專(zhuān)利名稱(chēng)：源于人多能干細(xì)胞的胰腺細(xì)胞的包封的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及源于人胚胎干細(xì)胞和其它人多能細(xì)胞的細(xì)胞的包封。
背景技術(shù)：
人胚胎干(hES)細(xì)胞和從成人分化的細(xì)胞誘導(dǎo)的多能干(iPS)細(xì)胞特別適合于細(xì)胞治療應(yīng)用，這是因?yàn)樗鼈兪嵌嗄艿那铱勺晕腋?。基于在分化多能干?xì)胞培養(yǎng)物中能夠出現(xiàn)極為多樣的細(xì)胞類(lèi)型，成功實(shí)現(xiàn)有效的、定向分化對(duì)于人多能干細(xì)胞的治療應(yīng)用是有用的。使用不同生長(zhǎng)和信號(hào)傳導(dǎo)因子以及小分子對(duì)于使人多能干細(xì)胞有效的定向分化成各種中間細(xì)胞類(lèi)型，包括胰腺細(xì)胞系是必要的。發(fā)明概述本文所述的實(shí)施方案涉及在哺乳動(dòng)物中生成胰島素的方法，所述方法通過(guò)下述步驟進(jìn)行向宿主哺乳動(dòng)物中提供可植入的腔室(chamber)，向所述腔室提供源于人多能干細(xì)胞(例如hES或iPS細(xì)胞)的胰腺祖細(xì)胞，使所述胰腺祖細(xì)胞成熟成為成熟的胰腺激素分泌細(xì)胞，其中所述胰腺激素分泌細(xì)胞為響應(yīng)體內(nèi)葡萄糖刺激生成胰島素的胰島素分泌細(xì)胞，從而在所述哺乳動(dòng)物中體內(nèi)生成胰島素。在一些實(shí)施方案中，所述腔室在引入胰腺祖細(xì)胞之前植入到哺乳動(dòng)物中。在其它實(shí)施方案中，在引入胰腺祖細(xì)胞之前使所述腔室血管化。 還在其它實(shí)施方案中，在植入之前將細(xì)胞引入所述腔室。一個(gè)實(shí)施方案涉及在哺乳動(dòng)物中生成胰島素的方法，所述方法包括(a)向可植入的可半滲透裝置中提供人PDX-I陽(yáng)性的胰腺祖細(xì)胞群；(b)使該細(xì)胞群在所述裝置中成熟為胰島，其中所述胰島包含內(nèi)分泌細(xì)胞和腺泡細(xì)胞，并且其中所述內(nèi)分泌細(xì)胞至少為響應(yīng)體內(nèi)葡萄糖刺激生成胰島素的胰島素分泌細(xì)胞，從而體內(nèi)為所述哺乳動(dòng)物生成胰島素。另一個(gè)實(shí)施方案涉及用于將細(xì)胞群植入到哺乳動(dòng)物宿主中的細(xì)胞包封組件。一方面，該組件包含限定用于包封活細(xì)胞的至少一個(gè)腔室的密封外緣。另一方面，該組件包含具有外周邊緣的壁機(jī)構(gòu)，其中該組件包含在所述壁機(jī)構(gòu)的外周邊緣的第一密封件(seal)，從而形成該包封組件。在一些方面，該組件包含有效降低腔室容積的第二密封件。另一個(gè)實(shí)施方案涉及冷凍保存的人胰腺祖細(xì)胞群。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，所述細(xì)胞群適合移植到哺乳動(dòng)物中。另一個(gè)實(shí)施方案涉及獲得適于移植的細(xì)胞群的方法。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面， 通過(guò)包括下述步驟的方法獲得適于移植的細(xì)胞a)人胰腺祖細(xì)胞群接觸冷凍保存溶液，從而獲得用于冷凍保存的細(xì)胞群；b)降低用于冷凍保存的祖細(xì)胞的溫度至大約-196°C，以獲得冷凍保存的細(xì)胞；和C)提高所述冷凍保存的細(xì)胞的溫度，從而獲得適于移植的胰腺祖細(xì)胞群。在一些實(shí)施方案中，用于冷凍保存的祖細(xì)胞的溫度降低至低于0°C、-10°C、-20°C、-3 0°C ,-40 °C ,-50 °C ,-60 °C ,-70 °C ,-80 °C ,-90 °C ,-IOO0C ,-IlO0C、-120°C、-130°C ,-140 °C、-150°C、-160°C、-170°C、-180°C、-190°C、-200°C、-210°C、-220°C、-230°C、-240°C、-250°C或-260°C。附圖簡(jiǎn)述

圖1為雙開(kāi)口包封裝置的透視圖，該包封裝置具有內(nèi)部超聲焊接部分(weld)以分
隔主腔。圖2為圖1所示的包封裝置的頂截面視圖。圖3為圖1所示的包封裝置的側(cè)視圖，其具有沿著內(nèi)部超聲焊接區(qū)通過(guò)該裝置中心獲取的橫截面。圖4為圖1所示的包封裝置的側(cè)視圖，其具有沿著開(kāi)口的軸并通過(guò)被分隔的腔的中心獲取的橫截面。圖5為圖1所示的包封裝置的端視圖，其具有通過(guò)被分隔的腔獲取的橫截面。圖6為包封裝置的透視圖，其沒(méi)有裝載口且包含定期超聲點(diǎn)焊部分以分隔內(nèi)腔。圖7為圖6所示的包封裝置的頂部橫截面視圖。圖8為圖6所示的包封裝置的側(cè)視圖，其具有通過(guò)被分隔的腔中心獲取的橫截面。圖9為圖6所示的包封裝置的端視圖，其具有通過(guò)被分隔的腔的橫截面。圖10為包封裝置的透視圖，其沒(méi)有裝載口且包含定期超聲點(diǎn)焊部分以分隔內(nèi)腔。 每個(gè)點(diǎn)焊部分都去除了中心以促進(jìn)血管化。圖11為圖10所示的包封裝置的放大視圖。優(yōu)選實(shí)施方案的詳述本文所述的實(shí)施方案涉及通過(guò)在哺乳動(dòng)物中植入處在包封裝置中的源于人胚胎干細(xì)胞的人胰腺祖細(xì)胞，從而體內(nèi)生成胰島素的方法，所述包封裝置包括生物可相容的基于聚乙二醇的裝置和機(jī)械/醫(yī)學(xué)裝置。除非另有說(shuō)明，本文使用的術(shù)語(yǔ)為相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)用法所理解的。除了下文提供的術(shù)語(yǔ)定義以外，分子生物學(xué)中的常用術(shù)語(yǔ)的定義還可見(jiàn)于Rieger 等人，1991 Glossary of genetics !classical and molecular,5th Ed. , Berlin Springer-VerlagjPiC^Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel 等人， Eds. , Current Protocol, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc,and John Wiley & Sons，he.，(1998增刊)。應(yīng)該理解，在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用的“a”或“an”可以表示一個(gè)或多個(gè)，取決于其使用的上下文。因此，例如，述及“細(xì)胞” 可以表示可以使用至少一個(gè)細(xì)胞。此外，出于本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)的目的，除非另有說(shuō)明，所有表示成分的數(shù)量的數(shù)字、材料的百分比或比例、反應(yīng)條件和在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用的其它數(shù)值在所有情況下都將被理解為通過(guò)術(shù)語(yǔ)“約”修飾。相應(yīng)地，除非相反指出，在以下說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)中提出的數(shù)值參數(shù)為可以依據(jù)本發(fā)明想要獲得的期望性質(zhì)而改變的近似值。 每個(gè)數(shù)值參數(shù)都應(yīng)該至少根據(jù)報(bào)道的有效數(shù)字和通過(guò)應(yīng)用常規(guī)舍入技術(shù)來(lái)理解，絲毫不想將等同原則的應(yīng)用限制于權(quán)利要求書(shū)的范圍。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用生物可相容的聚乙二醇(PEG)包封源于hES的細(xì)胞?；赑EG的包封更詳細(xì)地描述于題為“用于治療疾病的包封生物材料的植入”的美國(guó)專(zhuān)利 No. 7，427，415 ；題為“用于包封生物材料的凝膠”的美國(guó)專(zhuān)利No. 6，911，227 ；以及題為“用于包封生物材料的凝膠”的美國(guó)專(zhuān)利No. 6，911，227,5, 529，914,5, 801，033,6, 258，870中， 它們通過(guò)引用以其全文并入本文。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包封裝置為T(mén)heraCyte裝置(Irvine，California)。 TheraCyte細(xì)胞包封裝置進(jìn)一步描述于美國(guó)專(zhuān)利No. 6，773，458 ；6, 156，305 ；6, 060，640 ； 5，964，804 ；5，964，261 ；5，882，354 ；5，807，406 ；5，800，529 ；5，782，912 ；5，741，330 ； 5，733，336 ；5，713，888 ；5，653，756 ；5，593，440 ；5，569，462 ；5，549，675 ；5，545，223 ； 5，453，278 ；5，421，923 ；5，344，454 ；5，314，471 ；5，324，518 ；5，219，361 ；5，100，392 ；和 5，011，494中，上述所有專(zhuān)利通過(guò)全文引用以其全文并入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，描述了用于從多能干細(xì)胞培養(yǎng)物或源于hES的細(xì)胞培養(yǎng)物的單細(xì)胞懸液制備hES細(xì)胞團(tuán)塊懸液的方法。所述多能干細(xì)胞培養(yǎng)物可以最初在成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層(feeder)上培養(yǎng)，或者它們可以不使用飼養(yǎng)層。分離hESC和在人飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)hESC的方法描述于題為“用于在人飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的方法”的美國(guó)專(zhuān)利No. 7，432，104中，其通過(guò)引用以其全文并入本文。用于制備hES細(xì)胞團(tuán)塊懸液培養(yǎng)物和 /或源于hES的細(xì)胞團(tuán)塊懸液培養(yǎng)物的多種方法詳細(xì)描述于2008年10月4日提交的題為 “干細(xì)胞團(tuán)塊懸液組合物及其分化方法”的美國(guó)申請(qǐng)No. 12/264, 760中，其通過(guò)引用以其全文并入本文。本文所述的分化培養(yǎng)條件和源于hES的細(xì)胞類(lèi)型基本上類(lèi)似于上文的D'Amour等人2006年所述的，或描述于美國(guó)專(zhuān)利No. 7，534，608 ；2007年3月2日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No. 11/681,687 ；和2007年7月5日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No. 11/773,944中的那些，它們的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用以其全文并入本文。D'Amour等人描述了 5步分化方案階段1 (主要結(jié)果為定形內(nèi)胚層產(chǎn)生)，階段2 (主要使PDXl陰性的前腸內(nèi)胚層產(chǎn)生)，階段3 (主要使 PDXl陽(yáng)性的前腸內(nèi)胚層產(chǎn)生)，階段4(主要使胰腺內(nèi)胚層或胰腺內(nèi)分泌祖細(xì)胞產(chǎn)生)和階段5 (主要使表達(dá)激素的內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生)。本文所用的“定形內(nèi)胚層(DE) ”是指能夠分化成為腸管細(xì)胞或源于腸管的器官的多能內(nèi)胚層細(xì)胞系。根據(jù)某些實(shí)施方案，定形內(nèi)胚層細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，且在優(yōu)選實(shí)施方案中，定形內(nèi)胚層細(xì)胞為人細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，定形內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)或未能顯著表達(dá)某些標(biāo)志物。在一些實(shí)施方案中，在定形內(nèi)胚層細(xì)胞中表達(dá)一種或多種選自CER、F0ZA2、 S0X17、CXCR4、MIXLl、GATA4、HNF3-3、GSC、FGFl7、VWF、CALCR、FOXQl、CMKORl 和 CRIPl 的標(biāo)志物。在其它實(shí)施方案中，選自O(shè)CT 4、α-胎蛋白(AFP)、血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)、SPARC、S0X7 和HNF4-a中的一種或多種標(biāo)志物不在定形內(nèi)胚層細(xì)胞中顯著表達(dá)。為了清楚起見(jiàn)，將定形內(nèi)胚層細(xì)胞區(qū)別于其它內(nèi)胚層譜系的細(xì)胞，例如前腸內(nèi)胚層或腸內(nèi)胚層或PDXl陰性的前腸內(nèi)胚層細(xì)胞，這些細(xì)胞相比定形內(nèi)胚層都可識(shí)別地表達(dá)HNF4-a。定形內(nèi)胚層細(xì)胞群及其制備方法還描述于題為“定形內(nèi)胚層”的美國(guó)專(zhuān)利No. 7，510，876，其以其全文并入本文。其它實(shí)施方案還涉及名為“PDX1陰性的前腸內(nèi)胚層細(xì)胞”或“前腸內(nèi)胚層細(xì)胞”或 “腸內(nèi)胚層”或其等同物的細(xì)胞培養(yǎng)物。在一些實(shí)施方案中，前腸內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)S0X17、 HNFl-β、HNF4-a和FOXAl標(biāo)志物，但不實(shí)質(zhì)上表達(dá)PDX1、AFP、S0X7、S0X1。PDXl陰性的前腸內(nèi)胚層細(xì)胞群及其制備方法還描述于2006年10月27日提交的題為“表達(dá)PDXl的背部和腹部前腸內(nèi)胚層”的美國(guó)申請(qǐng)No. 11/588，693，其通過(guò)引用以其全文并入本文。并且，與定形內(nèi)胚層細(xì)胞或階段1的細(xì)胞相比，腸內(nèi)胚層可識(shí)別地表達(dá)HNF4-a ；參見(jiàn)下文實(shí)施例。本文所述的其它實(shí)施方案涉及“PDX1陽(yáng)性的偏向背部的前腸內(nèi)胚層細(xì)胞”、“PDX1 陽(yáng)性的前腸內(nèi)胚層細(xì)胞”或“PDX1陽(yáng)性的內(nèi)胚層”或其等同物的細(xì)胞培養(yǎng)物。在一些實(shí)施方案中，PDXl陽(yáng)性的前腸內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)PDX1、HNF6、S0X9和PROX 1標(biāo)志物，但不實(shí)質(zhì)上表達(dá) NKX6. 1、PTF1A、CPA、cMYC、S0X17、HNF1B 或 HNF4alpa。PDXl 陽(yáng)性的前腸內(nèi)胚層細(xì)胞群及其制備方法還描述于2006年10月27日提交的題為“表達(dá)PDXl的背部和腹部前腸內(nèi)胚層”的美國(guó)申請(qǐng)No. 11/588，693，其通過(guò)引用以其全文并入本文。本文所述的其它實(shí)施方案涉及“胰腺祖細(xì)胞”、“PDX1陽(yáng)性的胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞”、 "PDX1陽(yáng)性的胰腺祖細(xì)胞”、“胰腺上皮”、“PE”或其等同物的細(xì)胞培養(yǎng)物。PDXl陽(yáng)性的胰腺祖細(xì)胞是多能的，且可以在胰腺中產(chǎn)生多種細(xì)胞，包括但不限于腺泡細(xì)胞、導(dǎo)管細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，與不會(huì)可識(shí)別地表達(dá)PDXl和NKX6. 1的非前胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞相比，該P(yáng)DXl陽(yáng)性的胰腺祖細(xì)胞表達(dá)高水平的這些標(biāo)志物。PDXl陽(yáng)性的胰腺祖細(xì)胞還表達(dá)低水平的 PTF1A、CPA、cMYC、NGN3、PAX4、ARX 禾Π ΝΚΧ2. 2、INS、GCG, GHRL, SST 禾Π PP,甚至不表達(dá)。可選擇地，其它實(shí)施方案涉及“PDX1陽(yáng)性的胰腺內(nèi)胚層端細(xì)胞”或其等同物的細(xì)胞培養(yǎng)物。在一些實(shí)施方案中，類(lèi)似于PDXl陽(yáng)性的胰腺祖細(xì)胞，PDXl陽(yáng)性的胰腺內(nèi)胚層端細(xì)胞表達(dá)高水平的PDXl和ΝΚΧ6. 1，但是不同于PDXl陽(yáng)性的胰腺祖細(xì)胞，PDXl陽(yáng)性的胰腺內(nèi)胚層端細(xì)胞額外地表達(dá)高水平的PTF1A、CPA和cMYC。PDXl陽(yáng)性的胰腺內(nèi)胚層端細(xì)胞還表達(dá)低水平的 NGN3、PAX4、ARX 和 NKX2. 2、INS、GCG、GHRL, SST 和 PP，甚至不表達(dá)。其它實(shí)施方案涉及“胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞”、“胰腺內(nèi)分泌祖細(xì)胞”或其等同物的細(xì)胞培養(yǎng)物。胰腺內(nèi)分泌祖細(xì)胞是多能的，且產(chǎn)生成熟的內(nèi)分泌細(xì)胞，包括α、β、S和PP 細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，相比其它非內(nèi)分泌祖細(xì)胞類(lèi)型，胰腺內(nèi)分泌祖細(xì)胞表達(dá)高水平的 NGN3、ΡΑΧ4、ARX和ΝΚΧ2. 2。胰腺祖細(xì)胞還表達(dá)低水平的INS、GCG、GHRL, SST和PP，甚至不表達(dá)。其它實(shí)施方案還涉及“胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞”、“胰腺激素分泌細(xì)胞”、“胰腺胰島激素表達(dá)細(xì)胞”或其等同物的細(xì)胞培養(yǎng)物，所述等同物是指體外源于例如α、β、δ和/或PP細(xì)胞或其組合的多能細(xì)胞的細(xì)胞。該內(nèi)分泌細(xì)胞可以是多激素的或單激素的，例如表達(dá)胰島素、胰高血糖素、胃饑餓素、生長(zhǎng)激素抑制素和胰腺多肽或其組合。因此，該內(nèi)分泌細(xì)胞可以表達(dá)一種或多種胰腺激素，其具有人胰島細(xì)胞的至少部分功能。胰島激素表達(dá)細(xì)胞可以是成熟的或不成熟的。基于某些標(biāo)志物的差別表達(dá)，或者基于它們的功能，例如體外或體內(nèi)葡萄糖響應(yīng)，可以將不成熟的胰島激素表達(dá)細(xì)胞與成熟的胰島激素表達(dá)細(xì)胞相區(qū)分。胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞還可以表達(dá)低水平的NGN3、PAX 4、ARX和NKX2. 2，甚至不表達(dá)。相比間質(zhì)的定形內(nèi)胚層細(xì)胞，上文細(xì)胞類(lèi)型中的絕大多數(shù)為上皮化的。在一些實(shí)施方案中，胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)選自表3的一種或多種標(biāo)志物和/或相關(guān)的下述美國(guó)申請(qǐng)的表4中的一種或多種標(biāo)志物2006年10月27日提交的題為“表達(dá)PDXl的背部和腹部前腸內(nèi)胚層”的美國(guó)申請(qǐng)11/588,693，以及2005年4月沈日提交的題為“表達(dá)PDXl的內(nèi)胚層”的美國(guó)申請(qǐng)No. 11/115，868，這些申請(qǐng)通過(guò)引用以其全文并入本文。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“富集的”、“分離的”、“分開(kāi)的”、“分選的”、“純化的”或通過(guò)耗盡而純化或其等同方式是指這樣的細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群或細(xì)胞樣品其含有至少 15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%, 90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的目的細(xì)胞系或具有某種細(xì)胞表型，例如表達(dá)該細(xì)胞表型的某細(xì)胞標(biāo)志物或不表達(dá)該細(xì)胞表型的某細(xì)胞標(biāo)志物基因特征的目標(biāo)細(xì)胞。用于純化、富集、分離、分開(kāi)、分選和/或耗盡源于hES細(xì)胞的內(nèi)胚層譜系細(xì)胞的方法還描述于 2008年4月21日提交的題為“用于純化內(nèi)胚層和源于人胚胎干細(xì)胞的胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞的方法”的美國(guó)申請(qǐng)NO. 12/107，020，其通過(guò)引用以其全文并入本文。本文使用的術(shù)語(yǔ)“接觸”(即，例如可分化細(xì)胞的細(xì)胞接觸化合物)意在包括將化合物和細(xì)胞一起體外孵育(例如將化合物添加到培養(yǎng)的細(xì)胞中)。術(shù)語(yǔ)“接觸”不意在包括細(xì)胞體外暴露于包含ErbB3配體和任選地可能天然存在于受試者中的TGF-β家族成員的限定的細(xì)胞培養(yǎng)基(即可能作為自然生理過(guò)程的結(jié)果而發(fā)生的暴露)。細(xì)胞和包含ErbB3 配體和任選的TGF-β家族成員的限定的細(xì)胞培養(yǎng)基接觸的步驟可以以任何適合的方式進(jìn)行。例如，可以在貼壁培養(yǎng)中或在懸浮培養(yǎng)中處理細(xì)胞。應(yīng)該理解，與限定的培養(yǎng)基接觸的細(xì)胞可以進(jìn)一步用細(xì)胞分化環(huán)境處理，以穩(wěn)定細(xì)胞或分化細(xì)胞。本文使用的術(shù)語(yǔ)“分化”是指比其來(lái)源的細(xì)胞類(lèi)型更為分化的細(xì)胞類(lèi)型的產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“分化”表示產(chǎn)生比其來(lái)源的細(xì)胞具有更少命運(yùn)選擇的細(xì)胞。因此該術(shù)語(yǔ)包括部分和終末分化的細(xì)胞類(lèi)型。源于hES細(xì)胞的分化細(xì)胞通常被稱(chēng)為源于hES的細(xì)胞或源于hES的細(xì)胞團(tuán)塊培養(yǎng)物，或源于hES的單細(xì)胞懸液，或源于hES的細(xì)胞貼壁培養(yǎng)物等。本文使用的術(shù)語(yǔ)“可分化的細(xì)胞”用于描述可以分化成至少部分成熟的細(xì)胞，或者可以參與細(xì)胞分化，例如與可以分化成至少部分成熟的細(xì)胞的其它細(xì)胞融合的細(xì)胞或細(xì)胞群。本文使用的“部分成熟的細(xì)胞”、“祖細(xì)胞”、“不成熟細(xì)胞”、“前體細(xì)胞”、“多能細(xì)胞”或其等同物包括不是終末分化的那些細(xì)胞，例如定形內(nèi)胚層細(xì)胞、PDXl陰性的前腸內(nèi)胚層細(xì)胞、PDXl陽(yáng)性的胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞，PDXl陽(yáng)性的胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞進(jìn)一步包括PDXl陽(yáng)性的前胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞和PDXl陽(yáng)性的胰腺內(nèi)胚層端細(xì)胞。所有細(xì)胞都是表現(xiàn)出來(lái)自相同器官或組織的成熟細(xì)胞的至少一個(gè)表型特征，例如形態(tài)或蛋白表達(dá)，但是可以進(jìn)一步分化成至少一種其它細(xì)胞類(lèi)型。例如，正常的成熟肝細(xì)胞典型地表達(dá)例如白蛋白、纖維蛋白原、 α-1-抗胰蛋白酶、凝血素凝集因子(prothrombin clotting factor)、轉(zhuǎn)鐵蛋白和解毒酶 (detoxification enzyme)，如細(xì)胞色素P-450等及其它的蛋白。因此，本文使用的“部分成熟的肝細(xì)胞”可以表達(dá)白蛋白或另外的一種或多種蛋白，或者開(kāi)始具有正常的成熟肝細(xì)胞的外觀(guān)或功能。本文使用的術(shù)語(yǔ)“基本上”是指大的限度或程度，例如，上下文中的“基本上類(lèi)似的”可以用于描述一種方法以大范圍或程度類(lèi)似于另一種方法。然而，本文使用的術(shù)語(yǔ)“基本上不含”，例如，“基本上不含”或“基本上不含污染物”，或“基本上不含血清”或“基本上不含胰島素或胰島素樣生長(zhǎng)因子”或其等同物表示，溶液、培養(yǎng)基、補(bǔ)充物、賦形劑等為至少98%或至少98. 5%、或至少99%、或至少99. 5%、或至少100 %不含血清、污染物或其等同物。在一個(gè)實(shí)施方案中，限定的培養(yǎng)基不含血清，或?yàn)?00%不含血清，或基本上不含血清。相反地，本文使用的術(shù)語(yǔ)“基本上類(lèi)似的”或其等同方式表示，組合物、過(guò)程、方法、溶液、 培養(yǎng)基、補(bǔ)充物、賦形劑等為至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%類(lèi)似于在本文說(shuō)明書(shū)中之前描述的、或在以其全文并入本文的之前描述的過(guò)程或方法中的過(guò)程、方法、溶液等。并且，本文與細(xì)胞群的組合物一起使用的術(shù)語(yǔ)“實(shí)質(zhì)上”或“基本上”表示占主導(dǎo)地位地或主要地。在一些實(shí)施方案中，這些術(shù)語(yǔ)表示細(xì)胞群中的至少85%的細(xì)胞、細(xì)胞群中的至少86%的細(xì)胞、細(xì)胞群中的至少87%的細(xì)胞、細(xì)胞群中的至少88%的細(xì)胞、細(xì)胞群中的至少89%的細(xì)胞、細(xì)胞群中的至少90%的細(xì)胞、細(xì)胞群中的至少91%的細(xì)胞、細(xì)胞群中的至少92%的細(xì)胞、細(xì)胞群中的至少93%的細(xì)胞、細(xì)胞群中的至少94%的細(xì)胞、細(xì)胞群中的至少95%的細(xì)胞、細(xì)胞群中的至少96%的細(xì)胞、細(xì)胞群中的至少97%的細(xì)胞、細(xì)胞群中的至少98%的細(xì)胞、或細(xì)胞群中的至少99%的細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)或短語(yǔ) “實(shí)質(zhì)上不含”或“基本上不含”是指在任何細(xì)胞培養(yǎng)物中存在最低量或少量的組分或細(xì)胞，例如本文所述的胰腺祖細(xì)胞為“實(shí)質(zhì)上或基本上同質(zhì)的”、“實(shí)質(zhì)上或基本上同-細(xì)胞的 (homo-cellular) ”、“實(shí)質(zhì)上hES細(xì)胞”、“實(shí)質(zhì)上或基本上定形內(nèi)胚層細(xì)胞”、“實(shí)質(zhì)上或基本上前腸內(nèi)胚層細(xì)胞”、“實(shí)質(zhì)上或基本上腸內(nèi)胚層細(xì)胞”、“實(shí)質(zhì)上或基本上PDXl陰性的前腸內(nèi)胚層細(xì)胞”、“實(shí)質(zhì)上或基本上PDXl陽(yáng)性的前胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞”、“實(shí)質(zhì)上或基本上PDXl 陽(yáng)性的前胰腺祖細(xì)胞”、“實(shí)質(zhì)上或基本上胰腺上皮細(xì)胞”、“實(shí)質(zhì)上或基本上PDXl陽(yáng)性的胰腺內(nèi)胚層端細(xì)胞”、“實(shí)質(zhì)上或基本上胰腺內(nèi)胚層前體細(xì)胞”、“實(shí)質(zhì)上或基本上胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞”等。術(shù)語(yǔ)“實(shí)質(zhì)上”和“基本上”還可以表示至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%該細(xì)胞(定形內(nèi)胚層；PDXl陰性的前腸內(nèi)胚層；PDXl陽(yáng)性的前胰腺內(nèi)胚層；PDXl陽(yáng)性的胰腺祖細(xì)胞；PDXl陽(yáng)性的胰腺端細(xì)胞；內(nèi)分泌前體細(xì)胞，和內(nèi)分泌激素分泌細(xì)胞)。本文使用的術(shù)語(yǔ)化合物的“有效量”或其等同物是指該化合物的濃度在存在所限定的培養(yǎng)基的剩余組分下足以實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)物中的可分化細(xì)胞在缺乏培養(yǎng)層細(xì)胞和在缺乏血清或血清替代物時(shí)穩(wěn)定超過(guò)一個(gè)月。該濃度可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定。本文使用的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”是指細(xì)胞中多核苷酸的轉(zhuǎn)錄或多肽的翻譯，使得分子在表達(dá)該分子的細(xì)胞中的可測(cè)量水平比它們?cè)诓槐磉_(dá)該分子的細(xì)胞中的更高。測(cè)量分子表達(dá)的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，且包括但不限于，RNA印跡、RT-PCR、原位雜交、蛋白質(zhì)印跡和免疫染色。當(dāng)述及細(xì)胞、細(xì)胞系、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群時(shí)，本文使用的術(shù)語(yǔ)“分離的”是指基本上與該細(xì)胞的天然來(lái)源分開(kāi)的，從而該細(xì)胞、細(xì)胞系、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群能夠在體外培養(yǎng)。此外，術(shù)語(yǔ)“分離”用于指從兩種或更多種細(xì)胞的組中物理選擇一種或多種細(xì)胞，其中基于細(xì)胞形態(tài)和/或各種標(biāo)志物的表達(dá)選擇細(xì)胞。本文使用的術(shù)語(yǔ)“保存細(xì)胞”表示在移植前以可存活的狀態(tài)維持細(xì)胞一段時(shí)間。 該時(shí)間段可以是1小時(shí)、2小時(shí)、5小時(shí)、10小時(shí)、15小時(shí)、20小時(shí)、24小時(shí)、2天、4天、5天、 1周、2周、4周、1個(gè)月、2個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月、8個(gè)月、10個(gè)月、1年、2年、4年、6年、8年、10 年、12年、14年、16年、18年、20年、22年、M年、30年、35年、40年、45年或100年或在該范圍內(nèi)提供的任意時(shí)間之間的任何時(shí)間段。本文使用的可分化細(xì)胞可以是多能的(pluripotent)、多能的(multipotent)、寡能的(oligopotent)或甚至單能的。在某些實(shí)施方案中，可分化細(xì)胞是多能的可分化細(xì)胞。 在更具體的實(shí)施方案中，該多能的可分化細(xì)胞選自胚胎干細(xì)胞、ICM/上胚層細(xì)胞、原初外胚層細(xì)胞、原始生殖細(xì)胞和畸胎癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，可分化細(xì)胞源于植入前胚胎。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，可分化細(xì)胞是哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，可分化細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。從可分化細(xì)胞分化的細(xì)胞類(lèi)型在多個(gè)研究和開(kāi)發(fā)領(lǐng)域具有幾種用途，所述領(lǐng)域包括但不限于藥物發(fā)現(xiàn)、藥物開(kāi)發(fā)和試驗(yàn)、毒理學(xué)、用于治療目的以及基礎(chǔ)科學(xué)研究的細(xì)胞制備。這些細(xì)胞類(lèi)型表達(dá)在廣泛研究領(lǐng)域中感興趣的分子。這些包括已知的如標(biāo)準(zhǔn)參考教科書(shū)描述的各種細(xì)胞類(lèi)型的功能所需的分子。這些分子包括但不限于細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子受體、胞外基質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、分泌的多肽和其它分子以及生長(zhǎng)因子受體。本發(fā)明考慮到可分化細(xì)胞可以通過(guò)與細(xì)胞分化環(huán)境接觸而被分化。本文使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞分化環(huán)境”是指這樣的細(xì)胞培養(yǎng)條件其中誘導(dǎo)可分化細(xì)胞分化，或者誘導(dǎo)可分化細(xì)胞成為富集了分化的細(xì)胞的人細(xì)胞培養(yǎng)物。優(yōu)選地，通過(guò)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的分化的細(xì)胞系在性質(zhì)上將是同質(zhì)的。術(shù)語(yǔ)“同質(zhì)的，，是指含有超過(guò)約50 %、60 %、70 %、80 %、85 %、86 %、 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%的目的細(xì)胞系的群體?？梢岳眉?xì)胞分化培養(yǎng)基或環(huán)境來(lái)部分地、終末地或可逆地分化本文所述的可分化細(xì)胞。根據(jù)本文所述的實(shí)施方案，細(xì)胞分化環(huán)境的培養(yǎng)基可以含有多種組分，包括例如， KODMEM培養(yǎng)基(Knockout Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基)、DMEM、Ham氏F12培養(yǎng)基、 FBS (胎牛血清)、TOR2 (成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2)、KSR或hLIF (人白血病抑制因子)。細(xì)胞分化環(huán)境還可以含有補(bǔ)充物，例如L-谷氨酰胺、NEAA(非必需氨基酸)、P/S(青霉素/鏈霉素)、N2、B27和β-巰基乙醇(β-ME)。本發(fā)明考慮到可以向細(xì)胞分化環(huán)境中添加額外的因子，包括但不限于纖連蛋白、層粘連蛋白、肝素、硫酸肝素、視黃酸、表皮生長(zhǎng)因子家族(EGF) 的成員、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族(FGF)的成員(包括TOF2、FGF7、reF8和/或FGF10)、血小板源性生長(zhǎng)因子家族(PDGF)的成員、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)/骨形成蛋白(BMP)/生長(zhǎng)和分化因子(DGF)家族拮抗劑，包括但不限于頭蛋白(noggin)、卵泡抑素、腱蛋白、gremlin、 cerberus/DAN家族蛋白、ventropin、高劑量活化素和amnionless或其變體或功能片段。 還可以以TGF/BMP/⑶P受體-Fc嵌合體的形式添加TGF/BMP/⑶P拮抗劑?？梢蕴砑拥钠渌蜃影梢约せ罨蛞种仆ㄟ^(guò)Notch受體家族傳遞信號(hào)的分子，包括但不限于δ -樣和 Jagged家族的蛋白以及Notch加工或切割的抑制劑，或其變體或功能片段。其它生長(zhǎng)因子可以包括胰島素樣生長(zhǎng)因子家族(IGF)成員、胰島素、無(wú)翅相關(guān)(WNT)因子家族和hedgehog 因子家族或其變體或功能片段?？梢蕴砑悠渌蜃觼?lái)促進(jìn)中內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞、內(nèi)胚層干 /祖細(xì)胞、中胚層干/祖細(xì)胞、或定形內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞增殖和存活以及這些祖細(xì)胞衍生物的存活和分化?？梢酝ㄟ^(guò)對(duì)目的細(xì)胞系的標(biāo)志物基因特征的表達(dá)以及可分化細(xì)胞類(lèi)型的標(biāo)志物基因特征的表達(dá)的缺乏定量，來(lái)監(jiān)測(cè)可分化細(xì)胞向目的細(xì)胞系的發(fā)展，或其維持在未分化狀態(tài)。定量此類(lèi)標(biāo)志物基因的基因表達(dá)的一種方法是使用定量PCR(Q-PCR)。本領(lǐng)域熟知進(jìn)行Q-PCR的方法。本領(lǐng)域已知的其它方法也可用于定量標(biāo)志物基因表達(dá)?？梢酝ㄟ^(guò)使用針對(duì)該目標(biāo)標(biāo)志物基因的特異性抗體來(lái)檢測(cè)標(biāo)志物基因表達(dá)。本文所述的實(shí)施方案還考慮到來(lái)自動(dòng)物中的任何來(lái)源的可分化細(xì)胞，條件是該細(xì)胞是本文所限定的可分化的。例如，可以從胚胎或其中的任何初生胚層、從胎盤(pán)或絨毛膜組織、或從例如成人干細(xì)胞的更為成熟的組織，包括但不限于脂肪、骨髓、神經(jīng)組織、乳腺組織、肝組織、胰腺、上皮組織、呼吸組織、性腺組織和肌肉組織收獲可分化細(xì)胞。在特定實(shí)施方案中，可分化細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。在其它特定實(shí)施方案中，可分化細(xì)胞是成人干細(xì)胞。還在其它特定實(shí)施方案中，可分化細(xì)胞是源于胎盤(pán)或絨毛膜的干細(xì)胞。其它實(shí)施方案考慮到使用來(lái)自能夠產(chǎn)生可分化細(xì)胞的任何動(dòng)物的可分化細(xì)胞。從其收獲可分化細(xì)胞的動(dòng)物可以是脊椎動(dòng)物或無(wú)脊椎動(dòng)物，哺乳動(dòng)物或非哺乳動(dòng)物，人或非人。動(dòng)物來(lái)源的實(shí)例包括但不限于靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、嚙齒類(lèi)動(dòng)物、狗、貓、馬、牛和豬?！?shí)施方案考慮到使用誘導(dǎo)的多能干(iPS)細(xì)胞，其為源于非多能細(xì)胞的多能干細(xì)胞。參見(jiàn) Zhou 等人 Q009)，Cell Stem Cell 4 :381-384 ;Yu 等人，(2009) Science 324(5928) :729-801, Epub March 26,2009 ；Yu 等人，(2007) Science 318(5858) :1917-20, Epub November 20,2007 ；Takahashi 等人，(2007) Cell，131 :861-72 ；以及Takahashi K.和 Yamanaka S. Q006)，CellU6 :663_76，這些文獻(xiàn)通過(guò)引用以其全文并入本文。從其收獲非多能細(xì)胞的動(dòng)物可以是脊椎動(dòng)物或無(wú)脊椎動(dòng)物，哺乳動(dòng)物或非哺乳動(dòng)物，人或非人。動(dòng)物來(lái)源的實(shí)例包括但不限于靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、嚙齒類(lèi)動(dòng)物、狗、貓、馬、牛和豬?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法生成本文所述的可分化細(xì)胞。例如，可以使用去分化和核轉(zhuǎn)移方法制備人多能細(xì)胞。此外，本文使用的人ICM/上胚層細(xì)胞或原初外胚層細(xì)胞在體內(nèi)或體外生成。原初外胚層細(xì)胞可以在貼壁培養(yǎng)中產(chǎn)生，或作為細(xì)胞團(tuán)塊在懸浮培養(yǎng)中產(chǎn)生，如在W099/53021所述的。此外，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法傳代人多能細(xì)胞，該方法包括人工傳代方法，和批量傳代方法，例如酶促或非酶促的傳代。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)利用ES細(xì)胞時(shí)，胚胎干細(xì)胞具有正常的核型，而在其它實(shí)施方案中，胚胎干細(xì)胞具有異常的核型。在一個(gè)實(shí)施方案中，胚胎干細(xì)胞中的多數(shù)具有正常的核型。本發(fā)明考慮超過(guò)50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或超過(guò)95% 的被考察的中期細(xì)胞表現(xiàn)出正常的核型。儲(chǔ)存用于包封和移植的細(xì)胞一些實(shí)施方案涉及用于冷凍保存已經(jīng)體外培養(yǎng)和/或分化的細(xì)胞的方法。該儲(chǔ)存將實(shí)現(xiàn)保存、質(zhì)量控制和其它期望的操作和管理，或與體外分析有關(guān)，或與體內(nèi)植入有關(guān)。用于移植前細(xì)胞儲(chǔ)存的方法包括通過(guò)冷凍細(xì)胞(冷凍保存)；或者通過(guò)在高于冷凍溫度時(shí)冷藏細(xì)胞(冬眠)保存組織。參見(jiàn)Chanaud等人，1987 Neurosci Lett 82:127-133; Collier 等人，(1987) 436 :363-366 ；以及 Sauer 等人，1991 Neurology and Neuroscience 2 :123-1；35 ;Gage等人，1985 Neurosci Lett 60 133-137，這些文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用以其全文并入本文。盡管已報(bào)道冬眠相比冷凍保存的組織提高移植物存活率和功能，但是在冬眠期間，細(xì)胞可能在這樣的條件下無(wú)法長(zhǎng)期維持而不損害細(xì)胞活力。本文使用的“細(xì)胞懸液”或其等同物是指與培養(yǎng)基接觸的細(xì)胞團(tuán)塊和/或簇和/或球。這樣的細(xì)胞懸液詳細(xì)描述于2008年11月8日提交的題為“干細(xì)胞團(tuán)塊懸液組合物及其分化方法”的美國(guó)申請(qǐng)12/264，760中，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用以其全文并入本文。本文使用的“適合的細(xì)胞懸液”或細(xì)胞懸液培養(yǎng)物或其等同物包括已在冷凍以上， 優(yōu)選在4°C下在冬眠培養(yǎng)基中儲(chǔ)存約1小時(shí)和長(zhǎng)達(dá)約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 或長(zhǎng)達(dá) 30 天的細(xì)胞懸液。
本文使用的適于移植的細(xì)胞是指對(duì)于體內(nèi)治療代謝障礙來(lái)說(shuō)活力和/或功能充足的細(xì)胞或細(xì)胞群。例如，在將適于移植的細(xì)胞植入到患有糖尿病的受試者中之后的一段時(shí)間，糖尿病或其一種或多種癥狀可以得到改善或減輕。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，適于移植的細(xì)胞或細(xì)胞群為胰腺祖細(xì)胞或群，或PDXl陽(yáng)性的胰腺祖細(xì)胞或群，或內(nèi)分泌前體細(xì)胞或群，或多激素或單激素內(nèi)分泌細(xì)胞和/或細(xì)胞或細(xì)胞群的任意組合，或甚至是其純化的或富集的細(xì)胞或細(xì)胞群。適于本文所述的實(shí)施方案的細(xì)胞進(jìn)一步詳細(xì)描述于美國(guó)專(zhuān)利 7，534，608，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用以其全文并入本文。本文使用的術(shù)語(yǔ)“儲(chǔ)存”或其等同方式是指在冷凍以上或以下保持或維持細(xì)胞。該術(shù)語(yǔ)還表示包括在用于受試者移植之前維持細(xì)胞。本文使用的術(shù)語(yǔ)“冷凍保存”或其等同方式是指在冷凍以下的溫度保存細(xì)胞。本文使用的術(shù)語(yǔ)“冬眠”或其等同方式是指在冷凍以上和相比正常生理溫度足夠低的溫度下保存細(xì)胞，使得一種或多種正常細(xì)胞生理過(guò)程減少或停止。在一個(gè)實(shí)施方案中， 優(yōu)選的冬眠溫度范圍為0至4°C，優(yōu)選約4°C。本文使用的冬眠培養(yǎng)基包括缺少冷凍保存劑且對(duì)于在冷凍溫度以上，優(yōu)選約4°C下儲(chǔ)存細(xì)胞是生理上相容的任何培養(yǎng)基。冬眠條件冬眠溫度范圍通常為0至5°C，優(yōu)選約4°C。不同類(lèi)型的培養(yǎng)基可以用作冬眠培養(yǎng)基與現(xiàn)有方法相結(jié)合。用于冷凍和冬眠細(xì)胞的現(xiàn)有技術(shù)方法利用包含緩沖劑和添加的蛋白質(zhì)的復(fù)合培養(yǎng)基，有時(shí)候包括完全不限定的組分，例如血清。然而，為了使毒性和免疫原性最小化，這樣的添加物對(duì)于移植到人體中是不期望的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，冬眠培養(yǎng)基不含添加的Ca++。在某些實(shí)施方案中，用于冬眠細(xì)胞的培養(yǎng)基不含添加的蛋白質(zhì)和/或不含緩沖劑。優(yōu)選的冬眠培養(yǎng)基包括最小量的葡萄糖或適量的葡萄糖的鹽水溶液，例如在鹽水中沒(méi)有額外的葡萄糖或約0. 1% -0.9%葡萄糖，或者由其組成。在優(yōu)選實(shí)施方案中，冬眠培養(yǎng)基包括約0. 1-0. 5%葡萄糖，或者由其組成。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，冬眠培養(yǎng)基包括約 0.2%葡萄糖，或者由其組成。在優(yōu)選實(shí)施方案中，冬眠培養(yǎng)基包括非常小百分比(體積/ 體積)的NaCl，例如約0. 1-1% NaCl，優(yōu)選約0. 5-0. 9% NaCl，或者由其組成。在某些實(shí)施方案中，可以使用更復(fù)雜的培養(yǎng)基，例如Hank氏平衡鹽溶液、Dulbecco氏最低必需培養(yǎng)基或fegle氏改良的最低必需培養(yǎng)基。在某些實(shí)施方案中，用添加物補(bǔ)充所選擇的冬眠培養(yǎng)基是需要的，該添加物例如添加的蛋白質(zhì)(例如，哺乳動(dòng)物血清蛋白或全血清(優(yōu)選熱滅活的))、緩沖劑(例如，磷酸鹽緩沖劑，HEPES等)、抗氧化劑、生長(zhǎng)因子、KCl (例如約30mM)、 乳酸鹽(例如約20mM)、丙酮酸鹽、MgCl2 (例如約2_3mM)、山梨醇(例如約300mM)或本領(lǐng)域熟知的其它添加物。在某些實(shí)施方案中，在約0_5°C、優(yōu)選約4°C下冬眠細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，在冷凍或使用之前，在冬眠培養(yǎng)基中在約4°C下維持細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，在冷凍之后在冬眠培養(yǎng)基中在約4°C下維持細(xì)胞。還在其它實(shí)施方案中，不經(jīng)冷凍在冬眠培養(yǎng)基中在約4°C 下維持細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，在冷凍之前、冷凍之后或在用于移植之前，在約4°C下在冬眠培養(yǎng)基中維持細(xì)胞至少約1小時(shí)和長(zhǎng)達(dá)約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25或長(zhǎng)達(dá)30天。在其它實(shí)施方案中，在冷凍之前、冷凍之后或在用于移植之前，在冬眠培養(yǎng)基中在約4°C下維持細(xì)胞至少約12-72小時(shí)。在某些實(shí)施方案中，在冷凍之前、冷凍之后或在用于移植之前，在冬眠培養(yǎng)基中在約4°C下維持細(xì)胞至少約24小時(shí)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在冷凍之前、冷凍之后或在使用之前，在冬眠培養(yǎng)基中在約4°C下維持細(xì)胞至少約36-48小時(shí)。冷凍保存條件在一些實(shí)施方案中，使用冷凍保存溶液冷凍保存細(xì)胞。冷凍保存溶液或培養(yǎng)基包括含有冷凍保存劑的溶液，該冷凍保存劑即隨著細(xì)胞冷凍或解凍保護(hù)細(xì)胞免受胞內(nèi)和/或細(xì)胞膜傷害的化合物。通過(guò)下述方法鑒別冷凍保存劑當(dāng)和在無(wú)冷凍保存劑存在時(shí)進(jìn)行類(lèi)似地冷凍或解凍的細(xì)胞相比時(shí)，與冷凍保存劑接觸的細(xì)胞的存活和/或功能性提高。任何冷凍保存劑可以和現(xiàn)有方法一起使用，該術(shù)語(yǔ)意味著包括胞內(nèi)和胞外的冷凍保存劑。本領(lǐng)域已知的任何冷凍保存劑可以用于冷凍保存溶液中。在某些實(shí)施方案中，冷凍保存溶液包括胞內(nèi)冷凍保存劑，包括但不限于二甲基亞砜(DMSO)、各種二醇和三醇(例如乙二醇、丙二醇、丁二醇和三醇以及甘油)以及各種酰胺(例如甲酰胺和乙酰胺)；并且，也可以單獨(dú)使用或者與任何胞內(nèi)冷凍保存劑組合使用的胞外冷凍保存劑，包括但不限于磷酸甘油酯的磷酸單酯和磷酸二酯代謝物、聚乙烯吡咯烷酮或甲基纖維素(例如至少 0. )。在優(yōu)選實(shí)施方案中，DMSO用作冷凍保存劑。可以以大范圍的濃度使用DMS0，例如約 1%、2%、約 3%、約 4%、約 5%、約 6%、約 7%、約 8%、約 9%、約 10%、約 11%、約 12%、 約13%、約14%、約15%或更大。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，DMSO的濃度范圍為約6%至約 12%。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，DMSO的濃度為約10%。在某些實(shí)施方案中，冷凍保存劑以逐步方式添加到細(xì)胞中，從而梯度提高該冷凍保存劑的濃度直到達(dá)到冷凍保存劑的期望終濃度。在某些實(shí)施方案中，使細(xì)胞與冷凍保存溶液接觸，該冷凍保存溶液含有期望終濃度的冷凍保存劑，或者直接將冷凍保存劑添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中而無(wú)需濃度梯度上升。冷凍保存溶液包括在適合的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的冷凍保存劑。任何類(lèi)型的培養(yǎng)基都可以用于此目的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，添加冷凍保存劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基不含有添加的Ca++。在某些實(shí)施方案中，添加冷凍保存劑的培養(yǎng)基不含有添加的蛋白質(zhì)和/或不含有緩沖劑。在其它實(shí)施方案中，添加冷凍保存劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(例如DMEM或DMEM/F12)包括約0. 1-0. 5% 葡萄糖或者由其組成，或不包括葡萄糖或包括少量葡萄糖。在該實(shí)施方案的一些方面，添加冷凍保存劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(例如DMEM或DMEM/F12)包括約0. 5-0.9% NaCl，或者由其組成。在優(yōu)選實(shí)施方案中，添加冷凍保存劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括非常少的葡萄糖，甚至至沒(méi)有以及約0. 5-0. 9% NaCl，或者由其組成。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，添加冷凍保存劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括約0. 1-0. 2%葡萄糖，或者由其組成。在該實(shí)施方案的一些方面中，添加冷凍保存劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括約0. 5-0. 9% NaCl，或者由其組成。在某些實(shí)施方案中，冷凍保存溶液還可以含有添加的蛋白質(zhì)，例如血清(例如胎牛血清或人血清)，或者血清蛋白(例如白蛋白或敲除的血清替代物)。在其它實(shí)施方案中， 冷凍保存劑還可以含有其它添加物，例如上述用于包含在冬眠培養(yǎng)基中的，例如抗氧化劑、 生長(zhǎng)因子、KCl (例如約30mM)、乳酸鹽(例如約20mM)、丙酮酸鹽、MgCl2 (例如約2_3mM)、山梨醇(例如至約300mM的摩爾滲透壓濃度)或本領(lǐng)域熟知的其它添加物。一旦細(xì)胞懸浮在冷凍保存溶液中時(shí)，以受控方式降低細(xì)胞的溫度。在冷卻細(xì)胞到低于冷凍溫度時(shí)，優(yōu)選緩慢進(jìn)行溫度的降低，使得細(xì)胞在冷凍保存劑的胞內(nèi)和胞外濃度之間建立平衡，從而抑制胞內(nèi)冰晶形成。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選冷凍速度足夠快，從而保護(hù)細(xì)胞免于過(guò)多損失水分和冷凍保存劑的毒性作用。然后可以在_20°C至約_250°C的溫度下冷凍保存細(xì)胞。優(yōu)選地，在低于_90°C下儲(chǔ)存細(xì)胞，從而將冰再結(jié)晶的風(fēng)險(xiǎn)最小化。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在約-196°C的液氮中冷凍保存細(xì)胞。或者，可以在商業(yè)可得的電子控制冷凍設(shè)備的幫助下實(shí)現(xiàn)受控冷凍。解凍條件冷凍保存后，可通過(guò)任何可用的方法解凍細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，迅速解凍細(xì)胞，例如通過(guò)快速浸沒(méi)在37°C的液體中。一旦細(xì)胞解凍，通過(guò)添加稀釋培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)冷凍保存劑的稀釋。任何培養(yǎng)基都可以用于稀釋與解凍的細(xì)胞接觸的冷凍保存溶液。例如，用于冬眠細(xì)胞的或者用于細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的上文列出的任何培養(yǎng)基，都可以用于稀釋冷凍保存溶液。其它培養(yǎng)基也是合適的，例如Hank氏平衡鹽溶液(優(yōu)選不含Ca++)、含DMEM且不含葡萄糖或含最少量至少量葡萄糖的培養(yǎng)基。例如上文列出的用于包含于冬眠或冷凍培養(yǎng)基中的添加物也可以用于稀釋培養(yǎng)基中。示例性的添加物包括，例如，緩沖劑(例如磷酸鹽緩沖劑、HEPES等)、抗氧化劑、生長(zhǎng)因子、KCl (例如約30mM)、乳酸鹽(例如約20mM)、丙酮酸鹽、MgCl2 (例如約2-3mM)、山梨醇(例如至約300mM的摩爾滲透壓濃度)或本領(lǐng)域熟知的其它添加物。其它適合的添加物包括DNA酶(例如可從Genentech，hcorporated以 PULM0ZYME0R商購(gòu)的)。用于稀釋冷凍保存溶液的培養(yǎng)基可以任選地含有添加的蛋白質(zhì)，例如添加的蛋白質(zhì)(例如哺乳動(dòng)物血清(優(yōu)選熱滅活的))或血清蛋白，例如白蛋白。在其它實(shí)施方案中，培養(yǎng)基不含添加的蛋白質(zhì)和/或添加的緩沖劑。稀釋冷凍保存劑后，然后可以使細(xì)胞沉降，或者可以在離心力下形成細(xì)胞團(tuán)，以盡可能多地從細(xì)胞中去除冷凍保存溶液。然后在不含有冷凍保存劑的培養(yǎng)基中洗滌細(xì)胞。在加入洗滌培養(yǎng)基之后和使細(xì)胞沉降或在離心力下形成團(tuán)之前，對(duì)細(xì)胞來(lái)說(shuō)保持在室溫是優(yōu)選的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在第二次離心前，細(xì)胞在室溫下保持約10、15、20、30分鐘。本領(lǐng)域已知的任何培養(yǎng)基都可以用于洗滌細(xì)胞，例如可以使用上文列出的任何冬眠或稀釋培養(yǎng)基。解凍和洗滌后，在37°C下培養(yǎng)細(xì)胞不同的時(shí)間，從而在移植之前使其復(fù)蘇?？梢栽谌魏闻囵B(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選在適合它們的分化階段的培養(yǎng)基中。在此時(shí)間內(nèi)，一些細(xì)胞可能會(huì)死亡。為了用于移植，應(yīng)該將細(xì)胞懸浮在適于施用給受試者的最終培養(yǎng)基中。細(xì)胞移植基本上類(lèi)似于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7，534，608所述，其通過(guò)引用以其全文并入本文。此外，在用于移植之前，可以如上所述在0至37°C、優(yōu)選約4°C下將解凍的細(xì)胞維持在冬眠培養(yǎng)基中長(zhǎng)達(dá)1小時(shí)和長(zhǎng)達(dá)約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25或長(zhǎng)達(dá)30天，而不會(huì)有活力的明顯損失。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞活力沒(méi)有發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的損失。測(cè)定復(fù)蘇的細(xì)胞的活力儲(chǔ)存后，測(cè)定移植前細(xì)胞的活力和/或功能以確定它們用于，例如移植的適用性是需要的。這可以使用本領(lǐng)域已知的多種方法實(shí)現(xiàn)。例如，可以使用活體染料使細(xì)胞染色， 該活體染料例如臺(tái)盼藍(lán)或溴化乙錠或吖啶橙。在有些實(shí)施方案中，適于移植的細(xì)胞群為至少約50-100%是存活的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，適于移植的細(xì)胞群為至少約50%、為至少約 55 %、為至少約60 %、為至少約65 %、為至少約70 %、為至少約75 %、為至少約80 %、為至少約85%、為至少約90%、為至少約95%、為至少約96%、為至少約97%、為至少約98%、為至少約99%是存活的。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，這樣的細(xì)胞群為至少約85%是存活的。在其它實(shí)施方案中，可以測(cè)定細(xì)胞的形態(tài)特征作為用于移植的細(xì)胞適合性的度量。在優(yōu)選實(shí)施方案中，已使用現(xiàn)有方法儲(chǔ)存的且適于移植的細(xì)胞的形態(tài)和新鮮細(xì)胞沒(méi)有區(qū)別(例如，統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，已使用現(xiàn)有方法儲(chǔ)存的且適于移植的細(xì)胞的體內(nèi)形態(tài)和新鮮細(xì)胞沒(méi)有區(qū)別(例如，統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的)。在細(xì)胞簇的情況下，可以在細(xì)胞冷凍/解凍和復(fù)蘇之前和之后對(duì)細(xì)胞量進(jìn)行定量。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以控制懸液中培養(yǎng)的細(xì)胞簇以壓緊。然后可以對(duì)該簇占據(jù)的區(qū)域拍照并測(cè)量。通過(guò)比較冷凍/解凍和復(fù)蘇之前和之后細(xì)胞占據(jù)的區(qū)域，可以測(cè)定復(fù)蘇百分比的值。也可測(cè)定已儲(chǔ)存的細(xì)胞的某些hES和/或胰腺祖細(xì)胞或激素分泌細(xì)胞標(biāo)志物的存在，以確定它們是否適合用于移植。該方法詳細(xì)描述于上文2008年的Kroon等人的上述描述，或者美國(guó)專(zhuān)利No. 7，534，608中，這些文獻(xiàn)通過(guò)引用以其全文并入本文。此外，或者可選擇地，可以測(cè)試細(xì)胞的功能，例如如上文2008年的Kroon等人或者在美國(guó)專(zhuān)利No. 7，534，608中所討論的，這些文獻(xiàn)通過(guò)引用以其全文并入本文。包封裝置本文所述的一個(gè)實(shí)施方案涉及包封裝置。該裝置可以植入到哺乳動(dòng)物中以治療多種疾病和障礙。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該裝置包含生物相容的免疫分離的裝置，其能夠完全將治療生物活性劑和/或細(xì)胞包封在其中。例如，此類(lèi)裝置可以在半滲透膜內(nèi)容納治療有效量的細(xì)胞，該半滲透膜具有的孔徑使得對(duì)細(xì)胞存活和功能重要的氧和其它分子能夠通過(guò)該半滲透膜移動(dòng)，而免疫系統(tǒng)的細(xì)胞無(wú)法滲透或穿過(guò)該孔。類(lèi)似地，此類(lèi)裝置可以含有治療有效量的生物活性劑，例如血管生成因子、生長(zhǎng)因子、激素等?？梢圆捎帽疚乃龅难b置來(lái)治療需要向生物體連續(xù)供給生物活性物質(zhì)的病理。例如，此類(lèi)裝置還可以被稱(chēng)為生物人工器官，其含有生物活性劑和/或細(xì)胞的同質(zhì)或異質(zhì)混合物，或者產(chǎn)生一種或多種目標(biāo)生物活性物質(zhì)的細(xì)胞。理想地，生物活性劑和/或細(xì)胞被完全包封或包裹在至少一個(gè)內(nèi)部空間內(nèi)，或者為包封腔室，其被至少一個(gè)或多個(gè)半滲透膜界定。這樣的半滲透膜應(yīng)該容許包封的目標(biāo)生物活性物質(zhì)(例如胰島素、胰高血糖素、胰腺多肽等)通過(guò)，使活性物質(zhì)可到達(dá)裝置外的靶細(xì)胞和患者體內(nèi)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，半滲透膜容許天然存在于受試者中的營(yíng)養(yǎng)物通過(guò)該膜，從而將必需的營(yíng)養(yǎng)物提供給包封的細(xì)胞。同時(shí)，這樣的半滲透膜抑制或防止患者細(xì)胞，更具體地為免疫系統(tǒng)細(xì)胞通過(guò)和進(jìn)入該裝置并傷害裝置中的包封的細(xì)胞。例如，在糖尿病的情況下，該方法能夠使葡萄糖和氧刺激胰島素生成細(xì)胞來(lái)實(shí)時(shí)釋放身體所需的胰島素，同時(shí)防止免疫系統(tǒng)細(xì)胞識(shí)別和破壞植入的細(xì)胞。 在優(yōu)選實(shí)施方案中，半滲透膜抑制植入的細(xì)胞從包封中逸失。優(yōu)選的裝置可以具有某些需要的特征，但該特征不限于下述特征中的一種或組合i)包含在生理?xiàng)l件下起作用的生物相容性材料，該生理?xiàng)l件包括PH和溫度；實(shí)例包括但不限于，各向異性材料、聚砜(PSF)、納米纖維墊、聚酰亞胺、四氟乙烯/聚四氟乙烯 (PTFE ；也稱(chēng)為T(mén)eflon )、ePTFE (膨體聚四氟乙烯)、聚丙烯腈、聚醚砜、丙烯酸樹(shù)脂、醋酸纖維素、硝酸纖維素、聚酰胺以及羥丙基甲基纖維素(HPMC)膜；ii)不釋放傷害包封在裝置中的生物活性劑和/或細(xì)胞的毒性化合物；iii)促進(jìn)生物活性劑或大分子跨裝置的分泌或釋放；iv)促進(jìn)大分子擴(kuò)散的快速動(dòng)力學(xué)；ν)促進(jìn)包封的細(xì)胞的長(zhǎng)期穩(wěn)定性；vi)促進(jìn)血管生成；vii)包含化學(xué)惰性的膜或外殼結(jié)構(gòu)；viii)提供穩(wěn)定的機(jī)械特性；ix)維持結(jié)構(gòu)/外殼整體性(例如，防止毒性或有害試劑和/或細(xì)胞的不期望的泄露)；X)是可重裝填和/或可灌注的；xi)是機(jī)械上可擴(kuò)展的；xii)不含開(kāi)口或含至少1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或更多個(gè)開(kāi)口 ； xiii)提供用于從宿主組織中免疫分離移植的細(xì)胞的機(jī)構(gòu)；xiv)易于制造和制備；以及XV) 可被滅菌。本文所述的包封裝置的實(shí)施方案不意在限于特定的裝置尺寸、形狀、設(shè)計(jì)、容量和 /或用于制備該包封裝置的材料，只要實(shí)現(xiàn)上述一個(gè)或多個(gè)因素即可。裝置設(shè)計(jì)在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在裝置中形成一個(gè)或多個(gè)隔室來(lái)改善該包封裝置，而不是通過(guò)圍繞外周或邊緣來(lái)密封或焊接該裝置來(lái)防止細(xì)胞和/或生物活性劑的泄露而制成的。圖1是裝置的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖實(shí)例，但是該裝置不意在局限于此設(shè)計(jì)。而且，該設(shè)計(jì)可以包括例如本領(lǐng)域中常規(guī)設(shè)計(jì)的變化。在一些實(shí)施方案中，裝置設(shè)計(jì)可以依據(jù)包封的生物活性劑和/或細(xì)胞的類(lèi)型而進(jìn)行修改以滿(mǎn)足需要和發(fā)揮研究功能。具有可行的任意尺寸或形狀的裝置可以經(jīng)進(jìn)一步被分隔而具有至少1個(gè)、至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少11個(gè)、至少12個(gè)、至少 13個(gè)、至少14個(gè)、至少15個(gè)、至少16個(gè)、至少17個(gè)、至少18個(gè)、至少19個(gè)、至少20個(gè)、至少21個(gè)、至少22個(gè)、至少23個(gè)、至少M(fèi)個(gè)或更多個(gè)腔室或隔室。形成多個(gè)隔室的一個(gè)目的是其提高了包封的細(xì)胞和例如裝置周?chē)目障犊臻g之間的營(yíng)養(yǎng)物和氧交換的表面積；例如參見(jiàn)圖1-11。此外，這樣的設(shè)計(jì)抑制或并不促成大的細(xì)胞團(tuán)塊或簇或聚集體，它們使得被塞進(jìn)大的細(xì)胞簇/聚集體中心中的細(xì)胞被摒棄，或接受很少的營(yíng)養(yǎng)物和氧，因此可能無(wú)法存活。因此含有多個(gè)腔室或隔室的裝置更能夠?qū)⒓?xì)胞分散在整個(gè)腔室/隔室或多個(gè)腔室/ 隔室中。這樣，每個(gè)細(xì)胞更有機(jī)會(huì)接受營(yíng)養(yǎng)物和氧，從而促進(jìn)細(xì)胞存活而非細(xì)胞死亡。一個(gè)實(shí)施方案涉及基本上橢圓形至矩形裝置；參見(jiàn)圖1和6。這些裝置進(jìn)一步被分隔或重構(gòu)建，從而替代稍平的裝置，存在通過(guò)裝置中心走向的焊接部分或焊縫，將裝置的每一半密封起來(lái)，從而形成兩個(gè)分開(kāi)的儲(chǔ)庫(kù)、腔、腔室、中空空間、容器或隔室；或者該焊接部分或焊縫形成一個(gè)U形腔室，由于該焊接部分其從中間被隔開(kāi)或分開(kāi)，但在此情況下的這樣的焊接部分沒(méi)有完全密封該室；參見(jiàn)圖1。圖1中，提供的兩個(gè)開(kāi)口用于容易地使細(xì)胞裝填和沖進(jìn)該腔室和通過(guò)該腔室。另一個(gè)實(shí)施方案涉及類(lèi)似的橢圓形或矩形裝置，其具有跨該裝置平面的2、3、4、5、 6、7、8、9、10或更多個(gè)焊接部分。在一些方面，焊接部分跨裝置的水平面或水平平面。在其它方面，焊接部分跨裝置的垂直面或垂直平面。還在其它方面，相貫的焊接部分存在于跨該平面的水平面和垂直面二者。在一些方面，焊接部分彼此平行且等距。在其它方面，焊接部分是垂直的。還在其它方面，焊接部分平行但不等距。如上述實(shí)例中，如果焊接部分穿過(guò)裝置延伸并連接裝置的兩個(gè)邊界的話(huà)，這樣的設(shè)計(jì)可有效形成完全分開(kāi)的多達(dá)2、3、4、5、6、7、 8、9、10或更多的室，或者其可以形成一個(gè)連續(xù)但互相交叉的腔室。此外，盡管某些示例性裝置在圖1-11中與平行或平行并等距的焊接部分一起描述，但其它裝置還可以以任何方向或取向上的焊接部分定制或制備，包括具有不被焊接部分中斷的區(qū)域的長(zhǎng)焊接部分。使用的焊接部分的類(lèi)型和數(shù)量可以取決于采用的細(xì)胞群或試劑，并且取決于治療或用途。在一些實(shí)施方案中，可以排列焊接部分以修飾裝置的外觀(guān)。圖1顯示了體現(xiàn)本文所述特征的包封裝置，但是如上所述，這僅是一個(gè)示例，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以預(yù)見(jiàn)到通過(guò)在任意此裝置中使用焊接部分或焊縫形成不同構(gòu)型， 可以定制適于用途的隔室的數(shù)量。圖2-5顯示同一裝置的上部、側(cè)面和端部橫截面。該裝置可以圍繞整個(gè)邊緣1超聲焊接，以形成完全封閉的內(nèi)腔?？梢允褂眯纬纱鼱钛b置的密封或隔絕膜的其它機(jī)構(gòu)。通過(guò)位于中心且沿裝置的長(zhǎng)軸延伸的內(nèi)部焊接部分2將腔進(jìn)一步分隔。該焊接部分延伸到點(diǎn)3，該點(diǎn)3有效限制了每個(gè)隔室的厚度或深度，但尚未完全將內(nèi)腔分開(kāi)。通過(guò)此方法，隔室的寬度和深度得到控制且可以根據(jù)需要變化，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞產(chǎn)物存活和性能。此外，該裝置的所有尺寸，包括但不限于總長(zhǎng)度、總寬度、外緣焊接部分厚度、外緣焊接部分寬度、隔室長(zhǎng)度、隔室寬度、隔室深度、內(nèi)部焊接部分長(zhǎng)度、內(nèi)部焊接部分寬度和開(kāi)口位置為可以變化的設(shè)計(jì)規(guī)格，變化的目的在于最優(yōu)化用于特定細(xì)胞產(chǎn)物和/或生物活性劑的裝置。參照?qǐng)D1，通過(guò)兩個(gè)單獨(dú)的開(kāi)口 5、5’向隔室裝載細(xì)胞產(chǎn)物或生物活性劑，該開(kāi)口 5、5’在外緣超聲焊接時(shí)引入到裝置中。這些開(kāi)口延伸到腔或隔室中，并容許通向隔室，用于在裝載期間均勻分布細(xì)胞和/或試劑的目的。此外，由于通過(guò)如圖1中的U形內(nèi)腔連接開(kāi)口 5、5’，在裝載鄰近的開(kāi)口 5’時(shí)，使得氣體經(jīng)每個(gè)開(kāi)口 5通氣，因此防止在裝置內(nèi)積累壓力。可選擇地，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的裝置不含有入口或出口，即該裝置稱(chēng)為是少開(kāi)口的。這樣的實(shí)施方案顯示于圖6中。圖7-9顯示了基本上類(lèi)似的裝置的頂部、 側(cè)面和端部橫截面。為了制成如圖6-11所示的少開(kāi)口裝置，兩個(gè)、三個(gè)、或更多個(gè)階段的焊接加工是必須的。例如，在一個(gè)方面，首先通過(guò)超聲焊接形成橢圓形/矩形外緣6和分隔點(diǎn)焊部分7。點(diǎn)焊接部分7的功能類(lèi)似于圖1的內(nèi)部焊接部分2。該點(diǎn)焊部分7以跨裝置的方式設(shè)置，以定期限制在任何給定點(diǎn)處的腔或隔室8的擴(kuò)展。并且，通過(guò)點(diǎn)焊產(chǎn)生腔或隔室 8，由此隔室8相互連接，并且不分離或完全分開(kāi)任一腔或隔室。此外，點(diǎn)焊部分7的總數(shù)、 直徑和分布為設(shè)計(jì)參數(shù)，其可以最優(yōu)化以適應(yīng)裝載動(dòng)力學(xué)和任何細(xì)胞產(chǎn)物或試劑的生長(zhǎng)速率。一旦細(xì)胞被載入裝置中時(shí)，通過(guò)跨裝置的邊緣9的第二個(gè)超聲焊接部分將該外部邊緣完全和無(wú)菌地密封。多步密封方法的結(jié)果是完成的裝置完全封閉，且不具有從外緣延伸的開(kāi)口。這種方式簡(jiǎn)化了裝載過(guò)程，且改善了裝置的總體完整性和安全性，因?yàn)殚_(kāi)口可以是這樣的外緣區(qū)域，在該處由于未達(dá)到最佳的超聲焊接導(dǎo)致可能發(fā)生開(kāi)裂。此外，盡管上述方法以按順序的2個(gè)步驟描述，用于包封細(xì)胞和/或試劑的手段并不限于所描述的2個(gè)步驟，而是以任何順序的任意數(shù)目的步驟，該步驟對(duì)包封細(xì)胞是必需的且同時(shí)防止或降低裝置開(kāi)裂的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，圖10和11顯示了基本上類(lèi)似于圖6所示裝置的包封裝置， 但是在焊接過(guò)程中改進(jìn)了點(diǎn)焊接部分10以去除中心。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以以各種方式實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，例如通過(guò)使用具有尖銳的內(nèi)部邊緣的超聲焊極(ultrasonic sonotrode), 可以在焊接后立刻切割材料。這些切割出的焊接部分10具有的優(yōu)勢(shì)在于，它們更易于與宿主組織整合，這是由于切割出的焊接部分10促進(jìn)裝置的血管化，因此改善了氧依賴(lài)性細(xì)胞產(chǎn)物和/或試劑的存活和性能。通過(guò)裝置實(shí)現(xiàn)和促進(jìn)新的血管系統(tǒng)的結(jié)果是氧在X-Y方向上的擴(kuò)散運(yùn)輸?shù)玫礁纳?，該擴(kuò)散運(yùn)輸通常局限于平面片層裝置的中心。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該裝置設(shè)計(jì)可以為不同形狀，例如細(xì)胞包封裝置可以是管狀或平管狀，或者是滿(mǎn)足本發(fā)明裝置的上述要求之一的任何其它形狀。裝置材料所包括的本領(lǐng)域已描述的細(xì)胞可滲透膜和不可滲透膜包括上文Baxter之前描述的那些專(zhuān)利或之前被稱(chēng)為T(mén)heraCyte細(xì)胞包封裝置，包括美國(guó)專(zhuān)利No. 6，773，458 ； 6，520，997 ；6，156，305 ；6，060，640 ；5，964，804 ；5，964，261 ；5，882，354 ；5，807，406 ； 5，800，529 ；5，782，912 ；5，741，330 ；5，733，336 ；5，713，888 ；5，653，756 ；5，593，440 ； 5，569，462 ；5，549，675 ；5，545，223 ；5，453，278 ；5，421，923 ；5，344，454 ；5，314，471 ； 5，324,518 ；5, 219, 361 ；5, 100，392 ；和5，011，494，上述所有專(zhuān)利通過(guò)引用以其全文并入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，由生物相容性材料組成包封裝置，該生物相容性材料包括但不限于各向異性材料、聚砜(PSF)、納米纖維墊、聚酰亞胺、四氟乙烯/聚四氟乙烯(PTFE; 也稱(chēng)為T(mén)eflon )、ePTFE(膨體聚四氟乙烯)、聚丙烯腈、聚醚砜、丙烯酸樹(shù)脂、醋酸纖維素、硝酸纖維素、聚酰胺以及羥丙基甲基纖維素(HPMC)膜。至少由例如G0re 、Phillips Scientific 、Zeus 、Pall⑧和Dewal⑧等制備這些和基本上類(lèi)似的膜類(lèi)型和組分。固定化的裝置還提供了可植入的裝置，其固定在植入位點(diǎn)處，以將包封的細(xì)胞和/或生物活性劑維持在植入位點(diǎn)并使得例如表達(dá)和分泌的治療多肽從該植入位點(diǎn)擴(kuò)散。一方面，該植入位點(diǎn)在治療所針對(duì)的組織或器官處或者鄰近該組織或器官。在其它方面，在從裝置分泌的試劑的遞送并非位點(diǎn)依賴(lài)性的且該試劑的生物分布取決于血管系統(tǒng)的情況下，該裝置可以植入遠(yuǎn)離的位置。例如，在優(yōu)選實(shí)施方案中，該生物相容的裝置皮下植入在前臂、或側(cè)腹、 或背部、或臀部、或腿部等的皮膚下面，在該處其基本上保持直到需要將其移出的這樣的時(shí)間。可擴(kuò)展的裝置本文所述的裝置具有內(nèi)表面和外表面，其中該裝置含有至少一個(gè)空隙(或儲(chǔ)庫(kù)、 或腔、或容器或隔室)，并且其中至少一個(gè)空隙對(duì)裝置的內(nèi)表面是開(kāi)放的。常規(guī)可植入的裝置通常由剛性的、非擴(kuò)展的生物相容性材料制成。本文所述的裝置的一個(gè)實(shí)施方案由可擴(kuò)展的材料制成。其它實(shí)施方案涉及不可擴(kuò)展的材料。裝置是否能夠擴(kuò)展可以是制作該裝置而采用的材料的固有部分，例如可擴(kuò)展的聚合物外鞘，或者可以設(shè)計(jì)使得其可擴(kuò)展或具有可擴(kuò)展的能力。例如，提供了擴(kuò)展尺寸以容納額外的細(xì)胞或以重新裝填現(xiàn)有裝置的裝置。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該可植入的裝置包含在外殼或支架中，該外殼或支架是稍微更為剛性的，且為不可擴(kuò)展的，但是能夠以足夠的手段通過(guò)增加植入裝置的數(shù)量來(lái)提高細(xì)胞或試劑容量。例如，用于插入各自具有預(yù)先裝載的細(xì)胞或試劑的額外的儲(chǔ)庫(kù)、腔、容器、 隔室或盒子的機(jī)構(gòu)?？蛇x擇地，該外殼含有多個(gè)裝置，該多個(gè)裝置中僅部分裝載了細(xì)胞或其中包封了細(xì)胞，而其它裝置是空的，可以在之后的時(shí)間段及時(shí)或在最初植入后的任意時(shí)間裝載和裝填細(xì)胞或試劑。這樣的可擴(kuò)展外殼由適于體內(nèi)移植的惰性材料組成，該惰性材料例如金屬、鈦、鈦合金或不銹鋼合金、塑料和適合在哺乳動(dòng)物中、更具體地在人體內(nèi)植入的陶瓷。還在另一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的外殼或植入裝置支架包括外部套管，該外部套管具有縱軸、沿著該縱軸的至少一個(gè)通道和遠(yuǎn)端以及適合共同接合裝置的裝置接合區(qū)域。類(lèi)似地，該裝置支架起的作用類(lèi)似于能夠在任何時(shí)間或長(zhǎng)時(shí)間容納超過(guò)一個(gè)磁盤(pán)或盒式錄音帶的磁盤(pán)或盒式錄音帶支架。還在一些實(shí)施方案中，該裝置支架含有適合提高支架高度的延展器?？芍匮b填細(xì)胞的包封裝置另一個(gè)實(shí)施方案涉及具有可重裝填的儲(chǔ)庫(kù)、腔、容器或隔室的包封裝置，其可以用適合的治療或生物活性試劑和/或細(xì)胞定期裝填或灌注?？梢酝ㄟ^(guò)將治療有效量的適合的治療或生物活性劑和/或細(xì)胞注射進(jìn)植入的儲(chǔ)庫(kù)、腔、容器或隔室來(lái)實(shí)現(xiàn)這樣的裝填，例如使用注射器或本領(lǐng)域用于體內(nèi)裝填像儲(chǔ)庫(kù)、腔、容器或隔室的其它標(biāo)準(zhǔn)手段真皮下或皮下進(jìn)行。包封的細(xì)胞在一些實(shí)施方案中，該系統(tǒng)包含的細(xì)胞密度為約IX 105、1X IO6細(xì)胞/mL至約 1 X 101°細(xì)胞/mL或更大。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞在培養(yǎng)條件下或在系統(tǒng)中體內(nèi)存活至少1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月、6個(gè)月、7個(gè)月、8個(gè)月、9個(gè)月、10個(gè)月、11個(gè)月、 12個(gè)月或1年或更長(zhǎng)，且具有的功能相當(dāng)于細(xì)胞被引入系統(tǒng)時(shí)或細(xì)胞在系統(tǒng)中完全發(fā)育和 /或成熟時(shí)，例如植入需要在體內(nèi)進(jìn)一步發(fā)育或成熟為功能細(xì)胞的祖細(xì)胞表現(xiàn)的功能的至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)中的細(xì)胞在所述系統(tǒng)中擴(kuò)增，以提高系統(tǒng)體內(nèi)植入后的細(xì)胞密度和/或細(xì)胞功能。提高細(xì)胞存活的方法細(xì)胞和組織包封/免疫分離領(lǐng)域的一個(gè)障礙是跨過(guò)用于包封細(xì)胞和組織的聚合物膜的氧和營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸?shù)牟蛔?。這種氣體和營(yíng)養(yǎng)交換不足的結(jié)果是降低的代謝活性和細(xì)胞死亡。本文所述的實(shí)施方案涉及解決現(xiàn)有技術(shù)的這一缺陷的可植入的細(xì)胞包封裝置。已經(jīng)測(cè)量了在胰島的天然環(huán)境中分離后和移植后，在不同聚合物裝置中以及裸露或游離的，例如在腎包囊下胰島內(nèi)的氧分壓。胰腺胰島中的氧分壓是體內(nèi)任何器官中最高的(37-46mmHg)。然而，經(jīng)過(guò)分離，這些值急劇下降(14-19mmHg)。胰腺胰島經(jīng)移植到血糖量正常的動(dòng)物中后，和它們分離的值相比，該值輕微下降(9-15mmHg)。參見(jiàn)Diorme等人’ Trans. Am. Soc. Artf. Intern. Organs. 1989 ；35 :739-741 ；禾口 Carlsson 等人，Diabetes July 199847(7) :1027_32，所述文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用明確并入本文。這些研究證實(shí)了當(dāng)組織被免疫分離且移植時(shí)，即使在血管化的區(qū)域，例如腎包囊中，與其自然狀態(tài)相比 (37-46mmHg)，該氧分壓也下降。因此，這些近乎缺氧的條件可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡，特別是更為接近細(xì)胞簇的中心或包封裝置的中心的細(xì)胞。為了達(dá)到更好的氧利用性和向包封的細(xì)胞或組織和/或生物活性劑的更好的遞送，本文所述的實(shí)施方案涉及在裝置設(shè)計(jì)和/或制劑中，例如在用于裝配該裝置的膜或材料中使用例如全氟化物質(zhì)。特別是全氟有機(jī)化合物，例如全氟化碳(PFC)，由于其對(duì)氧的溶解性比水高數(shù)倍，是良好的溶劑。例如，在正常條件下，液體PFC溶解以體積計(jì)的40至55%的氧和以體積計(jì)的100至150%的C02。PFC被大量用作血液替代物和組織保存。此外，PFC 衍生物是無(wú)法代謝的密集的、化學(xué)惰性的水可溶性化合物。在該實(shí)施方案的另一個(gè)方面，&遞送的增強(qiáng)通過(guò)PFC-乳液或PFC和一些基質(zhì)的混合物進(jìn)行。例如，裝置部件或細(xì)胞可以懸浮于或浸于或孵育于乳液/基質(zhì)中以形成涂層。已知還有某些具有更高的重量/體積濃度的PFV乳液具有改善的氧遞送和保留特性。并且， 由于由PFC的化攜帶能力產(chǎn)生更高氧分壓，產(chǎn)生&壓力梯度，其推動(dòng)溶解的氧擴(kuò)散到組織中，從而增強(qiáng)向細(xì)胞的A遞送。PFC物質(zhì)包括但不限于全氟三丁基胺(FC-43)、全氟萘烷、全氟溴辛烷、二-全氟丁基乙烯或其它適合的PFC。優(yōu)選的PFC通常含有約60至約76重量百分比的碳鍵合的氟。該全氟流體可以是單一化合物，但通常是此類(lèi)化合物的混合物。美國(guó)專(zhuān)利 No. 2，500，388 (Simons) ；2，519，983 (Simons) ；2，594，272 (Kauck 等人)；2，616，927 (Kauck 等人)；和4，788，339(M00re等人)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文。用于本文所述 ^ ' PFC ^1^ Encyclopedia of Chemical Technology, Kirk-Othmer, 第三版，第10卷，第874-81頁(yè)，John ffiley&Sons (1980)的那些。例如，有用的PFC包括全氟-4-甲基嗎啉、全氟三乙基胺、全氟-2-乙基四氫呋喃、全氟-2- 丁基四氫呋喃、 全氟戊烷、全氟-2-甲基戊烷、全氟己烷、全氟-4-異丙基嗎啉、全氟二丁基醚、全氟庚烷、全氟辛烷、及其混合物。優(yōu)選的惰性液體氟化物包括全氟己烷、全氟-2-丁基四氫呋喃、全氟庚烷、全氟辛烷、及其混合物。用于本文所述的實(shí)施方案的可商購(gòu)的PFC包括 FLUORINERT. TM.流體，例如FC-72、FC-75、FC-77和FC-84 (描述于1990年產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) #98-0211-5347-7(101. 5) NPI), FLUORINERT. TM.流體(可得自 Minnesota Mining and Manufacturing Company, St. Paul, Minn)昆^^I 。體內(nèi)成像能力在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于在包封裝置中體內(nèi)成像或檢測(cè)細(xì)胞的手段。成像在干細(xì)胞療法中起到重要作用。例如，無(wú)創(chuàng)的成像形式可以用于(1)確定細(xì)胞和/或要治療的疾病的存在、嚴(yán)重性或表型；( 監(jiān)測(cè)移植細(xì)胞療法中有害或非靶向細(xì)胞類(lèi)型和結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，例如囊腫或小囊腫；C3)引導(dǎo)療法的遞送；(4)跟蹤疾病的時(shí)間進(jìn)程和評(píng)估效果或療效；( 提供標(biāo)簽和限定療法的機(jī)制；(6)分析和評(píng)估移植的細(xì)胞的存活和功能；以及 (7)通常促進(jìn)任何細(xì)胞療法的過(guò)程，例如通過(guò)確定細(xì)胞療法的移植、存活和局部功能，包括本文所述的通過(guò)替代和/或植入胰腺祖細(xì)胞用于治療糖尿病的細(xì)胞療法。此外，盡管細(xì)胞療法致力于降低致病率/死亡率，此處和下文更詳細(xì)描述的無(wú)創(chuàng)成像技術(shù)可以作為有用的替代性終點(diǎn)，例如在初步試驗(yàn)或初步研究中。任何理想的體內(nèi)成像技術(shù)為i)無(wú)創(chuàng)的；ii)可靠地重復(fù)的；iii)能夠進(jìn)入組織直到至少3mm的深度；iv)分辨能力不大于100 μ m,并且理想地不大于50 μ m ；ν)成像不被裝置材料削弱，例如可以透過(guò)PTFE成像；vi)臨床上相容的，且不是技術(shù)上難處理的或復(fù)雜的；vii)可商購(gòu)的；viii)FDA批準(zhǔn)用于人類(lèi)使用；ix)合理的成本效益；以及χ)可以在合理的時(shí)間段(例如數(shù)秒或數(shù)分鐘)內(nèi)對(duì)細(xì)胞成像，或者上述的任意組合。到目前為止，當(dāng)前的方法包括但不限于共聚焦顯微技術(shù)、2-光子顯微技術(shù)、高頻超聲、光學(xué)相干斷層成像術(shù)(OCT)、光聲成像技術(shù)(photoacoustic tomography, PAT)、計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)(CT)、磁共振成像(MRI)、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像術(shù)(SPECT)和正電子發(fā)射斷層成像術(shù)(PET)。這些技術(shù)單獨(dú)或組合可以提供監(jiān)測(cè)移植細(xì)胞的有用手段。此外，期望此類(lèi)技術(shù)將隨著時(shí)間而改進(jìn)，并且每項(xiàng)技術(shù)發(fā)揮功能或其利用的基本原理基本上是類(lèi)似的。這就是說(shuō)，本文所述的體內(nèi)成像不意在局限于下文描述的技術(shù)，還涉及將起到和本文所述的相同效用的今后開(kāi)發(fā)的和描述的技術(shù)。 在一個(gè)實(shí)施方案中，采用的成像技術(shù)為無(wú)創(chuàng)的，且提供3維斷層掃面數(shù)據(jù)，具有高的時(shí)間和空間分辨率，能夠分子成像，并且是低廉和便于攜帶的。盡管現(xiàn)在沒(méi)有單獨(dú)的模式是理想的(下文更為詳細(xì)地描述)，每一個(gè)具有不同的特性，并且這些模式可以共同提供值得稱(chēng)贊的信息。共聚焦顯微技術(shù)為提高顯微相差的光學(xué)成像技術(shù)，其能夠通過(guò)使用光學(xué)針孔來(lái)消除比聚焦平面更厚的樣本中的焦點(diǎn)外光線(xiàn)，從而重建三維圖像。由于在樣品中一次只有一個(gè)點(diǎn)被照射，2D或3D成像需要掃描樣本中的規(guī)則的光柵(即矩形的平行掃描線(xiàn)條式樣)。 通常采取三個(gè)主要掃描變量來(lái)產(chǎn)生共聚焦顯微掃描圖像?？梢酝ㄟ^(guò)下述方式來(lái)實(shí)現(xiàn)基本等同的共聚焦操作采用偶聯(lián)于穩(wěn)定照射光束的側(cè)向移動(dòng)的樣本鏡臺(tái)(鏡臺(tái)掃描)、具有穩(wěn)態(tài)的掃描光束(光束掃描)、或通過(guò)在用通過(guò)旋轉(zhuǎn)的Nipkow或Mpnov盤(pán)的孔投射的光點(diǎn)陣列掃描樣本的同時(shí)，保持鏡臺(tái)和光源穩(wěn)定。每項(xiàng)技術(shù)具有使得其有利于特定共聚焦應(yīng)用的性能特性，但是限制了其他應(yīng)用的特性的使用。所有的共聚焦顯微鏡都依賴(lài)于該技術(shù)順序通過(guò)相對(duì)厚的切面或全部封固的樣本而產(chǎn)生高分辨率圖像的能力，該高分辨率圖像稱(chēng)為光切面。基于作為基礎(chǔ)圖像單元的光切面，可以以單、雙、三或多波長(zhǎng)照射模式從固定的和染色的樣本收集數(shù)據(jù)，并且用不同照射和標(biāo)記策略收集的圖像將互相對(duì)準(zhǔn)?；罴?xì)胞成像和延時(shí)順序是可行的，并且應(yīng)用于圖像順序的數(shù)字圖像處理方法能獲得樣本的ζ-系列和三維表現(xiàn)，以及作為四維成像的3D數(shù)據(jù)的時(shí)間順序表現(xiàn)。并不限制上述共聚焦顯微鏡的使用，因?yàn)楝F(xiàn)在或以后開(kāi)發(fā)的其它共聚焦顯微鏡也包括于本文所述的實(shí)施方案中?？墒褂么罅康臒晒馓结?，當(dāng)引入到相對(duì)簡(jiǎn)單的操作中時(shí)，其可以給某些細(xì)胞表面標(biāo)志物和/或蛋白和胞內(nèi)細(xì)胞器和結(jié)構(gòu)染色，例如CelltrackeiNDil、核活體染料等等。特異地直接或間接結(jié)合某些細(xì)胞表面標(biāo)志物的熒光標(biāo)志物可以特別用于鑒別例如不想要的細(xì)胞類(lèi)型。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)體內(nèi)存在的包封的多能細(xì)胞實(shí)時(shí)成像提供了檢測(cè)手段，并因此提供了預(yù)防由多能干細(xì)胞導(dǎo)致的畸胎瘤形成的可能性，該多能干細(xì)胞例如hES 或人胚胎生殖細(xì)胞或誘導(dǎo)的多能干(IPQ細(xì)胞或無(wú)精生殖(parthenote)細(xì)胞等。同一檢測(cè)手段還可以鑒別從裝置逸出或泄漏的(或變得不被包封的)多能干細(xì)胞。還可以使用在多能干細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的熒光標(biāo)記的啟動(dòng)子基因0CT4和NANOG進(jìn)行此類(lèi)細(xì)胞的鑒別。類(lèi)似地，某些標(biāo)記核、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線(xiàn)粒體的胞內(nèi)熒光標(biāo)志物以及甚至例如以細(xì)胞內(nèi)聚合肌動(dòng)蛋白為靶點(diǎn)的熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽的染料都是可商購(gòu)的，且可以提供有關(guān)細(xì)胞命運(yùn)的重要信息。在另一個(gè)實(shí)施方案中，二光子發(fā)射熒光(TPEF)顯微術(shù)是監(jiān)測(cè)分化或反過(guò)來(lái)說(shuō)是鑒別多能干細(xì)胞的無(wú)創(chuàng)手段，該多能干細(xì)胞(例如hESC或IPS細(xì)胞或無(wú)精生殖細(xì)胞)不分化，且作為包封于本文所述裝置的非常小百分比的產(chǎn)物細(xì)胞而無(wú)意中植入。二光子發(fā)射熒光顯微術(shù)基本上依賴(lài)于內(nèi)部來(lái)源的相差，但還可以通過(guò)二次諧波發(fā)生檢測(cè)例如原纖維基質(zhì)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，二光子顯微術(shù)所依賴(lài)的熒光發(fā)射類(lèi)似于共聚焦顯微術(shù)采用的熒光發(fā)射。Rice等人(2007年)描述了 TPEF可用于揭示生物化學(xué)狀態(tài)中的量差和分化和未分化干細(xì)胞的二維 O-D)形狀。參見(jiàn) Rice 等人(2007 年)J BiomedOpt. 2007 年 11 月-12 月；12 (6)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用明確并入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以基因修飾多能干細(xì)胞以表達(dá)熒光蛋白，例如增強(qiáng)的綠色熒光蛋白，并被多能干細(xì)胞啟動(dòng)子(例如0CT4或NANOG或以后鑒別的任何其它多能干細(xì)胞啟動(dòng)子)驅(qū)動(dòng)。對(duì)于比皮下移植更深，即深度低于皮膚表面的那些可植入裝置，二光子提供比共聚焦顯微術(shù)更深的無(wú)創(chuàng)成像。此外，使用的紅外線(xiàn)對(duì)活細(xì)胞的傷害比暴露于可見(jiàn)光或紫外線(xiàn)的小，這是因?yàn)闊晒獍l(fā)射所需的光子能量?jī)H在焦點(diǎn)平面處，并且不被焦點(diǎn)外平面中的細(xì)胞或組織感受到。還在一個(gè)實(shí)施方案中，超聲是便于攜帶的、基本上無(wú)害的、多功能的，且可在包封的細(xì)胞產(chǎn)物和/或包封的生物活性劑植入時(shí)實(shí)時(shí)進(jìn)行。特別地，高頻超聲例如 VisualSonics所描述的。高分辨率成像使得可以體內(nèi)評(píng)估哺乳動(dòng)物縱向研究中的解剖結(jié)構(gòu)和血液動(dòng)力學(xué)功能。例如VisualSonics的Vevo提供(1)進(jìn)行個(gè)體受試者的疾病發(fā)展和退行的縱向研究的能力；(2)低至30微米的解剖和生理結(jié)構(gòu)的成像分辨率；(3)使圖像引導(dǎo)的針注射和抽取可視化的能力；(4)微循環(huán)和心血管血流評(píng)估；( 經(jīng)用戶(hù)友好的設(shè)備和研究推動(dòng)的界面的高通量；和(6)獲得全面測(cè)量和注釋以及離線(xiàn)數(shù)據(jù)分析的開(kāi)放性結(jié)構(gòu)。評(píng)估微循環(huán)和心血管血流的能力將有助于確定細(xì)胞的活力，例如O2流動(dòng)和遞送。在另一個(gè)實(shí)施方案中，磁共振成像(MRI)可以用于使用相差試劑區(qū)分健康的和患病的組織。此外，在另一個(gè)實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)(CT)或CT掃描可以用于產(chǎn)生體組織和結(jié)構(gòu)的詳細(xì)圖片。并且，此處使用相差試劑，并使其易于由于特定吸附速率使正常組織可視化。相差試劑例如8-羥基喹啉銦-111 (I-Ill)的一個(gè)用途是用于追蹤干細(xì)胞，盡管其半衰期確實(shí)短。此外，在另一個(gè)實(shí)施方案中，正電子發(fā)射斷層掃描技術(shù)(PET)掃描可以用于測(cè)量來(lái)自正電子發(fā)射分子，例如碳、氮和氧等的發(fā)射，并且提供有價(jià)值的功能信息。在又一個(gè)實(shí)施方案中，光子共聚焦斷層掃描技術(shù)(OCT)或光聲斷層掃描技術(shù)(PAT)也可用于考察裝置內(nèi)外的細(xì)胞和組織。OCT檢測(cè)不同組織的反射率差異，而PAT檢測(cè)組織暴露于低能量激光而被加熱時(shí)產(chǎn)生的超聲波。不同方法和技術(shù)或工具可以單獨(dú)或組合用于可視化、分析和評(píng)估體內(nèi)裝置內(nèi)的植入的細(xì)胞。這些和現(xiàn)在已知或今后開(kāi)發(fā)的其它技術(shù)可以利用到這樣的程度，即它們能夠用于體內(nèi)成像和監(jiān)測(cè)本文所述的細(xì)胞和/或試劑。在整個(gè)申請(qǐng)中，引用了不同出版物。所有這些出版物和這些出版物中引用的那些參考文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容都通過(guò)引用一起全文加入到本申請(qǐng)中，從而更為全面的描述該專(zhuān)利所屬領(lǐng)域的狀態(tài)。實(shí)施例1包封的胰腺祖細(xì)胞的體內(nèi)功能進(jìn)行了下述實(shí)施例，至少部分地首先確定了包封胰腺祖細(xì)胞的方法的完整性，其包括生物相容性裝置和醫(yī)學(xué)/機(jī)械裝置；第二，確定與未包封的胰腺祖細(xì)胞(對(duì)照)相比， 完全包封的胰腺祖細(xì)胞是否體內(nèi)存活并成熟為有功能的激素分泌細(xì)胞。用于制備來(lái)自人胚胎干(hEQ細(xì)胞的胰腺細(xì)胞系的方法基本上描述于下述專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)中題為“生產(chǎn)胰腺激素的方法”的美國(guó)專(zhuān)利No. 7，534，608、2008年10月4日提交的題為“干細(xì)胞團(tuán)塊懸浮組合物及其分化方法”的美國(guó)申請(qǐng)No. 12/264, 760 ；2007年7月5日提交的題為“生產(chǎn)胰腺激素的方法”美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No. 11/773,944 ;2008年6月3日提交的題為“用于生產(chǎn)定形內(nèi)胚層的生長(zhǎng)因子”的美國(guó)申請(qǐng)No. 12/132，437 ；2008年4月8日提交的題為“用于純化源于人胚胎干細(xì)胞的內(nèi)胚層和胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞的方法”的美國(guó)申請(qǐng) No. 12/107，020 ；2007年10月19日提交的題為“用于含人血清的無(wú)飼養(yǎng)層的多能干細(xì)胞培養(yǎng)基的方法和組合物”的美國(guó)申請(qǐng)No. 11/875，057 ；2007年2月23日提交的題為“用于培養(yǎng)分化的細(xì)胞的組合物和方法”的美國(guó)申請(qǐng)No. 11/678,487 ；題為“用于干細(xì)胞培養(yǎng)的可選的組合物和方法”的美國(guó)專(zhuān)利No. 7，432，104 ；Kroon等人，(2008年)Nature Biotechnology 26(4) :443-452 ；d，Amour 等人，2005 年，Nat Biotechnol. 23 :1534-41 ；D，Amour 等人，2006 年，Nat Biotechnol. 24(11) :1392-401 ；McLean 等人，2007 年，Stem Cells 25:29-38，其公開(kāi)內(nèi)容都通過(guò)弓I用以其全文并入本文。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，未分化的人胚胎干(hES)細(xì)胞在DMEM/F12 (Mediatech)中維持在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層(特殊培養(yǎng)基)上，該DMEM/F12補(bǔ)充了 20% KnockOut血清替代物 (K0SR, GIBCO BRL)、ImM 非必需氨基酸(GIBC0 BRL)、Glutamax (GIBC0 BRL)、青霉素 / 鏈霉素(GIBC0 BRL)、0. 55mM 的 2-巰基乙醇(GIBC0 BRL)和 4ng/mL 重組人 FGF2 (R&DSystems) 以及可選擇地補(bǔ)充了 10-20ng/mL的活化蛋白A (R&D Systems)。每5至7天以約1 4至 1 8、1 9或1 10的分流比人工傳代人ES細(xì)胞培養(yǎng)物。在作為貼壁培養(yǎng)物或在細(xì)胞團(tuán)塊懸液中分化之前，在PBSv+(含有Mg++和Ca++，Invitrogen)中簡(jiǎn)單洗滌細(xì)胞。人ES細(xì)胞系可以包括但不限于CyT49、CyT203、Cyt25、BGOl和BG02。用于培養(yǎng)和分化懸液中的細(xì)胞或細(xì)胞群的方法詳細(xì)描述于2007年2月23日提交的“用于培養(yǎng)分化的細(xì)胞的組合物和方法”的國(guó)際申請(qǐng)PCT/US2007/062755和2008年11月 4日提交的“干細(xì)胞團(tuán)塊懸浮組合物及其分化方法”的美國(guó)申請(qǐng)No. 12/264, 760中，這些申請(qǐng)通過(guò)引用以其全文并入到本文。分化培養(yǎng)條件基本上類(lèi)似于上文的D’ Amour等人2006年所描述的條件和下面的實(shí)施例4，二者都描述了 5步分化操作階段1 (定形內(nèi)胚層；第1天-第4天)、階段2 (原初腸管或前腸內(nèi)胚層；第5天-第8天)、階段3 (較晚的前腸或Pdxl陽(yáng)性的內(nèi)胚層；第9 天-第12天)、階段4(胰腺祖細(xì)胞、胰腺上皮和/或內(nèi)分泌前體；第13天-第15天)和階段5 (激素表達(dá)內(nèi)分泌細(xì)胞；第16天或更長(zhǎng))。在階段4，從階段3培養(yǎng)物中去除視黃酸(RA)，用DMEM+B27 (1 IOOGibco)洗滌培養(yǎng)物一次，然后將洗液替換為單獨(dú)的DMEM+1 XB27補(bǔ)充物，或替換為DMEM+1 XB27補(bǔ)充物和下述因子的任意組合或任何一種或全部達(dá)4-8天頭蛋白(50ng/ml)、FGF10 (50ng/ml)、 KGF(25-50ng/ml)、EGF(25-50ng/ml) ,1-5 % FBS0 在沒(méi)有添加 RA 的情況下，將 30_100ng/ ml (R&Dsystems)的頭蛋白加入到培養(yǎng)基中1_9天。可選擇地，在階段4不添加額外的生長(zhǎng)因子。并且，可以向培養(yǎng)物中添加細(xì)胞存活試劑，例如Y-27632、法舒地爾、H-1152P以及含有胰島素/轉(zhuǎn)鐵蛋白/硒(ITS)的混合物。無(wú)論是否從貼壁培養(yǎng)物或在細(xì)胞團(tuán)塊懸液中生產(chǎn)胰腺祖細(xì)胞，所有的胰腺祖細(xì)胞群在移植于哺乳動(dòng)物中時(shí)都體內(nèi)發(fā)育和成熟為功能性?xún)?nèi)分泌組織。由源于hES的移植細(xì)胞體內(nèi)生成胰島素描述于上文的美國(guó)申請(qǐng)和參考文獻(xiàn)中，例如題為“生產(chǎn)胰島激素的方法”的美國(guó)申請(qǐng)No. 11/773，944和上文的Kroon等人2008年。不同于美國(guó)申請(qǐng)No. 11/773，944和上文的Kroon等人2008年所描述的細(xì)胞組合物，本研究中的胰腺祖細(xì)胞為體內(nèi)完全分離的或包封的。使用生物相容性聚乙二醇(PEG) 包封胰腺祖細(xì)胞，其更為詳細(xì)地描述于題為“用于治療疾病的包封的生物材料的植入”的美國(guó)專(zhuān)利No. 7，427，415，其通過(guò)引用并入本文。PEG包封的胰腺祖細(xì)胞移植在附睪脂肪墊 (EFP)下；測(cè)定了葡萄糖刺激后不同時(shí)間點(diǎn)的血清C肽水平；并且在PEG包封的外植體上進(jìn)行了免疫組化分析。此外，這些方法之前已描述于題為“生產(chǎn)胰島激素的方法”的美國(guó)申請(qǐng) No. 11/773，944和上文的Kroon等人2008年(數(shù)據(jù)未示出)。免疫組化分析顯示胰島祖細(xì)胞能夠體內(nèi)成熟并含有激素表達(dá)細(xì)胞，例如胰島素、胰高血糖素和生長(zhǎng)激素抑制素。還可以使用醫(yī)學(xué)或機(jī)械裝置進(jìn)行該胰腺祖細(xì)胞的包封，該裝置例如TheraCyte 細(xì)胞包封裝置。所有述及的TheraCyte細(xì)胞包封裝置的參考文獻(xiàn)都指的是直接從廠(chǎng)商(TheraCyte，Inc.，Irvine, California)購(gòu)買(mǎi)的裝置，并進(jìn)一步描述于美國(guó)專(zhuān)利 No. 6，773，458 ；6，156，305 ；6，060，640 ；5，964，804 ；5，964，261 ；5，882，354 ；5，807，406 ； 5，800，529 ；5，782，912 ；5，741，330 ；5，733，336 ；5，713，888 ；5，653，756 ；5，593，440 ； 5，569，462 ；5，549，675 ；5，545，223 ；5，453，278 ；5，421，923 ；5，344，454 ；5，314，471 ； 5，324,518 ；5, 219, 361 ；5, 100，392 ；和5，011，494，上述所有專(zhuān)利通過(guò)引用以其全文并入本文。胰腺祖細(xì)胞體外裝載進(jìn)裝置中，或者當(dāng)該裝置已經(jīng)植入一段時(shí)間使得裝置預(yù)血管化后， 然后經(jīng)裝置一側(cè)上的裝載口體內(nèi)裝載細(xì)胞。因此，該裝置含有細(xì)胞(0.4微米)不可滲透的第一膜，但同時(shí)該膜不限制氧和不同營(yíng)養(yǎng)物進(jìn)出內(nèi)膜的活動(dòng)，例如來(lái)自?xún)?nèi)膜外的葡萄糖可以滲透進(jìn)入含有成熟的胰腺激素分泌細(xì)胞的囊，該胰腺激素分泌細(xì)胞響應(yīng)葡萄糖，可以分泌胰島素，然后該胰島素滲透出內(nèi)膜。該裝置還含有血管化的外膜。為了將裝置用于任何細(xì)胞療法，該裝置必需完全體內(nèi)含有細(xì)胞(例如源于hES的細(xì)胞與宿主免疫分離)。為了測(cè)定TheraCyte裝置的完整性，體內(nèi)比較了含有胰腺祖細(xì)胞的完整裝置與膜中具有穿孔的那些裝置。將裝置穿孔會(huì)使宿主細(xì)胞侵入，因此建立起宿主-移植物的細(xì)胞間接觸。通過(guò)外科手術(shù)將2個(gè)4. 5 μ L TheraCyte裝置植入到嚴(yán)重組合免疫缺陷型(SCID) 的各只雄性beige (BG)小鼠的附睪脂肪墊(EFP)下或皮下(SQ)，該TheraCyte裝置首先預(yù)血管化。即，一只動(dòng)物在EFP下接受2個(gè)裝置，另一只動(dòng)物接受2個(gè)裝置(SQ)。這些完整但空 (無(wú)胰腺祖細(xì)胞)的裝置在動(dòng)物內(nèi)保留足夠的時(shí)間，使得宿主血管結(jié)構(gòu)形成并與裝置相連， 例如至少2至8周。8周后，源于hES細(xì)胞的約1. 5 X IO6個(gè)胰腺祖細(xì)胞被裝載進(jìn)該4個(gè)裝置的每一個(gè)中。在帶有預(yù)血管化的裝置的動(dòng)物被裝載的同時(shí)，將2個(gè)改進(jìn)的TheraCyte裝置植入另外3只動(dòng)物，其中相同尺寸的原TheraCyte裝置的改進(jìn)是在該裝置的膜中穿孔。用具有和裝載進(jìn)入穿孔的裝置的相同劑量的細(xì)胞離體裝載這些穿孔的裝置(每只動(dòng)物 2個(gè)穿孔裝置)。并且在同一時(shí)間，和這些實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，并且每只動(dòng)物移植置了 Gelfoam上的胰腺祖細(xì)胞，如題為“生產(chǎn)胰腺激素的方法”的美國(guó)申請(qǐng)No. 11/773,944 和上文的Kroon等人2008年所述的，盡管在一只動(dòng)物中兩個(gè)移植物置于EFP下，另一只動(dòng)物中僅一個(gè)移植物置于EFP下。表1總結(jié)了上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。表1 來(lái)自包封的成熟胰腺激素分泌細(xì)胞的人C-肽血清水平9周12周15周植入動(dòng)物#GSIS時(shí)間 (分鐘)人C-肽 pMGSIS時(shí)間人C-肽 pMy GSIS時(shí)間L C-肽 pMPV6750910186EFP60224303042xl.5M60419PV676015703220908SQ606103053258742x1.5M6026373030376790 60239 7270 30374 482nPV +孑L EFP 2χ1.5M6022596800 60218 8990 30 60329 506 2177681040804220155460213630 601059 27515 301615 103306820912048801504EFP GF603716303025518782xl.5M6036733042886840279044401498EFP GF6058030751514112χ1.5M603000304698就葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIQ而言，0指時(shí)間為0 ;5指葡萄糖刺激后5分鐘； 30指葡萄糖刺激后30分鐘；60指葡萄糖刺激后60分鐘；PV TC EFP，在附睪脂肪墊下預(yù)血管化的HieraCyte ;PV TC SQ，皮下的預(yù)血管化的TheraCyte ;nPV TC+孔EFP，在附睪脂肪墊下的未預(yù)血管化的TheraCyte ；以及EFP GF, Gelfoam上的附睪脂肪墊，2 X 1. 5M，具有約 IXlO6個(gè)細(xì)胞的2個(gè)構(gòu)建體。使得胰腺祖細(xì)胞體內(nèi)發(fā)育和成熟，并且基本上如題為“生產(chǎn)胰腺激素的方法”的美國(guó)專(zhuān)利No. 11/773，944和上文的Kroon等人2008年所述，測(cè)定現(xiàn)在成熟的激素分泌細(xì)胞的胰島素分泌和葡萄糖響應(yīng)。參見(jiàn)表1。此外，為了確定裝置的完整性，處死一些動(dòng)物，并進(jìn)行裝置的免疫組化考察。申請(qǐng)人:之前證明了，對(duì)于證明胰島素分泌細(xì)胞對(duì)體內(nèi)葡萄糖有響應(yīng)的這一點(diǎn)，低于50pM的血清人C-肽水平或低于25pM的胰島素水平是沒(méi)有意義的。這一相同標(biāo)準(zhǔn)用于這些研究中。該研究的結(jié)果示于表1。原始Theracyte裝置和改進(jìn)的Theracyte裝置在8、 12和15周后都具有相當(dāng)?shù)难迦薈-肽水平(動(dòng)物編號(hào)675-676&679-681)，動(dòng)物編號(hào)681 在葡萄糖刺激后30分鐘時(shí)除外，當(dāng)時(shí)血清C-肽水平要比在該時(shí)間段的任何其它動(dòng)物要高得多。首先，就Theracyte包封裝置的完整性而言，進(jìn)行了原始Theracyte裝置和改進(jìn)的 Theracyte裝置(動(dòng)物編號(hào)分別為675-676和679-681)的蘇木精和伊紅染色。這些裝置的顯微鏡考察顯示，原始Theracyte裝置具有不同的宿主血管結(jié)構(gòu)，包括裝置周?chē)难苄图?xì)胞，但是沒(méi)有觀(guān)察到這些類(lèi)似的結(jié)構(gòu)侵入細(xì)胞不可滲透的內(nèi)膜和進(jìn)入含有源于hES的細(xì)胞的空間。即，在容納源于hES的細(xì)胞或移植物的細(xì)胞不可滲透的內(nèi)膜內(nèi)沒(méi)有觀(guān)察到宿主血管結(jié)構(gòu)。相比之下，改進(jìn)的Theracyte裝置的顯微鏡考察顯示，不僅在裝置的外側(cè)上存在相連的宿主血管結(jié)構(gòu)，在穿孔的細(xì)胞不可滲透的內(nèi)膜內(nèi)部也發(fā)現(xiàn)了血管結(jié)構(gòu)和血管細(xì)胞。 因此，原始Theracyte裝置可以完整含有源于hES的細(xì)胞，并且在容納源于hES的細(xì)胞的空間中沒(méi)有觀(guān)察到宿主細(xì)胞和組織?？偟膩?lái)說(shuō)，Theracyte裝置能夠完全體內(nèi)包封(分離)源于hES的細(xì)胞，并且胰腺祖細(xì)胞可以在這些裝置中體內(nèi)存活和成熟為功能性的激素分泌細(xì)胞。除了證明Theracyte裝置的完整性之外，本研究還證明了完全完整的裝置能夠在包含的源于hES的細(xì)胞和宿主環(huán)境之間交換足夠的氧和各種營(yíng)養(yǎng)物，并且胰腺祖細(xì)胞能夠體內(nèi)存活和成熟。例如，和對(duì)照(動(dòng)物682和684)相比，在9和12周時(shí)預(yù)血管化的裝置中的血清人C-肽水平不如相同時(shí)間點(diǎn)的一樣高。然而，到第15周(細(xì)胞植入后)，預(yù)血管化的裝置中的血清人C-肽水平和未包封(Gelfoam)的對(duì)照相當(dāng)。此外，處死帶有原始Theracyte (預(yù)血管化的)裝置的動(dòng)物，并取出裝置(或外植體)(動(dòng)物編號(hào)675&676)?；旧显偃鏚roon等人2008年所述，再次進(jìn)行免疫組化，其通過(guò)固定取出的裝置和/或外植體，將10個(gè)切片切成薄的微米切片而進(jìn)行。用PBS洗滌切片 2 次，之后用 PBST(PBS/0. 2% (wt/vol)吐溫 20 ；Thermo Fisher Scientific)洗滌。在 24°C下，用 5%正常猴血清(Jackson Immuno Research Labs)/PBSTr(PBS/0. 1% (wt/vol) Triton X-IOO(Sigma))封閉 1 小時(shí)。在 1 % BSA(Sigma)/PBSiTr 中稀釋一抗和二抗。在 4°C 下孵育一抗過(guò)夜，在保濕室中孵育二抗約1小時(shí)15分鐘。采用下述一抗和稀釋液；豚鼠抗胰島素(INS), 1 500 (Dako，A0564)；兔抗生長(zhǎng)激素抑制素(SST)，1 500 (Dako, A0566)；山羊抗生長(zhǎng)激素抑制素(SST), 1 300 (Santa Cruz Biotechnology, SC-7819)；山羊抗胰高血糖素(GCG)，1 100 (Santa Cruz Biotechnology，SC-7780)。通過(guò)共聚焦顯微術(shù)(Nikon, Exlipse 80i, Cl)進(jìn)行成像。原始Theracyte裝置/外植物的免疫組化考察清楚地顯示了單陽(yáng)性激素細(xì)胞，例如GCG、INS和SST表達(dá)細(xì)胞。該數(shù)據(jù)支持了血清人C-肽數(shù)據(jù)，后者證明了移植的源于hES 的細(xì)胞的葡萄糖響應(yīng)。激素分泌細(xì)胞的存在證實(shí)了胰腺祖細(xì)胞能夠體內(nèi)存活和成熟，即使是在完全包封的情況下。上述研究清楚地證明了原始和改進(jìn)的Theracyte裝置完全包含源于hES的胰腺祖細(xì)胞且沒(méi)有宿主細(xì)胞跨細(xì)胞不可滲透的內(nèi)膜侵入的能力。這些研究還證明了該裝置的細(xì)胞不可滲透的內(nèi)膜盡管對(duì)細(xì)胞是不可滲透的，但是對(duì)于源于hES的胰腺祖細(xì)胞在裝置中存活所需的氧和各種營(yíng)養(yǎng)物是可滲透的，使得祖細(xì)胞能夠體內(nèi)成熟為激素分泌細(xì)胞，即為發(fā)揮功能且對(duì)葡萄糖響應(yīng)的細(xì)胞。此外，預(yù)見(jiàn)到胰腺系細(xì)胞群、特別是至少本文所述的胰腺祖細(xì)胞，當(dāng)包封于改進(jìn)的裝置，例如至少為圖1-11中所述的那些之中時(shí)，將會(huì)體內(nèi)成熟和發(fā)揮功能。實(shí)施例2在沒(méi)有宿主-移棺物細(xì)胞接觸情況下,包封的胰腺祖細(xì)胞的體內(nèi)功能為了確定移植的胰腺祖細(xì)胞群內(nèi)功能化是否需要宿主-移植物細(xì)胞間接觸，將細(xì)胞裝載進(jìn)未預(yù)血管化的細(xì)胞包封裝置。胰腺祖細(xì)胞群基本上如實(shí)施例1中所述生成。在此研究中不對(duì)裝置進(jìn)行預(yù)血管化，并且將所有的TheraCyte裝置5 μ L)中的每個(gè)裝置離體裝載至少1. 5X IO6個(gè)細(xì)胞 (1.5Μ)或4. 5\106個(gè)細(xì)胞0.511)。將含有1.511個(gè)細(xì)胞的3個(gè)裝置皮下植入(1^ SQ 1. 5Μ)， 將含有4. 5 X IO6個(gè)細(xì)胞(4. 5Μ)或約15 μ L的3個(gè)裝置離體皮下植入(TC SQ 4. 5Μ)。為了對(duì)比和作為對(duì)照，將具有植入的未包封的胰腺祖細(xì)胞的動(dòng)物與包封的但未預(yù)血管化的實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行。將3只小鼠中的每一只皮下植入2個(gè)Gelfoam構(gòu)建體，所述構(gòu)建體裝載了約 1. 9-2. 4X IO6個(gè)細(xì)胞O個(gè)構(gòu)建體的總合)，或約4 μ L/構(gòu)建體，并且將2只小鼠在EFP下植入2個(gè)Gelfoam構(gòu)建體，所述構(gòu)建體裝載了約1. 9_2. 4Χ IO6個(gè)細(xì)胞O個(gè)構(gòu)建體的總合)， 或約4 μ L/構(gòu)建體。表2總結(jié)了上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。表2 來(lái)自包封的未預(yù)血管化的成熟胰腺激素分泌細(xì)胞的人C-肽血清水平
權(quán)利要求
1.一種用于在哺乳動(dòng)物中體內(nèi)生成胰島素的方法，所述方法包括(a)向可植入的半滲透裝置中提供體外人PDXl日性的胰腺祖細(xì)胞群；(b)將具有所述細(xì)胞祖細(xì)胞群的裝置植入到哺乳動(dòng)物宿主中；和(c)使所述祖細(xì)胞群在所述裝置中體內(nèi)成熟，使得所述祖細(xì)胞群包含內(nèi)分泌細(xì)胞和腺泡細(xì)胞，其中至少部分所述內(nèi)分泌細(xì)胞為響應(yīng)體內(nèi)葡萄糖刺激而生成胰島素的胰島素分泌細(xì)胞，從而為所述哺乳動(dòng)物生成胰島素。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括使PDXl陽(yáng)性的胰腺祖細(xì)胞成熟為腺泡細(xì)胞或?qū)Ч芗?xì)胞。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述裝置通過(guò)植入所述哺乳動(dòng)物中而首先預(yù)血管化。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述裝置包含多個(gè)焊接部分，用于使所述裝置中的人PDXl陽(yáng)性的胰腺祖細(xì)胞群的表面積與容積比最大化。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述裝置包含多個(gè)焊接部分，以提高所述宿主進(jìn)行的血管化。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述裝置是可重裝填的。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述裝置是可擴(kuò)展的。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中監(jiān)測(cè)所述體內(nèi)細(xì)胞群。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在葡萄糖刺激后所述哺乳動(dòng)物的血清中可檢測(cè)到大于25pM的胰島素。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在葡萄糖刺激后所述哺乳動(dòng)物的血清中可檢測(cè)到大于50pM的人C-肽。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞群與所述宿主哺乳動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞分隔開(kāi)。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是經(jīng)免疫抑制的。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中提供人PDXl陽(yáng)性的胰腺祖細(xì)胞群包括解凍細(xì)胞群。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中提供人PDXl陽(yáng)性的胰腺祖細(xì)胞群還包括富集所述細(xì)胞群的PDX1/NKX6. 1共陽(yáng)性的胰腺祖細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中提供人PDXl陽(yáng)性的胰腺祖細(xì)胞群還包括通過(guò)使所述細(xì)胞群接觸結(jié)合CD142抗原的抗體以及富集所述CD142結(jié)合細(xì)胞而富集所述細(xì)胞群的 PDX1/NKX6. 1共陽(yáng)性的胰腺祖細(xì)胞。
16.一種用于植入到哺乳動(dòng)物宿主中的細(xì)胞包封組件，所述組件包含用于包封活細(xì)胞的至少一個(gè)腔室，其中所述組件包括第一密封件和第二密封件，所述第一密封件位于所述組件的外周邊緣處從而形成所述包封組件，所述第二密封件有效降低腔室容積但提高裝置的表面積。
17.如權(quán)利要求16所述的組件，其中所述組件包含半滲透膜。
18.如權(quán)利要求16所述的組件，其中所述組件具有第三或第四密封件，并進(jìn)一步降低所述腔室容積。
19.如權(quán)利要求16所述的組件，其進(jìn)一步包含至少一個(gè)裝載口。
20.如權(quán)利要求16所述的組件，其包含2個(gè)裝載口。
21.如權(quán)利要求16所述的組件，其中所述組件進(jìn)一步包含活細(xì)胞。
22.如權(quán)利要求21所述的組件，其中所述活細(xì)胞為人PDXl陽(yáng)性的胰腺祖細(xì)胞。
23.—種冷凍保存的人胰腺祖細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞群適于移植到哺乳動(dòng)物中。
24.如權(quán)利要求23所述的細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞群的細(xì)胞能夠在所述哺乳動(dòng)物中成熟為胰島細(xì)胞或腺泡細(xì)胞。
25.如權(quán)利要求23所述的細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞群的細(xì)胞能夠成熟為β細(xì)胞，所述β 細(xì)胞能夠響應(yīng)葡萄糖刺激而分泌胰島素。
26.如權(quán)利要求23所述的細(xì)胞群，其中所述胰腺祖細(xì)胞群包含PDXl陽(yáng)性的胰腺祖細(xì)胞。
27.一種保存適于移植的細(xì)胞的體外群的方法，所述方法包括a)人胰腺祖細(xì)胞群接觸冷凍保存溶液，從而保存用于冷凍保存的細(xì)胞體外群；和b)降低所述用于冷凍保存的祖細(xì)胞的溫度至低于約0°C，從而獲得適于移植的胰腺祖細(xì)胞群。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述用于冷凍保存的祖細(xì)胞的溫度降低至低于約-50 0C ο
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述用于冷凍保存的祖細(xì)胞的溫度降低至低于約-100°C。
30.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述用于冷凍保存的祖細(xì)胞的溫度降低至低于約-150°C。
31.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述用于冷凍保存的祖細(xì)胞的溫度降低至低于約-190"C。
32.一種提供適于移植的細(xì)胞的體外群的方法，所述方法包括提高冷凍保存的細(xì)胞群的溫度，以獲得適于移植的胰腺祖細(xì)胞群。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其進(jìn)一步包括將所述細(xì)胞群提供給細(xì)胞包封組件的步馬聚ο
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述細(xì)胞包封組件為如權(quán)利要求16所述的組件。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在生物相容性半滲透包封裝置中包封胰腺祖細(xì)胞的方法。本發(fā)明還涉及在哺乳動(dòng)物中響應(yīng)葡萄糖刺激生成人胰島素。
文檔編號(hào)C12N11/00GK102282254SQ200980154622
公開(kāi)日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2009年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月14日
發(fā)明者喬德·格林, 伊曼紐爾·E·拜特格, 依文特·克魯恩, 凱文·德阿穆?tīng)? 勞拉·馬丁森, 奧利維亞·凱利, 艾倫·奧古爾尼克 申請(qǐng)人:維賽特公司