈的玻璃瓶中，并對其質(zhì)量進行測定。將室內(nèi)灰塵5 g放入裝有200 ml PBS的燒杯中，在4°C 條件下溶解12小時，再用紗布除去較大的物質(zhì)。提取1份灰塵液，將其濃度按1/10的比例進行稀釋，然后，在帶有細菌和霉可以生長的培養(yǎng)液的板上涂抹灰塵液。經(jīng)過一定的時間以后，確認細菌和霉的生長情況。如圖觀所示，室內(nèi)灰塵中棲息有多種細菌和霉。然后，本發(fā)明人實施了對室內(nèi)灰塵中棲息的細菌進行分離及鑒定的實驗。對室內(nèi)灰塵中棲息的細菌進行分離的方法如圖四所示。具體地說，將從床上收集的灰塵按實施例 1所述方法溶解后，利用紗布將較大的物質(zhì)除去。在這種情況下，提取1份灰塵液，將其濃度按1/10的比例進行稀釋，然后，在帶有細菌可以生長的培養(yǎng)液的板上涂抹灰塵液。經(jīng)過一定時間以后，確認大小和顏色互不相同的多種菌落，分別接種菌落后，放入裝有3ml營養(yǎng)液的試管內(nèi)，在37°C條件下進行培養(yǎng)。然后，利用生化方法，使用鑒定細菌的微生物自動檢測系統(tǒng)VITEK裝備，對棲息于灰塵中的細菌進行鑒定。結(jié)果作為革蘭氏陽性細菌鑒定出金黃色葡萄球菌，人葡萄球菌。因此，可以預測灰塵中的細胞外小泡含有革蘭氏陽性細菌分泌的小泡。
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實施例16.源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡引發(fā)的體外免疫反應及小泡內(nèi)蛋白質(zhì)的作用
最近，本發(fā)明人最先發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陽性細菌即金黃色葡萄球菌能夠分泌細胞外小泡。為了源于室內(nèi)空氣中革蘭氏陽性細菌的細胞外小泡對誘發(fā)呼吸器官疾病的發(fā)生所起的作用進行評估，從金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液中按實施例1所述方法對金黃色葡萄球菌分泌的細胞外小泡進行分離，并評估其對呼吸器官疾病病因所產(chǎn)生的作用。具體地說，將金黃色葡萄球菌接種到裝有3 ml營養(yǎng)液的試管中，在37°C條件下培養(yǎng)6小時，然后，將其中的5 ml移入裝有500 ml營養(yǎng)液的2 L三角燒瓶中，在37°C條件下培養(yǎng)4小時，使其吸光度(600 nm)值達到1. 0。將培養(yǎng)液裝入500 ml容量的高速離心分離管 (high speed centrifuge tube)內(nèi)，然后在4°C條件下按10,000 χ g標準離心分離20分鐘。 將除去細菌的上層液1次通過帶有0. 45 μ m大小孔的薄膜過濾器(membrane filter)，利用裝有能夠除去分子量在100 kDa以下蛋白質(zhì)的薄膜超濾系統(tǒng)(Quixstand system)將其濃縮25倍。將濃縮液1次通過帶有0. 22 μ m大小孔的薄膜過濾器，然后，將其裝入70 ml 容量的超速離心管(ultracentrifuge tube)內(nèi)，在4°C條件下按150，000 χ g標準超速離心分離(ultracetrifugation)3 小時。將沉淀物利用 PBS (phosphate buffered saline) 進行懸浮(resuspension)后，提取源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡。為了對源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡引發(fā)的體外免疫反應進行評估，將老鼠巨噬細胞(RA\^64. 7)在M孔板上培養(yǎng)M小時使其達到1 χ 105，利用PBS進行灌洗，除去FBS(fetal bovine serum)后，將對DMEM培養(yǎng)基利用源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡按1、10 μ g/ml進行處理，將其作為對照群。這時，在100°C條件下煮沸20分鐘，將利用除去耐熱性較弱成份功能的源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡處理的細胞作為實驗群。利用各細胞外小泡處理15小時后，收集培養(yǎng)液，在4°C條件下按800 χ g標準離心分離10分鐘， 收集上層液，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbant assay, ELISA)方法測定細胞因子的量。圖四是對各具有代表性的炎癥性細胞因子即TNF-α和IL-6進行測定的示意圖。如圖30所示，對于TNF- α而言，利用經(jīng)熱處理的細胞外小泡(Heat-S-EV) 1 μ g/ml處理的群，雖然其生成量減少至1/2以下，但是，利用10 μ g/ml處理的群卻沒有太大的差異。相反，對于IL-6而言，利用源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡經(jīng)熱處理的群 (Heat-S-EV)中，IL-6的生成量與小泡的濃度無關(guān)而顯著少。上述結(jié)果表明，源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡內(nèi)蛋白質(zhì)或者耐熱性較弱的成份對于由IL-6引發(fā)的炎癥反應起重要作用。實施例17.源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡引發(fā)的體內(nèi)先天免疫反應及肺炎為了對源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡引發(fā)的體內(nèi)免疫反應進行評估，用C57BL/6，
6周齡雌性(每群3只)做實驗，將溶于PBS的源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡1、10 yg 通過老鼠呼吸道注入的群作為實驗群，將PBS通過呼吸道注入的群作為對照群。將細胞外小泡注入1次后，第二天測定誘發(fā)老鼠早期肺炎和細胞因子IL-6的量(參照圖31的實驗方案)。圖32是通過呼吸道注入源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡后對支氣管肺泡灌洗液中炎癥進行評估的示意圖?？梢钥闯?，將細胞外小泡通過呼吸道注入的群(S-EV)中，支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞的數(shù)量與小泡濃度成比例增加。特別是，炎癥細胞中中性粒細胞的數(shù)量顯著增加。另外，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗對支氣管肺泡灌洗液中誘發(fā)Thl7免疫反應的核心物質(zhì)即IL-6的生成量進行測定的結(jié)果如圖33所示，可以看出，IL-6的分泌量也與源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡(S-EV)的濃度成比例增加。上述結(jié)果表明，當源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡被哺乳動物吸入時，就會誘發(fā)中性粒細胞性肺炎，另外，源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡促進在Thl7免疫反應中起核心作用的IL-6的生成。實施例18.蛋白質(zhì)或者耐熱性較弱成份對源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡引發(fā)先天免疫反應的發(fā)生所起的作用
在上述實施例16的體外實驗基礎(chǔ)上，通過體內(nèi)實驗檢驗源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡內(nèi)蛋白質(zhì)對先天免疫反應的發(fā)生所起的作用。具體地說，用C57BL/6，6周齡雌性(每群3只)老鼠做實驗，將細胞外小泡1、10 μ g通過老鼠呼吸道注入的群作為對照群。將細胞外小泡在100°C條件下煮沸20分鐘的群作為實驗群。在老鼠中注入1次細胞外小泡后，第二天測定誘發(fā)老鼠早期肺炎和細胞因子 IL-6的量(參照圖34的實驗方案)。圖35是將源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡通過呼吸道注入后評估支氣管肺泡灌洗液中炎癥反應的示意圖。可以看出，將經(jīng)熱處理的細胞外小泡10 μ g通過呼吸道注入的群(Heat-S-EV IOyg)與對照群(S_EV IOyg)的肺炎(支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞的數(shù)量)沒有太大的差異。圖36是通過酶聯(lián)免疫吸附試驗測定支氣管肺泡灌洗液中IL-6量的示意圖，與肺炎的情況不同，注入經(jīng)熱處理的源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡(1 ug, 10 yg)的群與對照群相比，IL-6的生成量顯著減少。上述結(jié)果再次表明，源于金黃色葡萄球菌的細胞外小泡的蛋白質(zhì)或者耐熱性較弱成份對由IL-6引發(fā)的免疫反應及炎癥性呼吸器官疾病的發(fā)生起重要作用。實施例19.源于大腸桿菌的細胞外小泡疫苗的免疫學特性
將根據(jù)實施例8所述方法分離的源于大腸桿菌的細胞外小泡1 mg按間隔1周的頻率在3周內(nèi)通過腹腔向C57BL/6 (雄性，6周，每群10只)注入3次。注入后分別間隔6小時、M小時、7天，提取老鼠血液，測定血液中細胞外小泡特異抗體。將包覆有源于大腸桿菌的小泡200 ng的黑色96孔板上添加用1% BSA/PBS按1 500稀釋的老鼠血清，在常溫下培養(yǎng)2小時后，觀察與過氧化物酶結(jié)合的老鼠抗體。圖37是對老鼠血液中源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV)特異抗體的量隨時間觀察的示意圖。如圖37所示，細胞外小泡特異抗體從注入1次細胞外小泡7天后開始形成，第二次和第三次注入細胞外小泡后，會形成更多的抗體，第三次接種小泡疫苗7天后形成的抗體達到非常高的值。根據(jù)上述方法，三次接種源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV) 7天后，從老鼠中分離脾臟細胞。向分離的脾臟細胞O X IO4)中加入源于大腸桿菌的細胞外小泡100 ng，培養(yǎng) 72小時后，分別通過ELISA方法測定與分泌脾臟細胞的免疫反應相關(guān)的細胞因子即IFN-g， IL-17，IL-4 的量。
圖38是顯示將老鼠脾臟細胞利用源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV)處理時分泌的IFN-g量的示意圖。如圖38所示，與從未接種源于大腸桿菌的細胞外小泡的老鼠群中提取的脾臟細胞相比，從接種了細胞外小泡的老鼠中提取的脾臟細胞分泌的IFN-g增加。圖39是顯示將老鼠脾臟細胞利用源于大腸桿菌的細胞外小泡(EC_EV)處理時分泌的IL-17量的示意圖。如圖39所示，與從未接種源于大腸桿菌的細胞外小泡的老鼠群中提取的脾臟細胞相比，從接種了細胞外小泡的老鼠中提取的脾臟細胞分泌的IL-17增加。上述結(jié)果表明，接種源于大腸桿菌的細胞外小泡時，會誘導針對細菌感染的防御機制即B細胞生成的抗體反應和T細胞免疫反應。特別是，T細胞免疫反應中，對細菌感染的防御起重要作用的分泌IFN-g的Thl免疫反應和分泌IL-17的Thl7免疫反應通過接種源于大腸桿菌的細胞外小泡而有效地被誘導。實施例20.源于大腸桿菌細胞外小泡疫苗對大腸桿菌感染引發(fā)敗血癥的效果
為了對源于大腸桿菌的細胞外小泡疫苗的效果進行評估，構(gòu)建大腸桿菌感染引發(fā)的敗血癥動物模型。將大腸桿菌1 X IO6,1 X IO8,1 X 101° CFU通過腹腔向C57BL/6 (雄性，6 周，每群10只)注入，在5天內(nèi)按間隔8小時的頻率觀察老鼠的存活率。圖40是顯示由大腸桿菌(EC)感染導致老鼠致死率的示意圖。如圖40所示，當注入大腸桿菌1 χ 101° CFU時，老鼠在M小時內(nèi)死亡，當注入大腸桿菌1 χ IO6U χ IO8 CFU 時，對老鼠的生存沒有什么影響。根據(jù)實施例19所述方法，將源于大腸桿菌的細胞外小泡0. 5、1 μ g按間隔1周的頻率在3周內(nèi)通過腹腔向C57BL/6 (雄性，6周，每群10只)注入3次。完成3次接種源于大腸桿菌的細胞外小泡7天后，將大腸桿菌1 χ 101° CFU通過腹腔注入，在5天內(nèi)按間隔8 小時的頻率觀察老鼠的存活率。圖41是觀察源于大腸桿菌的細胞外小泡疫苗對根據(jù)上述方法構(gòu)建的大腸桿菌感染引發(fā)敗血癥的發(fā)生所產(chǎn)生效果的示意圖。如圖41所示，5天后，與未接種源于大腸桿菌的細胞外小泡的老鼠存活率為20%相比，接種了源于大腸桿菌的細胞外小泡的老鼠群的存活率為80-100 %。根據(jù)上述方法將源于大腸桿菌的細胞外小泡1 μ g按間隔1周的頻率通過腹腔接種3次后，將大腸桿菌1 χ 101° CFU通過老鼠腹腔注入，間隔6小時后，測定血液中大腸桿菌的數(shù)量，其結(jié)果如圖42所示。如圖42所示，當接種源于大腸桿菌的細胞外小泡時，與從未接種源于大腸桿菌的細胞外小泡的老鼠中提取的血液中大腸桿菌的數(shù)量相比，接種了小泡的老鼠血液中大腸桿菌的數(shù)量顯著減少。上述結(jié)果表明，當事先將源于大腸桿菌的細胞外小泡作為疫苗注入時，就能夠有效地預防由大腸桿菌弓丨發(fā)的感染。實施例21.源于大腸桿菌的細胞外小泡疫苗對源于大腸桿菌的細胞外小泡引發(fā)炎癥發(fā)生的效果
為了評估小泡疫苗對源于大腸桿菌的細胞外小泡引發(fā)炎癥的發(fā)生所起的效果，根據(jù)實施例19所述方法，將源于大腸桿菌的細胞外小泡1 μ g按間隔1周的頻率通過腹腔向 C57BL/6 (雄性，6周，每群5只)注射3次進行接種后，將源于大腸桿菌的細胞外小泡通過腹腔注入后，測定血液中炎癥媒介的分泌。圖43是按高用量向接種了源于大腸桿菌的細胞外小泡的老鼠注入源于大腸桿菌的細胞外小泡(5 118，3次)6小時后，提取老鼠血液對誘導血清內(nèi)Thl7免疫反應的炎癥媒介即IL-6的量進行測定的示意圖。可以看出，與未接種源于大腸桿菌的細胞外小泡的老鼠群相比，接種了源于大腸桿菌的細胞外小泡的群的血清內(nèi)IL-6量顯著減少。上述結(jié)果表明，當將源于大腸桿菌的細胞外小泡作為疫苗按低用量事先注入時， 就能夠有效地預防由源于大腸桿菌的細胞外小泡引發(fā)的炎癥。如上所述，對本發(fā)明的技術(shù)思想進行了示例性說明，通過上述的說明內(nèi)容，本領(lǐng)域人員完全可以在不偏離本項發(fā)明技術(shù)思想的范圍內(nèi)，進行多樣的修改、變更以及替換。本發(fā)明中記載的實施例及附圖等僅為了對本發(fā)明進行說明，并不限定本發(fā)明的技術(shù)思想。因此，本領(lǐng)域人員可知，本發(fā)明的技術(shù)性范圍并不局限于上述實施例及附圖的內(nèi)容。工業(yè)實用性
依據(jù)本發(fā)明，利用源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡可以對炎癥性呼吸器官疾病等進行診斷、預防及/或者治療。具體地說，將本發(fā)明的源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡向動物注入，以構(gòu)建呼吸器官疾病動物模型，利用上述動物模型能夠有效地篩選及/或者發(fā)掘預防或者治療呼吸器官疾病的備選藥物。另外，本發(fā)明能夠準確診斷重癥哮喘、慢性阻塞性肺病、肺癌等呼吸器官疾病的致病因子，進而可用于能夠預防及/或者治療上述疾病的疫苗研發(fā)。
權(quán)利要求
1.一種組合物，其特征在于上述組合物含有源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于上述細胞外小泡源于選自以下群中，該群由室內(nèi)灰塵、塵螨、霉、蟑螂、寵物的分泌物、 人的皮屑及花粉構(gòu)成。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于 上述細胞外小泡由室內(nèi)空氣中的細菌分泌。
4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于上述細菌分泌的細胞外小泡由棲息于選自以下群中的細菌分泌，該群由室內(nèi)灰塵、塵螨、霉、蟑螂、寵物、植物及人的皮屑構(gòu)成。
5.如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于上述細菌分泌的細胞外小泡為由2種以上的細菌分泌的細胞外小泡的混合物。
6.如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于上述細菌從由葡萄球菌{Staphylococcus)、微球菌(Micrococcus)、腸球菌 (Enterococcus)、{段單胞菌 iPseudomonas)、鏈霄菌{Streptomycetes)及棒狀桿菌 {Corinebacterium)構(gòu)成的群中選擇。
7.如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于上述細菌從由金黃色葡萄球菌〈Staphylococcus aureus)、人葡萄球菌 {,Staphylococcus Aoffliflis)、里拉微球菌(Micrococcus、獎腸球菌{En terococcusfaecal is)、其jf 氏 /[段單胞菌 iPseudomonas stutzeri)、淺黃 /[段單胞菌{Pseudomonas luteola)及大腸桿菌iBscherichia coli)構(gòu)成的群中選擇。
8.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于 上述細胞外小泡由室內(nèi)空氣中的霉分泌。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于 上述霉分泌的細胞外小泡由棲息于室內(nèi)灰塵的霉分泌。
10.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于 上述細胞外小泡從細菌或者霉培養(yǎng)液中分離。
11.如權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于 上述細胞外小泡通過細菌或者霉培養(yǎng)液自然分泌。
12.如權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于 上述細胞外小泡通過細菌或者霉培養(yǎng)液人工分泌。
13.一種疾病模型，其特征在于通過將源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡注入動物而構(gòu)建。
14.如權(quán)利要求13所述的疾病模型，其特征在于上述細胞外小泡源于選自以下群中，該群由室內(nèi)灰塵、塵螨、霉、蟑螂、寵物、人的皮屑及花粉構(gòu)成。
15.如權(quán)利要求13所述的疾病模型，其特征在于 上述細胞外小泡由室內(nèi)空氣中的細菌或者霉分泌。
16.如權(quán)利要求13所述的疾病模型，其特征在于上述細胞外小泡由棲息于選自以下群中的細菌或者霉分泌，該群由室內(nèi)灰塵、塵螨、蟑螂、寵物及植物構(gòu)成。
17.如權(quán)利要求13所述的疾病模型，其特征在于上述細胞外小泡為由2種以上的細菌或者霉分泌的細胞外小泡的混合物。
18.如權(quán)利要求15所述的疾病模型，其特征在于上述細菌從由葡萄球菌屬Staphylococcus)、微球菌屬(Micrococcus)、腸球菌(Enterococcus)、{段單胞菌 iPseudomonas)、鏈霄菌{Streptomycetes)及棒狀桿菌 {Corinebacterium)構(gòu)成的群中選擇。
19.如權(quán)利要求15所述的疾病模型，其特征在于上述細菌從由金黃色葡萄球菌〈Staphylococcus aureus)、人葡萄球菌 {,Staphylococcus Aoffliflis)、里拉微球菌(Micrococcus、獎腸球菌{En terococcusfaecal is) > f 1 Iix Ifi lif (Pseudomonas stutzeri) , ^ It j[x Ifi lif {Pseudomonas Λ/teoh)、大腸桿菌(^Escherichia coli)構(gòu)成的群中選擇。
20.如權(quán)利要求13所述的疾病模型，其特征在于上述細胞外小泡從細菌或者霉培養(yǎng)液中分離。
21.如權(quán)利要求20所述的疾病模型，其特征在于上述細胞外小泡通過細菌或者霉培養(yǎng)液自然分泌。
22.如權(quán)利要求20所述的疾病模型，其特征在于上述細胞外小泡通過細菌或者霉培養(yǎng)液人工分泌。
23.如權(quán)利要求13所述的疾病模型，其特征在于上述疾病從由鼻炎、鼻竇炎、鼻咽癌、哮喘、慢性阻塞性肺病、支氣管炎、支氣管擴張癥、 毛細支氣管炎、肺炎及肺癌構(gòu)成的群中選擇。
24.如權(quán)利要求13所述的疾病模型，其特征在于上述動物為老鼠。
25.如權(quán)利要求13所述的疾病模型，其特征在于上述注入通過鼻腔、口腔或者氣管(trachea)注入。
26.—種篩選預防或治療疾病的備選藥物的方法，其特征在于上述方法利用源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡。
27.如權(quán)利要求沈所述的方法，其特征在于上述細胞外小泡源于選自以下群中，該群由室內(nèi)灰塵、塵螨、霉、蟑螂、寵物、人的皮屑及花粉構(gòu)成。
28.如權(quán)利要求沈所述的方法，其特征在于上述細胞外小泡由室內(nèi)空氣中的細菌或者霉分泌。
29.如權(quán)利要求沈所述的方法，其特征在于上述細胞外小泡由棲息于選自以下群中的細菌或者霉分泌，該群由室內(nèi)灰塵、塵螨、蟑螂、寵物及植物構(gòu)成。
30.如權(quán)利要求沈所述的方法，其特征在于上述細胞外小泡為由2種以上的細菌分泌的細胞外小泡的混合物。
31.如權(quán)利要求觀所述的方法，其特征在于上述細菌從由葡萄球菌{Staphylococcus)、微球菌(Micrococcus)、腸球菌 (Enterococcus)、{段單胞菌 iPseudomonas)、鏈霄菌{Streptomycetes)及棒狀桿菌 {Corinebacterium)構(gòu)成的群中選擇。
32.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于上述細菌從由金黃色葡萄球菌〈Staphylococcus aureus)、人葡萄球菌 {,Staphylococcus Aoffliflis)、里拉微球菌(Micrococcus、獎腸球菌{En terococcusfaecal is)、其jf 氏 /[段單胞菌 iPseudomonas stutzeri)、淺黃 /[段單胞菌{Pseudomonas Λ/teoh)、大腸桿菌(^Escherichia coli)構(gòu)成的群中選擇。
33.如權(quán)利要求沈所述的方法，其特征在于 上述細胞外小泡從細菌或者霉培養(yǎng)液中分離。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于上述細胞外小泡通過細菌或者霉培養(yǎng)液自然分泌。
35.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于上述細胞外小泡通過細菌或者霉培養(yǎng)液人工分泌。
36.如權(quán)利要求沈所述的方法，其特征在于上述疾病從由室內(nèi)空氣中的細胞外小泡誘發(fā)或者導致惡化的鼻炎、鼻竇炎、鼻咽癌、 哮喘、慢性阻塞性肺病、支氣管炎、支氣管擴張癥、毛細支氣管炎、肺炎及肺癌構(gòu)成的群中選擇。
37.如權(quán)利要求沈所述的方法，其特征在于上述方法將備選藥物注入權(quán)利要求13所述的疾病模型。
38.如權(quán)利要求沈所述的方法，其特征在于上述方法在將源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡從體外向細胞處理時對備選藥物進行處理。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于上述細胞為炎癥細胞、上皮細胞或者成纖維細胞。
40.如權(quán)利要求沈所述的方法，其特征在于上述方法在將備選藥物與室內(nèi)空氣中的細胞外小泡一起注入后測定炎癥相關(guān)媒介的標準。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于上述炎癥相關(guān)媒介為TNF(Tumor necrosis factor) -α (alpha)或者 IL(Interleukin) -6。
42.一種用于預防或者治療疾病的疫苗，其特征在于上述疫苗含有源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡。
43.如權(quán)利要求42所述的疫苗，其特征在于上述疾病從由鼻炎、鼻竇炎、鼻咽癌、哮喘、慢性阻塞性肺病、支氣管炎、支氣管擴張癥、 毛細支氣管炎、肺炎及肺癌構(gòu)成的群中選擇。
44.如權(quán)利要求42所述的疫苗，其特征在于上述細胞外小泡源于選自以下群中，該群由室內(nèi)灰塵、塵螨、霉、蟑螂、寵物的分泌物、 人的皮屑及花粉構(gòu)成。
45.如權(quán)利要求42所述的疫苗，其特征在于上述細胞外小泡源于室內(nèi)空氣中的細菌或者霉。
46.如權(quán)利要求42所述的疫苗，其特征在于上述細胞外小泡源于棲息在選自以下群中的細菌或者霉，該群由室內(nèi)灰塵、塵螨、蟑螂、寵物及植物構(gòu)成。
47.如權(quán)利要求42所述的疫苗，其特征在于上述細胞外小泡為由2種以上的細菌分泌的細胞外小泡的混合物。
48.如權(quán)利要求45所述的疫苗，其特征在于上述細菌從由葡萄球菌{Staphylococcus)、微球菌(Micrococcus)、腸球菌 (Enterococcus)、{段單胞菌 iPseudomonas)、鏈霄菌{Streptomycetes)及棒狀桿菌 {Corinebacterium)構(gòu)成的群中選擇。
49.如權(quán)利要求45所述的疫苗，其特征在于上述細菌從由金黃色葡萄球菌〈Staphylococcus aureus)、人葡萄球菌 {,Staphylococcus Aoffliflis)、里拉微球菌(Micrococcus、獎腸球菌{En terococcusfaecal is) > f 1 Iix Ifi lif (Pseudomonas stutzeri) , ^ It j[x Ifi lif {Pseudomonas Λ/teoh)、大腸桿菌(^Escherichia coli)構(gòu)成的群中選擇。
50.如權(quán)利要求42所述的疫苗，其特征在于上述細胞外小泡從細菌或者霉培養(yǎng)液中分離。
51.如權(quán)利要求50所述的疫苗，其特征在于上述細胞外小泡通過細菌或者霉培養(yǎng)液自然分泌。
52.如權(quán)利要求50所述的疫苗，其特征在于上述細胞外小泡通過細菌或者霉培養(yǎng)液人工分泌。
53.如權(quán)利要求42所述的疫苗，其特征在于上述細胞外小泡為基于增強效果或者減少副作用的目的而使用的源于轉(zhuǎn)化的細菌或者霉的細胞外小泡。
54.如權(quán)利要求42所述的疫苗，其特征在于上述細胞外小泡為基于增強效果或者減少副作用的目的而使用的源于經(jīng)化學物質(zhì)處理的細菌或者霉的細胞外小泡。
55.如權(quán)利要求42所述的疫苗，其特征在于上述細胞外小泡為基于增強效果或者減少副作用的目的而使用的經(jīng)化學物質(zhì)處理的細胞外小泡。
56.如權(quán)利要求42所述的疫苗，其特征在于上述細胞外小泡基于增強效果或者減少副作用的目的而與藥物并用注入。
57.一種用于預防或者治療感染的疫苗，其特征在于上述疫苗含有源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡。
58.如權(quán)利要求57所述的疫苗，其特征在于上述感染為由室內(nèi)空氣中的細菌或者霉引發(fā)的感染。
59.如權(quán)利要求58所述的疫苗，其特征在于上述感染為由醫(yī)院室內(nèi)空氣中的細菌或者霉引發(fā)的感染。
60.如權(quán)利要求57所述的疫苗，其特征在于上述感染從由細菌或者霉引發(fā)的鼻竇炎、支氣管炎、支氣管擴張癥、肺炎及敗血癥構(gòu)成的群中選擇。
61.如權(quán)利要求57所述的疫苗，其特征在于上述細胞外小泡由室內(nèi)空氣中的細菌或者霉分泌。
62.如權(quán)利要求57所述的疫苗，其特征在于上述細胞外小泡由棲息于室內(nèi)灰塵中的細菌或者霉分泌。
63.如權(quán)利要求57所述的疫苗，其特征在于上述細胞外小泡為由2種以上的細菌分泌的細胞外小泡的混合物。
64.如權(quán)利要求61所述的疫苗，其特征在于上述細菌從由葡萄球菌{Staphylococcus)、微球菌(Micrococcus)、腸球菌 (Enterococcus)、{段單胞菌 iPseudomonas)、鏈霄菌{Streptomycetes)及棒狀桿菌 {Corinebacterium)構(gòu)成的群中選擇。
65.如權(quán)利要求61所述的疫苗，其特征在于上述細菌從由金黃色葡萄球菌〈Staphylococcus aureus)、人葡萄球菌 {,Staphylococcus Aoffliflis)、里拉微球菌(Micrococcus、獎腸球菌{En terococcusfaecal is)、其jf 氏 /[段單胞菌 iPseudomonas stutzeri)、淺黃 /[段單胞菌{Pseudomonas Λ/teoh)、大腸桿菌(^Escherichia coli)構(gòu)成的群中選擇。
66.如權(quán)利要求57所述的疫苗，其特征在于上述細胞外小泡從細菌或者霉培養(yǎng)液中分離。
67.如權(quán)利要求66所述的疫苗，其特征在于上述細胞外小泡通過細菌或者霉培養(yǎng)液自然分泌。
68.如權(quán)利要求66所述的疫苗，其特征在于上述細胞外小泡通過細菌或者霉培養(yǎng)液人工分泌。
69.如權(quán)利要求57所述的疫苗，其特征在于上述細胞外小泡為基于增強效果或者減少副作用的目的而使用的源于轉(zhuǎn)化的細菌或者霉的細胞外小泡。
70.如權(quán)利要求57所述的疫苗，其特征在于上述細胞外小泡為基于增強效果或者減少副作用的目的而使用的源于經(jīng)化學物質(zhì)處理的細菌或者霉的細胞外小泡。
71.如權(quán)利要求57所述的疫苗，其特征在于上述細胞外小泡為基于增強效果或者減少副作用的目的而使用的經(jīng)化學物質(zhì)處理的細胞外小泡。
72.如權(quán)利要求57所述的疫苗，其特征在于上述細胞外小泡基于增強效果或者減少副作用的目的而與藥物并用注入。
73.—種診斷致病因子的方法，其特征在于上述方法利用源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡診斷由上述細胞外小泡引發(fā)的疾病發(fā)生或者導致惡化相關(guān)的致病因子。
74.—種診斷致病因子的方法，其特征在于上述方法利用源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡診斷由室內(nèi)空氣中的細菌或者霉引發(fā)的感染發(fā)生或者導致惡化相關(guān)的致病因子。
75.如權(quán)利要求73所述的方法，其特征在于上述細胞外小泡引發(fā)的疾病從由鼻炎、鼻竇炎、鼻咽癌、哮喘、慢性阻塞性肺病、支氣管炎、支氣管擴張癥、毛細支氣管炎、肺炎、肺癌及敗血癥構(gòu)成的群中選擇。
76.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于上述細菌或者霉引發(fā)的感染從由鼻竇炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、支氣管擴張癥、肺炎及敗血癥構(gòu)成的群中選擇。
77.如權(quán)利要求73或74所述的方法，其特征在于上述診斷為對室內(nèi)空氣中細胞外小泡的遺傳物質(zhì)的堿基序列進行分析。
78.如權(quán)利要求73或74所述的方法，其特征在于上述診斷為對室內(nèi)空氣中細胞外小泡的蛋白質(zhì)進行測定。
79.如權(quán)利要求73或74所述的方法，其特征在于上述診斷為對室內(nèi)空氣中細胞外小泡的免疫反應進行測定。
80.如權(quán)利要求79所述的方法，其特征在于上述免疫反應測定是對室內(nèi)空氣中細胞外小泡的抗體進行測定。
81.如權(quán)利要求73或74所述的方法，其特征在于 上述診斷利用室內(nèi)灰塵。
82.如權(quán)利要求73或74所述的方法，其特征在于 上述診斷利用源于患者血液的樣本。
83.如權(quán)利要求73或74所述的方法，其特征在于 上述診斷利用源于患者的痰、鼻涕或者小便的樣本。
84.一種預防疾病的發(fā)生或者導致惡化的方法，其特征在于 上述方法包括除去源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡的活性。
85.一種預防疾病的發(fā)生或者導致惡化的方法，其特征在于 上述方法包括除去源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡。
86.如權(quán)利要求84或85所述的方法，其特征在于上述疾病從由鼻炎、鼻竇炎、鼻咽癌、哮喘、慢性阻塞性肺病、支氣管炎、支氣管擴張癥、 毛細支氣管炎、肺炎、肺癌及敗血癥構(gòu)成的群中選擇。
87.如權(quán)利要求84所述的方法，其特征在于上述細胞外小泡的活性去除包括將細胞外小泡經(jīng)熱處理。
88.如權(quán)利要求84所述的方法，其特征在于上述細胞外小泡的活性去除包括將細胞外小泡經(jīng)有特殊作用的化學物質(zhì)處理。
89.如權(quán)利要求88所述的方法，其特征在于上述化學物質(zhì)為抑制細胞外小泡內(nèi)蛋白質(zhì)、LPS (Iipopolysaccharide)或者肽聚糖活性的物質(zhì)。
90.如權(quán)利要求89所述的方法，其特征在于上述抑制LPS活性的化學物質(zhì)為多粘菌素B (polymyxin B)。
91.如權(quán)利要求84所述的方法，其特征在于 上述方法利用除去上述細胞外小泡活性的裝置。
92.如權(quán)利要求91所述的方法，其特征在于上述裝置利用權(quán)利要求87至權(quán)利要求90中任意一項所述的方法。
93.如權(quán)利要求85所述的方法，其特征在于 上述方法利用除去上述細胞外小泡的裝置。
94.如權(quán)利要求93所述的方法，其特征在于 上述裝置包括微濾器。
95.如權(quán)利要求94所述的方法，其特征在于上述微濾器的孔大小(pore size)為10 nm至200 nm。
96.一種評估相關(guān)于呼吸器官疾病的發(fā)生或者導致惡化的室內(nèi)空氣質(zhì)量的方法，其特征在于上述方法對室內(nèi)空氣中細胞外小泡的濃度進行測定。
97.如權(quán)利要求96所述的方法，其特征在于上述細胞外小泡的濃度測定是通過測定細胞外小泡的遺傳物質(zhì)而完成。
98.如權(quán)利要求97所述的方法，其特征在于 上述遺傳物質(zhì)為16S rRNA。
99.如權(quán)利要求96所述的方法，其特征在于上述細胞外小泡的濃度測定是通過測定細胞外小泡的蛋白質(zhì)而完成。
100.如權(quán)利要求96所述的方法，其特征在于上述細胞外小泡的濃度測定是通過利用顯微鏡測定細胞外小泡的數(shù)量而完成。
101.如權(quán)利要求100所述的方法，其特征在于上述顯微鏡利用高分辨率光學顯微鏡或者電子顯微鏡。
102.一種預防或者治療疾病的方法，其特征在于上述方法包括將源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡注入哺乳動物。
103.如權(quán)利要求102所述的方法，其特征在于上述細胞外小泡源于選自以下群中，該群由室內(nèi)灰塵、塵螨、霉、蟑螂、寵物、人的皮屑及花粉構(gòu)成。
104.如權(quán)利要求102所述的方法，其特征在于 上述細胞外小泡由室內(nèi)空氣中的細菌或者霉分泌。
105.如權(quán)利要求102所述的方法，其特征在于上述細胞外小泡由棲息于選自以下群中的細菌或者霉分泌，該群由室內(nèi)灰塵、塵螨、蟑螂、寵物及植物構(gòu)成。
106.如權(quán)利要求102所述的方法，其特征在于上述細胞外小泡為由2種以上細菌分泌的細胞外小泡的混合物。
107.如權(quán)利要求104所述的方法，其特征在于上述細菌從由葡萄球菌{Staphylococcus)、微球菌(Micrococcus)、腸球菌 (Enterococcus)、{段單胞菌 iPseudomonas)、鏈霄菌{Streptomycetes)及棒狀桿菌 {Corinebacterium)構(gòu)成的群中選擇。
108.如權(quán)利要求104所述的方法，其特征在于上述細菌從由金黃色葡萄球菌〈Staphylococcus aureus)、人葡萄球菌{,Staphylococcus Aoffliflis)、里拉微球菌(Micrococcus、獎腸球菌{En terococcusfaecal is)、其jf 氏 /[段單胞菌 iPseudomonas stutzeri)、淺黃 /[段單胞菌{Pseudomonas Λ/teoh)、大腸桿菌(^Escherichia coli)構(gòu)成的群中選擇。
109.如權(quán)利要求102所述的方法，其特征在于上述細胞外小泡從細菌或者霉培養(yǎng)液中分離。
110.如權(quán)利要求109所述的方法，其特征在于上述細胞外小泡通過細菌或者霉培養(yǎng)液自然分泌。
111.如權(quán)利要求109所述的方法，其特征在于上述細胞外小泡通過細菌或者霉培養(yǎng)液人工分泌。
112.如權(quán)利要求102所述的方法，其特征在于上述疾病從由室內(nèi)空氣中的細胞外小泡誘發(fā)或者導致惡化的鼻炎、鼻竇炎、鼻咽癌、 哮喘、慢性阻塞性肺病、支氣管炎、支氣管擴張癥、毛細支氣管炎、肺炎及肺癌構(gòu)成的群中選擇。
113.如權(quán)利要求102所述的方法，其特征在于上述注入通過皮下注射或者粘膜注入。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡的組合物。另外，本發(fā)明提供了一種利用上述細胞外小泡對炎癥性呼吸器官疾病及肺癌等進行診斷、預防及/或者治療的方法。具體地說，本發(fā)明將源于室內(nèi)空氣的細胞外小泡向動物注入而構(gòu)建呼吸器官疾病動物模型，利用上述動物模型對預防或者治療呼吸器官疾病的備選藥物進行篩選及/或者發(fā)掘。另外，本發(fā)明還提供了對預防及/或者治療呼吸器官疾病的疫苗、對呼吸器官疾病的致病物質(zhì)進行診斷的方法，以及為了預防呼吸器官疾病的發(fā)生及惡化而抑制室內(nèi)空氣中細胞外小泡的活性或者除去上述細胞外小泡的方法等。
文檔編號A61K39/35GK102573904SQ201080045503
公開日2012年7月11日 申請日期2010年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月8日
發(fā)明者崔埈標, 崔銀廷, 李恩暎, 池永求, 洪成旭, 洪福實, 金宥善, 金潤根, 高用松 申請人:阿昂梅迪克斯公司