專利名稱：用于制備人重組胰島素的方法
用于制備人重組胰島素的方法本發(fā)明涉及生物技術(shù)學(xué)、基因工程和醫(yī)學(xué)并且可被用于藥物生產(chǎn)，特別是用于制造治療糖尿病的藥物。胰島素是由通過3個(gè)二硫鍵(1個(gè)鏈間鍵(A6-A11)和2個(gè)鏈內(nèi)鍵(A7-B7和A2tl-B19)) 連接的21個(gè)殘基的酸性A鏈和30個(gè)氨基酸的堿性B鏈[1]組成的蛋白質(zhì)激素。雖然可成功地在體外重組胰島素的分開的A鏈和B鏈[2]，但在體內(nèi)通常合成單鏈多肽(前胰島素原)。其含有B鏈N末端處的信號(hào)肽和A鏈與B鏈之間的C肽。在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中切割N末端信號(hào)序列后，所產(chǎn)生的多肽折疊并且作為胰島素原被包裝到分泌顆粒中[3]。由一組特定的蛋白酶進(jìn)一步加工后，胰島素原然后被轉(zhuǎn)化為胰島素并且被分泌到血流中以調(diào)節(jié)糖水平。在商業(yè)上，已通過轉(zhuǎn)肽作用產(chǎn)生了人胰島素，其中用蘇氨酸替代了豬胰島素的B 鏈第30個(gè)位置處的丙氨酸殘基[4]。由于從豬胰島素產(chǎn)生人胰島素受到其高成本的限制， 最近的研究已主要集中在通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)人胰島素的方法。已利用了 3個(gè)主要的方法使用微生物進(jìn)行胰島素的生產(chǎn)。其中兩個(gè)方法涉及大腸桿菌(Escherichia coli)，其中胰島素前體作為更大的融合蛋白的一部分被表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中(主要以包涵體的形式)，或者被分泌到周質(zhì)空間中[5]。第三種方法利用酵母，并且胰島素前體被分泌到周圍的培養(yǎng)基中[6]或形成不溶性包涵體[7]。通過基因工程方式制備人胰島素的方法包括下列步驟在大腸桿菌中以融合蛋白的形式產(chǎn)生胰島素原，將融合蛋白重折疊以形成正確的二硫鍵；用胰蛋白酶和羧肽酶B處理重折疊的多肽；純化生成物以獲得胰島素。該方法的變型也利用了融合蛋白的磺化作用和溴化氰切割來獲得作為胰島素生產(chǎn)的中間產(chǎn)物的胰島素原[8]。此外，基因操作使得能夠產(chǎn)生在重組蛋白的胰島素原和/或C肽部分中具有不同氨基酸含量的的融合蛋白。這些操作被引向增加正確折疊的胰島素原(前胰島素原)的產(chǎn)率。然而，具有正確二硫鍵的重折疊的胰島素原的產(chǎn)率隨著重折疊緩沖液中胰島素原的濃度增加而降低。這是由于錯(cuò)折疊和一定程度的聚合。因此，重折疊是胰島素生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵步驟。此外，在胰島素生產(chǎn)的隨后步驟中胰島素的純化是非常費(fèi)力的并且通常是高成本的。總之，開發(fā)人胰島素生產(chǎn)的新方法不僅有益于終產(chǎn)品的質(zhì)量而且還節(jié)約資源并為消費(fèi)者降低產(chǎn)品價(jià)格。重組人胰島素生產(chǎn)的公開方法包括包含編碼胰島素原的重組DNA的質(zhì)粒構(gòu)建 [9]、產(chǎn)生雜合多肽的大腸桿菌菌株的開發(fā)和培養(yǎng)、細(xì)胞的分離和破碎、雜合多肽的回收和酶促切割，繼而分離所需的產(chǎn)物。然而，該方法只利用大腸桿菌菌株BL21/pIK8-胰島素原，其攜帶單一的質(zhì)粒DNA PIK8-胰島素原，因而限制許多宿主/表達(dá)載體組合。此外，該方法包括在酶促切割之前用檸康酐處理雜合多肽，這加入了額外的純化步驟并且降低了所需產(chǎn)物的產(chǎn)率。本發(fā)明的目標(biāo)在于開發(fā)重組人胰島素生產(chǎn)的方法，該方法保證增加雜合多肽的產(chǎn)率和制造具有高質(zhì)量的所需產(chǎn)品。該方法的主要結(jié)果是由于某些制造步驟的簡(jiǎn)化和消除、終產(chǎn)物產(chǎn)率的數(shù)量增加和改善的終產(chǎn)物質(zhì)量而改進(jìn)技術(shù)的有效性。所有這些益處均歸因于表達(dá)載體數(shù)量的增加、前肽氨基酸序列的優(yōu)化、重折疊方法的優(yōu)化和細(xì)胞破碎、包涵體洗滌、蛋白質(zhì)回收及純化方法的精進(jìn)。所聲明的一系列特征與所達(dá)到的技術(shù)效果之間存在密切的因果關(guān)系。本發(fā)明涉及用于通過培養(yǎng)用編碼重組人胰島素多肽的DNA序列轉(zhuǎn)化的原核宿主而產(chǎn)生重組人胰島素的改進(jìn)的方法。在大腸桿菌中合成了包含連接于胰島素原的前導(dǎo)序列的重組雜合多肽。通過用胰蛋白酶和羧肽酶B處理正確折疊的雜合多肽，以及隨后的純化來產(chǎn)生人胰島素。根據(jù)本發(fā)明，可以以良好的重現(xiàn)性制造人重組胰島素，而蛋白質(zhì)回收和純化步驟被顯著改善了。新的質(zhì)粒DNA構(gòu)建體的開發(fā)使我們能夠擴(kuò)大所使用的微生物菌株的種類并優(yōu)化前肽的氨基酸組成。本方法中所提出的介由利用快速流動(dòng)高容量樹脂的吸附層析而濃縮雜合多肽的有效技術(shù)允許我們顯著提高該方法的生產(chǎn)率。此外，所提出的方法不存在在酶促切割之前利用檸康酐步驟封閉氨基。為了使脫蘇氨酸的形成最小化，在高PH值時(shí)進(jìn)行胰蛋白酶解，因而增加終產(chǎn)物的產(chǎn)率并且省略與 citraconilation相關(guān)聯(lián)的額外純化步驟。此外，優(yōu)化了胰島素純化的方法。其包括離子交換層析和反相高效液相色譜，這允許產(chǎn)生98-99 %的純度的胰島素。因此，在付之以開發(fā)新的表達(dá)載體、改進(jìn)細(xì)胞破碎和包涵體洗滌方法、優(yōu)化重折疊和利用吸附層析進(jìn)行蛋白質(zhì)濃縮、不使用citraconilation以及在高pH值下進(jìn)行胰蛋白酶解以使脫蘇氨酸的形成最小化后，解決了被擱置的問題。除了所報(bào)導(dǎo)的之前的質(zhì)粒DNA(ρΙΚ8-胰島素原)外，本發(fā)明呈現(xiàn)了具有一些益處的新質(zhì)粒-縮短的C肽(質(zhì)粒pMUT12、pISYN2、pCIM61、pDIM07)。作為該修飾的結(jié)果，終產(chǎn)物的產(chǎn)率增加了。胰島素在PIK8-胰島素原表達(dá)載體中產(chǎn)生47 %的雜合多肽，當(dāng)使用pMUT12 或pISYN2質(zhì)粒時(shí)產(chǎn)生68%的雜合多肽，在使用pCIM61或pDIM07質(zhì)粒的情況下產(chǎn)生82% 的雜合多肽。-編碼由前肽序列的差異而不同的雜合多肽的新質(zhì)粒。經(jīng)驗(yàn)性地選擇前肽的氨基酸組成來改變雜合多肽的電荷(和適當(dāng)時(shí)等電點(diǎn))，因而允許使用不同的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)純化?？紤]了大腸桿菌密碼子的使用頻率而化學(xué)合成編碼雜合多肽的DNA(pISYN2質(zhì)粒)，與包含具有原始密碼子的人胰島素原cDNA的相似表達(dá)載體相比，這使雜合多肽的產(chǎn)率增加40%。本發(fā)明利用非常有效的高壓細(xì)胞破碎技術(shù)(細(xì)胞破碎效率超過99% )，而當(dāng)使用公知的超聲處理方法時(shí)細(xì)胞破碎的效率為40至50%左右。此外，該方法是節(jié)約成本的、高產(chǎn)的并且產(chǎn)生質(zhì)量更好的終產(chǎn)物(包涵體)。此外，用于重折疊的雜合多肽的制備不包括亞硫酸分解步驟(該步驟通常降低終產(chǎn)物的產(chǎn)率并且增加生產(chǎn)成本)。所提出的還原的多肽的直接重折疊方法被大大簡(jiǎn)化并且其使得可能以0. 5-1. Omg/ml的蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行重折疊，而磺化多肽的還原需要低于 0. lmg/ml的多肽濃度。這樣，蛋白質(zhì)復(fù)性所需的重折疊緩沖液的體積大大減小了。
通過下列附圖進(jìn)一步闡釋本發(fā)明

圖1是質(zhì)粒DNA pIK8-胰島素原的示意圖，顯示了胰島素前體的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。圖2是質(zhì)粒DNA pMUT12的示意圖，顯示了胰島素前體的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。圖3是質(zhì)粒DNA pISYN2的示意圖，顯示了胰島素前體的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。圖4是質(zhì)粒DNA pCIM61的示意圖，顯示了胰島素前體的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。圖5是質(zhì)粒DNA pDIM07的示意圖，顯示了胰島素前體的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。圖6描繪了人胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明基于克隆編碼人胰島素前體的重組DNA，所述人胰島素前體作為包涵體在大腸桿菌宿主細(xì)胞中被表達(dá)，隨后回收重組多肽并且在允許半胱氨酸殘基之間形成正確的二硫鍵的條件下復(fù)性。進(jìn)一步酶促切割和純化重組多肽。用于產(chǎn)生雜合多肽的方法包括下列步驟a)用編碼在重組多肽的內(nèi)部具有胰蛋白酶切割位點(diǎn)的人胰島素前體的重組DNA 轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株；b)在允許重組DNA表達(dá)和包涵體產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；c)細(xì)胞破碎和回收所表達(dá)的多肽；d)在變性劑和還原劑存在的情況下溶解重組多肽，然后使其重折疊；e)利用胰蛋白酶和羧肽酶B酶促切割雜合多肽以產(chǎn)生胰島素；f)胰島素的分離和純化。本發(fā)明的主要目的是在根據(jù)本發(fā)明介由構(gòu)建編碼胰島素原的重組質(zhì)粒DNA，產(chǎn)生和培養(yǎng)產(chǎn)生雜合多肽的大腸桿菌菌株，分離和破碎細(xì)胞以及分離多肽，對(duì)其進(jìn)行酶促轉(zhuǎn)化，然后純化和分離所需的產(chǎn)物而產(chǎn)生重組人胰島素的方法中，編碼包含人胰島素原的氨基酸序列的雜合多肽的重組質(zhì)粒DNA片段為表達(dá)載體pIK8-胰島素原、或pMUT12、或 PISYN2、或pCIM61、或pDIM07的一部分或與前述DNA插入物之一雜交并且在表達(dá)時(shí)編碼人胰島素原前體，從而編碼包含人胰島素原序列的雜合多肽并且作為PIK8-胰島素原質(zhì)粒的一部分的重組質(zhì)粒DNA片段包含下列序列1......... ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCA
T1..........Μ. . G. . S. . S. . H. . H. . H. . H. . H. . H. . S. . S. . G. . L. . V. . P. . R. . G. . S..H. 61........ATGCGCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGT
G21.........Μ. . R. . F. . V. . N. . Q. . H. . L. . C. . G. . S. . H. . L. . V. . Ε. . A. . L. . Y. . L..V..121....... TGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAGTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCT .V. . G. . 0. . V. . R. . I,. . G. . G. . G. . P. . G. . Α. . G. . S. . I,. . 0. . P. . I,. . Α..L..241....... GAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCT
C「00441 41.
C. . G. . R. . R. . G. . F. . F. . Y. . Τ. . P. . K. . Τ. . R. . R. . R. . Α. . R. . D. . I,81.........Ε. . G. . S. . L. . Q. . K. . R. . G. . I. . V. . Ε. . Q. . C. . C. . Τ. . S. . I. . C. . S..L..301.......TACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAG101........Y. . Q. . L. . Ε. . N. . Y. . C. . N..女· ·編碼包含人胰島素原序列的雜合多肽并且作為pMUT12質(zhì)粒的一部分的重組質(zhì)粒 DNA片段包含下列序列1......... ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCA
T1..........Μ. . G. . S. . S. . H. . H. . H. . H. . H. . H. . S. . S. . G. . L. . V. . P. . R. . G. . S..H.61........ATGCGCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGT
G21.........Μ. . R. . F. . V. . N. . Q. . H. . L. . C. . G. . S. . H. . L. . V. . Ε. . A. . L. . Y. . L..V..121....... TGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCAAGCGTGGCATTGTGGAACAATG
C41.........C. . G. . Ε. . R. . G. . F. . F. . Y. . Τ. . P. . K. . Τ. . K. . R. . G. . I. . V. . Ε. . Q..C..181....... TGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAG61.........C. . Τ. . S. . I. . C. . S. . L. . Y. . Q. . L. . Ε. . N. . Y. . C. . N..女編碼包含人胰島素原序列的雜合多肽并且作為pISYN2質(zhì)粒的一部分的重組質(zhì)粒 DNA片段包含下列序列 1.........ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCA
T1..........Μ. . G. . S. . S. . H. . H. . H. . H. . H. . H. . S. . S. . G. . L. . V. . P. . R. . G. . S..H.61........ATGCGCTTTGTGAACCAGCATCTGTGTGGCAGCCACCTGGTGGAAGCGCTGTATTTAGT
G21.........Μ. . R. . F. . V. . N. . Q. . H. . L. . C. . G. . S. . H. . L. . V. . Ε. . A. . L. . Y. . L..
121....... TGCGGCGAGCGTGGCTTCTTTTATACCCCGAAAACCAAACGTGGCATTGTGGAACAGTG
T41.........C. . G. . E. . R. . G. . F. . F. . Y. . T. . P. . K. . T. . K. . R. . G. . I. . V. . E. . Q..C..181.......TGCACCAGTATTTGTAGCCTGTATCAGCTGGAAAATTACTGCAACTAA61.........C. . T. . S. . I. . C. . S. . L. . Y. . Q. . L. . E. . N. . Y. . C. . N..女編碼包含人胰島素原序列的雜合多肽并且作為pCIM61質(zhì)粒的一部分的重組質(zhì)粒 DNA片段包含下列序列1......... ATGCGAAAGAAGCGGAAGAAGAAGCGTTTTGTGAACCAGCATCTGTGTGGCAGCCACCT
G1..........M. . R. . K. . K. . R. . K. . K. . K. . R. . F. . V. . N. . Q. . H. . L. . C. . G. . S. . H..L.61........GTGGAAGCGCTGTATTTAGTGTGCGGCGAGCGTGGCTTCTTTTATACCCCGAAAACCAA
A21.........V. . E. . A. . L. . Y. . L. . V. . C. . G. . E. . R. . G. . F. . F. . Y. . T. . P. . K. . T..K..121....... CGTGGCATTGTGGAACAGTGTTGCACCAGTATTTGTAGCCTGTATCAGCTGGAAAATTA
C41.........R. . G. . I. . V. . E. . Q. . C. . C. . T. . S. . I. . C. . S. . L. . Y. . Q. . L. . E. . N..Y..181.......TGCAACTAA61.........C. . N..女· ·編碼包含人胰島素原序列的雜合多肽并且作為pDIM07質(zhì)粒的一部分的重組質(zhì)粒 DNA片段包含下列序列1......... ATGGATGAAGACGAGGATGAAGCACGCTTTGTGAACCAGCATCTGTGTGGCAGCCACCT
G1..........M. . D. . E. . D. . E. . D. . E. . A. . R. . F. . V. . N. . Q. . H. . L. . C. . G. . S. . H..L. 61........GTGGAAGCGCTGTATTTAGTGTGCGGCGAGCGTGGCTTCTTTTATACCCCGAAAACCAA
A21.........V. . E. . A. . L. . Y. . L. . V. . C. . G. . E. . R. . G. . F. . F. . Y. . T. . P. . K. . T..K..121....... CGTGGCATTGTGGAACAGTGTTGCACCAGTATTTGTAGCCTGTATCAGCTGGAAAATTA
C41.........R. . G. . I. . V. . E. . Q. . C. . C. . T. . S. . I. . C. . S. . L. . Y. . Q. . L. . E. . N..Y..181.......TGCAACTAA61.........C. . N..女· ·大腸桿菌菌株的開發(fā)利用包含編碼一種或數(shù)種重組多肽的核苷酸序列的表達(dá)載體，此處所述編碼一種或數(shù)種重組多肽的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄被置于可誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)的控制之下，然后進(jìn)行對(duì)經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株的培養(yǎng)，隨后誘導(dǎo)表達(dá)以允許重組多肽在宿主細(xì)胞中合成，并回收所產(chǎn)生的重組多肽。通過破碎細(xì)菌細(xì)胞或其片段的細(xì)胞壁，將細(xì)胞內(nèi)沉淀物與裂解物分開，用非離子性去污劑洗滌細(xì)胞內(nèi)沉淀物來進(jìn)行包涵體回收，其進(jìn)一步轉(zhuǎn)化包括將沉淀物溶解在含有變性劑的緩沖液中，用還原劑處理雜合多肽，使雜合多肽重折疊以及介由吸附層析或超濾濃縮雜合多肽。通過用胰蛋白酶和羧肽酶B同時(shí)處理或通過用這兩種酶分開處理進(jìn)行胰島素前體的蛋白水解轉(zhuǎn)化，優(yōu)選使用離子交換層析和/或高效液相色譜純化所得產(chǎn)物。如進(jìn)一步所描述的進(jìn)行所述方法。在本發(fā)明中可利用各種允許人胰島素的最佳生產(chǎn)的宿主/表達(dá)載體組合。例如， 有用的表達(dá)載體可由下述組成啟動(dòng)子、翻譯起始信號(hào)、人胰島素原cDNA(具有或不具有引入到C肽序列中的修飾)以及通過胰蛋白酶切割位點(diǎn)與胰島素原分隔的任選的前肽。本發(fā)明的優(yōu)選重組DNA分子是含有如上所述的DNA插入物的質(zhì)粒。本發(fā)明的優(yōu)選質(zhì)粒包括 PIK8-胰島素原、pMUT 12, piSYN2及其衍生物。本發(fā)明中還包括的是制造重組DNA分子的方法。該方法包括提供相應(yīng)于為胰島素的多肽的全部、部分、類似物、同源物或前體的DNA插入物和將該DNA插入物引入克隆載體中。優(yōu)選地，將所述DNA序列與表達(dá)控制序列一起以正確的閱讀框引入克隆載體中。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，用至少一種能夠表達(dá)人胰島素的全部、部分或前體或具有與胰島素相似的免疫原性或生物活性的多肽的重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。有用的表達(dá)宿主包括公知的原核宿主例如大腸桿菌的菌株，包括但不限于下列菌株大腸桿菌HB101、大腸桿菌X1776、大腸桿菌X2^2、大腸桿菌DH5a、大腸桿菌JM103、大腸桿菌BL21。通常將細(xì)菌宿主細(xì)胞培養(yǎng)在液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中以在適合于宿主細(xì)胞和表達(dá)載體的條件下產(chǎn)生胰島素前體多肽。優(yōu)選地，將宿主細(xì)胞培養(yǎng)在細(xì)菌發(fā)酵罐中以使生產(chǎn)最大化， 但任何方便的培養(yǎng)方法都是可接受的(例如，搖瓶，特別是對(duì)于體積小于1升的培養(yǎng)物)。 確切的生長(zhǎng)條件、培養(yǎng)基補(bǔ)充的時(shí)間安排和速率、培養(yǎng)基PH、溫度和溶解氧水平以及誘導(dǎo)劑的添加(適當(dāng)時(shí))根據(jù)宿主細(xì)胞和表達(dá)構(gòu)建體的特性而變化。在將細(xì)菌宿主細(xì)胞培養(yǎng)至所需的密度并完成了任何表達(dá)必需的誘導(dǎo)后，收集細(xì)胞。通常通過離心生長(zhǎng)培養(yǎng)基來進(jìn)行收集，雖然可使用任何其他方便的技術(shù)如超濾。此時(shí)， 可根據(jù)本發(fā)明立即處理所收集的細(xì)菌宿主細(xì)胞，或可將其冷凍用于日后處理。然后裂解細(xì)胞漿的細(xì)胞以釋放包含胰島素前體多肽的包涵體。使用約0. OlM至 2M的量級(jí)的離子強(qiáng)度，將細(xì)胞懸浮在約pH 6.0至9.0的緩沖液中。任何適當(dāng)?shù)柠}(包括 NaCl)可被用于維持適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度水平。優(yōu)選地，在下列條件下裂解細(xì)胞其中充分破碎細(xì)胞碎片使得其在低速離心下不出現(xiàn)在沉淀物中。通過常用技術(shù)例如機(jī)械方法(例如冷凍/解凍循環(huán)、使用微射流均質(zhì)機(jī)、弗氏壓碎器或超聲振蕩器)或利用酶促方法(例如用溶菌酶處理)來裂解細(xì)胞。通常推薦在降低的溫度(即，低于約20°C)的條件下進(jìn)行細(xì)胞裂解。
使用任何方便的技術(shù)(例如離心)從裂解的細(xì)胞漿中收集包涵體，如果需要，然后進(jìn)行洗滌。通常通過將包涵體重懸在加入了去污劑(例如Triton X-100)的緩沖液中來洗滌包涵體，然后重新收集所述包涵體。隨后將經(jīng)洗滌的包涵體溶解在溶解緩沖液中，該緩沖液包含高濃度的離液劑(例如尿素或鹽酸胍)、還原劑和任選的PH。尿素在溶解緩沖液中的濃度為6M至8M，優(yōu)選7M并且鹽酸胍濃度為5至7M，優(yōu)選 6M。溶解緩沖液的PH范圍為7. 5至11.0，優(yōu)選8. 5至9.0。可使用任何pH緩沖劑(例如Tris、HEPES、MOPS、三(羥甲基)甲基甘氨酸等)。以提供有效pH緩沖的濃度(例如10 至約IOOmM,優(yōu)選20mM)將pH緩沖劑加入溶解緩沖液中。所述溶解緩沖液中包括還原劑以還原二硫鍵并且以其還原形式維持半胱氨酸殘基。有用的還原劑包括β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇等。β-巰基乙醇的任選濃度為20至 200mM，優(yōu)選 100 至 150mM。所述溶解緩沖液任選地包含另外的組分例如陽(yáng)離子螯合劑如EDTA。將EDTA以約 0. 5至約5mM的濃度，優(yōu)選以ImM至約2mM的濃度加入到溶解緩沖液中。此外，可加入甘氨酸(或其他氨基酸)以減少或消除自由基介導(dǎo)的蛋白質(zhì)損害。甘氨酸的濃度范圍為5至 IOOmM,優(yōu)選 10 至 20mM。通常在約6小時(shí)至約M小時(shí)，優(yōu)選約8小時(shí)的時(shí)期內(nèi)進(jìn)行包涵體的溶解。可在環(huán)境溫度或降低的溫度下(通常在約4°C至約M°C，優(yōu)選在約20°C下)進(jìn)行溶解。在包涵體溶解完成后，澄清經(jīng)還原的多肽溶液以除去不溶性碎片。可通過使用高速離心來進(jìn)行澄清。然后用重折疊緩沖液迅速稀釋還原的胰島素原前體。通過將包涵體溶液加入重折疊緩沖液中或通過將重折疊緩沖液和包涵體溶液同時(shí)遞送入重折疊容器中來進(jìn)行稀釋?？捎弥卣郫B緩沖液將包涵體溶液稀釋約10至約200倍，最優(yōu)選100倍。稀釋后最終的蛋白質(zhì)濃度可以為約0. 01mg/ml至約5mg/ml，優(yōu)選約lmg/ml。重折疊緩沖液通常包含pH緩沖劑、二硫化物改組氧化還原系統(tǒng)、二價(jià)陽(yáng)離子螯合劑、自由基清除劑和一些其他低分子量添加劑。在約4°C至約的溫度，優(yōu)選在約10°C下進(jìn)行重折疊過程。孵育時(shí)間通常為約2小時(shí)至約20小時(shí)，優(yōu)選約6小時(shí)。重折疊緩沖液的主要組分包括濃度為約ImM至IOOmM,優(yōu)選IOmM的甘氨酸；濃度為約0. 5mM至20mM的胱氨酸；約0. ImM至5mM的EDTA ；約至20%的甘油。在重折疊反應(yīng)后，可濃縮經(jīng)恰當(dāng)重折疊的胰島素前體，將其進(jìn)一步純化，并且可對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白水解處理(例如，利用胰蛋白酶和羧肽酶B)以產(chǎn)生成熟的胰島素?？墒褂萌魏畏奖愕募夹g(shù)(例如超濾或?qū)游?例如，離子交換層析、疏水相互作用層析或親和層析) 等)實(shí)現(xiàn)重折疊的蛋白質(zhì)的濃縮。如果需要，濃縮步驟還可包括緩沖液交換過程。優(yōu)選在降低的溫度(例如，約4至10°C )下進(jìn)行濃縮。通過用胰蛋白酶和羧肽酶B同時(shí)處理或通過用這兩種酶分開處理來進(jìn)行胰島素前體的蛋白水解轉(zhuǎn)化。以1 200至約1 20，000(酶底物，重量重量)的比率使用胰蛋白酶，而以1 100至約1 5，000的比率使用羧肽酶B。在具有pH 7. 5至約11.0，優(yōu)選pH 10. 5的緩沖液中進(jìn)行蛋白水解轉(zhuǎn)化；Ca2+、Zn2\ Mn2+、Mg2+的添加可有利于所述反應(yīng)。 孵育溫度的范圍為0°C至約30°C，優(yōu)選為約60C，孵育時(shí)間為1至M小時(shí)，優(yōu)選約14小時(shí)。在蛋白水解轉(zhuǎn)化后，純化具有生物活性的胰島素。
下列實(shí)施例闡釋了本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于闡釋的目的而不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1.質(zhì)粒DIK8-胰島素原的構(gòu)建使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)以及引物Pl和P2從人胰腺單鏈cDNA擴(kuò)增人胰島素cDNA 引物Pl (正向引物)5，-GC ICATATGI CGATTTGTGAACCAACACCTGTG-3，引物P2(反向引物)5 ’ -TG |GAATTC| CTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGC-3 ’引物Pl被設(shè)計(jì)為編碼始于人前胰島素原的Arf2的人胰島素B鏈片段和用于克隆目的的NdeI位點(diǎn)(加框的)。反向引物(P2)與胰島素A鏈的氨基端及用于克隆目的EcoRI 位點(diǎn)(加框的)互補(bǔ)。PCR反應(yīng)包含各25pmole的寡聚引物、IXPCR緩沖液、各200 μ M濃度的4種核苷酸(dA、dC、dG和dT)、2ng單鏈cDNA、5. 0單位的Taq聚合酶。PCR反應(yīng)的條件為95°C下進(jìn)行3分鐘，35個(gè)循環(huán)(95°C下進(jìn)行1分鐘；65 °C下進(jìn)行30秒；72 °C下進(jìn)行30 秒)，然后在72°C下進(jìn)行5分鐘。凝膠純化約^Obp的PCR產(chǎn)物，將其克隆到pTA克隆載體中。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH5 α中，并且在含有氨芐青霉素的LB板上選擇轉(zhuǎn)化體。將數(shù)個(gè)菌落在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，使用Wizard小量制備DNA分離試劑盒分離質(zhì)粒DNA。克隆IK8被測(cè)定具有正確的DNA序列。為了在大腸桿菌中表達(dá)，用NdeI和EcoRI消化從克隆IK8分離的質(zhì)粒DNA，凝膠純化約270bp的片段，將其克隆到已用相同的酶降解、并且經(jīng)牛小腸堿性磷酸酶處理的質(zhì)粒 pET28a中。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中，并在LB卡那霉素板上選擇轉(zhuǎn)化體。從數(shù)個(gè)轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA，并且通過用NdeI和EcoRI消化來進(jìn)行篩選。鑒定出正確的克隆， 將其命名為ρΙΚ8-胰島素原。將該質(zhì)粒進(jìn)一步轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株如JM109或BL21中。實(shí)施例2.質(zhì)粒PMUT12的構(gòu)建在使用PCR和下列引物進(jìn)行的定點(diǎn)誘變中將質(zhì)粒DNA ρΙΚ8_胰島素原用作模板Ml :5，-CTTCTACACACCCAAGACCAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTG-3，Μ2 :5’ -CAGCATTGTTCCACAATGCCACGCTTGGTCTTGGGTGTGTAGAAG-3，在于96°C變性3分鐘后，使用5U rTth DNA聚合酶進(jìn)行30個(gè)PCR循環(huán)。PCR條件如下94°C，30秒；59°C，30秒；72°C，6分鐘以及在72°C下最終延伸10分鐘。利用Zymoclean PCR純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，并且用IOU的DpnI進(jìn)行降解-以除去原始模板。在進(jìn)行另一輪柱純化后，將2mkl的等分轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH5 α中，并在含有卡那霉素的LB板上選擇轉(zhuǎn)化體。將數(shù)個(gè)克隆在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，并且使用Wizard小量制備DNA分離試劑盒分離質(zhì)粒DNA?？寺UT12被測(cè)定具有正確的DNA序列。為了在大腸桿菌中表達(dá)，將該質(zhì)粒進(jìn)一步轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株如JM109或BL21中。實(shí)施例3質(zhì)粒pISYN2的構(gòu)建
為了構(gòu)建PCSYN61，我們首先利用報(bào)導(dǎo)的人胰島素氨基酸序列[10]合成了 5個(gè)寡脫氧核苷酸。在這些合成中，我們考慮了大腸桿菌的高度表達(dá)基因中的密碼子使用[11]和大腸桿菌tRNA的豐度[12]。我們還在沿著我們的寡核苷酸序列的各種位置處包括了用于克隆目的的內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)。引物序列Sl :5，-CATATGCGCTTTGTGAACCAG-3，S2 5 ’-AAGCCACGCTCGCCGCACACTAAATACAGCGCTTCCACCAGGTGGCTGCCACACAGATGCTGG TTCACAAAGCGCATATG-3’S3 5 ’-CGGCGAGCGTGGCTTCTTTTATACCCCGAAAACCAAACGTGGCATTGTGGAACAGTGTTGCAC CAGTATTTGTAGCCTGT-3'S4 5 ’-CAGGCGTGAATTCTTAGTTGCAGTAATTTTCCAGCTGATACAGGCTACAAATACTGGTGC-3’S5 :5， -CAGGCGTGAATTCTTAGTTGC-3，將PCR緩沖液中的引物Sl、S2、S3、S4 (各自終濃度2mkm)與5U的rTth聚合酶的混合物加熱至94°C 1分鐘，冷卻至62°C，在72°C下進(jìn)行反應(yīng)2分鐘以填充缺口。在下列條件下進(jìn)行接下去的20個(gè)擴(kuò)增循環(huán)94°C，15秒；62°C，30秒；72°C，30秒。在Sl和S5引物存在的情況下，將2mkl的上述反應(yīng)混合物用作模板來擴(kuò)增胰島素原cDNA。凝膠純化約ISObp 的PCR產(chǎn)物，將其克隆到pTA-克隆載體中?？寺S2被測(cè)定具有正確的DNA序列。為了在大腸桿菌中表達(dá)，用NdeI和EcoRI消化從克隆IS2分離的質(zhì)粒DNA，凝膠純化約170bp的片段，將其克隆到已用相同的酶消化、并且經(jīng)牛小腸堿性磷酸酶處理的質(zhì)粒 pET28a中。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中，并且在LB卡那霉素板上選擇轉(zhuǎn)化體。 從數(shù)個(gè)轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并且通過用NdeI和EcoRI消化來進(jìn)行篩選。鑒別出正確的克隆，將其命名為PISYN2。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株如JM109或BL21中。實(shí)施例4質(zhì)粒pCIM61的構(gòu)建將質(zhì)粒DNA pMUT12用作模板來擴(kuò)增具有經(jīng)修飾的前肽的人胰島素原cDNAmini。 利用下列引物在對(duì)于實(shí)施例1所描述的條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)引物C(正向)5’ -GCCATATGCGAAAGAAGCGGAAGAAGAAGCGTTTTGTGAACACCTGTG-3’引物IL4(反向)5’ -CCGCAAGCTTTTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTGG-3’凝膠純化約210bp的PCR產(chǎn)物，將其克隆到pTA克隆載體中。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH5ci中，并且在含有氨芐青霉素的LB板上選擇轉(zhuǎn)化體。克隆CIM6被測(cè)定具有正確的DNA序列。為了在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，用NdeI和HindIII消化從克隆CIM6分離的質(zhì)粒 DNA，凝膠純化約200bp的片段，將其克隆到已用相同的酶降解的質(zhì)粒pET39a中。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中，并且在LB卡那霉素板上選擇轉(zhuǎn)化體。從數(shù)個(gè)轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過用NdeI和HindIII消化來進(jìn)行篩選。鑒別出正確的克隆，將其命名為 PCIM61。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株如JM109或BL21中。實(shí)施例5
質(zhì)粒DDIM07的構(gòu)建將質(zhì)粒DNA pMUT12用作模板來擴(kuò)增具有經(jīng)修飾的前肽的人胰島素原cDNAmini。 利用下列引物在對(duì)于實(shí)施例1所描述的條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)引物D (正向)5 ’ -TACCATGGATGAAGACGAGGATGAAGCACGCTTTGTGAACCAACACCTGTG-3’引物IL4(反向)5’ -CCGCAAGCTTTTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTGG-3’凝膠純化約210bp的PCR產(chǎn)物，將其克隆到pTA克隆載體中。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH5ci中，并且在含有氨芐青霉素的LB板上選擇轉(zhuǎn)化體?？寺IMl被確定具有正確的DNA序列。為了在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，用NcoI和HindIII消化從克隆DIMl中分離的質(zhì)粒 DNA，凝膠純化約200bp的片段，將其克隆到已用相同的酶降解的質(zhì)粒pET28a中。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中，并且在LB卡那霉素板上選擇轉(zhuǎn)化體。從數(shù)個(gè)轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并且通過用NcoI和HindIII消化來進(jìn)行篩選。鑒別出正確的克隆，將其命名為 PDIM07。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株如JM109或BL21中。實(shí)施例6胰島素前體蛋白的表汰按照與上述相同的方法將經(jīng)確認(rèn)包含編碼胰島素前體的DNA片段的質(zhì)粒 (ΡΙΚ8-胰島素原、pMUT12、pCIM61、pISYN2、pDIM07等)用于轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主細(xì)胞大腸桿菌 BL21 (DE3)，選擇抗卡那霉素的菌落。將用質(zhì)粒pIK8-胰島素原、pISYN2和pCIM61轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21 (DE3)細(xì)胞在用于專利程序目的的關(guān)于微生物保藏的國(guó)際認(rèn)可的布達(dá)佩斯條約的條款下適當(dāng)?shù)匾?MB B-7169、IMB B-7230和1MB B-7251的登錄號(hào)保藏在烏克蘭微生物中心(Ukrainian Center of Microorganisms)以及適當(dāng)?shù)匾訡CM 7511 (保藏日期2008年 1月30日)、CCM 7568(保藏日期2008年8月28日)和CCM 7567(保藏日期2008年8月 28日)的登錄號(hào)保藏在捷克微生物保藏中心(Czech Collection of Microorganisms)。將上述所選擇的菌落接種在Iml LB培養(yǎng)基中(每升IOg細(xì)菌用胰蛋白胨、5g細(xì)菌用酵母提取物和IOg NaCl)，然后在37°C下培養(yǎng)超過12小時(shí)。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至50ml含有 30 μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，并且當(dāng)培養(yǎng)物的0D_為0. 5至0. 8時(shí)，向培養(yǎng)物中加入 IPTG(異丙基-β -D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至ImM的終濃度。伴隨200rpm的振蕩于37°C 繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，以4，OOOrpm離心15分鐘以獲得大腸桿菌細(xì)胞沉淀。通過在95°C下于蛋白質(zhì)加樣緩沖液中加熱5分鐘來裂解細(xì)胞，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法[13]通過SDS凝膠電泳來分析裂解物。實(shí)施例7發(fā)酵和生長(zhǎng)條件1.工作庫(kù)將具有任一上述質(zhì)粒的大腸桿菌菌株BL21的單個(gè)菌落培養(yǎng)在LB培養(yǎng)基(10g/L 細(xì)菌用胰蛋白胨、5g/L酵母提取物和5g/L NaCl)或補(bǔ)充有適當(dāng)抗生素的其類似物中。然后用冷凍培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)物并儲(chǔ)存在-80°C或-170°C。2.接種物
從工作庫(kù)向搖瓶中的無(wú)菌LB培養(yǎng)基接種，所述LB培養(yǎng)基補(bǔ)充有30 μ g/ml的卡那霉素或50yg/ml的氨芐青霉素，在振蕩器上于37°C和約250rpm下孵育15小時(shí)。如果需要，在攪拌通氣發(fā)酵罐中進(jìn)行接種物擴(kuò)增的隨后階段。用5-10%的燒瓶培養(yǎng)物接種無(wú)菌培養(yǎng)基，并在攪拌和通氣的條件下于37°C，pH 6. 9士0. 5下孵育5至8小時(shí)以使溶解氧水平維持在20%的空氣飽和度之上。3.牛產(chǎn)用1-10%的接種培養(yǎng)物接種生產(chǎn)培養(yǎng)基，在37°C下進(jìn)行孵育。設(shè)置攪拌-通氣速率以使溶解氧水平維持在20%的空氣飽和度之上。利用NH4OH將pH維持在6. 9 士 0. 5。將炔丙醇B400用作消泡劑。生產(chǎn)培養(yǎng)基
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)重組人胰島素的方法，所述方法是介由構(gòu)建編碼胰島素原的重組質(zhì)粒DNA，產(chǎn)生和培養(yǎng)產(chǎn)生雜合多肽的大腸桿菌菌株，分離和破碎細(xì)胞以及分離多肽，對(duì)其進(jìn)行酶促轉(zhuǎn)化，然后純化和分離所需的產(chǎn)物，所述方法的特征在于，編碼包含人胰島素原的氨基酸序列的雜合多肽的重組質(zhì)粒DNA片段為表達(dá)載體pIK8-胰島素原、或pMUT12、或pISYN2、或 PCIM61或pDM07的一部分或與前述DNA插入物之一雜交并且在表達(dá)時(shí)編碼人胰島素原前體，從而編碼包含人胰島素原序列的雜合多肽并且作為ΡΙΚ8-胰島素原質(zhì)粒的一部分的重組質(zhì)粒DNA片段具有下列序列.1.........ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCAT.1..........Μ. . G. . S. . S. . H. . H. . H. . H. . H. . H. . S. . S. . G. . L. . V. . P. . R. . G. . S. . H..61........ ATGCGCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTG.21.........Μ. . R. . F. . V. . N. . Q. . H. . L. . C. . G. . S. . H. . L. . V. . Ε. . A. . L. . Y. . L. . V...121....... TGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAG.41.........C. . G. . Ε. . R. . G. . F. . F. . Y. . Τ. . P. . K. . Τ. . R. . R. . Ε. . A. . Ε. . D. . L. . Q...181....... GTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCTG.61.........V. . G. . Q. . V. . Ε. . L. . G. . G. . G. . P. . G. . A. . G. . S. . L. . Q. . P. . L. . A. . L...241....... GAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTC.81.........Ε. . G. . S. . L. . Q. . K. . R. . G. . I. . V. . Ε. . Q. . C. . C. . Τ. . S. . I. . C. . S. . L...301.......TACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAG.101........Y. . Q. . L. . Ε. . N. . Y. . C. . N..女· ·編碼包含人胰島素原序列的雜合多肽并且作為PMUT12質(zhì)粒的一部分的重組質(zhì)粒DNA 片段具有下列序列.1.........ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCAT.1..........Μ. . G. . S. . S. . H. . H. . H. . H. . H. . H. . S. . S. . G. . L. . V. . P. . R. . G. . S. . H..61........ ATGCGCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTG.21.........Μ. . R. . F. . V. . N. . Q. . H. . L. . C. . G. . S. . H. . L. . V. . Ε. . A. . L. . Y. . L. . V...121.......TGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGC.41.........C. . G. . Ε. . R. . G. . F. . F. . Y. . Τ. . P. . K. . Τ. . K. . R. . G. . I. . V. . Ε. . Q. . C...181....... TGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAG.61.........C. . Τ. . S. . Τ. . C. . S. . L. . Y. . Q. . L. . Ε. . N. . Y. . C. . N..女…編碼包含人胰島素原序列的雜合多肽并且作為PISYN2質(zhì)粒的一部分的重組質(zhì)粒DNA 片段具有下列序列.1.........ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCAT.1..........Μ. . G. . S. . S. . H. . H. . H. . H. . H. . H. . S. . S. . G. . L. . V. . P. . R. . G. . S. . H..61........ATGCGCTTTGTGAACCAGCATCTGTGTGGCAGCCACCTGGTGGAAGCGCTGTATTTAGTG.21.........Μ. . R. . F. . V. . N. . Q. . H. . L. . C. . G. . S. . H. . L. . V. . Ε. . A. . L. . Y. . L. . V..121....... TGCGGCGAGCGTGGCTTCTTTTATACCCCGAAAACCAAACGTGGCATTGTGGAACAGTGT.41.........C. . G. . Ε. . R. . G. . F. . F. . Y. . Τ. . P. . K. . Τ. . K. . R. . G. . I. . V. . Ε. . Q. . C...181....... TGCACCAGTATTTGTAGCCTGTATCAGCTGGAAAATTACTGCAACTAA.61.........C. . Τ. . S. . I. . C. . S. . L. . Y. . Q. . L. . Ε. . N. . Y. . C. . N..女編碼包含人胰島素原序列的雜合多肽并且作為PCIM61質(zhì)粒的一部分的重組質(zhì)粒DNA 片段具有下列序列·1......... ATGCGAAAGAAGCGGAAGAAGAAGCGTTTTGTGAACCAGCATCTGTGTGGCAGCCACCTG·1..........M. . R. . K. . K. . R. . K. . K. . K. . R. . F. . V. . N. . Q. . H. . L. . C. . G. . S. . H. . L.·61........GTGGAAGCGCTGTATTTAGTGTGCGGCGAGCGTGGCTTCTTTTATACCCCGAAAACCAAA·21.........V. . E. . A. . L. . Y. . L. . V. . C. . G. . E. . R. . G. . F. . F. . Y. . T. . P. . K. . T. . K..·121.......CGTGGCATTGTGGAACAGTGTTGCACCAGTATTTGTAGCCTGTATCAGCTGGAAAATTAC·41.........R. . G. . I. . V. . E. . Q. . C. . C. . T. . S. . I. . C. . S. . L. . Y. . Q. . L. . E. . N. . Y..·181.......TGCAACTAA·61.........C. . N..女..編碼包含人胰島素原序列的雜合多肽并且作為PDIM07質(zhì)粒的一部分的重組質(zhì)粒DNA 片段具有下列序列·1......... ATGGATGAAGACGAGGATGAAGCACGCTTTGTGAACCAGCATCTGTGTGGCAGCCACCTG·1..........M. . D. . E. . D. . E. . D. . E. . A. . R. . F. . V. . N. . Q. . H. . L. . C. . G. . S. . H. . L.·61........GTGGAAGCGCTGTATTTAGTGTGCGGCGAGCGTGGCTTCTTTTATACCCCGAAAACCAAA·21.........V. . E. . A. . L. . Y. . L. . V. . C. . G. . E. . R. . G. . F. . F. . Y. . T. . P. . K. . T. . K..·121.......CGTGGCATTGTGGAACAGTGTTGCACCAGTATTTGTAGCCTGTATCAGCTGGAAAATTAC·41.........R. . G. . I. . V. . E. . Q. . C. . C. . T. . S. . I. . C. . S. . L. . Y. . Q. . L. . E. . N. . Y..·181.......TGCAACTAA·61.........C. . N..*..
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于大腸桿菌菌株產(chǎn)生的步驟是使用質(zhì)粒載體進(jìn)行的，所述質(zhì)粒載體含有編碼一種或數(shù)種重組多肽的核苷酸序列，并且同時(shí)所述編碼一種或多種重組多肽的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄在可誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)的控制之下，然后培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株并誘導(dǎo)所述表達(dá)系統(tǒng)以允許所述重組多肽在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)，以及回收所產(chǎn)生的重組多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，使用細(xì)菌細(xì)胞或細(xì)胞片段的破碎、細(xì)胞內(nèi)沉淀的分離、然后用非離子性去污劑洗滌沉淀來進(jìn)行細(xì)胞分離和破碎以及雜合多肽的回收，而雜合多肽的分離包括在含有變性劑的緩沖溶液中溶解沉淀，用還原劑處理雜合多肽，重折疊雜合多肽，介由吸附層析或超濾濃縮雜合多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，同時(shí)或相繼使用胰蛋白酶和羧肽酶進(jìn)行雜合多肽的酶促切割，然后優(yōu)選進(jìn)行離子交換層析。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，在酶促切割后介由離子交換層析和/或反向高效液相色譜進(jìn)行胰島素純化。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)學(xué)并且可被用于生產(chǎn)人重組胰島素，所述人重組胰島素用來制備用于治療胰腺糖尿病的藥劑。提出了各種含有人工基因并編碼人胰島素前體的重組質(zhì)粒DNA。使用異丙基-硫代半乳糖吡喃糖苷來誘導(dǎo)雜合多肽的生物合成，從而使得雜合多肽的誘導(dǎo)后水平等于或大于總細(xì)胞蛋白質(zhì)的25％。根據(jù)所述的方法，通過培養(yǎng)含有所述重組質(zhì)粒之一的生產(chǎn)菌株、分離包涵體、溶解并復(fù)性融合蛋白、以及酶促降解和層析純化所述蛋白質(zhì)而產(chǎn)生人胰島素。本發(fā)明簡(jiǎn)化了生產(chǎn)人重組胰島素的方法并且增加了其產(chǎn)率。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102282260SQ200980154515
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2009年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月26日
發(fā)明者A·P·拉扎耶夫, I·E·考斯特斯基, I·L·里索夫斯基, I·P·勒斯克, V·R·魯西夫 申請(qǐng)人:Mako有限責(zé)任公司