專利名稱：治療衰老相關疾病的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于調節(jié)細胞壽命的方法以及涉及用于治療衰老相關疾病的方法和藥物。
背景技術：
酵母是一種非常好的模式系統(tǒng)，其中可以研究衰老及其調控途徑，與人類非常相
關1O衰老有兩種類型。一種稱為復制衰老并被定義為細胞能夠分裂的次數。每種細胞類型都具有特征性復制壽命(RLQ，其可以通過如卡路里限制(caloric restriction, CR, 一種熟知的延長在從酵母到小鼠大范圍內的生物體中的壽命的方法))等介入來延長。復制衰老是干細胞壽命中的一個重要特征。另一種類型的衰老是世代衰老，世代衰老被定義為在細胞停止分裂后其保持代謝活性或和生存力的時間長度。成熟哺乳動物中的很多細胞已經停止分裂并且它們的CLS是衰老的一個重要特征。和復制衰老類似的是，世代衰老也受到卡路里限制的影響3’4。去乙?；?sirtuin)如酵母中的Sir2保持細胞的RLS?？赡艽嬖趯哂兄赀z傳背景特異性的 CLS的較小影響。然而，Sir2在野生型背景中一般不直接調控CLS5’6。衰老、衰老相關疾病和細胞壽命調控之間的聯系突出了在包括代謝型疾病、糖尿病、炎性疾病、骨質疏松癥、癌癥、心血管疾病等在內的很多疾的治療處置中的細胞壽命的調節(jié)物的潛在作用。用于細胞的營養(yǎng)利用度、各種生長因子、脅迫和能量狀態(tài)的信號通過包括PI3-激酶Torl或Tor2在內的復合物TORCl (雷帕霉素復合物的標靶)9_11被集成并翻譯為細胞生長。來自TORCl的信號通過包括激酶和轉錄因子Sch9、Snfl和Rtg2等在內的底物介導 14O Snfl激酶的標靶之一是Gcn5 (Kat2)，其是一種賴氨酸乙?；D移酶，也是SAGA和SLIK 復合物兩者的組分15_18。SAGA和SLIK復合物調控多族基因響應細胞生長信號轉導的表達。 Rtg2是TORCl的底物，線粒體反饋反應的已知調節(jié)物19，與衰老關聯，并且是SLIK復合物的亞基19。SAGA和SLIK復合物兩者的另一個重要亞基是Spt7，Spt7在只有SLIK復合物的情況下由WdpS剪接17_2°。SAGA復合物的活性由SpW單獨控制15。已知由卡路里限制的備選方法導致的TORCl信號轉導的下調通過基因表達的重大變化而提高酵母和其它生物體的壽命9’1(1。然而，這種調控的機制尚未知道并且目前還在研究當中。在酵母中，S6激酶(Sch9)的突變導致世代壽命和復制壽命的延長。當敲除小鼠或C. elegans中的類似基因時，也觀察到壽命的延長。在本發(fā)明中，本發(fā)明人已經鑒定到參與細胞壽命控制的另外因子，并且已經證明這種因子對CLS和RLS均具有作用。本發(fā)明還鑒定到酵母中的Ydr026c對染色質中的高級結構的保持是必需的。這種高級結構已經牽涉到由于其在通過實驗胚胎學控制基因表達中的作用而在衰老中發(fā)揮重要作用。

發(fā)明內容
根據本發(fā)明的第一方面，提供了藤霉素在制造用于治療衰老相關疾病的藥物中的用途。優(yōu)選的是，所述衰老相關疾病選自包括以下疾病的組代謝紊亂，例如，糖代謝紊亂(如糖原累積病)；氨基酸代謝紊亂(如苯丙酮尿癥、戊二酸血癥等)；有機酸代謝紊亂 (有機酸尿癥，如尿黑酸尿癥)；脂肪酸氧化和線粒體代謝紊亂(如戊二酸血癥，II型)；嘌呤和嘧啶代謝紊亂(如萊施-尼漢綜合征(Lesch-Nyhan syndrome))；線粒體功能紊亂(例如，卡恩斯-塞爾綜合征(Kearns-Sayre syndrome))；過氧化物酶體功能紊亂(例如澤爾韋格氏綜合征)、炎癥疾病、心血管疾病、I型糖尿病、II型糖尿病、動脈粥樣硬化、阿爾茨海默氏癥、癡呆癥、臨床抑郁癥、脂肪紊亂(adipose disorder)，包括肥胖癥、脂肪相關代謝紊亂和肌肉萎縮癥、少肌癥、惡病質和骨質疏松癥。根據本發(fā)明的第二方面，提供了用于提高細胞的復制壽命的方法，所述方法包括破壞編碼以下多肽的基因的功能包含SEQ ID No :1、3或5的多肽或與SEQ ID No :1、3或 5具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%的同一性的多肽或其同系物，或與SEQ ID No :1、3或5具有一個或若干個氨基酸增加、缺失或取代差異的多肽。根據本發(fā)明的第三方面，提供了提高細胞世代壽命的方法，所述方法包括破壞編碼以下多肽的基因的功能包含SEQ ID No :1或3的多肽或與SEQ ID No :1或3具有至少 70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%的同一性的多肽或其同系物，或與SEQ ID No :1、 3或5具有一個或若干個氨基酸增加、缺失或取代差異的多肽。根據本發(fā)明的第四方面，提供了提高細胞的世代壽命和/或復制壽命的方法，所述方法包括使用藤霉素處理所述細胞。根據本發(fā)明的第五方面，提供了用于在治療衰老相關疾病中使用的藤霉素。在一個實施方式中，優(yōu)選的是，所述疾病與細胞的世代壽命和/或復制壽命相關。在另外的實施方式中，所述疾病選自包括以下疾病的組代謝紊亂，例如，糖代謝紊亂(如糖原累積病)；氨基酸代謝紊亂(如苯丙酮尿癥、戊二酸血癥等)；有機酸代謝紊亂(有機酸尿癥，如尿黑酸尿癥)；脂肪酸氧化和線粒體代謝紊亂(如戊二酸血癥，II型)； 嘌呤和嘧啶代謝紊亂(如萊施-尼漢綜合征)；線粒體功能紊亂(例如，卡恩斯-塞爾綜合征)；過氧化物酶體功能紊亂(例如澤爾韋格氏綜合征)、炎癥疾病、心血管疾病、I型糖尿病、II型糖尿病、動脈粥樣硬化、阿爾茨海默氏癥、癡呆癥、臨床抑郁癥、脂肪紊亂，包括肥胖癥、脂肪相關代謝紊亂和肌肉萎縮癥、少肌癥、惡病質和骨質疏松癥。
具體實施例方式本發(fā)明基于本發(fā)明人的如下發(fā)現不表達多肽Ydr026c (SEQ ID NO :3)的酵母細胞具有明顯提高的世代壽命(與表達該多肽的細胞相比)。本發(fā)明還基于如下另一個發(fā)現不表達多肽Ydr026c (SEQ ID NO :3)的細胞也具有明顯提高的復制壽命(與表達該多肽的細胞相比)。本領域技術人員應該清楚的是，術語“世代壽命”是指細胞保持代謝活性和生存力但不分裂的時間的長度。還應該清楚的是，術語“復制壽命”是指細胞能夠分裂的次數。因此，不難理解的是，提高涉及細胞保持生存力而沒有復制的時間的長度的提高或者細胞變老前能夠復制的次數的提高。在此使用的基因名稱YDR026C和OBDl是同義詞并且可以互換。編碼該多肽的基因位于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisia)中的YDR(^6C基因座。在此使用的術語“衰老相關疾病”涉及在患者衰老中具有其病因學因子的任何疾病。應當理解的是，衰老可能是眾多因子中的一個因子，但是結合后導致疾病的發(fā)展。這些疾病的實例包括但不限于代謝紊亂，例如，糖代謝紊亂(如糖原累積病)；氨基酸代謝紊亂 (如苯丙酮尿癥、戊二酸血癥等)；有機酸代謝紊亂(有機酸尿癥，如尿黑酸尿癥)；脂肪酸氧化和線粒體代謝紊亂(如戊二酸血癥，II型)；嘌呤和嘧啶代謝紊亂(如萊施-尼漢綜合征)；線粒體功能紊亂(例如，卡恩斯-塞爾綜合征)；過氧化物酶體功能紊亂(例如澤爾韋格氏綜合征)、II型糖尿病、內分泌紊亂(例如甲狀腺紊亂)、癌癥、炎癥疾病、自體免疫紊亂、心血管疾病、I型糖尿病、動脈粥樣硬化，包括阿爾茨海默氏癥、癡呆癥、臨床抑郁癥、脂肪紊亂，包括肥胖癥、脂肪相關代謝紊亂和肌肉萎縮癥、少肌癥、惡病質和骨質疏松癥。根據本發(fā)明的一個不同方面，提供了藤霉素在制備用于治療衰老相關疾病的藥物中的用途。優(yōu)選的是，所述衰老相關疾病選自包括包括以下疾病的組代謝紊亂，例如，糖代謝紊亂(如糖原累積病)；氨基酸代謝紊亂(如苯丙酮尿癥、戊二酸血癥等)；有機酸代謝紊亂(有機酸尿癥，如尿黑酸尿癥)；脂肪酸氧化和線粒體代謝紊亂(如戊二酸血癥，II型)； 嘌呤和嘧啶代謝紊亂(如萊施-尼漢綜合征)；線粒體功能紊亂(例如，卡恩斯-塞爾綜合征)；過氧化物酶體功能紊亂(例如澤爾韋格氏綜合征)、炎癥疾病、心血管疾病、I型糖尿病、II型糖尿病、動脈粥樣硬化、阿爾茨海默氏癥、癡呆癥、臨床抑郁癥、脂肪紊亂，包括肥胖癥、脂肪相關代謝紊亂、肌肉萎縮癥、少肌癥、惡病質和骨質疏松癥。在一個優(yōu)選的實施方式中，所述疾病選自阿爾茨海默氏癥、癡呆癥、臨床抑郁癥。在另一個優(yōu)選的實施方式中，所述疾病選自少肌癥或惡病質。向細胞中添加藤霉素導致CLS的提高和RLS的提高。本領域技術人員應當清楚的是，CLS和/或RLS中的這種提高涉及到與衰老關聯的疾病的治療。所述藥物包含本發(fā)明的治療有效量的一種或多種試劑，并且優(yōu)選還包含藥學可接受的載體、稀釋劑或賦形劑(包括它們的組合)。所述藥物可以在人類醫(yī)學或獸醫(yī)中用于人類或動物用途，并且一般包含任意一種或多種藥學可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。用于治療用途的可接受的載體或稀釋劑在藥學領域是已知的，并且在例如Remington' s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co. (A.R.Gennaro編，198 中有描述。藥學載體、賦形劑或稀釋劑可以根據目標施用途徑和標準藥學實踐進行選擇。所述藥物可以包括作為載體、賦形劑或稀釋劑的以下物質或除了載體、賦形劑或稀釋劑之外還包括以下物質任意適合的一種或多種粘合劑、一種或多種潤滑劑、一種或多種懸浮劑、一種或多種涂層劑、一種或多種加溶劑。在所述藥物中可以提供防腐劑、穩(wěn)定劑、染料甚至是芳香劑。防腐劑的實例包括苯甲酸鈉、山梨酸和對羥基苯甲酸酯。還可使用抗氧化劑和懸浮劑。根據不同的遞送系統(tǒng)，可能有不同的組成/配制要求。舉例來說，本發(fā)明的所述藥物可以配制成使用微型泵或通過粘膜途徑例如作為噴鼻劑或吸入用氣霧劑或可吸收溶液施用，或者通過腸胃外施用，其中組合物以可注射形式配制通過例如靜脈內、肌肉內、皮下途徑遞送?？蛇x的是，制劑可以設計成通過若干種途徑施用。在所述試劑擬通過粘膜方式經由胃腸道粘膜施用的情況下，該試劑在經由胃腸道穿過的過程中應該能夠保持穩(wěn)定；例如，該試劑應該耐受蛋白酶降解，在酸性PH下穩(wěn)定并且耐受膽汁的去污作用。在合適的情況下，所述藥物可以通過吸入施用、以栓劑或陰道栓的形式施用、以洗劑、溶液、霜劑、軟膏或塵粉劑的形式局部施用、采用皮膚貼劑施用、以如下形式口服施用 含有諸如淀粉或乳糖之類的賦形劑的片劑的形式、或單獨的或與賦形劑混合的膠囊或藥胚 (ovule)的形式、含有芳香劑或著色劑的酏劑、溶液或懸浮劑的形式，或者它們可以腸胃外注射，例如通過靜脈內、肌肉內或皮下施用。對于腸胃外施用，所述組合物最好可以以無菌水溶液施用，所述水溶液可以含有其他物質，如足夠的鹽或單糖以使該溶液與血液等滲。對于口腔或舌下施用，所述組合物可以以片劑或錠劑的形式施用，所述片劑或錠劑可以以常規(guī)方式配制。如果所述試劑是蛋白，則所述蛋白可以在受治對象中原位制得。在這一方面，可以通過使用非病毒技術(例如通過使用脂質體)和/或病毒技術(例如通過使用逆轉錄病毒載體)遞送編碼所述蛋白的的核苷酸序列，使得所述蛋白由所述核苷酸序列表達?！胺€(wěn)定的”制劑是其中的多肽或蛋白在保存時基本保持其物理和化學穩(wěn)定性和生物學活性的制劑。在現有技術中可以利用各種分析技術來測量蛋白穩(wěn)定性，這些技術可以參見肽和蛋白藥物遞送(Peptide and Protein Drug Delivery) (247-301, Vincent Lee 編，Marcel Dekker, Inc. , New York, N. Y. , Pubs. (1991))禾口 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90(199；3)。穩(wěn)定性可以在選定的溫度下在選定的時間內測得。對于快速篩查， 目標制劑可以在40°C保存1周至1月，此時對穩(wěn)定性進行測量。凍干保存后凝聚程度可以用作肽和/或蛋白穩(wěn)定性的指標。例如，“穩(wěn)定的”制劑是這樣的制劑其中有少于約10%， 優(yōu)選少于約5%的肽或蛋白以凝聚體存在于制劑中。可以確定凍干制劑在凍干保存后凝聚制劑的增加。例如，“穩(wěn)定的”凍干制劑可以是這樣的制劑其中當凍干制劑在40°C溫育至少1周后，該凍干制劑中的凝聚體的增加小于約5%或小于約3%?？梢允褂蒙锘钚詼y定法例如本文所述的結合測定法測量融合蛋白制劑的穩(wěn)定性。根據又一方面，提供了用于提高細胞的復制壽命的方法，所述方法包括破壞編碼以下多肽的多核苷酸或基因的功能包含SEQ ID No :1、3或5的多肽或與SEQ ID No :1、3 或5具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%的同一性的多肽或其同系物，或與 SEQ ID No :1、3或5具有一個或若干個氨基酸增加、缺失或取代差異的多肽。在一些優(yōu)選的實施方式中，所述多核苷酸或基因包含如在SEQ ID No :4、6或7中所示的核苷酸序列，或由于遺傳密碼子的簡并性而與SEQ ID No:4、6或7具有至少70%、 80%、90%、95%、97%、98%或99%的同一性的序列，或與SEQ ID No :4、6或7相比具有一個或若干個核苷酸增加、缺失或取代差異的序列。在一個優(yōu)選實施方式中，所述細胞是干細胞。更優(yōu)選的是，所述細胞是哺乳動物干細胞。最優(yōu)選的是，所述細胞是人類干細胞。在又一個優(yōu)選的實施方式中，所述細胞是經誘導的多潛能干細胞。
應當理解的是，本發(fā)明使用的術語“細胞”是指動物細胞和植物細胞，也指回體(ex Vivo)保持的細胞或細胞群，或者在適用的情況下可選的是，是指體內細胞或細胞群。應當注意的是，SEQ ID NO :1和5 (TTFl)以及SEQ ID NO :3(Ydr026c)是相同蛋白的人類和酵母同系物。另外，SEQ ID N0:3(本發(fā)明)和小鼠同系物(Shiue，C-N等，(2009) Oncogene, 28,1833-1842)均已經顯示出調控基因環(huán)形成。還應當理解的是，SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 5是人類TTFl的剪接變體。根據本發(fā)明的又一方面，提供了提高細胞的世代壽命的方法，所述方法包括破壞編碼以下多肽的多核苷酸或基因的功能包含SEQ ID No :1、3或5的多肽；或與SEQ ID No: 1、3或5具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%的同一性的多肽或其同系物； 或與SEQ ID No :1、3或5相比具有一個或若干個氨基酸增加、缺失或取代差異的多肽。在一些優(yōu)選的實施方式中，所述多核苷酸或基因包含如在SEQ ID No :4、6或7中所示的核苷酸序列；或與SEQ ID No :4、6或7具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98% 或99%的同一性的序列；或由于遺傳密碼子的簡并性不同于SEQ ID No :4、6或7的序列； 或與SEQ ID No :4、6或7相比具有一個或若干個核苷酸增加、缺失或取代差異的序列。應當理解的是，所述同系物可以是異體同源肽或異源肽，即來自相同或不同物種的肽。在本發(fā)明的上下文中，同系物理解為包括與主題序列可以具有至少50^^60%、 70^^75^^80^^85%或90%的同一性的氨基酸序列，優(yōu)選包括與主題序列具有至少 95 %、97 %、98 %或99 %的同一性的氨基酸序列。通常，同系物應包含與主題氨基酸序列相同的活性位點等。盡管同源性還可以認為是相似性(即氨基酸殘基具有相似的化學性質/ 功能)，但是在本發(fā)明的情況下，優(yōu)選將同源性表示為序列同一性。同源性比較可以通過肉眼進行，或者更常用的是借助于容易獲得的序列比較程序進行。這些可以商購獲得的計算機程序可以計算兩條以上序列之間的同源性百分比(％)。同源性百分比可以在相鄰的序列上進行計算，即一條序列與另一條序列比對，并且一條序列中的每個氨基酸直接與另一條序列的對應氨基酸比較，一次比較一個殘基。這就是所謂的“無間隙”比對。通常，這種無間隙比對僅在數目相對較少的殘基上進行。雖然這是一種非常簡單和具有一致性的方法，但是該方法沒有考慮到，例如如果在相同的一對序列中，一個插入或缺失將導致隨后的氨基酸殘基沒有比對，因此可能導致在全局比對時同源性百分比顯著降低。因此，最大同源性百分比的計算首先需要把間隙罰分考慮在內而形成最優(yōu)比對。 用于執(zhí)行這種比對的合適的計算機程序是Vector NTI (Invitrogen Corp.)。能夠執(zhí)行序列比較的軟件的實例包括但不限于BLAST包(參見Ausubel等，1999，分子生物學中的短程序(Short Protocols in Molecular Biology)，第 4 版第 18 章)、BLAST 2(例如參見 FEMS Microbiol Lett 1999174(2) :247-50 ；FEMS Microbiol Lett 1999177(1) :187-8 和 tatianaincbi. nlm. nih. rov)、FASTA (Altschul 等，1990，J. Mol. Biol. 403-410)以及 AlignX0至少有BLAST、BLAST 2和FASTA可以離線獲得并且可以在線檢索(參見Ausubel 等，1999，第7-58頁至第7-60頁)。應當理解的是，術語“破壞功能”是指破壞多核苷酸或基因的表達，或者破壞編碼多肽的活性。還應當理解的是，可以破壞轉錄起始至成熟蛋白的生成之間任意階段的基因表達。本領域技術人員應當理解的是，這包括通過控制染色質結構來控制基因表達的后生 (epigenetic)手段以及通過控制基因表達的轉錄、翻譯和后翻譯手段。應當理解的是，在此使用的破壞基因表達是指通過本領域已知的任何手段防止或抑制功能性多肽的生成，并且破壞編碼多肽的活性是指破壞功能性多肽與其一個或多個結合配偶體的相互作用使得所述多肽不執(zhí)行其功能。所述生成或功能可以部分或全部受阻。 在一個實施方式中，優(yōu)選基因產物的生成或功能完全受阻，即，沒有活性基因產物。在一些情況中，基因產物的生成或功能可以被破壞使得僅保留野生型表達水平的約5%、約10%、 約 20%、約 30%、約 50%、約 60%、約 70%、約 80%、約 90%或約 95%。在此使用的抑制功能性多肽的生成是指可以通過如下方式防止或抑制基因產物的生成(a)敲除所述基因；(b)通過例如使用iRNA或反義RNA使所述基因在后轉錄階段沉默(基因沉默)；(c)通過例如后生技術使所述基因在轉錄階段沉默；(d)通過導入至少一個點突變防止或改變基因產物的功能；(e)使基因產物在后翻譯階段失活。在一個優(yōu)選的實施方式中，通過iRNA破壞基因或同系物的表達。優(yōu)選的是，在啟動子的控制下使用編碼iRNA的質粒/載體轉化細胞。應當清楚的是，該啟動子可以是組成型啟動子和/或組織特異性啟動子。在此使用的術語“ iRNA”是指RNA干擾(RNAi)。這是通過直接導入dsRNA誘導真核生物中的后轉錄基因沉默(PTGS)的方法(Fire A等，(1998))。在又一個優(yōu)選實施方式中，在轉錄/DNA水平上破壞基因的表達。優(yōu)選的是，所述破壞通過將至少一個核苷插入到基因中或者使基因至少缺失一個核苷來實現。在又一個實施方式中，基因的破壞通過導入至少一個點突變來實現。應當理解的是，在破壞多肽與其一個或多個結合配偶體的相互作用的情況中，這種破壞可以采用任何合適的方法進行，例如采用競爭抑制、非競爭性抑制、混合抑制或無競爭性抑制。根據本發(fā)明，提供了提高細胞的世代壽命和/或復制壽命的方法，所述方法包括使用藤霉素處理所述細胞。如上所述，所述細胞可以是植物細胞或動物細胞。優(yōu)選的是，所述細胞是動物細胞。在一個優(yōu)選的實施方式中，所述細胞是哺乳動物細胞。更優(yōu)選的是，所述細胞是人類細胞。本發(fā)明還提供用于在治療衰老相關疾病中使用的藤霉素。優(yōu)選的是，所述疾病與細胞的世代壽命和/或復制壽命相關。優(yōu)選的是，所述疾病選自包括以下疾病的組代謝紊亂，例如，糖代謝紊亂(如糖原累積病)；氨基酸代謝紊亂(如苯丙酮尿癥、戊二酸血癥等)；有機酸代謝紊亂(有機酸尿癥，如尿黑酸尿癥)；脂肪酸氧化和線粒體代謝紊亂(如戊二酸血癥，II型)；嘌呤和嘧啶代謝紊亂(如萊施-尼漢綜合征)；線粒體功能紊亂(例如，卡恩斯-塞爾綜合征)；過氧化物酶體功能紊亂(例如澤爾韋格氏綜合征)、炎癥疾病、心血管疾病、I型糖尿病、II型糖尿病、動脈粥樣硬化、阿爾茨海默氏癥、癡呆癥、臨床抑郁癥、脂肪紊亂，包括肥胖癥、脂肪相關代謝紊亂肌肉萎縮癥、少肌癥、惡病質和骨質疏松癥。在一個優(yōu)選的實施方式中，所述疾病選自阿爾茨海默氏癥、癡呆癥、臨床抑郁癥。在另一個優(yōu)選的實施方式中，所述疾病選自少肌癥或惡病質。
本領域技術人員應當了解的是，藤霉素(Π(-506)是ー種免疫抑制抗生素藥物，主要在器官移植后使用。據信藤霉素是通過抑制鈣調磷酸酶的活性來發(fā)揮作用的(Griffith， J. P.等，[1995]Cell，82(3) ,507-522)。阿爾茨海默氏癥不僅是一種衰老疾病，而且還是ー種通過破壞調控衰老途徑應當能夠逆轉的ー種疾病。例如，秀麗隱桿線蟲(C.eleagns)中的Daf2的突變能夠減緩秀麗隱桿線蟲模型中阿爾茨海默氏癥的進程。這種突變破壞了 IGF-I信號轉導并導致壽命的延長。在小鼠中進行的類似實驗提出了相同的假說。阿爾茨海默氏癥還與毒性蛋白聚集體的累積有關。諸如延長世代壽命的Π(-506(藤霉素)之類的化合物可以減少這些聚集體的累積，因此可以用于治療阿爾茨海默氏癥和相關疾病，如癡呆癥和臨床抑郁癥。除非另有說明，否則所有在此使用的技術和科學術語具有本領域技術人員通常理解的相同涵義。從業(yè)者具體可以查閱分子生物學通用程序(Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel))中的技術定義和術語。氨基酸殘基的縮略詞是標準的3字母和/或單字母代碼，該代碼在本領域中用來表示20個常用L-氨基酸中的一個氨基酸。另外需要注意的是，在本說明書中使用的“ー個”、“ー種”以及“所述”除非另有明確而沒有疑義地說明表示的是ー個所指物，否則包括多個所指物。術語“或”除非語境另有明確表示，否則可以與術語“和/或”互換使用。另外，在此使用的“部分”和“片段”可以互換使用，表示多肽、核酸或其他分子結構體的部分。本文使用的“多肽”和“蛋白，，可以互換使用，用于描述可能包含部分或全長蛋白的蛋白分子。如本領域中已知的那梓，“蛋白”、“肽”、“多肽”和“寡肽”是氨基酸(通常為L-氨基酸)鏈，其α-碳原子通過肽鍵連接，所述肽鍵通過ー個氨基酸的α-碳原子的羧基與另一個氨基酸的α-碳原子的氨基之間的縮合反應形成。通常，形成蛋白的氨基酸按順序編號，從蛋白的氨基末端殘基開始向蛋白的羧基末端殘基方向増加?！昂怂帷笔嵌嗪塑账?，例如脫氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)。該術語用以包括單鏈核酸、雙鏈核酸以及由核苷或核苷類似物構成的RNA和DNA。在一個實施方式中，術語“質粒/載體”是指核酸分子，該核酸分子可以用于將另 ー個核酸分子轉運到細胞中。在一個實施方式中，所述載體允許插入到該載體中的DNA序列復制。所述載體可以包含啟動子以增強核酸分子在至少ー些宿主細胞中表達。載體可以自動(染色體外)復制，或者可以整合到宿主細胞染色體中。在一個實施方式中，所述載體可以包括能夠生成衍生自被插入到該載體中的核酸序列的至少一部分的蛋白的表達載體。在此使用的“有效量”是指試劑的能夠在受治對象中產生期望效果的量。術語“治療有效量”表示藥物或藥學試劑的引發(fā)動物或人類所追求的治療性響應的量。包含有效量的實際劑量可以取決于施用途徑、受治對象的大小和健康狀況和所治療的疾病等。本文使用的術語“藥學可接受的載體”可以指適合用于人類或動物受治對象的化合物和組合物，例如施用以治療目標紊亂或疾病的藥學組合物。


下文將參考附圖對本發(fā)明進行更加詳細的描述，其中
圖1顯示由酵母中的YDR(^6C基因座生成的Ydr026c基因產物作為酵母中后生調控的的一部分直接參與基因上高級結構的形成。圖2A顯示了在厭氧條件下在ydr026c耗竭(depleted)突變體中世代壽命的延長，但是在fobl耗竭突變體的野生型中沒有延長。圖2B作為經標校的生長曲線顯示了相同的結果。圖3顯示了在通氣(頂圖)和脫氧(底圖)條件下野生型(BW741)、ydr026c Δ 和fobl Δ酵母株的世代壽命。圖4顯示了藤霉素對世代壽命的影響。圖5顯示了 Π(_506對秀麗隱桿線蟲的壽命的影響。圖6顯示了 Π(-506對人類纖維原細胞系MRC5中的細胞分裂速度的影響。圖7顯示了缺失obdl和sir2對細胞的世代壽命的影響。
實施例實例1圖1顯示了 YDR026C基因產物對基因高級結構的影響，這形成了基因座的穩(wěn)定性的后生調控的一部分(以rDNA為例)。Ydr026c及其功能的喪失導致后生高級染色體結構的喪失(通過染色體構象捕獲測定法測量)(圖1B)。在野生型中觀測到的正常高級結構的喪失與后生失調和基因座穩(wěn)定性喪失有關。Fobl (Ydr026c的相互作用配偶體)的喪失導致高級結構穩(wěn)定性的提高。圖IA顯示了在酵母rDNA基因座的上游和下游帶有兩個YDR026C結合位點的酵母 rDNA基因座、在標準染色體構象捕獲測定法中使用的Bfal限制位點的位置(豎線)和PCR 引物標記Ter、25c、5. 8c、18c和Pro的位置(小箭頭)，還顯示由該基因座構成的rRNA轉錄本(大箭頭(block arrow)) 圖IB顯示了染色體構象捕獲測定法(3C)的測定結果。在野生型中，這顯示了使用野生型的引物對Ter-Pro經33個循環(huán)后特異性產物的生成。在fobl缺失株中經28個循環(huán)之后也看到相同的產物。應當注意的是，在ydr026C缺失株中即使經過33個循環(huán)之后也沒有見到產物。這表明Ydr026c的喪失導致由酵母中的rDNA基因座進行的野生型正常轉錄中所觀察到的特征性后生高級結構的喪失。還表明fobl的缺失(其與Ydr026c相互作用)導致高級結構的高度穩(wěn)定性，使得它們容易在3C測定的早期的PCR循環(huán)檢測到。實施例2讓細胞在含有2%葡萄糖的培養(yǎng)基中在沒有通氣(氧剝奪)的情況下生長所示天數并以10倍稀釋液鋪板以監(jiān)測生存力。本實驗表明，Ydr026c耗竭突變體具有延長的壽命(與野生型或fobl耗竭突變體相比)。附圖顯示在厭氧培養(yǎng)基中培養(yǎng)12天后，野生型和Afobl株不再具有生存力，而 ydr026c Δ株仍然顯示出生長。實施例3在該實驗中，在通氣或脫氧(AN)培養(yǎng)條件下，在含有3%葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所示天數后，將野生型、ydr026cA和foblA酵母細胞鋪板在生長培養(yǎng)基上。從圖中可以看出，在通氣和厭氧兩種條件下，ydr026cA突變體顯示出分別為33天和20天的提高的世代壽命。實施例4從圖4中可以看出，Π(_506(藤霉素)延長了釀酒酵母(S. cerevisiae)的世代壽命。以0. lng/ml向培養(yǎng)基中添加藤霉素對細胞的世代壽命沒有顯著的影響(與對照相比)，但是添加lng/ml以上具有顯著的影響，提高了酵母細胞的平均壽命(與對照相比)。 使用 Murakami，C.和 Kaeberlein，Μ. ((2009) J. Vis. Exp, 27)所述的生長暈法(outgrowth method)測量壽命。簡而言之，酵母的世代壽命表示為衰老酵母培養(yǎng)物隨時間的生存力曲線。為了對此進行測量，使這種酵母培養(yǎng)物生長在液體培養(yǎng)基中知道葡萄糖碳源耗盡并且細胞停止分裂。此時，使用Bioscreen C機(0y Growth Curves Ab Ltd，芬蘭)通過觀察衰老培養(yǎng)物的新鮮接種物的生長暈特征來測量存活細胞與能夠分裂的細胞的比例。比較各個不同的時間點的生存カ來確定培養(yǎng)物的世代壽命。實施例5從圖5可以看出，添加Π(-506以劑量依賴模式延長了秀麗隱桿線蟲的壽命，添加4yg/ml導致生物體的生存力(世代壽命)的顯著提高。在同步產卵階段(timed egg laying stage)將 FK-506 添加到秀麗隱桿線蟲中，并按 Sutphin, G. L.和 Kaeberlein, M.， ((2009) J. Vis. Exp, 27.)所述的方法測量壽命。簡而言之，該方法包括使蟲群同步并在一定范圍的時間點測量活蟲的百分比，根據它們能夠響應物理刺激的能力對活蟲進行打分。實施例6圖6顯示，FK-506呈現出逆轉MRC5人類纖維原細胞系中的細胞分裂速度的衰老依賴型降低。這表明Π(506提高了這些細胞的復制壽命。使用Fairweather，D. S.，M. Fox 和 G. P. Margison ((1987)，Exp Cell Res, 168(1)第 153-9 頁)的方法測量細胞分裂速度。 簡而言之，通過將MRC5細胞在培養(yǎng)皿表面上生長直到達成匯合(此時它們以1 2的比例分裂，即以1稀釋為2、測量MRC5細胞的復制壽命。培養(yǎng)物分裂的次數等于細胞能夠經歷的分裂次數，這就是培養(yǎng)物復制壽命。MCR5細胞僅能夠分裂有限的次數，并且隨著它們到達它們生命的末期，它們經歷細胞分裂所需的時間增加。在這種情況中，細胞分裂的速度被當作衰老指標使用?？梢钥闯?，在39次分裂后添加Π(-506導致分裂時間的降低(與沒有添加Π _506 的對照相比)。在較高濃度，FK506對細胞具有毒性，因此限制了細胞復制能力。數據表明，Π(506在人類和秀麗隱桿線蟲中均能夠延遲衰老的開始。秀麗隱桿線蟲的衰老主要是肌肉和腸細胞的衰老。數據顯示Π(506延長了秀麗隱桿線蟲的壽命，因此必然延遲了這些組織的衰老。這表明Π(506將延遲人類肌肉細胞衰老的影響，并且將可用于治療諸如少肌癥之類的疾病。這種疾病的發(fā)展是與臥床休息或化學療法(惡病質)關聯的肌肉喪失，這被機械地認為是ー種非常類似的過程。數據還表明，Π(-506能夠延遲衰老的開始，因此可以用于提高受誘導的多潛能干細胞和直接人造細胞(directly converted cell)的效率，這可以在干細胞治療中加以利用。
實施例7通過使YDR 026c基因座缺失提高分裂干細胞的復制壽命(RLQ。使用顯微操縱器(Singer Instruments)測量復制壽命。這包括物理解剖由在YPD瓊脂培養(yǎng)基葡萄糖，2%酵母提取物，細菌用蛋白胨，2%瓊脂)生長的單個母細胞的生命期產生的每個姐妹細胞。由10至50個母細胞得到的數據求平均值以得到每株及其野生型親本的平均壽命。需要謹慎以確保由小的(因而是年輕的)母細胞生成初始處女型細胞[Kaeberlein， Μ.，Kirkland，K. Τ.，Fields, S. &Kennedy，B. K.，基因確定在長存活遺傳背景中的酵母復 Κ Ι壽命(Genes determining yeast replicative life span in a long—lived genetic background). Mech Ageing Dev 126，491-504 Q005)和 Kaeberlein，M.等。通過 TOR 和 Sch9 響應營養(yǎng)而調控酵母復制壽命(Regulation of yeast replicative life span by TOR and Sch9in response to nutrients). Science 310,1193-1196(2005)]。表權利要求
1.藤霉素在制造用于治療與細胞的世代壽命和/或復制壽命相關的疾病的藥物中的用途，所述疾病選自包括以下疾病的組代謝紊亂、炎癥疾病、心血管疾病、I型糖尿病、II 型糖尿病、動脈粥樣硬化、阿爾茨海默氏癥、癡呆癥、臨床抑郁癥、脂肪紊亂，包括肥胖癥、脂肪相關代謝紊亂、肌肉萎縮癥、少肌癥、惡病質和骨質疏松癥。
2.一種提高細胞的復制壽命的方法，所述方法包括破壞編碼以下多肽的多核苷酸或基因的功能包含SEQ ID No :1、3或5的多肽或與SEQ ID No :1、3或5具有至少70%、80%、 90%、95%、97%、98%或99%的同一性的多肽或其同系物。
3.根據權利要求2中任一項所述的方法，其中所述細胞是干細胞。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述細胞是人類干細胞。
5.根據權利要求3或4所述的方法，其中所述細胞是受誘導的多潛能干細胞。
6.一種提高細胞的世代壽命的方法，所述方法包括破壞編碼以下多肽的多核苷酸或基因的功能包含SEQ ID No :1、3或5的多肽；或與SEQ ID No 1、3或5具有至少70%、80%、 90%、95%、97%、98%或99%的同一性的多肽或其同系物。
7.根據權利要求2至6中任一項所述的方法，其中所述基因或同系物的功能通過iRNA 進行破壞。
8.根據權利要求2至6中任一項所述的方法，其中所述基因的功能在轉錄/DNA水平上進行破壞。
9.一種提高細胞的世代壽命和/或復制壽命的方法，所述方法包括使用藤霉素處理所述細胞。
10.根據權利要求2至9中任一項所述的方法，其中所述細胞是植物細胞或動物細胞。
11.根據權利要求2至10中任一項所述的方法，其中所述細胞是哺乳動物細胞。
12.—種組合物，所述組合物包含用于在治療衰老相關疾病中使用的藤霉素。
13.根據權利要求12所述的組合物，所述組合物在其中所述疾病與細胞的世代壽命和 /或復制壽命相關的情況中使用。
14.根據權利要求12或權利要求13所述的組合物，所述組合物在其中所述疾病選自包括以下疾病的組的情況中使用代謝紊亂、炎癥疾病、心血管疾病、I型糖尿病、II型糖尿病、動脈粥樣硬化、阿爾茨海默氏癥、癡呆癥、臨床抑郁癥、脂肪紊亂，包括肥胖癥、脂肪相關代謝紊亂、肌肉萎縮癥、少肌癥、惡病質和骨質疏松癥。
15.如權利要求12至14中任一項所述的組合物，所述組合物進一步包含藥學可接受的稀釋劑、賦形劑或載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及藤霉素在治療與細胞的世代壽命和/或復制壽命相關的疾病中的用途，本發(fā)明還涉及提高細胞的復制壽命的方法，所述方法包括破壞編碼包含SEQ ID No1、3或5的多肽的多核苷酸或基因的功能。
文檔編號A61K38/13GK102573841SQ201080031099
公開日2012年7月11日 申請日期2010年7月8日 優(yōu)先權日2009年7月8日
發(fā)明者喬納森·艾林, 亞歷山大·阿庫利特切瓦, 伊麗莎白·簡·梅勒, 邁克爾·尤德爾 申請人:克羅諾斯治療有限公司