專利名稱：人源化抗egfl7抗體及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明關(guān)注抗EGFL7抗體及其用途。
背景技術(shù)：
維管聯(lián)結(jié)(vascular supply)的發(fā)育是許多生理性和病理性過程的基本要求?；钴S生長中的組織諸如胚胎和腫瘤要求充足的血液供應(yīng)。它們通過生成促血管發(fā)生因子來滿足這一需要，所述促血管發(fā)生因子經(jīng)由稱為血管發(fā)生(angiogenesis)的過程促進自已有的血管形成新血管；或經(jīng)由稱為維管發(fā)生(vasculogenesis)的過程自祖細胞形成新血管。 管發(fā)生(tubulogenesis)是血管發(fā)育中一個至關(guān)重要的步驟。血管的管形成是復(fù)雜但有序的生物學(xué)事件，涉及所有或許多以下步驟a)自已有的內(nèi)皮細胞(EC)增殖出EC或自祖細胞分化出EC ；b)EC遷移；c)EC接合以形成索樣結(jié)構(gòu)；d)血管索然后發(fā)生管發(fā)生以形成具有中央內(nèi)腔的血管；e)已有的索或血管伸出芽以形成次生血管(血管發(fā)生)；f)初級血管叢發(fā)生進一步重塑(remodeling)和整形(reshaping)；及g)內(nèi)皮周細胞(peri-endothelial cell)被募集來包圍內(nèi)皮管，為血管提供維持和調(diào)控功能，此類細胞包括用于小毛細血管的周細胞、用于大血管的平滑肌細胞、和心臟中的心肌細胞。Hanahan，D. Science 277， 48-50(1997) ；Hogan, B. L. &Kolodziej, P. A. Nature Reviews Genetics. 3,513-23(2002)； Lubarsky, B. & Krasnow，Μ. A.Cell.112，19—28(2003)?，F(xiàn)在完全確立了涉及自已有的內(nèi)皮形成新血管的血管發(fā)生參與多種病癥的發(fā)病機理。這些包括實體瘤和轉(zhuǎn)移、動脈粥樣硬化、晶狀體后纖維組織增生、血管瘤、慢性炎癥、眼內(nèi)新血管綜合征諸如增殖性視網(wǎng)膜病例如糖尿病性視網(wǎng)膜病、老年性黃斑變性 (AMD)、新生血管性青光眼、移植角膜組織和其它組織的免疫排斥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、和銀屑病。Folkman et al.，J. Biol. Chem.，267 10931-10934 (1992) ；Klagsbrun et al.， Annu. Rev. Physiol. , 53 :217-239(1991) ； R Garner Α. , “ Vascular diseases “ ， In Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A. , Klintworth GK, eds. ,2nd Edition(Marcel Dekker, NY,1994),pp 1625—1710。在腫瘤生長的情況中，血管發(fā)生對于自增生至瘤形成的轉(zhuǎn)換，及為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供營養(yǎng)似乎是至關(guān)重要的。Folkman et al.，Nature，339 :58 (1989)。新血管形成 (neovascularization)讓腫瘤細胞獲得了與正常細胞相比的生長優(yōu)勢和增殖自治。腫瘤通常開始于單個異常細胞，由于與可利用毛細管床的距離，該細胞只能增殖至幾立方毫米的尺寸，而且它能在較長的一段時間里保持“休眠”狀態(tài)而不進一步生長和傳播。有些腫瘤細胞然后轉(zhuǎn)向血管發(fā)生表型以激活內(nèi)皮細胞，所述內(nèi)皮細胞增殖并成熟成新的毛細血管。這些新形成的血管不僅讓原發(fā)性腫瘤繼續(xù)生長，而且讓轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞傳播并再建群(recolonization)。因而，在腫瘤切片中的微血管密度與乳腺癌及數(shù)種其它腫瘤的患者存活之間觀察到了相關(guān)性。Weidner et al. ,N. Engl. J. Med, 324 :1-6(1991) ；Horak et al.， Lancet, 340 :1120-1124(1992) ；Macchiarini et al.，Lancet，340 145-146 (1992)。尚未完全了解控制血管發(fā)生轉(zhuǎn)換的精確機制，但是認為腫瘤塊的新血管形成源自眾多血管發(fā)生刺激物與抑制物的凈平衡(Folkman, 1995, Nat Med 1(1) :27-31)。血管發(fā)育過程受到嚴密調(diào)節(jié)。迄今為止，多種分子，多為由周圍細胞生成的分泌性因子，已顯示出調(diào)節(jié)EC分化、增殖、遷移和接合成索樣結(jié)構(gòu)。例如，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)已鑒定為涉及刺激血管發(fā)生和誘導(dǎo)血管通透性的關(guān)鍵因子。i^errara et al.， Endocr. Rev. , 18 :4-25 (1997)。甚至單個VEGF等位基因的遺失導(dǎo)致胚胎致死的發(fā)現(xiàn)指向此因子在血管系統(tǒng)的發(fā)育和分化中所發(fā)揮的不可代替的作用。此外，VEGF已顯示為與腫瘤和眼內(nèi)病癥有關(guān)的新血管形成的關(guān)鍵介導(dǎo)物。i^errara et al.，Endocr. Rev.，見上文。VEGF mRNA在多數(shù)所檢查的人腫瘤中過表達。Berkman et al. , J. Clin. Invest. ,91 153-159(1993) ；Brown et al.，Human Pathol. ,26 :86-91(1995) ；Brown et al.，Cancer Res. ,53 :4727-4735(1993) ；Mattern et al.，Brit.J. Cancer,73 :931-934(1996) ；Dvorak et al.，Am. J. Pathol.，146 1029-1039 (1995)。血管形成過程中的有些步驟仍然不是很清楚。具體而言，關(guān)于管發(fā)生如何受到調(diào)節(jié)-血管索如何進展而變成管，和什么因子調(diào)節(jié)這種轉(zhuǎn)換知道的很少。鑒于維管發(fā)生和血管發(fā)生在許多疾病和病癥中的作用，希望有降低或抑制一種或多種引起這些過程的生物學(xué)效應(yīng)的手段。通過述及完整收錄本文中引用的所有參考文獻，包括專利申請和出版物。發(fā)明概述本發(fā)明部分基于多種針對EGFL7的抗體。EGFL7作為一種重要且有利的治療靶，而且本發(fā)明提供抗體，作為治療劑和診斷劑，供靶向與EGFL7表達和/或活性有關(guān)的病理狀況中使用。因而，本發(fā)明提供涉及EGFL7的方法、組合物、試劑盒和制品。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明提供抗EGFL7抗體。在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種抗EGFL7抗體，其包含可變域，該可變域包含至少一種、兩種、三種、四種或五種選自下組的高變區(qū)(HVR)序列⑴包含KX1SASX3OTX4GDSra5S的HVR-Ll，其中&為A或R ;X2 為 H或Q ;)(3為6或V ;)(4選自 D，L，R，S，和 W;且)(5為11或 V(SEQ ID NO :210) ； (ii)包含 GASX1X2EiC3 的 HVR-L2，其中)(1為N或Y;X2選自 L，R 和 Y ；且 & 為 Q 或 S (SEQ ID NO :211)； (iii)包含 QQNNEX1PX2TmHVR-LS,其中 ^C1 為 D 或 E ；且 & 或 Y (SEQ ID NO :212) ； (iv) 包含 GX1X2X3X4TYGX5S 的 HVR-Hl，其中 & 為 H 或 V J2 為 R 或 T ;X3 選自 F，G，R，和 S ;X4 選自 D，G，R，禾口 T ；且 X5 為 M 或 Y (SEQ ID NO :213) ； (ν)包含 GffINX1X2SGVPTX3AX4X5X6X7X8 的 HVR-H2，其中 &選自 1，1，1\和1;)(2為!1或1 ;)(3選自 Ι，Μ，Τ，和 Y J4 為 D 或 H J5 選自 D，M 禾口T;)(6為F或Y;X7為K或S;且 為G或R(SEQ ID NO :214)，和(vi) ^ AxiLGSX2AVDX3 的 HVR-H3，其中或 R;)(2 選自 C，S，和 Y;且)(3為六或 Y(SEQ ID NO :215)。在一些實施方案中，該抗EGFL7抗體包含所有六種上述HVR。在一些實施方案中，HVR-Ll包含選自SEQ ID NO :31和37-43的氨基酸序列，HVR-L2包含選自SEQ ID NO 32和44-47的氨基酸序列，HVR-L3包含選自SEQ ID NO 33和48的氨基酸序列，HVR-Hl包含選自SEQ ID NO 34和49-57的氨基酸序列，HVR-H2包含選自SEQ ID NO 35和58-73的氨基酸序列， 且HVR-H3包含選自SEQ ID NO 36和74-77的氨基酸序列。在一些實施方案中，重鏈包含下述框架序列包含 exiqlvesggglvqpggslrlscaas 的 fr-h1，其中 ^c1 為 i 或 v (seq id no 216)；包含 wvrqapgkgleffx1 的 fr-h2，其中 x1 為 i 或 v (seq id no :217)；包含 rftx1s x2dx3sx4x5tx6ylqmnslraedtavyx7car 的 fr-h3,其中 ^c1 為 f 或 i j2 為 l 或 r ;x3 為 n 或 t ； x4 選自 a，e，k 和 t j5 或 s j6 選自 a，l，m，t 和 v ；且 x7 為 f 或 y (seq id no :218)； 和包含wgqgtlvtvss的fr-h4(seq id no :219)。在一些實施方案中，重鏈包含下述框架序列包含 evqlvesggglvqpggslrlscaas 的 fr-hl (seq id no :197)；包含 wvrqapgkglewv 的 fr-h2 (seq id no :198)；包含 rftisxpnsknt)^ylqmnslraedtavyycar 的 fr-h3，其中 x1 為 l 或 r ;x2 選自 a, l，m，t 和 v (seq id no :220)；和包含 wgqgtlvtvss 的 fr-h4 (seq id no 200)。在一些實施方案中，輕鏈包含下述框架序列包含diqmtqspsslsasvgdrvtitc 的 FR-Ll (SEQ ID NO :201)，包含 WYQQKPGKAPKLLIY 的 FR-L2 (SEQ ID NO :202)，包含 gvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyc 的 fr-l3(seq id no :203)，包含 fgqgtkveik (seq id no :221)或fgqgtkveikr(seq id no :204)的fr-l4。在一些實施方案中，輕鏈包含圖 15 (seq id no :82和83)所示4f11. vl7或4f11. v22的可變域序列。在一些實施方案中，重鏈包含

圖16(seq id n0:84和85)所示4fll.vl7或4fll.v22的可變域序列。在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種抗體，其中輕鏈包含圖15(seq id no :82)所示4f11. vl7的可變域序列且重鏈包含圖16(seq id no :84)所示4f11. vl7的可變域序列。在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種抗體，其中輕鏈包含圖15 (seq id no:8;3)所示4f11.v22的可變域序列且重鏈包含圖16 (seq id no 85)所示4f11. v22的可變域序列。 在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種抗egfl7抗體，其包含可變域，該可變域包含至少一種、兩種、三種、四種或五種選自下組的hvr序列(i)包含 x1x2x3x4x5x6vx7x8x9x101tylx1 ！的 hvr-ll，其中 & 選自 l，q，r，s，和 t j2 選自 p，t，和 w ；x3 為 h或s j4為d或q j5為g或s j6為l或v j7為h或p j8選自i，l，p，t，和y ；知選自n， q或s;x1(i選自a，g，和s;且x11為g或h(seq id no :222) ； (ii)包含 rvsnx1x2s 的 hvr-l2， 其中 &為0 或1 ;且)(2 選自 a，g，f，i，和 t(seq id no 223) ； (iii)包含 x1qsx2x3vplt 的 hvr-l3，其中 & 選自 a，g，i，k，l，n，s，t，和 vj2sc 或t ；且或h(seq id no :224)； (iν)包含 gyx1x2x3dx4yx5n 的 hvr-hl，其中 x1 為 n 或 t j2 為 f 或 v j3 選自 i，m，r，和 s ;χ4 選自 y，q，和 k ；且)(5 為 i 或 m (seq id no :225) ； (ν)包含 gdinx1x2x3x4x5x6hx7x8x9x1OX11x12x13 的hvr-h2，其中x1選自a，l，n,和p成選自d，l，和r j3選自g，k，n, r，s，和y j4為g或 s j5 選自 g，i，k，r，s，τ，和 v j6 選自 g，r，和 t ;χ7 選自 i，v，和 y j8 為 n 或 s ；x9 選自 α， n，禾口 q;x1(1 為 k或 v5x11 為 f或q;x12*k或τ;且 x13選自 g，h，r，和 s(seq id no 226), ^p (vi)包含x1regvyhx2yddyax3dy的hvr-h3，其中x1選自a，n，和τ成為d或ρ ；且&為μ或 w(seq id no :227)。在一些實施方案中，該抗egfl7抗體包含所有六種上述hvr。在一些實施方案中，hvr-ll包含選自seq id no 100和106-1m的氨基酸序列，hvr-l2包含選自seq id no 101和125-129的氨基酸序列，hvr-l3包含選自seq id no :102和130-145的氨基酸序列，hvr-hl包含選自seq id no :103和146-153的氨基酸序列，hvr-h2包含選自seq id no :104禾口 154-187的氨基酸序列，且hvr-h3包含選自seq id no :105禾口 188-192的氨基酸序列。在一些實施方案中，重鏈包含下述框架序列包含evqlvesggglvqpggslrlscaas 的 fr-hl (seq id no :197)；包含 wvrqapgkgleffx1 的 fr-h2，其中 x1 為 i 或 v (seq id no 228)；包含 rxj)(2sx3d)(4sx5x6tx7y)(8qmnslraedtavyyc 的 fr-h3，其中 ^c1 為 f 或 v j2 為 i 或
9L成選自L，R，和V式為K或N ；X5選自K，N，R，和S J6為N或S ；X7選自A，L，和V ；且 & 為 L 或 M(SEQ ID NO 229)；和包含 WGQGTLVTVSS 的 FR_H4(SEQ ID NO :200)。在一些實施方案中，重鏈包含下述框架序列包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS的FR-Hl (SEQ ID NO 197)；包含 WVRQAPGKGLEWV 的 FR-H2(SEQ ID NO :198)；包含 RFTISRK^SKNI^YLQMNSL RAEDTAVYYCAR 的 FR-H3，其中 X1 為 N 或 K ；且 & 選自 A，L,禾口 V(SEQ ID NO :230)；和包含 WGQGTLVTVSS的FR-H4 (SEQ ID NO :200)。在一些實施方案中，輕鏈包含下述框架序列包含 DIQMTQSPSSLSASVa)RVTITC&FR-Ll(SEQ ID NO :201)，包含 WYQQKPGKAPKLLIY 的 FR-L2 (SEQ ID NO 202)，包含 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 的 FR-L3 (SEQ ID NO 203)，包含 FGQGTKVEIK(SEQ ID NO :221)或 FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO :204)的 FR-L4。在一些實施方案中，輕鏈包含圖27 (SEQ ID NO :193禾口 194)所示18F7. v6或18F7. Wk的可變域序列。在一些實施方案中，重鏈包含圖^(SEQ ID NO 195和196)所示18F7. v6或18F7v6k的可變域序列。在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種抗體，其中輕鏈包含圖27 (SEQ ID NO :193)所示18F7. v6的可變域序列且重鏈包含圖^(SEQ ID NO :195)所示18F7. v6的可變域序列。 在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種抗體，其中輕鏈包含圖27 (SEQ ID N0:194)所示18F7. v6k的可變域序列且重鏈包含圖^(SEQ ID NO :196)所示18F7. v6k的可變域序列。在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種抗體，其中框架序列的至少一部分為人共有框架序列。在一些實施方案中，該抗體包含人κ亞組1共有框架序列。在一些實施方案中， 該抗體包含重鏈人亞組III共有框架序列。在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種抗EGFL7抗體，其為雙特異性抗體。在一些實施方案中，該雙特異性抗體結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，例如與bevacizumab或 ranibizumab結(jié)合相同VEGF表位。在一些實施方案中，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明抗體的核酸。在一些實施方案中，本發(fā)明提供包含此類核酸的載體。在一些實施方案中，本發(fā)明提供包含該核酸或載體的宿主細胞。在一些實施方案中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明抗體的組合物。在一些實施方案中，該組合物包含載體。在一些實施方案中，該組合物為藥物組合物。在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種用于制備抗EGFL7抗體的方法，其通過在合適宿主細胞中表達包含編碼本發(fā)明抗體的核酸的載體并回收該抗體來進行。在一些實施方案中，該宿主細胞是原核的。在一些實施方案中，該宿主細胞是真核的。在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種用于治療腫瘤、癌癥、或細胞增殖性病癥的方法，該方法包括將有效量的本發(fā)明抗EGFL7抗體施用于需要此類治療的個體。在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種抗EGFL7抗體，其用于治療腫瘤、癌癥、或細胞增殖性病癥。在一些實施方案中，該癌癥選自下組乳腺癌，結(jié)腸直腸癌，肺癌，食管癌，膀胱癌，卵巢癌，胰腺癌， 和肝細胞癌。在一些實施方案中，該癌癥為乳腺癌、結(jié)腸直腸癌或肺癌。在一些實施方案中， 該細胞增殖性病癥為癌癥。在一些實施方案中，該治療還包括有效量的第二藥物，其中抗EGFL7抗體為第一藥物。在一些實施方案中，該第二藥物為另一種抗體、化療劑、細胞毒劑、抗血管發(fā)生齊U、免疫抑制劑、前藥、細胞因子、細胞因子拮抗劑、細胞毒性放療劑、皮質(zhì)類固醇、止吐劑、 癌癥疫苗、止痛劑、或生長抑制劑。在一些實施方案中，該第二藥物為抗VEGF抗體，例如bevacizumab。在一些實施方案中，該第二藥物在施用抗EGFL7抗體之前或之后施用。在一些實施方案中，該第二藥物與抗EGFL7抗體同時施用。在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種在具有與血管發(fā)生有關(guān)的病理狀況的受試者中降低或抑制血管發(fā)生的方法，包括對受試者施用本發(fā)明的抗體，由此在受試者中降低或抑制血管發(fā)生。在一些實施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的一種抗體，其用于治療與血管發(fā)生有關(guān)的病理狀況。在一些實施方案中，該病理狀況為新生物狀況。在一些實施方案中，該病理狀況為非新生物狀況。在一些實施方案中，該非新生物狀況選自下組糖尿病性和其它增殖性視網(wǎng)膜病，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病，新生血管性青光眼，老年性黃斑變性，糖尿病性黃斑水腫， 角膜新血管形成，角膜移植片新血管形成，視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜新血管形成。在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種在具有與血管發(fā)生有關(guān)的病理狀況的受試者中增強抗血管發(fā)生劑的功效的方法，包括對受試者施用與抗血管發(fā)生劑組合的有效量的本發(fā)明抗體，由此增強所述抗血管發(fā)生劑的抑制活性。在一些實施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的一種抗體，其用于在具有與血管發(fā)生有關(guān)的病理狀況的受試者中增強抗血管發(fā)生劑的功效。在一些實施方案中，該與血管發(fā)生有關(guān)的病理狀況為腫瘤、癌癥或細胞增殖性病癥。在一些實施方案中，該與血管發(fā)生有關(guān)的病理狀況為非新生物狀況。在一些實施方案中，該非新生物狀況選自下組糖尿病性和其它增殖性視網(wǎng)膜病，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病，新生血管性青光目艮，老年性黃斑變性，糖尿病性黃斑水腫，角膜新血管形成，角膜移植片新血管形成，視網(wǎng)膜 /脈絡(luò)膜新血管形成。在一些實施方案中，該抗血管發(fā)生劑在施用抗EGFL7抗體之前或之后施用。在一些實施方案中，該抗血管發(fā)生劑與抗EGFL7抗體同時施用。在一些實施方案中， 該抗血管發(fā)生劑為抗VEGF劑，抗VEGF抗體，例如bevacizumab或ranibizumab。在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種在受試者中降低或抑制腫瘤灌注和滲透性的方法，包括對受試者施用本發(fā)明的抗體。在一些實施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的一種抗體，其用于在受試者中降低或抑制腫瘤灌注和滲透性。在一些實施方案中，該方法或用途進一步包括施用抗血管發(fā)生劑，例如抗VEGF劑(例如抗VEGF抗體，諸如bevacizumab)。附圖簡述圖1描繪來自小鼠(SEQ ID NO 1)和人(SEQ ID ON 2)的EGFL7的氨基酸序列。 標(biāo)示了 EMI1、EMI2、EGF和卷曲螺旋域的位置。截短的EGFL7缺少卷曲螺旋域。肽EMI1 (SEQ ID NO 3)、EMI2 (SEQ ID NO :4)禾口p2 (SEQ ID N0:5)、P4(SEQ ID N0:6)、p5(SEQ ID NO :7)、 和p6(SEQ ID NO :8)的序列標(biāo)有下劃線。圖2描繪人卡帕I共有(SEQ ID NO 9)和4F11. vl (SEQ ID NO :10)的輕鏈可變域的氨基酸序列。位置依照Kabat來編號，而且框示了高變區(qū)。圖3 描繪人亞組 III 共有(SEQ ID NO 11)和 4F11. vl (SEQ ID NO :12)的重鏈可變域的氨基酸序列。位置依照Kabat來編號，而且框示了高變區(qū)。圖4描繪用于轉(zhuǎn)換框架轉(zhuǎn)換文庫中位置的寡核苷酸。顯示了 4F11. vl的DNA序列和用于生成框架轉(zhuǎn)換的寡核苷酸。還顯示了初始和一些所得框架轉(zhuǎn)換區(qū)的氨基酸序列。在一些情況中，基于如何設(shè)計簡并密碼子，還摻入了別的氨基酸殘基。序列標(biāo)識符顯示于相應(yīng)序列右邊的括號中(SEQ ID NO 13-28) ο圖5描繪結(jié)果，證明了 mu4Fll結(jié)合EGFL7能被肽2 (SEQ ID NO 5)阻斷，但不被交疊肽1或3 (分別為SEQ ID NO 29和30)或隨機對照肽阻斷。
圖6描繪展示4F11. VlFab的噬菌體對微量滴定板上固定化的截短的EGFL7的結(jié)合。作為漸增噬菌體濃度的函數(shù)，4F11. Vl噬菌體的兩份樣品都顯示升高的對固定化EGFL7 的結(jié)合。對照噬菌體顯示與4F11. Vl噬菌體在低噬菌體濃度的水平相似的背景結(jié)合，提示一些非特異性噬菌體-EGFL7相互作用。圖7描繪展示4F11. VlFab的噬菌體對EMI2域或p2肽(經(jīng)由游離氨基或游離硫醇基生物素化的)的結(jié)合。圖8描繪框架轉(zhuǎn)換期間在每個框架位置處找到的殘基的豐度。列出了框架轉(zhuǎn)換期間在每個框架位置處引入的氨基酸。圖9描繪在6個“單位置文庫”(SPL)每一個中對3種框架每一個觀察到的⑶R序列變化。文庫通過使用的框架分開(4F11.V1、4F11.V2和4F11.V3)。相對于特定CDR序列突顯了自每一個SPL獲得的變化。這些變化以外的VL和VH序列與相應(yīng)框架相同，而且現(xiàn)在顯示。序列標(biāo)識符顯示于相應(yīng)序列右邊的括號中(SEQ ID NO :31-77)。出現(xiàn)超過一次的序列個體可能不是總是具有相應(yīng)的序列標(biāo)識符。圖10描繪有限文庫1和2的輕鏈可變域的框架和文庫設(shè)計。與用于文庫1 (SEQ ID NO 78)和文庫2 (SEQ ID NO 79)的模板相比，顯示了人卡鉬I共有(SEQ ID NO 9)和 4Fll.vl(SEQ ID NO 10)的氨基酸序列。以穿過氨基酸的斜線顯示了隨機化成所有20種
氨基酸的位置。圖11描繪有限文庫1和2的重鏈可變域的框架和文庫設(shè)計。與用于文庫1 (SEQ ID NO 80)和文庫2 (SEQ ID NO 81)的模板相比，顯示了人亞組III共有(SEQ ID NO 11) 和4Fll.vl(SEQ ID NO :12)的氨基酸序列。以穿過氨基酸的斜線顯示了隨機化成所有20
種氨基酸的位置。圖12描繪在有限文庫1和2中的隨機化位置處觀察到的變化頻率。顯示了輕鏈中位置53和M及重鏈中四、52、和98處選擇的氨基酸偏愛。對任何氨基酸的偏愛(Sigma) 報告為超出假設(shè)氨基酸二項式分布時文庫中給定殘基的隨機機會出現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)目。通過此方法進行的打分說明了建立共有時預(yù)期的密碼子偏倚和取樣統(tǒng)計學(xué)。圖13和14描繪在體外人源化4F11變體對HUVEC粘附固定化人或鼠EGFL7的抑制。在漸增濃度的抗體存在下容許HUVE以20，000個細胞/孔)粘附至用5 μ g/ml人或鼠 EGFL7包被的96孔板。對清洗后仍粘附至板的細胞數(shù)計數(shù)，并作為分配入每個孔的總細胞的百分比來計算。圖 15 描繪人卡帕 I 共有(SEQ ID NO :9)、4F11. vl (SEQ ID NO :10)、4F11. vl7 (SEQ ID N0:82)JP4F11.v22(SEQ ID NO :83)的輕鏈可變域的氨基酸序列。位置依照Kabat來編號，而且框示了高變區(qū)。圖 16 描繪人亞組 III 共有(SEQ ID NO :11)、4F11. vl (SEQ ID N0:12)、4F11. vl7(SEQ ID N0:84)JP4F11.V22(SEQ ID NO :85)的重鏈可變域的氨基酸序列。位置依照 Kabat來編號，而且框示了高變區(qū)。圖17描繪人卡帕I共有(SEQ ID NO 9)和18F7-嫁接(SEQ ID NO 86)的輕鏈可變域的氨基酸序列。位置依照Kabat來編號，而且框示了高變區(qū)。圖18 描繪人亞組 III 共有(SEQ ID NO 11)和 18F7-嫁接(SEQ ID NO 87)的重鏈可變域的氨基酸序列。位置依照Kabat來編號，而且框示了高變區(qū)。
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圖19描繪用于轉(zhuǎn)換框架轉(zhuǎn)換文庫中位置的寡核苷酸。顯示了 18F7-嫁接的DNA序列和用于生成框架轉(zhuǎn)換的寡核苷酸。還顯示了初始和一些所得框架轉(zhuǎn)換區(qū)的氨基酸序列。 在一些情況中，基于如何設(shè)計簡并密碼子，還摻入了別的氨基酸殘基。序列標(biāo)識符顯示于相應(yīng)序列右邊的括號中(SEQ ID NO :88-99)。圖20描繪描繪結(jié)果，證明了結(jié)合EGFL7的mul8F7能被EMIl (SEQ IDNO 3)或肽 P5 (SEQ ID NO: 7)阻斷，但不被肽P4或P6 (分別為SEQ ID NO :6和8)阻斷。用含有帶HA 標(biāo)簽的全長人EGFL7 cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細胞。在200倍過量的競爭性肽存在下用mul8F7免疫沉淀自經(jīng)轉(zhuǎn)染細胞制備的細胞溶胞物。使用抗HA抗體通過Western印跡分析免疫沉淀物。圖21描繪展示18F7-嫁接Fab的噬菌體對微量滴定板上固定化的截短的huEGFL7 的結(jié)合。作為漸增噬菌體濃度的函數(shù)，18F7-嫁接噬菌體的兩份樣品都顯示升高的對固定化 EGFL7的結(jié)合。對照噬菌體顯示與18F7-嫁接噬菌體在低噬菌體濃度的水平相似的背景結(jié)合，提示一些非特異性噬菌體-EGFL7相互作用。圖22描繪展示18F7-嫁接Fab對EMIl域或p5肽(經(jīng)由游離氨基或游離硫醇基生物素化的)的結(jié)合。圖23描繪框架轉(zhuǎn)換期間在每個框架位置處找到的殘基的豐度。列出了框架轉(zhuǎn)換期間在每個框架位置處引入的氨基酸。圖M描繪在6個SPL每一個中對3段框架每一個觀察到的⑶R序列變化。文庫通過使用的框架分開(18F7-嫁接、18F7-K、18F7-KV、和18F7-KA)。相對于特定CDR序列突顯了自每一個SPL獲得的變化。這些變化以外的VL和VH序列與相應(yīng)框架相同，而且現(xiàn)在顯示。序列標(biāo)識符顯示于相應(yīng)序列右邊的括號中(SEQ ID NO :100-192)。出現(xiàn)超過一次的序列個體可能不是總是具有相應(yīng)的序列標(biāo)識符。圖25描繪在體外人源化18F7變體對HUVEC粘附固定化人或小鼠EGFL7的抑制。 在漸增濃度的抗體存在下容許HUVEC (20, 000個細胞/孔)粘附至用5 μ g/ml人或鼠EGFL7 包被的96孔板。對清洗后仍粘附至板的細胞數(shù)計數(shù)，并作為分配入每個孔的總細胞的百分比來計算。圖沈描繪對HUVEC跨孔遷移的抑制。將HUVEC (50，000個細胞每孔)在跨孔板的上槽中培養(yǎng)16小時，并用5μ g/ml重組人EGFL7蛋白包被上槽中的膜。將各種濃度的對照抗體(抗IgE)或不同18F7變體添加至上和下槽中的培養(yǎng)基，而在下孔中添加20ng/ml重組人VEGF-165以刺激HUVEC遷移。對遷移至上槽下側(cè)的細胞計數(shù)，并相對于處理(抗體和濃度)繪圖。圖 27 描繪人卡帕 I 共有(SEQ ID NO :9)、18F7. v6 (SEQ ID NO 193)、和 18F7. v6k(SEQ ID NO :194)的輕鏈可變域的氨基酸序列。位置依照Kabat來編號，而且框示了高變區(qū)。在沒有顯示18F7.州k的序列的情況中(比對的第二和第三部分中)，相應(yīng)序列與 18F7. v6的序列相同。圖沘描繪人亞組 III 共有(SEQ ID NO 11) U8F7. v6 (SEQ ID NO 195)、和 18F7. v6k(SEQ ID NO :196)的重鏈可變域的氨基酸序列。位置依照Kabat來編號，而且框示了高變區(qū)。在沒有顯示18F7.州k的序列的情況中(比對的第一和第三部分中)，相應(yīng)序列與 18F7. v6的序列相同。
圖四描繪單獨地或與抗VEGF抗體組合地使用hul8F7. v6k對H1299異種移植物腫瘤生長的抑制。圖30描繪單獨地和與抗VEGF抗體組合地使用hul8F7. v6k對LXFL 1674異種移植物腫瘤生長的抑制。圖31描繪單獨地和與抗VEGF抗體組合地使用hul8F7. v6k對新生兒氣管血管化的抑制。發(fā)明詳述本發(fā)明提供抗EGFL7抗體的方法、組合物、試劑盒和制品。本文中提供這些方法、組合物、試劑盒和制品的詳情。通用技術(shù)本文中描述或提到的技術(shù)和規(guī)程一般得到了本領(lǐng)域技術(shù)人員的充分理解，而且通常利用常規(guī)方法得以采用，諸如例如下列文獻中記載的廣泛應(yīng)用的方法=Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual 3rd. edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N. Y ；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F. M. Ausubel, et al. eds.，(2003))；叢書 METHODS IN ENZYM0L0GY(Academic Press, Inc.) :PCR2 :A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G.R.Taylor eds. (1995)) ；Harlow and Lane, eds. (1988)ANTIBODIES, ALAB0RAT0RY MANUAL ；及 ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney，ed. (1987))。定義“分離的”抗體指已經(jīng)鑒定且自其天然環(huán)境的一種成分分開和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指將會干擾該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，將抗體純化至(1)根據(jù)Lowry 法的測定，抗體重量超過95%，最優(yōu)選重量超過99%，(2)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或C3)根據(jù)還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE及使用考馬斯藍或優(yōu)選銀染色，達到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分不會存在，那么分離的抗體包括重組細胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至少一個純化步驟來制備?！胺蛛x的”核酸分子指已經(jīng)鑒定且與抗體核酸的天然來源中通常與之關(guān)聯(lián)的至少一種污染性核酸分子分開的核酸分子。分離的核酸分子不同于在自然界中發(fā)現(xiàn)它時的形式或背景。分離的核酸分子因此與存在于天然細胞中時的核酸分子有區(qū)別。然而，分離的核酸分子包括通常表達該抗體的細胞中所包含的核酸分子，例如當(dāng)所述核酸分子在所述細胞中的染色體定位不同于它在天然細胞中的染色體定位時。術(shù)語“抗EGFL7抗體”或“結(jié)合EGFL7的抗體”指能夠以足夠親和力結(jié)合EGFL7，使得該抗體可用作靶向EGFL7的診斷劑和/或治療劑的抗體。在某些實施方案中，結(jié)合EGFL7 的抗體具有彡1 μ M、< 100nM、彡10nM、彡InM、或彡0. InM的解離常數(shù)(Kd)?！敖Y(jié)合親和力”通常指分子(例如抗體)的單一結(jié)合位點與其結(jié)合配偶體(例如抗原)之間全部非共價相互作用總和的強度。除非另有說明，在用于本文時，“結(jié)合親和力”指反映結(jié)合對的成員(例如抗體與抗原)之間1 1相互作用的內(nèi)在結(jié)合親和力。分子X對其配偶體Y的親和力通?？捎媒怆x常數(shù)(Kd)來表述。親和力可通過本領(lǐng)域知道的常用方法來測量，包括本文中所描述的。低親和力抗體通常緩慢的結(jié)合抗原且趨于容易解離，而高親和力抗體通常更快速的結(jié)合抗原且趨于保持更長時間的結(jié)合。本領(lǐng)域知道測量結(jié)合親和力的多種方法，其中任一種都可用于本發(fā)明的目的。下文描述了具體的示例性實施方案。在一個實施方案中，依照本發(fā)明的“Kd”或“Kd值”是通過如下測定法所述使用Fab 型式的目的抗體及其抗原進行的放射性標(biāo)記抗原結(jié)合測定法(RIA)來測量的通過在存在未標(biāo)記抗原的滴定系列的條件下，用最小濃度的125I標(biāo)記抗原平衡，然后用抗Fab抗體包被的平板捕捉結(jié)合的抗原來測量Fab對抗原的溶液結(jié)合親和力(Chen，et al. , (1999) J. Mol Biol 293:865-881)。為了確定測定條件，用50mM碳酸鈉(pH 9.6)中的5yg/ml捕捉用抗Fab抗體(Cappel Labs)包被微量滴定板(Dynex)過夜，隨后用PBS中的2% (w/v)牛血清清蛋白在室溫(約23°C )封閉2-5小時。在非吸附平板(Nunc#269620)中，將IOOpM 或洸pM[125I]_抗原與連續(xù)稀釋的目的Fab混合(例如與I^resta et al.，(1997)Cancer Res. 57 :4593-4599中抗VEGF抗體，F(xiàn)ab-12的評估一致)。然后將目的Fab保溫過夜；不過，保溫可持續(xù)更長時間(例如65個小時)以保證達到平衡。此后，將混合物轉(zhuǎn)移至捕捉板以進行室溫保溫(例如1小時)。然后除去溶液，并用含0. 1 % Tween -20的PBS洗板8 次。平板干燥后，加入150 μ 1/孔閃爍液(Micrc^cint -20 ；I^ackard)，然后在TopCount伽馬計數(shù)器O^ckard)上對平板計數(shù)10分鐘。選擇各Fab給出小于或等于最大結(jié)合之20% 的濃度用于競爭性結(jié)合測定法。依照另一實施方案，Kd或Kd值是通過表面等離振子共振測定法使用 BIAcore -2000 或 BIAcore -3000 (BIAcore，Inc.，Piscataway, NJ)在 25°C使用固定化抗原CM5芯片在約10個響應(yīng)單位(RU)測量的。簡而言之，依照供應(yīng)商的說明書用鹽酸N-乙基-N’ -(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 活化羧甲基化右旋糖苷生物傳感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用IOmM乙酸鈉pH 4. 8將抗原稀釋至5 μ g/ml (約0. 2 μ Μ)，然后以5 μ 1/分鐘的流速注入至獲得約10個響應(yīng)單位 (RU)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注入抗原后，注入IM乙醇胺以封閉未反應(yīng)基團。為了進行動力學(xué)測量，在25°C以約25 μ 1/分鐘的流速注入在含0. 05% Tween -20的PBS(PBST)中兩倍連續(xù)稀釋的Fab (0. 78nM至500nM)。使用簡單一對一朗格繆爾(Langmuir)結(jié)合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)通過同時擬合結(jié)合和解離傳感圖計算結(jié)合速率(k。n) 和解離速率(k。ff)。平衡解離常數(shù)(Kd)以比率k。ff/k。n計算。參見例如Chen，Y.，et al.， (1999) J. Mol. Biol. 293 :865-881。如果根據(jù)上文表面等離振子共振測定法，結(jié)合速率超過 IO6M-1S-1，那么結(jié)合速率可使用熒光淬滅技術(shù)來測定，即根據(jù)分光計諸如配備了斷流裝置的分光光度計(a stop-flow equipped spectrophometer) (Aviv Instruments)或 8000 系列 SLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)中用攪拌比色杯的測量，在存在濃度漸增的抗原的條件下，測量PBS，pH 7. 2中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)在25°C的熒光發(fā)射強度(激發(fā)=295nm ；發(fā)射=340nm, 16nm帶通)的升高或降低。術(shù)語“載體”在用于本文時意指能夠運輸與其連接的其它核酸的核酸分子。一類載體是“質(zhì)?！?，指其中可連接另外的DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一類載體是噬菌體載體。另一類載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區(qū)段連接到病毒基因組中。某些載體能夠在其所導(dǎo)入的宿主細胞中自主復(fù)制(例如具有細菌復(fù)制起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動物載體)可在導(dǎo)入宿主細胞后整合到宿主細胞的基因組中，由此隨著宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)與其可操作連接的基因表達。此類載體在本文中稱為“重組表達載體”(或簡稱為“重組載體”或“表達載體”)。 通常，在重組DNA技術(shù)中有用的表達載體常常是質(zhì)粒形式。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體” 可互換使用。“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互換使用，指任何長度的核苷酸聚合物，包括DNA 和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經(jīng)過修飾的核苷酸或堿基、和/或其類似物，或者是可通過DNA或RNA聚合酶或者通過合成反應(yīng)摻入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含經(jīng)過修飾的核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。如果有的話，對核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可以在裝配聚合物之前或之后進行。核苷酸序列可以由非核苷酸組分中斷。多核苷酸可以在合成后進一步修飾，諸如通過與標(biāo)記物偶聯(lián)。其它類型的修飾包括例如“帽”， 將一個或多個天然存在的核苷酸用類似物替代，核苷酸間修飾諸如例如具有不帶電荷連接 (例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有帶電荷連接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修飾，含有懸垂模塊(pendant moiety)諸如例如蛋白質(zhì)(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚L-賴氨酸等)的修飾、具有嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等)的修飾、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的修飾、含有烷化劑的修飾、具有經(jīng)修飾連接(例如α端基異構(gòu)核酸(anomeric nucleic acid) 等)的修飾、以及未修飾形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖類中的任何羥基可以用例如膦酸(phosphonate)基團、磷酸(phosphate)基團替換，用標(biāo)準(zhǔn)保護基團保護，或活化以制備與別的核苷酸的別的連接，或者可偶聯(lián)至固體和半固體支持物。5'和3'末端OH可磷酸化或者用胺或1-20個碳原子的有機加帽基團模塊取代。其它羥基也可衍生成標(biāo)準(zhǔn)保護基團。多核苷酸還可含有本領(lǐng)域普遍知道的核糖或脫氧核糖糖類的類似物形式，包括例如 2'-氧-甲基、2'-氧-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮-核糖，碳環(huán)糖類似物，α-端基異構(gòu)糖，差向異構(gòu)糖諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，無環(huán)類似物及脫堿基核苷類似物諸如甲基核糖核苷?？捎脗溥x連接基團替換一個或多個磷酸二酯連接。這些備選連接基團包括但不限于以下實施方案，其中磷酸酯用P(0)S( “硫代酸酯，，(thioate))、P(S)S( “二硫代酸酯”(dithioate))、(0)NR2( “酰胺酯” (amidate)) ,P (0) R> P (O)OR'、⑶或CH2 (“甲縮醛”(formacetal))替代，其中R或R'各自獨立為H或者取代或未取代的烷基(1-20個C)，任選含有醚(-0-)連接、芳基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有連接都必需是相同的。前述描述適用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA?！肮押塑账帷痹谟糜诒疚臅r一般指短的多核苷酸，一般是單鏈，一般是合成的，長度一般但不是必需小于約200個核苷酸。術(shù)語“寡核苷酸”與“多核苷酸”并不互相排斥。上文關(guān)于多核苷酸的描述平等且完全適用于寡核苷酸。術(shù)語“EGFL7”(可互換地稱為 “EGF 樣域，多種 7 (EGF-1 ike-domain multiple 7)”)，在用于本文時，除非另有明確說明或者上下文另有說明，指任何天然的或變異的(無論是天然的或合成的)EGFL7多肽。術(shù)語“天然序列”明確涵蓋天然存在的截短或分泌形式 (例如胞外結(jié)構(gòu)域序列)、天然存在的變異形式(例如可變剪接形式)和天然存在的等位變體。術(shù)語“野生型EGFL7”一般指包含天然存在EGFL7蛋白的氨基酸序列的多肽。術(shù)語“野生型EGFL7序列”一般指在天然存在EGFL7中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列。術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”以最廣義互換使用，包括單克隆抗體(例如全長或
16完整單克隆抗體)、多克隆抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性)，而且還可以包括某些抗體片段(如本文中更為詳細描述的)。抗體可以是人的、人源化的和/或親和力成熟的?！翱勺兊摹敝缚勺冇蛑械哪承┎糠衷诳贵w序列間差異廣泛且用于每種特定抗體對其特定抗原的結(jié)合和特異性的實情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個可變域。它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作互補決定區(qū)或高變區(qū)(CDR或HVR，在本文中可互換使用) 的三個區(qū)段?？勺冇蛑休^保守的部分稱作框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個FR，它們大多采取折疊片構(gòu)象，通過形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成折疊片結(jié)構(gòu)一部分的三個HVR連接。每條鏈中的HVR通過FR非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的HVR —起促成抗體的抗原結(jié)合位點的形成(參見Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991))。恒定域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)器功能， 諸如抗體依賴性細胞的(細胞)毒性中抗體的參與。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段，稱為“Fab”片段，各自具有一個抗原結(jié)合位點，及一個剩余的“Fe”片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個F (ab' )2片段，它具有兩個抗原結(jié)合位點且仍能夠交聯(lián)抗原?！癋v”是包含完整抗原識別和結(jié)合位點的最小抗體片段。在雙鏈Fv種類中，此區(qū)由緊密、非共價結(jié)合的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚體組成。在單鏈Fv種類中， 一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域可以通過柔性肽接頭共價相連，使得輕鏈和重鏈在與雙鏈Fv種類類似的“二聚體”結(jié)構(gòu)中相結(jié)合。正是在這種構(gòu)造中，各可變域的三個HVR相互作用而在二聚體表面上確定了抗原結(jié)合位點。六個HVR共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個可變域(或只包含對抗原特異的三個HVR的半個Fv)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，只是親和力低于完整結(jié)合位點。Fab片段還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CHl)。Fab'片段與Fab片段的不同之處在于重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab' -SH是本文中對其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab' 的稱謂。F(ab' )2抗體片段最初是作為在Fab'片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對Fab‘片段生成的。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。根據(jù)其恒定域的氨基酸序列，來自任何脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡帕(κ)和拉姆達(λ)。根據(jù)其重鏈恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可歸入不同的類。免疫球蛋白有五大類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進一步分為亞類(同種型)，例如IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。將與不同類的免疫球蛋白對應(yīng)的重鏈恒定域分別稱作α、δ、 ε、Y和μ。不同類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的?！翱贵w片段”只包含完整抗體的一部分，其中所述部分優(yōu)選保留該部分存在于完整抗體中時通常與之有關(guān)的至少一項、優(yōu)選大多數(shù)或所有功能?？贵w片段的例子包括Fab、 Fab'、F(ab' )2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。在一個實施方案中，抗體片段包含完整抗體的抗原結(jié)合位點，如此保留結(jié)合抗原的能力。在另一個實施方案中，抗體片段，例如包含F(xiàn)c區(qū)的抗體片段，保留通常與Fc區(qū)存在于完整抗體中時通常與之有關(guān)的至少一項生物學(xué)功能，諸如Fcfoi結(jié)合、抗體半衰期調(diào)控、ADCC功能和補體結(jié)合。在一個實施方案中，抗體片段是體內(nèi)半衰期與完整抗體基本上相似的單價抗體。例如，這樣的抗體片段可包含一個抗原結(jié)合臂且其與能夠賦予該片段以體內(nèi)穩(wěn)定性的Fc序列相連。術(shù)語“高變區(qū)”、“HVR”或“HV”在用于本文時指抗體可變域中序列上高度可變和 /或形成結(jié)構(gòu)上定義的環(huán)的區(qū)域。通常，抗體包含六個HVR:三個在VH中(H1、H2、H3)，三個在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗體中，H3和L3展示這六個HVR的最大多樣性，而且認為特別是H3在賦予抗體以精密特異性中發(fā)揮獨特作用。參見例如Xu et al. , Immunity 13 :37-45(2000) Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248 :1-25(Lo, ed.，Human Press, Totowa，NJ，2003)。事實上，僅由重鏈組成的天然存在camelid抗體在缺乏輕鏈時是有功能的且穩(wěn)定的。參見例如Hamers-Casterman et al.，Nature 363 446-448(1993) ；Sheriff et al. , Nature Struct. Biol. 3 :733-736(1996)。本文中使用且涵蓋許多HVR的敘述。Kabat互補決定區(qū)(OTR)是以序列變異性為基石出的，而且是最常用的(Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothia 改為指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196 901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR與Chothia結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗體建模軟件的使用。“接觸(contact) ” HVR是以對可獲得的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的分析為基礎(chǔ)的。下文記錄了這些HVR中每一個的殘基。
環(huán) KabatAbMChothia 接觸
Ll L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 Hl H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Kabat編號)
Hl H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Chothia編號)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101HVR 可包括如下“延伸的 HVR” VL 中的 M-36 或 M_34(L1) ,46-56 或 50-56 (L2) 和 89-97 或 89-96 (L3)及 VH 中的 26-35 (Hl) ,50-65 或 49-65 (H2)和 93-102,94-102 或 95-102 (H3)。對于這些定義中的每一個，可變區(qū)殘基是依照Kabat等，見上文編號的?！翱蚣堋被颉癋R”殘基指可變域中除本文中所定義的高變區(qū)殘基外的那些殘基。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在一個實施方案中，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的HVR 殘基用具有期望特異性、親和力和/或能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類的HVR殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的FR殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有找到的殘基。 進行這些修飾可以是為了進一步改進抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個、 通常兩個基本上整個如下可變域，其中整個或基本上整個高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且整個或基本上整個FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細節(jié)參見例如Jones et al.，Nature 321 :522-525(1986) ；Riechmann et al.，Nature 332 :323-329(1988)； Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596(199 。還可參見例如 Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 :105-115(1998) ；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23 :1035-1038(1995) ；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5 :428-433(1994)；及美國專利 No. 6，982，321 和 7，087，409。術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個抗體是相同的，除了可以以極小量存在的可能突變(例如天然存在突變)外。如此，修飾語“單克隆”表明抗體不是不同抗體混合物的特征。在某些實施方案中，此類單克隆抗體典型的包括包含能結(jié)合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結(jié)合多肽序列是通過包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結(jié)合多肽序列在內(nèi)的過程得到的。例如，選擇過程可以是從眾多克隆(諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組DNA克隆的集合)中選擇獨特克隆。應(yīng)當(dāng)理解，所選擇的靶物結(jié)合序列可進一步改變，例如為了提高對靶物的親和力、將靶物結(jié)合序列人源化、提高其在細胞培養(yǎng)物中的產(chǎn)量、降低其在體內(nèi)的免疫原性、創(chuàng)建多特異性抗體等，而且包含改變后的靶物結(jié)合序列的抗體也是本發(fā)明的單克隆抗體。與典型的包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，單克隆抗體制備物的每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。在它們的特異性之外，單克隆抗體制備物的優(yōu)點在于它們通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語“單克隆”表明抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來生產(chǎn)抗體。例如，將依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過多種技術(shù)來生成，包括例如雜交瘤法(例如 Kohler and Milstein, Nature 256:495-97(1975) ；Hongo et al. , Hybridoma,14(3) :253-260(1995) ；Harlow et al. , Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed. 1988 ；Hammerling et al., 于Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, 563-681, Elsevier, N. Y. , 1981) > 重組DNA法(參見例如美國專利No. 4，816，567)、噬菌體展示技術(shù)(參見例如Clackson et al. , Nature 352:624-628(1991) ；Marks et al. , J. Mol. Biol. 222 :581-597 (1992)； Sidhu et al. , J. Mol. Biol. 338(2) :299-310(2004) ；Lee et al. , J. Mol. Biol. 340(5) 1073-1093(2004) ；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101 (34) :12467-12472(2004)； 及 Lee et al. , J. Immunol. Methods 284 (1-2) : 119-132 O004))、及用于在具有部分或整個人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動物中生成人或人樣抗體的技術(shù)(參見例如 WO 1998/24893 ；WO 1996/34096 ；WO 1996/33735 ；W01991/10741 ； Jakobovits et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551(1993) ；Jakobovits et al.,Nature 362:255—258(1993) ；Bruggemann et al. , Year in Immuno. 7 :33(1993)；美國專利 No. 5，545，807 ；5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 ；5，661，016 ；Marks et al.，Bio/Technology 10 :779-783(1992) ；Lonberg et al.，Nature 368 :856-859(1994)； Morrison, Nature 368 :812-813(1994) ；Fishwild et al. , Nature Biotechnol. 14 845-851(1996) ；Neuberger, Nature Biotechnol. 14 :826(1996)；及 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 :65-93(1995))。單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(參見例如美國專利No. 4，816，567 ； Morrison et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。嵌合抗體包括“靈長類化”抗體，其中抗體的抗原結(jié)合區(qū)衍生自通過例如用感興趣抗原免疫獼猴而生成的抗體。“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。一般地，scFv多肽在Vh與\結(jié)構(gòu)域之間進一步包含多肽接頭，其使得scFv 能夠形成結(jié)合抗原的期望結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見Pluckthun，于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore 編，Springer-Verlag, New York, 第 269-315 頁，1994?！翱乖敝缚贵w可選擇性結(jié)合的預(yù)定抗原。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、 脂質(zhì)、半抗原或其它天然存在的或合成的化合物。術(shù)語“雙抗體”指具有兩個抗原結(jié)合位點的小抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(Vh-VJ中包含相連的重鏈可變域(Vh)和輕鏈可變域(\)。通過使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對， 從而產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。雙抗體更完整的記載于例如EP 404, 097 ；WO 93/11161 ；及 Hollinger et al.，Proc. Natl. Acad. ki. USA，90 :6444-6448 (1993)。三抗體(Triabody) 和四抗體(tetrabody)也記載于 Hudson et al.，Nat. Med. 9 :129-134(2003)。“人抗體”指擁有與由人生成的抗體的氨基酸序列對應(yīng)的氨基酸序列和/或使用本文所公開的用于生成人抗體的任何技術(shù)生成的抗體。人抗體的這種定義明確排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。人抗體可使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來生成，包括噬菌體展示文庫(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227 :381 (1991) ；Marks et al.，J. Mol. Biol. 222 :581 (1991))。還可用于制備人單克隆抗體的是以下文獻中記載的方法Cole et al. , Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) ；Boerner et al.，J. Immunol. 147(1) :86-95 (1991)。還可參見 van Dijk and van de ffinkel,Curr. Opin. Pharmacol.，5 :368-74 (2001)?？赏ㄟ^給已經(jīng)修飾以應(yīng)答抗原性刺激而生成人抗體但其內(nèi)源基因組已經(jīng)失能的轉(zhuǎn)基因動物例如經(jīng)過免疫的異種小鼠(xenomice)施用抗原來制備人抗體(參見例如6，075，181和6，150，584，關(guān)于XEN0M0USE 技術(shù))。還可參見例如Li et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103 :3557-3562 (2006)，關(guān)于經(jīng)人 B-細胞雜交瘤技術(shù)生成的人抗體。術(shù)語“依照Kabat的可變域殘基編號”或“依照Kabat的氨基酸位置編號”及其變體指Kabat et al.，見上文中的抗體編輯用于重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統(tǒng)。使用此編號系統(tǒng)，實際的線性氨基酸序列可包含較少或另外的氨基酸，對應(yīng)于可變域FR或HVR 的縮短或插入。例如，重鏈可變域可包含H2殘基52后的單一氨基酸插入(依照Kabat為殘基52a)及重鏈FR殘基82后的插入殘基(例如依照Kabat為殘基82a、82b和82c等)。 給定抗體的Kabat殘基編號可通過將抗體序列與“標(biāo)準(zhǔn)”Kabat編號序列對比同源區(qū)來確定。Kabat編號系統(tǒng)一般在提及可變域中的殘基(大約是輕鏈殘基1_107和重鏈殘基 1-113)時使用(例如 Kabat et al. , Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md. (1991))?！癊U 編號系統(tǒng)”或“EU指數(shù)”一般在提及免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)中的殘基時使用(例如Kabat et al.，見上文中報道的EU指數(shù))?！癒abat中的EU指數(shù)”指人IgGl EU抗體的殘基編號方式。除非本文中另有說明，提及抗體可變域中的殘基編號指根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的殘基編號方式。除非本文中另有說明，提及抗體恒定域中的殘基編號指根據(jù)EU編號系統(tǒng)的殘基編號方式(例如參見美國臨時申請60/640，323，關(guān)于EU編號方式的圖)?！白钄嘈浴笨贵w或“拮抗性”抗體指抑制或降低其所結(jié)合的抗原的生物學(xué)活性的抗體。某些阻斷性抗體或拮抗性抗體實質(zhì)或完全抑制抗原的生物學(xué)活性。短語“基本上相似”或“基本上相同”在用于本文時表示兩個數(shù)值(例如一個涉及本發(fā)明的抗體而另一個涉及參照/比較抗體)之間足夠高的相似程度，以致本領(lǐng)域技術(shù)人員將認為在用所述數(shù)值(例如Kd值)所測量的生物學(xué)特性背景內(nèi)兩個數(shù)值之間的差異具有很小的或沒有生物學(xué)顯著性。作為參照/比較值的函數(shù)，所述兩個數(shù)值之間的差異例如小于約50%、小于約40%、小于約30%、小于約20%、和/或小于約10%。短語“實質(zhì)性降低”或“實質(zhì)性不同”在用于本文時表示兩個數(shù)值(通常一個與某分子有關(guān)而另一個與參照/比較分子有關(guān))之間足夠高的差異程度，以致本領(lǐng)域技術(shù)人員將認為在用所述數(shù)值(例如Kd值)所測量的生物學(xué)特性背景內(nèi)兩個數(shù)值之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。作為參照/比較分子該數(shù)值的函數(shù)，所述兩個數(shù)值之間的差異例如大于約 10 %，大于約20 %，大于約30 %，大于約40 %，和/或大于約50 %?？贵w“效應(yīng)器功能”指那些可歸于抗體Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體 Fc區(qū))且隨抗體同種型而變化的生物學(xué)活性?？贵w效應(yīng)器功能的例子包括Clq結(jié)合和補體依賴性細胞毒性(CDC) ；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)下調(diào)；和B細胞活化。術(shù)語“Fe區(qū)，，在本文中用于定義免疫球蛋白重鏈的C-末端區(qū)，包括天然序列Fc 區(qū)和變體Fc區(qū)。雖然免疫球蛋白重鏈Fc區(qū)的邊界可以變化，但是人IgG重鏈Fc區(qū)通常定義為自其或ftx)230位置的氨基酸殘基至羧基末端的區(qū)段。Fc區(qū)的C-末端賴氨酸 (殘基447，依照EU編號系統(tǒng))可以消除，例如在生產(chǎn)或純化抗體的過程中，或者通過對編碼抗體重鏈的核酸進行重組工程。相應(yīng)的，完整抗體組合物可包括消除了所有K447殘基的抗體群、沒有消除K447殘基的抗體群、或者混合了有和沒有K447殘基的抗體的抗體群?！肮δ苄訤c區(qū)”擁有天然序列Fc區(qū)的“效應(yīng)器功能”。例示性的“效應(yīng)器功能”包括Clq結(jié)合、⑶C、Fc受體結(jié)合、ADCC、吞噬作用、細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)下調(diào)等。此類效應(yīng)器功能一般要求Fc區(qū)與結(jié)合域(例如抗體可變域)聯(lián)合，而且可使用多種測定法來評估，例如本文定義中所公開的。
“天然序列Fc區(qū)”包含與自然界中找到的Fc區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。 天然序列人Fc區(qū)包括天然序列人IgGl Fc區(qū)(非A和A同種異型)、天然序列人IgG2 Fc 區(qū)、天然序列人IgG3 Fc區(qū)、及天然序列人IgG4 Fc區(qū)，及其天然存在變體?！白儺怓c區(qū)”包含由于至少一處氨基酸修飾，優(yōu)選一處或多處氨基酸替代而與天然序列Fc區(qū)有所不同的氨基酸序列。優(yōu)選的是，變異Fc區(qū)具有與天然序列Fc區(qū)或與親本多肽的Fc區(qū)相比至少一處氨基酸替代，例如在天然序列Fc區(qū)中或在親本多肽的Fc區(qū)中具有約1處至約10處氨基酸替代，優(yōu)選約1處至約5處氨基酸替代。變異Fc區(qū)在本文中將優(yōu)選與天然序列Fc區(qū)和/或親本多肽的Fc區(qū)擁有至少約80%的同源性，最優(yōu)選與其至少約 90 %的同源性，更優(yōu)選與其至少約95 %的同源性。"Fe受體”或“FcR”描述結(jié)合抗體Fc區(qū)的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。 此外，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的FcR( γ受體)，包括Fc γ RI、Fc γ RII和Fc γ RIII亞類的受體，包括這些受體的等位變體和可變剪接形式。FcyRII受體包括Fc γ RIIA (“活化受體”)和Fc y RIIB (“抑制受體”)，它們具有相似的氨基酸序列，區(qū)別主要在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中。 活化受體Fc γ RIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體Fc y RIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見綜述 Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15 :203-234 (1997))。 FcR 的綜述參見 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 :457-492(1991) ；Capel et al. , Immunomethods 4:25-34(1994) ；de Haas et al.，J. Lab. Clin. Med. 126 :330-41 (1995)。術(shù)語"FcR，，在本文中還涵蓋其它 FcR， 包括那些未來將會鑒定的。術(shù)語“Fe受體”或“FcR”還包括新生兒受體，F(xiàn)cfoi，它負責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyer et al.，J. Immunol. 117 :587(1976)和 Kim et al.，J. Immunol. 24 :249(1994)) 并調(diào)節(jié)免疫球蛋白的動態(tài)平衡。測量對Fcfoi的結(jié)合的方法是已知的(參見例如(ihetie and Ward, Immunol. Today 18 :592-8 (1997)) ；Ghetie et al. , Nature Biotechnology, 15(7) :637-640(1997) ；Hinton et al.，J. Biol. Chem. 279(8) :6213-6216(2004) ；WO 2004/92219(Hinton et al.)?？蓽y定人Fcfoi高親和力結(jié)合多肽與人Fcfoi的體內(nèi)結(jié)合和血清半衰期，例如在表達人Fcfoi的轉(zhuǎn)基因小鼠或經(jīng)轉(zhuǎn)染的人細胞系中，或者在施用了 Fc變體多肽的靈長類動物中。WO 00/42072 (Presta)記載了對FcR的結(jié)合提高或降低的抗體變體。還可參見Siields et al. , J. Biol. Chem. 9 (2) :6591-6604 Q001)?！叭诵?yīng)細胞”指表達一種或多種FcR并行使效應(yīng)器功能的白細胞。在某些實施方案中，該細胞至少表達Fc YRIII并行使ADCC效應(yīng)器功能。介導(dǎo)ADCC的人白細胞的例子包括外周血單個核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞。效應(yīng)細胞可以從其天然來源分離，例如血液。“抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性”或“ADCC”指其中結(jié)合到某些細胞毒性細胞 (例如NK細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)上存在的Fc受體(FcR)上的分泌型Ig使得這些細胞毒性效應(yīng)細胞能夠特異性結(jié)合攜帶抗原的靶細胞，隨后用細胞毒素殺死靶細胞的細胞毒性形式。介導(dǎo)ADCC的主要細胞，NK細胞，只表達Fc γ RIII，而單核細胞表達Fc YRI、 Fc yRII、禾口 Fc yRIII。Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 :457-92(1991)第 464 頁表3總結(jié)了造血細胞上的FcR表達。為了評估目的分子的ADCC活性，可進行體外ADCC測定法，諸如美國專利No. 5，500，362或5，821，337或美國專利No. 6，737，056 (Presta)中所記載的。可用于此類測定法的效應(yīng)細胞包括PBMC和NK細胞。或者/另外，可在體內(nèi)評估目的分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes et al.，PNAS (USA) 95 :652-656 (1998) 中所披露的?！把a體依賴性細胞毒性”或“CDC”指存在補體時對靶細胞的溶解。經(jīng)典補體途徑的激活是由補體系統(tǒng)第一組分(Clq)結(jié)合抗體(適宜亞類的)起始的，該抗體已結(jié)合至其關(guān)聯(lián)抗原。為了評估補體激活，可進行CDC測定法，例如如feizzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods202 =163(1996)中所記載的。具有更改的Fc區(qū)氨基酸序列(具有變異 Fc區(qū)的多肽)及提高或降低的Clq結(jié)合能力的多肽變體記載于例如美國專利No. 6，194，551 Bl 和 WO 1999/51642。還可參見例如 Idusogie et al.，J. Immunol. 164 :4178-4184 Q000)?！昂現(xiàn)c區(qū)的抗體”指包含F(xiàn)c區(qū)的抗體。Fc區(qū)的C-末端賴氨酸(依照EU編號系統(tǒng)的殘基447)可以消除，例如在純化抗體的過程中或者通過重組改造編碼抗體的核酸。因此，依照本發(fā)明包含具有Fc區(qū)的抗體的組合物可包含具有K447的抗體、消除了所有K447 的抗體、或具有與沒有K447殘基的抗體的混合物。就本文目的而言，“受體人框架”是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的 VL或VH框架之氨基酸序列的框架?！把苌浴比嗣庖咔虻鞍卓蚣芑蛉斯灿锌蚣艿氖荏w人框架可包含與之相同的氨基酸序列，或者可包含預(yù)先存在的氨基酸序列變化。當(dāng)存在預(yù)先存在的氨基酸變化時，優(yōu)選存在不超過5個，優(yōu)選4個或更少，或者3個或更少預(yù)先存在的氨基酸變化。當(dāng)VH中存在預(yù)先存在的氨基酸變化時，優(yōu)選那些變化只位于71H、73H和78H中的三個、兩個或一個位置；例如，位于那些位置的氨基酸殘基可以是71A、73T和/或78A。在一個實施方案中，VL受體人框架在序列上與VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同?！叭斯灿锌蚣堋敝复砣嗣庖咔虻鞍譜L或VH框架序列選集中最常見的氨基酸殘基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列選集來自可變區(qū)序列亞型。通常，序列亞型是如 Kabat等人的亞型。在一個實施方案中，對于VL，亞型是如Kabat等人的亞型κ I。在一個實施方案中，對于VH，亞型是如Kabat等人的亞型III?！癡H亞型III共有框架”包含從Kabat等人的可變重鏈亞型III中的氨基酸序列獲得的共有序列。在一個實施方案中，VH亞型III共有框架氨基酸序列包含下列各序列的至少一部分或整個全部EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO 197)-Hl-WVRQAPGKGLEffV(SEQ ID NO198)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO :199-H3-WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO :200)。"VL亞型I共有框架”包含從Kabat等人的可變輕鏈κ亞型I中的氨基酸序列獲得的共有序列。在一個實施方案中，VH亞型I共有框架氨基酸序列包含下列各序列的至少一部分或整個DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITC (SEQ ID NO 201)-Ll-ffYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO202)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO :203)-L3-FGQGTKVEIK(SEQ ID NO :221)。“生物學(xué)樣品”(可互換地稱作“樣品”或“組織或細胞樣品”)涵蓋自個體獲得的且可用于診斷或監(jiān)測測定法的多種樣品類型。該定義涵蓋血液和生物學(xué)起源的其它液體樣品、固體組織樣品諸如活檢標(biāo)本或組織培養(yǎng)物或自其衍生的細胞、及其后代。該定義還涵蓋在獲得它們后已經(jīng)進行過操作的樣品，諸如用試劑處理、增溶、或富集某些成分諸如蛋白質(zhì)或多核苷酸、或為切片目的而埋藏在半固體或固體基質(zhì)中。術(shù)語“生物學(xué)樣品”涵蓋臨床樣品，而且還包括培養(yǎng)中的細胞、細胞上清液、細胞溶胞物、血清、血漿、生物學(xué)流體、和組織樣品。生物學(xué)樣品的來源可以是實體組織，像來自新鮮的、冷凍的和/或保存的器官或組織樣品或活檢樣品或穿刺樣品；血液或任何血液組分；體液，諸如腦脊液、羊水、腹膜液、或間質(zhì)液；來自妊娠或受試者發(fā)育中任何時間的細胞。在有些實施方案中，生物學(xué)樣品是自原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤獲得的。生物學(xué)樣品可含有在自然界中不與該組織天然混和的化合物，諸如防腐劑、抗凝劑、緩沖劑、固定劑、營養(yǎng)物、抗生素、諸如此類。為本發(fā)明目的，組織樣品的“切片”指一塊或一片組織樣品，例如從組織樣品上切下來的一薄片組織或細胞。應(yīng)當(dāng)了解，可以制作多片組織樣品切片并依照本發(fā)明進行分析。 在有些實施方案中，將組織樣品的同一切片用于形態(tài)學(xué)和分子兩個水平的分析或者針對蛋白質(zhì)和核酸二者進行分析的方法。術(shù)語“標(biāo)記物”在用于本文時指與試劑諸如核酸探針或抗體直接或間接偶聯(lián)或融合，以便于檢測它所偶聯(lián)或融合的試劑的化合物或組合物。標(biāo)記物可以是自身可檢測的 (例如放射性同位素標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物)，或者在酶標(biāo)記物的情況中，可催化可檢測的底物化合物或組合物的化學(xué)改變?！八幬铩被颉八巹敝赣糜谥委熕懻摰牟“Y或其癥狀、或副作用的活性藥物?！安“Y”或“疾病”指任何會受益于本發(fā)明的物質(zhì)/分子或方法的治療的疾患。這包括慢性和急性病癥或疾病，包括那些使哺乳動物傾向于所討論病癥的病理狀況。本文中待治療的病癥的非限制性例子包括惡性和良性腫瘤；癌瘤、母細胞瘤和肉瘤。術(shù)語“細胞增殖性病癥”和“增殖性病癥”指與一定程度的異常細胞增殖有關(guān)的病癥。在一個實施方案中，細胞增殖性病癥指癌癥。“腫瘤”在用于本文時指所有腫瘤性細胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的， 及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。術(shù)語“癌癥”、“癌性”、“細胞增殖性紊亂”、 “增殖性紊亂”和“腫瘤”在本文中提到時并不互相排斥。術(shù)語“癌癥”和“癌性”指向或描述哺乳動物中特征通常為細胞生長/增殖不受調(diào)控的生理疾患。癌癥的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤和白血病。此類癌癥的更具體例子包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、腦垂體癌、食管癌、星形細胞瘤、軟組織肉瘤、非小細胞肺癌、肺的腺癌、肺的鱗癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、 宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝瘤(h印atoma)、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、腦癌、子宮內(nèi)膜癌、睪丸癌、膽管癌、膽囊癌、胃癌、黑素瘤、及各種類型的頭和頸癌。血管發(fā)生失調(diào)可導(dǎo)致可通過本發(fā)明的組合物和方法來治療的許多病癥。這些病癥包括非贅生性的和贅生性的疾患。贅生病包括但不限于上文所描述的那些。非贅生性病癥包括但不限于不想要的或異常的肥大、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、銀屑病、銀屑病斑塊、結(jié)節(jié)病、動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化斑塊、糖尿病性和其它增殖性視網(wǎng)膜病包括早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、晶狀體后纖維組織增生、老年性黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、角膜移植片排斥、視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜新血管形成、眼角的新血管形成(發(fā)紅)、眼新血管疾病、血管再狹窄、動靜脈畸形(AVM)、腦脊膜瘤、血管瘤、血管纖維瘤、甲狀腺增生(包括格雷夫斯氏(Graves)病)、角膜和其它組織移植、慢性炎癥、肺炎、急性肺損傷 /ARDS、敗血癥、原發(fā)性肺動脈高壓、惡性肺積液(malignant pulmonary effusion)、腦水腫 (例如與急性中風(fēng)/閉合性頭部外傷/創(chuàng)傷有關(guān)的)、滑液炎癥、RA中的血管翳形成、骨化性肌炎、肥大性骨形成、骨關(guān)節(jié)炎(OA)、頑固性腹水、多囊卵巢病、子宮內(nèi)膜異位癥、第三空間流體病(3rd spacing of fluid diseases)(胰腺炎、間隔綜合征、燒傷、腸病)、子宮纖維瘤 (uterine fibroids)、早產(chǎn)、慢性炎癥諸如IBD(克羅恩氏(Crohn)病和潰瘍性結(jié)腸炎)、腎同種異體移植物排斥、炎性腸病、腎病綜合征、不想要的或異常的組織塊生長(非癌性的)、 血友病性關(guān)節(jié)、肥厚性瘢痕、毛發(fā)生長的抑制、奧-韋二氏(Osier-Weber)綜合征、膿性肉芽腫晶狀體后纖維組織增生、硬皮病、沙眼、血管粘連、滑膜炎、皮炎、先兆子癇、腹水、心包積液(諸如與心包炎有關(guān)的)和胸腔積液。術(shù)語“消耗性/衰竭性”病癥(例如衰竭綜合征、惡病質(zhì)、肌肉減少癥 (sarcopenia))指由不希望的和/或不健康的體重減輕或體細胞質(zhì)量減輕引起的病癥。在老年人中以及在AIDS和癌癥患者中，消耗性疾病可導(dǎo)致不希望的體重減輕，包括脂肪和無脂肪隔室二者。消耗性疾病可以由不當(dāng)攝食和/或與不適和/或衰老過程有關(guān)的代謝變化所致。癌癥患者和AIDS患者，以及接受大量手術(shù)或具有慢性感染、免疫學(xué)疾病、甲狀腺功能亢進、克羅恩氏病、心理性疾病、慢性心力衰竭或其它嚴重創(chuàng)傷的患者經(jīng)常遭受消耗性疾病，有時也稱為惡病質(zhì)、代謝障礙、和進食障礙。惡病質(zhì)還表現(xiàn)為高代謝和分解代謝過度。 盡管惡病質(zhì)和消耗性疾病經(jīng)常互換使用，指消耗性疾患，但是至少有一項研究將惡病質(zhì)與衰竭綜合征區(qū)分開，即喪失無脂肪物質(zhì)，特別是體細胞物質(zhì)(Mayer，1999，J. Nutr. 129 (IS Suppl.) :256S-259S)。肌肉減少癥，另一種影響衰老個體的此類病癥，通常表現(xiàn)為喪失肌肉物質(zhì)。如上所述末期消耗性疾病可以在患有惡病質(zhì)或肌肉減少癥的個體中發(fā)生。在用于本文時，“治療”或“處理”指試圖改變所治療個體或細胞的自然進程的臨床干預(yù)，可以是為了預(yù)防或在臨床病理學(xué)的進程中進行。治療的期望效果包括預(yù)防疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)、緩解癥狀、削弱疾病的任何直接或間接病理學(xué)后果、減緩疾病進展的速率、改善或減輕疾病狀態(tài)、及免除或改善預(yù)后。在有些實施方案中，本發(fā)明的抗體用于延遲疾病或病癥的發(fā)生/發(fā)展?！翱寡馨l(fā)生劑”或“血管發(fā)生抑制劑”指或直接或間接抑制血管發(fā)生 (angiogenesis)、血管生成(vasculogenesis)、或不想要的血管通透性的小分子量物質(zhì)、多核苷酸、多肽、分離的蛋白質(zhì)、重組蛋白、抗體、或其偶聯(lián)物或融合蛋白。例如，抗血管發(fā)生劑是上文定義的血管發(fā)生劑的抗體或其它拮抗劑，例如VEGF的抗體、VEGF受體的抗體、阻斷 VEGF受體信號傳導(dǎo)的小分子(例如PTK787/ZK2^4、SU6668、SUTENT /SU11248(sunitinib malate)、AMG706)?？寡馨l(fā)生劑還包括天然血管發(fā)生抑制劑，例如血管他丁 (angiostatin)、內(nèi)皮他丁 (endostatin)等。參見例如 Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol.，53 :217-39(1991) ；Streit and Detmar，Oncogene, 22 :3172-3179 Q003)(例如列舉惡性黑素瘤中抗血管發(fā)生療法的表3) ；Ferrara & Alitalo，Nature Medicine 5(12) 1359-1364(1999) ；Tonini et al.，Oncogene，22 :6549-6556 Q003)(例如列舉抗血管發(fā)生因子的表2) ；Sato Int. J. Clin. Oncol.，8 =200-206(2003)(例如列舉臨床試驗中所使用的抗血管發(fā)生劑的表1)?！皞€體”、“受試者”或“患者”指脊椎動物。在某些實施方案中，脊椎動物為哺乳動物。哺乳動物包括但不限于牲畜(諸如牛)、運動用動物、寵物(諸如貓、犬、和馬)、靈長類動物、小鼠和大鼠。在某些實施方案中，哺乳動物為人?！坝行Я俊敝冈诒匦璧膭┝亢蜁r間上有效實現(xiàn)期望的治療或預(yù)防效果的量。本發(fā)明的物質(zhì)/分子、拮抗劑或激動劑的“治療有效量”可根據(jù)諸如個體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重及該物質(zhì)/分子、激動劑或拮抗劑在個體中引發(fā)期望應(yīng)答的能力等因素而變化。治療有效量還指該物質(zhì)/分子、激動劑或拮抗劑的治療有益效果勝過任何有毒或有害后果的量?！邦A(yù)防有效量”指在必需的劑量和時間上有效實現(xiàn)期望的預(yù)防效果的量。 通常而非必然，由于預(yù)防劑量是在疾病發(fā)作之前或在疾病的早期用于受試者的，因此預(yù)防有效量會低于治療有效量。術(shù)語“細胞毒劑”在用于本文時指抑制或防止細胞的功能和/或引起細胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語意圖包括放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32 和Lu的放射性同位素；化療劑，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、長春花生物堿類(vinca alkaloids)(長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、依托泊昔(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法倉(melphalan)、絲裂霄素(mitomycin)C、 苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅霉素(daunorubicin)或其它嵌入劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；和毒素，諸如小分子毒素或者細菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體；及下文披露的各種抗腫瘤藥或抗癌藥。下文記載了其它細胞毒劑。 殺腫瘤藥引起腫瘤細胞的破壞。“毒素”指能夠?qū)毎纳L或增殖產(chǎn)生有害效果的任何物質(zhì)?！盎焺敝缚捎糜谥委煱┌Y的化學(xué)化合物。化療劑的實例包括烷化劑類(alkylating agents)，諸如塞替派(thiotepa)禾口環(huán)憐酷胺(cyclophosphamide) (CYTOXAN )；磺酸烷基酯類(alkyl sulfonates)，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類(aziridines)，諸如苯佐替派(benzod印a)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturecbpa)和烏瑞替派(ured印a)；乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamines)， 包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺 (triethylenephosphoramide)、三乙撐硫代憐酉先胺(triethylenethiophosphoramide) 和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝內(nèi)酯類(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)) ； δ -9-四氫大麻酚 (tetrahydrocannabinol)(屈大麻 ) (dronabinol) ,MARIN0L ) ； β -拉中白酉昆(Iapachone)； 拉帕醇(Iapachol)；秋水仙素類(colchicines)；白樺脂酸(betulinic acid)；喜樹堿 (camptothecin)(包括合成類似物托泊替康(topotecan) (HYCAMTIN )、CPT_11 (伊立替康 (irinotecan), CAMPTOSAR )、乙酰喜樹堿、東莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜樹堿)； 苔蘚抑素(bryostatin) ；callystatin ;CC_1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)； 鬼白酸(podophyllinic acid)；替尼泊昔(teniposide)；隱藻素類(cryptophycins) (特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他汀(dolastatin) ；duocarmycin (包括合成類似物，KW-2189 和 CB1-TM1)；艾槽塞洛素(eleutherobin) ；pancratistatin ； sarcodictyin ；海綿抑素(spongistatin)；氮芥類(nitrogen mustards),諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酉先胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、 鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法倉(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾酉享(phenesterine)、撥尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿啼唆氮芥(uracil mustard)；亞硝脲類(nitrosoureas),諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀 (Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素Y II和加利車霉素 ω Il (參見例如 Nicolaou et al. , Angew. Chem Intl. Ed. Engl. , 33 183-186 (1994))； CDP323，一種口服α-4整聯(lián)蛋白抑制劑；蒽環(huán)類抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A ；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、 氨茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素 C(cactinomycin) > carabicin、洋紅霄素(carminomycin) ^ ^m ^ MM (carzinophilin) > 色霉素(chromomycin)、方文線菌素 D (dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6_ 二氮_5_氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括 ADRIAMYCIN 、嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射劑(D0XIL )、脂質(zhì)體多柔比星TLC D-99(MY0CET )、PEG化脂質(zhì)體多柔比星(CAELYX )、和脫氧多柔比星)、表柔比星(印irubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素 C、霉酚酸(mycophenolic acid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin) > 培洛霉素(ρ印lomycin)、泊非霉素(potf iromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(str印tonigrin)、鏈佐星(Sti^ptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物類，諸如甲氨蝶呤、吉西他濱 (gemcitabine) (GEMZAR )、替力卩氟(tegafur) (UFTORAL )、卡培他濱(capecitabine) (XEL0DA )、埃坡霉素(印othilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉 M (denopterin)、甲 M 蟲f Πφ、蟲f St^IMSI (pteropterin) > H ￥ ffi ^ (trimetrexate)； 嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤 (thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、 阿扎胞苷(azacitidine)、6_氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、 氟尿苷(floxuridine)；雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮 (dromostanolone propionate)、表硫雄酉享(epitiostanol)、美雄燒(mepitiostane)、 睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦 (mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸(folinic acid)；醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸 (aminolevulinic acid)；恩尿啼唆(eniluracil)；安口丫唆(amsacrine) ；bestrabucil ； 比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛
27(demecolcine)；地口丫酉昆(diaziquone) ；elfornithine ；依禾lJSt 安(elliptinium acetate)； epothilone ；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea)；香菇多糖(Ientinan)； 氯尼達明(Ionidamine)；美登木素生物堿類(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine) 禾口安絲菌素(ansamitocin)；米托月瓜月宗(mitoguazone)；米托惠酉昆(mitoxantrone)； 莫哌達醇(mopidamol) ； 二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁 (pentostatin)；蛋 M M ^f (phenamet) ； 口比柔比星(pirarubicin)；洛索惠酉昆(Iosoxantrone) ；2_ 乙基酰胼(ethylhydrazide)；丙卡巴胼(procartazine) ；PSK 多糖復(fù)合物(JHS Natural Products, Eugene, OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲蘭 (sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺酉昆 (triaziquone) ；2,2'，2〃 _ 三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是 T-2 毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、桿孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；烏拉坦 (urethan)；長春地辛(vindesine) (ELDISINE FILDESIN )；達卡巴嗪(dacarbazine)； 甘露酉享氮芥(mannomustine) ；二溴甘露酉享(mitobronitol) ；二溴衛(wèi)矛酉享(mitolactol)； 哌泊溴燒(pipobroman) ；gacytosine ；阿糖胞苷(arabinoside) ( “Ara-C")；塞替派 (thiotepa)；類紫杉醇(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel) (TAXOL )、清蛋白改造的納米顆粒劑型帕利他塞(ABRAXANE )和多西他塞(doxetaxel) (TAXOTERE )；苯丁酸 M^f (chlorambucil) ； 6- ρτ -^Β Πφ (thioguanine) 5 ^!^ (mercaptopurine) ； 蝶呤(methotrexate)；鉬類似物，諸如順鉬(cisplatin)、奧沙利鉬(oxaliplatin)(例如 ELOXATIN )和卡鉬(carboplatin)；長春藥類(vincas)，其阻止微管蛋白聚合形成微管， 包括長春堿(vinblastine) (VELBAN )、長春新堿(vincristine) (ONCOVIN )、長春地辛 (vindesine) (ELDISINE ,FILDESIN )、和長春瑞濱(vinorelbine) (NAVELBINE )；依托泊苷(etoposide) (VP-16)；異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；亞葉酸 (Ieucovorin)；能滅瘤(novantrone) ；{衣達曲沙(edatrexate) : (daunomycin)； 氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸鹽(ibandronate)；拓撲異構(gòu)酶抑制劑RFS 2000 ；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類維A酸(retinoids)，諸如維A酸(retinoic acid)，包括貝沙羅汀(bexarotene) (TARGRETIN ) ；二膦酸鹽類(bisphosphonates)，諸如氯膦酸鹽 (clodronate)(例如 B0NEF0S ⑧或 OSTAC )、依替膦酸鈉(etidronate) (DIDROCAL )、 NE-58095、唑來膦酸 / 唑來膦酸鹽(zoledronicacid/zoledronate) (ZOMETA )、阿倫膦酸鹽(alendronate) (FOSAMAX )、帕米膦酸鹽(pamidronate) (AREDIA )、替魯膦酸鹽 (tiludronate) (SKELID )或利塞膦酸鹽(risedronate) (ACTONEL )；以及曲沙他濱 (troxacitabine) (1，3_ 二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制涉及異常細胞增殖的信號途經(jīng)中的基因表達的反義寡核苷酸，諸如例如I3KC-Ci、Raf、H-RaS和表皮生長因子受體(EGF-R)；疫苗，諸如THERATOPE 疫苗和基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN 疫苗、LEUVECTIN 疫苗和VAXID 疫苗；拓撲異構(gòu)酶1抑制劑(例如LURTOTECAN )；rmRH(例如 ABARELIX ) ；BAY439006(sorafenib ;Bayer) ；SU—11248(sunitinib， SUTENT Pfizer)；哌立福辛(perifosine)，C0X-2 抑制劑(如塞來考昔(celecoxib) 或艾托考昔(etoricoxib))，蛋白體抑制劑(例如 PS341) ；bortezomib (VELCADE )； CCI-779 ;tipifarnib(R11577) ;orafenib， ABT510 ;Bcl-2 抑制劑，諸如 oblimersen sodium(GENASENSE ) ；pixantrone ；EGFR抑制劑(見下文定義)；酪氨酸激酶抑制劑(見下文定義)；絲氨酸-蘇氨酸激酶抑制劑，諸如雷帕霉素(rapamycin) (sirolimus，RAPAMUNE )；法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，諸如lonafarnib (SCH 6636，SARASARTM)；及任何上述各項的藥學(xué)可接受鹽、酸或衍生物；以及兩種或更多種上述各項的組合，諸如CHOP (環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松龍聯(lián)合療法的縮寫)和FOLFOX(奧沙利鉬(EL0XATIN )聯(lián)合5-FU和亞葉酸的治療方案的縮寫)。本文中定義的化療劑包括起調(diào)節(jié)、降低、阻斷或抑制可促進癌生長的激素效果作用的“抗激素劑”或“內(nèi)分泌治療劑”類。它們自身可以是激素，包括但不限于具有混合的激動劑/拮抗劑特性的抗雌激素類，包括他莫昔芬(tamoxifen) (NOLVADEX)、4_羥基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene) (FAREST0N )、艾多昔芬(idoxifene)、屈洛昔芬 (droloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene) (EVISTA )、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬 (keoxifene)，和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑類(SERM)，諸如SERM3 ；沒有激動劑特性的純的抗雌激素類，諸如氟維司群(fulvestrant) (FASL0DEX )和EM800 (此類藥劑可阻斷雌激素受體(ER) 二聚化、抑制DNA結(jié)合、提高ER周轉(zhuǎn)、和/或遏制ER水平)；芳香酶抑制劑類，包括類固醇芳香酶抑制劑類，諸如福美坦(formestane)和依西美坦(exemestane) (AR0MASIN )，和非類固醇芳香酶抑制劑類，諸如阿那曲唑(anastrozole) (ARIMIDEX )、 來曲唑(Ietrozole) (FEMARA )和氨魯米特(aminoglutethimide)，和其它芳香酶抑制劑類，包括伏氯唑(vorozole) (RIVISOR )、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate) (MEGASE )、法倔唑(fadrozole)和4 (5)-咪唑；促黃體生成激素釋放激素激動劑類，包括亮丙瑞林 (Ieuprolide) (LUPR0N 和 ELIGARD )、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)禾口曲普瑞林(triptorelin)；性類固醇類(sex steroids)，包括妊娠素類(progestine)，諸如醋酸甲地孕酮和醋酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone acetate)，雌激素類，諸如二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)和普雷馬林(premarin)，和雄激素類/類視黃酸類， 諸如氟甲睪酮(fluoxymesterone)、所有反式視黃酸(transretionic acid)和芬維A胺 (fenretinide)；奧那司酮(onapristone)；抗孕酮類；雌激素受體下調(diào)劑類(ERD)；抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及任何上述物質(zhì)的藥學(xué)可接受鹽、酸或衍生物；以及兩種或更多種上述物質(zhì)的組合?！吧L抑制劑”在用于本文時指在體外或在體內(nèi)抑制細胞(諸如表達EGFL7的細胞)生長的化合物或組合物。因此，生長抑制劑可以是顯著降低處于S期的細胞(諸如表達EGFL7的細胞)百分比的藥劑。生長抑制劑的例子包括阻斷細胞周期行進(處于S期以外的位置)的藥劑，諸如誘導(dǎo)Gl停滯和M期停滯的藥劑。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長春藥類(vincas)(長春新堿(vincristine)和長春堿(vinblastine))、紫杉烷類(taxanes)、 和拓撲異構(gòu)酶Π抑制劑諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(印irubicin)、柔紅霉素 (daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博來霉素(bleomycin)。那些阻滯Gl的藥劑也溢出進入S期停滯，例如DNA烷化劑類諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、 達卡巴嗪(dacarbazine)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、順鉬(cisplatin)、甲氨蝶呤 (methotrexate)、5_ 氣尿口密 (5-fIuorouraci 1)禾口 ara_C。更多信;窗、可參見 Mendelsohn 禾口 Israel 編，〈〈The Molecular Basis of Cancer〉〉，第 1 章，題為"Cell cycle regulation, oncogenes, and antieioplastic drugs", Murakaini 等X，W. B.Saunders, Philadelphia, 1995，例如第13頁。紫杉烷類(紫杉醇(paclitaxel)和多西他賽(docetaxel))是衍生自紫杉樹的抗癌藥。衍生自歐洲紫杉的多西他賽(TAXOTERE ,I hone-P0ulenc Rorer)是紫杉醇(TAXOL , Bristol-Myers Squibb)的半合成類似物。紫杉醇和多西他賽促進由微管蛋白二聚體裝配成微管并通過防止解聚使微管穩(wěn)定，導(dǎo)致對細胞中有絲分裂的抑制?！岸嗳岜刃?Doxorubicin)”是蒽環(huán)類抗生素。多柔比星的完整化學(xué)名是(8S-順式)-10-[ (3-氨基-2,3,6-三脫氧-α -L-來蘇-吡喃己糖基)氧基]_7，8，9，10-四氫_6， 8，11-三羥基-8-(羥基乙?；?-1-甲氧基-5，12-萘二酮。(8S-cis)-10-[ (3-amino-2, 3， 6-trideoxy-α -L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetra hydro-6,8,11-trihydrox y-8-(hydroxyacetyl)-l-methoxy-5,12-naphthacenedione含“Fe區(qū)多肽”指包含F(xiàn)c區(qū)的多肽，諸如抗體或免疫粘附素(見下文定義)。Fc 區(qū)的C-末端賴氨酸(依照EU編號系統(tǒng)的殘基447)可以消除，例如在純化多肽的過程中或者通過重組改造編碼多肽的核酸。因此，依照本發(fā)明包含具有Fc區(qū)的多肽的組合物可包含具有K447的多肽、消除了所有K447的多肽、或具有與沒有K447殘基的多肽的混合物。貫穿本說明書和權(quán)利要求書，詞語“包含”、“包括”、“含有”或其變化形式應(yīng)當(dāng)理解為暗示包括所述整數(shù)或整數(shù)組，但不排除任何其它整數(shù)或整數(shù)組。牛成展示HAMA應(yīng)答降低或缺失的變體抗體HAMA應(yīng)答降低或消除是合適治療劑的臨床開發(fā)的一個重要方面。參見例如 Khaxzaeli et al. , J. Natl. Cancer Inst. (1988) , 80 937 Jaffers et al., Transplantation (1986), 41 :572 ；Shawler et al. , J. Immunol. (1985),135 :1530 ；Sears et al. , J. Biol. Response Mod. (1984) ,3 138 ；Miller et al. , Blood(1983),62 988 ； Hakimi et al. , J. Immunol. (1991),147 :1352 ； Reichmann et al. , Nature (1988),332 323 Junghans et al.，Cancer Res. (1990)，50 :1495。正如本文所述，本發(fā)明提供了經(jīng)人源化使得HAMA應(yīng)答降低或消除的抗體。這些抗體的變體還可使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法獲得，其中有些在下文中有進一步描述。例如，來自本文所述抗體的氨基酸序列可充當(dāng)框架和/或高變序列多樣化的起始 (親本)序列。起始高變序列所連接的選定框架序列在本文中稱為受體人框架。盡管受體人框架可來自或衍生自人免疫球蛋白(其VL和/或VH區(qū))，優(yōu)選受體人框架來自或衍生自人共有框架序列，因為這樣的框架已證實在人類患者中具有最小免疫原性或者沒有免疫原性。當(dāng)受體衍生自人免疫球蛋白時，可任選根據(jù)它與供體框架序列的同源性來選擇人框架序列，即將供體框架序列與人框架序列集合中的各種人框架序列比對，并選擇最具同源性的框架序列作為受體。在一個實施方案中，本文中的人共有框架來自或衍生自VH亞型III和/或VL κ 亞型I共有框架序列。因此，VH受體人框架可包含一種、兩種、三種或所有如下框架序列包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO :197)的 FR1，包含WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO :198)的 FR2，包含RFTISXiDtSKNI^YLQMNSLRAEDTAVYYC^SEQ ID NO 加5)的 FR3,其中 ^C1 是 A 或 R, & 是 T 或 N，而 & 是 A 或 L，包含 WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO :200)的 FR4。在一個實施方案中，VH受體人框架包含一種、兩種、三種或所有如下框架序列
包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO :197)的 FR1，包含WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO :198)的 FR2，包含RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO :231)、RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA(SEQ ID NO :206)、RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO :207)、RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCS(SEQ ID NO :208)或RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSR(SEQ ID NO :209)的 FR3，包含WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO :200)的 FR4。VL受體人框架可包含一種、兩種、三種或所有如下框架序列包含DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITC(SEQID NO :201)的 FR1，包含WYQQKPGKAH(LLIY (SEQ ID NO 202)的 FR2，包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO :203)的 FR3，包含F(xiàn)GQGTKVEIK(SEQ ID NO :221)的 FR4。雖然受體可在序列上與選定的人框架序列相同，無論它是來自人免疫球蛋白或人共有框架，本發(fā)明設(shè)想了受體序列可包含相對于人免疫球蛋白序列或人共有框架序列而言預(yù)先存在的氨基酸替代。這些預(yù)先存在的替代優(yōu)選是最小限度的；通常只是相對于人免疫球蛋白序列或共有框架序列而言的四個、三個、兩個或一個氨基酸差異。將非人抗體的高變區(qū)殘基摻入VL和/或VH受體人框架。例如，可摻入對應(yīng)于 Kabat⑶R殘基、Chothia高變環(huán)殘基、Abm殘基和/或接觸殘基的殘基。任選的是，摻入如下延伸的高變區(qū)殘基:24-34 (Li)、50-56 (L2)和 89-97 (L3)，洸_35 (Hl)、50-65 或 49-65 (H2) 和 93-102,94-102 或 95-102(H3)。當(dāng)本文中討論高變區(qū)殘基的“摻入”時，應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會這可以各種方式實現(xiàn)，例如編碼期望氨基酸殘基的核酸可通過突變編碼小鼠可變區(qū)序列的核酸使得其框架殘基改變成受體人框架殘基，或者通過突變編碼人可變區(qū)序列的核酸使得高變區(qū)殘基改變成非人殘基， 或者通過合成編碼期望序列的核酸等等而產(chǎn)生。在本文的實施例中，高變區(qū)移植變體是使用各個高變區(qū)的個別寡核苷酸通過編碼人受體序列的核酸的Kunkel誘變而產(chǎn)生的。Kunkel et al.，Methods Enzymo 1. 154 367-382(1987)?？衫贸Ｒ?guī)技術(shù)在框架和/或高變區(qū)內(nèi)引入合適的改變以糾正和重建正確的高變區(qū)-抗原相互作用。噬菌體(噬菌粒)展示(本文在有些內(nèi)容中也稱為噬菌體展示)可作為方便快捷的方法用于在通過序列隨機化構(gòu)建的文庫中生成和篩選許多不同的潛在變體抗體。不過， 熟練技術(shù)人員可利用其它方法來制備和篩選改變的抗體。噬菌體(噬菌粒)展示技術(shù)為生成和選擇與配體諸如抗原結(jié)合的新蛋白質(zhì)提供了有力的工具。噬菌體(噬菌粒)展示技術(shù)的使用使得能夠構(gòu)建大型蛋白質(zhì)變體文庫，可從中快速分揀以高親和力與靶分子結(jié)合的那些序列。通常將編碼變體多肽的核酸與編碼病毒外殼蛋白諸如基因III蛋白或基因VIII蛋白的核酸序列融合。已經(jīng)開發(fā)出了其中編碼蛋白質(zhì)或多肽的核酸序列與編碼一部分基因III蛋白的核酸序列融合的單價噬菌粒展不系統(tǒng)(Bass, S. , Proteins,8 :309(1990) ；Lowman and Wells, Methods :A Companion to Methods in Enzymology，3 :205 (1991))。在單價噬菌粒展示系統(tǒng)中，基因融合物以低水平表達，而且野生型基因III蛋白也表達，從而保留了粒子的侵染性。許多專利中已經(jīng)公開了構(gòu)建肽庫和篩選那些文庫的方法(例如美國專利5，723，286 ；美國專利5，432，018 ；美國專利 5，580，717 ；美國專利 5，427，908 ；和美國專利 5，498，530)。已經(jīng)以許多方式制備了抗體或抗原結(jié)合多肽文庫，包括改變單個基因、插入隨機DNA序列，或克隆一個家族的相關(guān)基因。美國專禾U 5，750，373,5, 733，743,5, 837，242、 5，969，108,6, 172，197,5, 580，717和5，658，727中記載了利用噬菌體(噬菌體粒)展示來展示抗體或抗原結(jié)合片段的方法。然后對文庫篩選具期望特性的抗體或抗原結(jié)合蛋白的表達。本領(lǐng)域已經(jīng)建立了在模板核酸中替代選定氨基酸的方法，其中有些在本文有描述。例如,可用Kunkel法替代高變區(qū)殘基。參見例如Kunkel et al. ,Methods Enzymo 1. 154 367-382(1987)。寡核苷酸序列包含待改變高變區(qū)殘基的一個或多個設(shè)計的密碼子集合。密碼子集合是用于編碼期望變體氨基酸的不同核苷酸三聯(lián)體序列的集合。密碼子集合可用如下所示依照IUB密碼指定特定核苷酸或等摩爾核苷酸混合物的符號來表示。IUB 密碼G 鳥嘌呤A腺嘌呤T胸腺嘧啶C胞嘧啶R (A 或 G)Y (C 或 T)M (A 或 C)K (G 或 T)S (C 或 G)W (A 或 T)H (A 或 C 或 T)B (C 或 G 或 T)V (A 或 C 或 G)D (A 或 G 或 T)N (A 或 C 或 G 或 T)例如，在密碼子集合DVK中，D可以是核苷酸A或G或T ;V可以是A或G或C;而K 可以是G或T。此密碼子集合可呈現(xiàn)18種不同的密碼子，而且可編碼氨基酸Ala、Trp、Tyr、 Lys> Thr> Asn、Lys> Ser> Arg、Asp、Glu、Gly 禾口 Cys0寡核苷酸或引物集合可用標(biāo)準(zhǔn)方法合成。可通過例如固相合成來合成包含代表密碼子集合所提供的核苷酸三聯(lián)體所有可能組合且將編碼期望氨基酸集合的序列的一套寡核苷酸。在某些位置具有選定核苷酸“簡并性”的寡核苷酸的合成是本領(lǐng)域眾所周知的。具有某些密碼子集合的此類核苷酸集合可使用商品化核酸合成儀(可從例如 Applied Biosystems,Foster City，CA購買)來合成，或者可通過商業(yè)途徑獲得(例如Life Technologies, Rockville, MD)。因此，具有特定密碼子集合的合成寡核苷酸集合將通常包
32括具有不同序列的眾多寡核苷酸，所述差異由整個序列內(nèi)的密碼子集合確定。依照本發(fā)明使用時，寡核苷酸具有能夠與可變區(qū)核酸模板雜交的序列且還可包含用于克隆目的的限制酶位點。在一種方法中，可通過寡核苷酸介導(dǎo)的誘變來產(chǎn)生編碼變體氨基酸的核酸序列。 此技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，如Zoller et al. ,Nucleic Acids Res. 10:6487-6504(1987) 中所述。簡單的說，編碼變體氨基酸的核酸序列是如下產(chǎn)生的，將編碼期望密碼子集合的寡核苷酸集合與DNA模板雜交，其中模板是包含可變區(qū)核酸模板序列的單鏈形式質(zhì)粒。雜交后，用DNA聚合酶合成模板的完整第二條互補鏈，其由此將摻入寡核苷酸引物，并將含有寡核苷酸集合所提供的密碼子集合。通常使用長度為至少25個核苷酸的寡核苷酸。最佳寡核苷酸將有12至15個核苷酸與編碼突變的核苷酸任一側(cè)的模板完全互補。這確保了寡核苷酸將與單鏈DNA模板分子正確雜交。寡核苷酸易于使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)合成，諸如Crea et al. ,Proc. Nat' 1. Acad. Sci. USA, 75 :5765 (1978)中所述。DNA模板是由衍生自噬菌體M13載體(商品化M13mpl8和M13mpl9載體是合適的) 的那些載體或如Viera et al.，Meth. Enzymol.，153 :3 (1987)中所述包含單鏈?zhǔn)删w復(fù)制起點的那些載體產(chǎn)生的。因此，為了產(chǎn)生單鏈模板，可將待突變的DNA插入這些載體之一。 Sambrook等人(見上文)在第4. 21-4. 41節(jié)中記載了單鏈模板的產(chǎn)生。為了改變天然DNA序列，在合適的雜交條件下將寡核苷酸與單鏈模板雜交。然后加入DNA聚合酶，通常是T7DNA聚合酶或DNA聚合酶I的Klenow片段，以所述寡核苷酸作為合成的引物合成所述模板的互補鏈。由此形成異源雙鏈體分子，其中DNA的一條鏈編碼基因1的突變形式，另一條鏈(最初的模板)編碼天然的、未改變的基因1序列。然后將此異源雙鏈體分子轉(zhuǎn)化到合適的宿主細胞中，通常是原核生物，諸如大腸桿菌JMlOl。培養(yǎng)細胞后，將它們涂布到瓊脂糖平板上，并用32-磷酸鹽放射性標(biāo)記的寡核苷酸引物進行篩選， 以鑒定包含突變DNA的細菌菌落?？尚薷纳衔膭倓偯枋龅姆椒?，以便產(chǎn)生其中質(zhì)粒兩條鏈均包含突變的同源雙鏈體分子。修改如下如上所述將單鏈寡核苷酸與單鏈模板退火。將三種脫氧核糖核苷酸脫氧核糖腺苷酸(dATP)、脫氧核糖鳥苷酸(dGTP)和脫氧核糖胸苷酸(dTT)的混合物與稱為 dCTP-(aS)(可從Amersham購買)的修飾硫代脫氧核糖胞苷酸混合。將此混合物加入模板-寡核苷酸復(fù)合物中。向此混合物中添加DNA聚合酶后，產(chǎn)生了除突變堿基外與模板相同的一條DNA鏈。此外，這條新的DNA鏈將包含dCTP-(aS)替代dCTP，這用于保護它不受限制性內(nèi)切核酸酶的消化。在用恰當(dāng)?shù)南拗泼笇﹄p鏈異源雙鏈體的模板鏈造成缺刻后，可用 ExoIII核酸酶或其它適當(dāng)?shù)暮怂崦赶０彐?，越過包含待誘變位點的區(qū)域。然后終止反應(yīng)，剩下只有部分是單鏈的分子。然后在存在所有四種脫氧核糖核苷三磷酸、ATP和DNA連接酶的條件下用DNA聚合酶形成完全是雙鏈的DNA同源雙鏈體。然后可將此同源雙鏈體轉(zhuǎn)化到合適的宿主細胞中。正如先前所指出的，寡核苷酸集合的序列在長度上足以與模板核酸雜交，而且還可以，但不是必需的，包含限制性位點?？捎裳苌允删wM13載體或如Viera et al., Meth. Enzymol. , 153 :3(1987)中所述包含單鏈?zhǔn)删w復(fù)制起點的載體的那些載體生成DNA 模板。因此，為了生成單鏈模板，必須將待突變DNA插入這些載體之一。Sambrook等人(見上文)在第4. 21-4. 41節(jié)中記載了單鏈模板的產(chǎn)生。依照另一種方法，可如下構(gòu)建文庫，即提供上游和下游寡核苷酸集合，每個集合含有具不同序列的眾多寡核苷酸，所述不同序列由寡核苷酸序列內(nèi)所提供的密碼子集合確定。上游和下游寡核苷酸集合，與可變區(qū)模板核酸序列一起，可用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，以產(chǎn)生PCR產(chǎn)物“文庫”。PCR產(chǎn)物可稱為“核酸盒”，因為利用已建立的分子生物學(xué)技術(shù)，可將它們與其它相關(guān)或不相關(guān)的核酸序列融合，例如病毒外殼蛋白和二聚化結(jié)構(gòu)域。PCR引物序列包含高變區(qū)中溶劑可達且高度多樣位置的一個或多個設(shè)定密碼子集合。如上所述，密碼子集合是用于編碼期望變體氨基酸的不同核苷酸三聯(lián)體序列的集合。通過適當(dāng)?shù)暮Y選/選擇步驟選定的符合預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)的抗體選出物(selectant)可使用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)進行分離和克隆?？贵w片段本發(fā)明涵蓋抗體片段?？贵w片段可以通過傳統(tǒng)手段來生成，諸如酶促消化，或者通過重組技術(shù)來生成。在某些情況中，使用抗體片段，而不是完整抗體有優(yōu)勢。片段的較小尺寸容許快速清除，而且可導(dǎo)致更易于到達實體瘤。某些抗體片段的綜述參見Hudson等 (2003) Nat. Med. 9 129-134。已經(jīng)開發(fā)了用于生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過蛋白水解消化完整抗體來衍生這些片段(參見例如 Morimoto 等，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107—117(1992)；及 Brennan 等，Science 229 :81(1985)) 然而，現(xiàn)在可直接由重組宿主細胞生成這些片段。Fab、Fv和scFv抗體片段都可在大腸桿菌中表達和由大腸桿菌分泌，如此容許容易地生成大量的這些片段?？蓮纳衔挠懻摰氖删w抗體庫中分離抗體片段?；蛘撸芍苯訌拇竽c桿菌回收Fab' -SH片段并化學(xué)偶聯(lián)以形成F(ab' )2片段 (Carter等，Bio/Technology 10 163-167 (1992)) 0依照另一種方法，可直接從重組宿主細胞培養(yǎng)物分離F(ab' )2片段。包含補救受體結(jié)合表位殘基、具有延長的體內(nèi)半衰期的 Fab和F(ab' )2片段記載于美國專利No. 5，869，046。用于生成抗體片段的其它技術(shù)對于熟練從業(yè)人員會是顯而易見的。在某些實施方案中，抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185 ；美國專利No. 5，571，894 ；及5，587，458。Fv和scFv是具有完整結(jié)合位點、缺少恒定區(qū)的唯一類型；如此，它們可能適于在體內(nèi)使用時降低非特異性結(jié)合?？蓸?gòu)建scFv融合蛋白以生成效應(yīng)器蛋白質(zhì)在scFv的氨基或羧基末端的融合。參見Antibody Engineering, Borrebaeck編，見上文。抗體片段還可以是“線性抗體”，例如如美國專利No. 5，641，870中所記載的。此類線性抗體可以是單特異性的或雙特異性的。人源化抗體本發(fā)明涵蓋人源化抗體。本領(lǐng)域知道用于人源化非人抗體的多種方法。例如，人源化抗體可具有一個或多個從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱為 “輸入”殘基，它們通常取自“輸入”可變域?；旧峡勺裱璚inter及其同事的方法進行人源化(Jones 等(1986)Nature 321 :522-525 ；Riechmann 等(1988)Nature 332 :323-327 ； Verhoeyen等(1988)kience 239 15；34_1536)，即用高變區(qū)序列替代人抗體的對應(yīng)序列。 因此，此類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利No. 4，816，567)，其中顯著少于完整的人可變域用非人物種的相應(yīng)序列替代。在實踐中，人源化抗體通常是如下人抗體，其中有些高變區(qū)殘基和可能的有些FR殘基用嚙齒類抗體類似位點的殘基替代。
用于制備人源化抗體的人輕鏈和重鏈二者可變域的選擇對于降低抗原性可能是重要的。依照所謂的“最適(best-fit)”方法，用嚙齒類抗體的可變域序列對已知人可變域序列的整個文庫進行篩選。然后選擇與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的人框架 (參見例如 Sims 等(1993) J. Immunol. 151 :2296 ；Chothia等(1987) J. Mol. Biol. 196 :901)。 另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于數(shù)種不同的人源化抗體(參見例如Carter等(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 4285 ；Presta 等(1993)J. Immunol. 151 :2623)。一般還希望的是，抗體在人源化后保留對抗原的高親和力和其它有利的生物學(xué)特性。為了達到此目的，依照一種方法，通過使用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物的過程來制備人源化抗體。通?？色@得免疫球蛋白三維模型，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。還可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機程序。通過檢查這些顯示圖像容許分析殘基在候選免疫球蛋白序列發(fā)揮功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可以從受體序列和輸入序列中選出FR殘基并組合，從而得到期望的抗體特征，諸如對靶抗原的親和力升高。一般而言，高變區(qū)殘基直接且最實質(zhì)地涉及對抗原結(jié)合的影響。人抗體本發(fā)明的人抗體可以通過如上所述聯(lián)合選自人衍生噬菌體展示庫的Fv克隆可變域序列與已知的人恒定域序列來構(gòu)建?；蛘撸梢酝ㄟ^雜交瘤方法來生成本發(fā)明的人單克隆抗體。用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系已有記載，例如 Kozbor, J. Immunol. ,133 :3001(1984) ；Brodeur 等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc. , New York,1987)；及 Boerner 等，J. Immunol.，147 :86 (1991).例如，現(xiàn)在有可能生成在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫后生成人抗體完整全集的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)。例如，已經(jīng)記載了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合刪除導(dǎo)致內(nèi)源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉(zhuǎn)移大量人種系免疫球蛋白基因會導(dǎo)致在抗原攻擊后生成人抗體。參見例如Jakobovits
Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :2551 (1993) Jakobovits 等，Nature 362 :255(1993)； Bruggermann 等，Year in Immunol. 7 :33(1993)?；蚋慕M也可用于自非人(例如嚙齒類)抗體衍生人抗體，其中人抗體具有與起始非人抗體相似的親和力和特異性。依照此方法，它也稱為“表位印記”(印itope imprinting)，如本文所述通過噬菌體展示技術(shù)得到的非人抗體片段的重鏈或輕鏈可變域用人V結(jié)構(gòu)域基因全集替換，產(chǎn)生非人鏈/人鏈scFv或Fab嵌合物群。用抗原進行的選擇導(dǎo)致如下非人鏈/人鏈嵌合scFv或Fab的分離，其中人鏈在一級噬菌體展示克隆中消除相應(yīng)的非人鏈后恢復(fù)了抗原結(jié)合位點，即表位決定(印記，imprint)人鏈配偶的選擇。在重復(fù)該過程以替換剩余非人鏈時，得到人抗體(參見PCT WO 93/06213，公布于1993年4月1 日)。與傳統(tǒng)的通過HVR嫁接進行的非人抗體的人源化不同，此技術(shù)提供完全人的抗體，它們不含非人起源的FR或HVR殘基。雙特異性抗體雙特異性抗體指對至少兩種不同抗原具有結(jié)合特異性的單克隆抗體。在某些實施方案中，雙特異性抗體是人抗體或人源化抗體。在某些實施方案中，結(jié)合特異性之一針對 EGFL7，結(jié)合特異性之另一針對任何其它抗原。在某些實施方案中，另一抗原是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，例如抗體bevacizumab和ranibizumab結(jié)合的表位。在某些實施方案中，雙特異性抗體具有包含本發(fā)明抗體之HVR序列的第一臂和包含bevacizumab或ranibizumab 之HVR序列的第二臂。在某些實施方案中，雙特異性抗體包含bevacizumab或ranibizumab 的VH和VL序列。在某些實施方案中，雙特異性抗體可結(jié)合EGFL7的兩種不同表位。雙特異性抗體還可用于將細胞毒劑定位于表達EGFL7的細胞。這些抗體擁有EGFL7結(jié)合臂和結(jié)合細胞毒劑(諸如例如肥皂草毒蛋白、抗干擾素-α、長春花生物堿類、蓖麻毒蛋白A鏈、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂?？蓪㈦p特異性抗體制備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab' )2雙特異性抗體)。用于構(gòu)建雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。在傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組生產(chǎn)基于兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達，其中兩種重鏈具有不同的特異性 (Millstein和Cuello，Nature 305 :537(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配， 這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過親和層析步驟進行的正確分子的純化相當(dāng)麻煩且產(chǎn)物產(chǎn)量低。類似的規(guī)程披露于WO 93/08829，公布于1993年5月13日及Traunecker等， EMBO J. 10 :3655(1991)。依照一種不同的方法，將具有期望結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點)的抗體可變域與免疫球蛋白恒定域序列融合。例如，與包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定域進行融合。在某些實施方案中，在至少一種融合物中存在包含輕鏈結(jié)合所必需的位點的第一重鏈恒定區(qū)(CHl)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和，在需要時，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達載體，并共轉(zhuǎn)染入合適的宿主生物體。在用于構(gòu)建的三種多肽鏈比例不等時提供最佳產(chǎn)量的實施方案中，這為調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供了極大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比例表達導(dǎo)致高產(chǎn)量時或在該比例沒有特別意義時，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入一個表達載體。在該方法的一個實施方案中，雙特異性抗體由一個臂上具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個雙特異性分子中的存在提供了便利的分離途徑， 因此發(fā)現(xiàn)這種不對稱結(jié)構(gòu)便于將期望的雙特異性化合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開。該方法披露于WO 94/04690。關(guān)于生成雙特異性抗體的進一步詳情參見例如Suresh 等，Methodsin Enzymology 121 :210 (1986)。依照另一種方法，可改造一對抗體分子間的界面，以將從重組細胞培養(yǎng)物回收的異二聚體的百分比最大化。界面包含至少部分抗體恒定域(^3結(jié)構(gòu)域。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個或多個小氨基酸側(cè)鏈用較大側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過將大氨基酸側(cè)鏈用較小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換，在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生與大側(cè)鏈相同或相似大小的補償性“空腔”。這提供了較之其它不想要的終產(chǎn)物諸如同二聚體提高異二聚體產(chǎn)量的機制。雙特異性抗體包括交聯(lián)或“異源偶聯(lián)”抗體。例如，異源偶聯(lián)物中的一種抗體可以與親合素偶聯(lián)，另一種抗體與生物素偶聯(lián)。例如，此類抗體已經(jīng)建議用于將免疫系統(tǒng)細胞靶向不想要的細胞(美國專利No. 4，676，980)，及用于治療HIV感染(W0 91/00360, WO 92/00373和EP 03089)。可使用任何便利的交聯(lián)方法來制備異源偶聯(lián)抗體。合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域眾所周知的，連同許多交聯(lián)技術(shù)一起披露于美國專利No. 4，676，980。文獻中還記載了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可使用化學(xué)連接來制備雙特異性抗體。Brerman等，Science 229 =81(1985)記載了通過蛋白水解切割完整抗體以生成F(ab' )2片段的規(guī)程。將這些片段在存在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉的情況下(用以穩(wěn)定鄰近的二硫醇和防止分子間二硫鍵的形成)還原。然后將產(chǎn)生的Fab’片段轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼趸郊姿狨?TM)衍生物。然后將Fab' -TNB衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢復(fù)成Fab'-硫醇，并與等摩爾量的另一種Fab' -TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。最新的進展便于從大腸桿菌直接回收Fab' -SH片段，這些片段可化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。Shalaby等，J. Exp. Med. 175 :217-225(1992)記載了完全人源化的雙特異性抗體F(ab' )2分子的生成。由大腸桿菌分開分泌每種Fab'片段，并在體外進行定向化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能夠結(jié)合過表達HER2受體的細胞和正常人T細胞，以及觸發(fā)人細胞毒性淋巴細胞針對人乳房腫瘤靶物的溶解活性。還記載了直接從重組細胞培養(yǎng)物生成和分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)。例如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。Kostelny等，J. Immunol. 148(5) 1547-1553(1992)。將來自Fos和Jim蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體的Fab‘部分連接?？贵w同二聚體在鉸鏈區(qū)還原以形成單體，然后重新氧化以形成抗體異二聚體。這種方法也可用于生成抗體同二聚體。Hollinger等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448(1993)記載的“雙抗體”技術(shù)提供了構(gòu)建雙特異性抗體片段的替代機制。該片段包含通過接頭相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)，所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對。因此，迫使一個片段上的VH和VL結(jié)構(gòu)域與另一個片段上的互補VL和VH結(jié)構(gòu)域配對，由此形成兩個抗原結(jié)合位點。還報道了通過使用單鏈Fv(sFv) 二聚體構(gòu)建雙特異性抗體片段的另一種策略。參見Gruber等，J. Immunol. 152 :5368(1994)。涵蓋具有超過兩個效價的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt等， J. Immunol. 147 :60(1991)。多價抗體多價抗體可以比二價抗體更快的受到表達該抗體所結(jié)合抗原的細胞的內(nèi)在化 (和/或異化)。本發(fā)明的抗體可以是可容易地通過編碼抗體多肽鏈的核酸的重組表達而生成的、具有三個或更多抗原結(jié)合位點(例如四價抗體)的多價抗體(IgM類別以外的)。 多價抗體可包含二聚化結(jié)構(gòu)域和三個或更多抗原結(jié)合位點。在某些實施方案中，二聚化結(jié)構(gòu)域包含(或由其組成)Fc區(qū)或鉸鏈區(qū)。在這種情況中，抗體會包含F(xiàn)c區(qū)及Fc區(qū)氨基末端的三個或更多抗原結(jié)合位點。在某些實施方案中，多價抗體包含(或由其組成)三個至大約八個抗原結(jié)合位點。在一個這樣的實施方案中，多價抗體包含(或由其組成)四個抗原結(jié)合位點。多價抗體包含至少一條多肽鏈(例如兩條多肽鏈)，其中所述多肽鏈包含兩個或更多可變域。例如，所述多肽鏈可包含VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-FC，其中VDl是第一可變域，VD2是第二可變域，F(xiàn)c是Fc區(qū)的一條多肽鏈，Xl和X2代表氨基酸或多肽，而η是O或 1。例如，多肽鏈可包含VH-CH1-柔性接頭-VH-CHl-Fc區(qū)鏈；或VH-CHl-VH-CHI-Fc區(qū)鏈。本文中的多價抗體可進一步包含至少兩條(例如四條)輕鏈可變域多肽。本文中的多價抗體可包含例如約兩條至約八條輕鏈可變域多肽。本文所涵蓋的輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域，且任選進一步包含CL結(jié)構(gòu)域。單域抗體在有些實施方案中，本發(fā)明的抗體是單域抗體(single-domain antibody) 0單域抗體是包含抗體的整個或部分重鏈可變域或者整個或部分輕鏈可變域的單一多肽鏈。在某些實施方案中，單域抗體是人單域抗體(Domantis，Inc.，ffaltham, MA ；參見例如美國專利 No. 6，248, 516B1)。在一個實施方案中，單域抗體由抗體的整個或部分重鏈可變域組成?？贵w變體在有些實施方案中，涵蓋本文所述抗體的氨基酸序列修飾。例如，可能希望改進抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)特性?？贵w的氨基酸序列變體可以是通過將適宜的變化引入編碼抗體的核苷酸序列或通過肽合成制備的。此類修飾包括例如抗體氨基酸序列內(nèi)的殘基刪除和/或插入和/或替代。可進行任何刪除、插入和替代組合以獲得最終的構(gòu)建物， 倘若最終的構(gòu)建物具有期望的特征。可在制備序列時將氨基酸改變引入受試抗體的氨基酸序列。可用于鑒定抗體中作為優(yōu)選誘變位置的某些殘基或區(qū)域的方法有“丙氨酸掃描誘變，，，如 Cunningham 和 Wells (1989) kience 244 :1081-1085 中所述。這里，鑒定一個殘基或一組靶殘基(例如帶電荷的殘基，諸如arg、asp、his、IysjP glu)并用中性或帶負電荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替換，以影響氨基酸與抗原的相互作用。然后通過在或?qū)μ娲稽c引入更多或其它變體，推敲對替代展示功能敏感性的氨基酸位置。由此，盡管用于引入氨基酸序列變異的位點是預(yù)先決定的，然而突變本身的本質(zhì)不必預(yù)先決定。例如， 為了分析指定位點處突變的后果，在靶密碼子或區(qū)域進行丙氨酸掃描或隨機誘變，并對所表達的免疫球蛋白篩選期望的活性。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，長度范圍由一個殘基至包含一百或更多殘基的多肽，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰殘基的抗體。抗體分子的其它插入變體包括將抗體的N或C端與酶(例如用于ADEPT)或延長抗體血清半衰期的多肽融合。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體發(fā)生了改變以提高或降低抗體糖基化的程度。 多肽的糖基化典型的或是N-連接的或是0-連接的。N-連接指碳水化合物模塊附著于天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-χ-絲氨酸和天冬酰胺-χ-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是將碳水化合物模塊酶促附著于天冬酰胺側(cè)鏈的識別序列。如此， 多肽中這兩種三肽序列任一的存在產(chǎn)生了潛在的糖基化位點。0-連接的糖基化指將糖類 N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附著于羥基氨基酸，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，但也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。向抗體中添加或刪除糖基化位點可通過改變氨基酸序列從而創(chuàng)建或消除一個或多個上述三肽序列而便利地完成(用于N-連接的糖基化位點)。所述改變還可通過向原始抗體的序列中添加、刪除、或替代一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來進行(用于0-連接的糖基化位點)。若抗體包含F(xiàn)c區(qū)，則可改變附著其上的碳水化合物。由哺乳動物細胞生成的天然抗體典型地包含分支的、雙觸角的寡糖，其一般通過N-連接附著于Fc區(qū)CH2結(jié)構(gòu)域的 Asr^97(參見例等(1997)TIBTECH 15:26-32)。寡糖可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、和唾液酸，以及附著至雙觸角寡糖結(jié)構(gòu)“主干” 中GIcNAC的巖藻糖。在一些實施方案中，可以對本發(fā)明抗體中的寡糖進行修飾以創(chuàng)建具有某些改善特性的抗體變體。例如，提供了有缺乏巖藻糖的碳水化合物結(jié)構(gòu)(直接地或間接地)附著于Fc區(qū)的抗體變體。此類變體具有改善的ADCC功能(參見例如美國專利申請?zhí)朥S 2003/0157108(Presta, L.) ；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co·，Ltd))。涉及 “脫巖藻糖型”或“巖藻糖缺乏型”抗體變體的出版物的例子包括-MS 2003/0157108 ；WO 2000/61739 ；WO 2001/29246 ；US 2003/0115614 ；US 2002/0164328 ；US 2004/0093621 ；US 2004/0132140 ；US 2004/0110704 ；US 2004/0110282 ；US 2004/0109865；WO 2003/085119 ； WO 2003/084570 ；WO 2005/035586 ；WO 2005/035778 ；W02005/053742 ；W02002/031140 ； Okazaki 等，J. Mol. Biol. 336 1239-1249 (2004) ；Yamane-Ohnuki 等，Biotech. Bioeng. 87 61M2004)。能夠生成脫巖藻糖化抗體的細胞系的例子包括蛋白質(zhì)巖藻糖化缺陷的 Lecl3 CHO 細胞(Ripka 等，Arch. Biochem. Biophys. 249 :533-545(1986)；美國專利申請?zhí)?US 2003/0157108 Al，Presta，L ；及 WO 2004/056312 Al，Adams 等，尤其是實施例 11)和敲除細胞系，諸如α_1，6-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因FUT8敲除的CHO細胞(參見例如 Yamane-Ohnuki 等，Biotech. Bioeng. 87 :614(2004) ；Kanda, Y.等，Biotechnol. Bioeng., 94(4) :680-688(2006)；及 W02003/085107)。進一步提供了具有等分寡糖的抗體變體，例如其中附著于抗體Fc區(qū)的雙觸角寡糖被GlcNAc等分。此類抗體變體可具有降低的巖藻糖化和/或改善的ADCC功能。此類抗體變體的例子記載于例如WO 2003/011878 (Jean-Mairet等)；美國專利No. 6，602, 684 (Umana 等)；及US 2005/0123M6(Umana等)。還提供了在附著于R區(qū)的寡糖中有至少一個半乳糖殘基的抗體變體。此類抗體變體可具有改善的CDC功能。此類抗體變體記載于例如WO 1997/30087 (Patel 等)；WO 1998/58964(Raju, S.)；及 WO 1999/22764(Raju, S.)。在某些實施方案中，抗體變體包含具有一處或多處進一步改善ADCC的氨基酸替代的Fc區(qū)，例如Fc區(qū)第四8、333、和/或334位(EU殘基編號方式)處的替代。此類替代可以與任何上文所述變異組合存在。在某些實施方案中，本發(fā)明涵蓋了如下抗體變體，其具有一些但非所有效應(yīng)器功能，這使之成為其中抗體體內(nèi)半衰期是重要的但某些效應(yīng)器功能(諸如補體和ADCC)不是必需的或有害的許多應(yīng)用的期望候選物。在某些實施方案中，測量抗體的Fc活性以確保只保留了期望的特性。可進行體外和/或體內(nèi)細胞毒性測定法來證實CDC和/或ADCC活性的降低/消除。例如，可以進行Fc受體(FcR)結(jié)合測定法來確認抗體缺乏Fc γ R結(jié)合(從此有可能缺乏ADCC活性)，但保留Fcfoi結(jié)合能力。介導(dǎo)ADCC的主要細胞，NK細胞，只表達 Fc γ RIII，而單核細胞表達 Fc YRI、Fc γ RII 和 Fc γ RIII。Ravetch and Kinet，Annu. Rev. Immunol. 9 :457-92(1991)第464頁表3總結(jié)了造血細胞上的FcR表達。美國專利 No. 5，500，362中記載了評估感興趣分子的ADCC活性的體外測定法的非限制性實例(還可參見 Hellstrom，I. , et al. Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA83 :7059-7063 (1986) ；Hellstrom, I et al.，Proc. Nat，1 Acad.Sci. USA82 :1499-1502(1985) ；5,821, 337 ；Bruggemann, M. et
39al.，J. Exp. Med. 166 :1351-1361 (1987))?；蛘撸刹捎梅欠派湫詼y定方法(參見例如ACTI 非放射性細胞毒性測定法，其用于流式細胞術(shù)(CellTechnology，he. Mountain View, CA)； 和CytoI1ox 96 非放射性細胞毒性測定法(Promega，Madison，WI))?？捎糜诖祟悳y定法的效應(yīng)細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞?；蛘?另外，可以在體內(nèi)評估感興趣分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes et al. Proc. Nat' 1 Acad. Sci. (USA)95 :652-656(1998)中所披露的。還可以進行Clq結(jié)合測定法來證實抗體不能結(jié)合Clq及從此缺乏CDC活性。為了評估補體激活，可進行CDC測定法(參見例如 Gazzano-Santoro et al. , J. Immunol. Methods 202 :163(1996) ；Cragg,M. S. et al. , Blood 101 :1045-1052(2003)；及 Cragg，M. S.和 Μ. J. Glennie，Blood 103 :2738-2743 (2004))。還可以使用本領(lǐng)域知道的方法進行Fcfoi結(jié)合和體內(nèi)清除/半衰期測定(參見例如Petkova， S. B. et al. , Int' 1. Immunol. 18(12) 1759-1769 (2006)) 提供了另一類具有一處或多處氨基酸替代的抗體變體。進行替代誘變的感興趣位點包括高變區(qū)，但是也涵蓋FR改變?！鞍被崽娲怼敝小皟?yōu)選替代”欄顯示了保守替代。表 1中提供了稱為“例示替代”的更實質(zhì)變化，或如下文參照氨基酸分類進一步描述的。可以將氨基酸替代摻入感興趣抗體，并篩選產(chǎn)物，例如篩選期望的活性，諸如改善的抗原結(jié)合、 降低的免疫原性、改善的ADCC或CDC、等等。氨基酸替代表
權(quán)利要求
1.一種抗EGFL7抗體，其包含可變域，該可變域包含至少一種、兩種、三種、四種或五種選自下組的高變區(qū)(HVR)序列⑴包含KXiSX2SX3DYX4GDSYX5S的HVR-Ll，其中X1為A或R成為H或Q成為G或V ； X4 選自 D，L，R，S，和W;且)(5為M或V(SEQ ID NO :210)；(ii)包含GASX1X2EX3 的 HVR-L2，其中 X1 為 N 或 Y ;X2 選自 L，R 和 Y ；且 & 為 Q 或 S (SEQ ID NO 211)；(iii)包含QQNNEX1PX2TmHVR-LS,其中 ^C1 為 D 或 E ；且 & 或 Y(SEQ ID NO :212)； (iν)包含GX1X2X3X4TYGX5S的HVR-Hl，其中X1為H或V成為R或T成選自F，G，R，禾口S J4 選自 D，G，R，和T;且)(5為M或Y(SEQ ID NO :213)；(ν)包含 GffINX1X2SGVPTX3AX4X5X6X7X8 的 HVR-H2，其中 X1 選自 I，M，T，和 W ;X2 為 H 或 R ； 選自I，M，T，和Y; 為D或H;X5選自D，M和T;)(6為F或Y;X7為K或S;且 為G或 R(SEQ ID NO :214，和(vi)包含Ax1Lgsx2Avdx3的hvr-h3，其中X1為ν或r ;x2選自c，s，和γ ；且&為A或 Y(SEQ ID NO 215)。
2.權(quán)利要求1的抗EGFL7抗體，其包含可變域，該可變域包含下述HVR序列⑴包含KXiSX2SX3DYX4GDSYX5S的HVR-Ll，其中X1為A或R成為H或Q成為G或V ； X4 選自 D，L，R，S，和W;且)(5為M或V(SEQ ID NO :210)；(ii)包含GASX1X2EX3 的 HVR-L2，其中 X1 為 N 或 Y ;X2 選自 L，R 和 Y ；且 & 為 Q 或 S (SEQ ID NO 211)；(iii)包含QQNNEX1PX2TmHVR-LS,其中 ^C1 為 D 或 E ；且 & 或 Y(SEQ ID NO :212)； (iν)包含GX1X2X3X4TYGX5S的HVR-Hl，其中X1為H或V成為R或T成選自F，G，R，禾口S J4 選自 D，G，R，和T;且)(5為M或Y(SEQ ID NO :213)；(ν)包含 GffINX1X2SGVPTX3AX4X5X6X7X8 的 HVR-H2，其中 X1 選自 I，M，T，和 W ;X2 為 H 或 R ； 選自I，M，T，和Y; 為D或H;X5選自D，M和T;)(6為F或Y;X7為K或S;且 為G或 R(SEQ ID NO :214，和(vi)包含Ax1Lgsx2Avdx3的hvr-h3，其中X1為ν或r ;x2選自c，s，和γ ；且&為A或 Y(SEQ ID NO 215)。
3.權(quán)利要求1或2的抗體，其中HVR-Ll包含選自SEQID NO 31和37-43的氨基酸序列，HVR-L2包含選自SEQ ID NO 32和44-47的氨基酸序列，HVR-L3包含選自SEQ ID NO 33和48的氨基酸序列，HVR-Hl包含選自SEQ ID NO 34和49-57的氨基酸序列，HVR-H2包含選自SEQ ID NO 35和58-73的氨基酸序列，且HVR-H3包含選自SEQ ID NO 36和74-77的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1-3任一項的抗體，其中重鏈包含下述框架序列包含 EXiQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 的 FR-Hl，其中 ^C1 為 I 或 V (SEQ ID NO :216)；包含 WVRQAPGKGLEffX1 的 FR-H2，其中 \ 為 I 或 V (SEQ ID NO :217)；包含 RFTiC1 SX2D)(3SX4X5T)(6YLQ mnslraedtavyx7CAR 的 FR-H3，其中 ^c1 為 F 或 ι ;x2 為 L 或 R 成為 Ν 或 τ，& 選自 Α，Ε，κ 禾口 T或 S ;)(6選自 A，L，M，T 和 V ；且X7 為 F或 Y(SEQ ID NO :218)；和包含 WGQGTLVTVSS 的 FR-H4(SEQ ID NO :219)。
5.權(quán)利要求4的抗體，其中重鏈包含下述框架序列包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS的 FR-Hl (SEQ ID NO :197)；包含 WVRQAPGKGLEWV 的 FR-H2 (SEQ ID NO :198)；包含 RFTISX !DNSKNTXJLQMNSLRAEDTAVYYCAR 的 FR-H3，其中 X1 為 L 或 R ;X2 選自 A, L，M，T 禾口 V (SEQ ID NO 220)；和包含 WGQGTLVTVSS 的 FR-H4 (SEQ ID NO :200)。
6.權(quán)利要求4或5的抗體，其中輕鏈包含下述框架序列包含 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 的 FR-Ll (SEQ ID NO :201)，包含 WYQQKPGKAPKLLIY 的 FR-L2 (SEQ ID N0:202)，包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC的FR-L3(SEQ ID NO :203)，包含 FGQGTKVEIK(SEQ ID NO :221)或 FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO :204)的 FR-L4。
7.權(quán)利要求1的抗體，其中輕鏈包含圖15(SEQ ID NO 82)所示4F11. vl7的可變域序列。
8.權(quán)利要求1的抗體，其中輕鏈包含圖15(SEQ ID NO 83)所示4F11. v22的可變域序列。
9.權(quán)利要求1的抗體，其中重鏈包含圖16(SEQID NO :84)所示4F11. vl7的可變域序列。
10.權(quán)利要求1的抗體，其中重鏈包含圖16(SEQ ID NO 85)所示4F11. v22的可變域序列。
11.權(quán)利要求1的抗體，其中輕鏈包含圖15(SEQ ID NO 82)所示4F11. vl7的可變域序列且重鏈包含圖16 (SEQ ID NO 84)所示4F11. vl7的可變域序列。
12.權(quán)利要求1的抗體，其中輕鏈包含圖15(SEQ ID NO 83)所示4F11. v22的可變域序列且重鏈包含圖16 (SEQ ID NO 85)所示4F11. v22的可變域序列。
13.權(quán)利要求1-3任一項的抗體，其中框架序列的至少一部分為人共有框架序列。
14.權(quán)利要求13的抗體，其包含人κ亞組1共有框架序列。
15.權(quán)利要求13的抗體，其包含重鏈人亞組III共有框架序列。
16.一種抗EGFL7抗體，其包含可變域，該可變域包含至少一種、兩種、三種、四種或五種選自下組的HVR序列⑴包含 XAX3X4X5X6VX7X8XiAc1ITYLX11 的 HVR-Ll，其中 & 選自 L，Q，R，S，和 T J2 選自 P， T，和W J3為H或S J4為D或Q 為G或S 為L或V ;X7為H或P J8選自I，L，P，T，和 Y;X9 選自 N，Q或S;X1(1選自A，G，和S;且X11為G或H(SEQ ID NO :222)；(ii)包含RVSNX1X2S的HVR-L2，其中)(1為D或R;且 選自A，G，F(xiàn)，I，和T(SEQID NO: 223)；(iii)包含X1QSX2X3VPLT 的 HVR-L3，其中 X1 選自 A，G，I，K，L，N，S，T，禾口 V J2 為 C 或 T ；且 & 為 F 或 H (SEQ ID NO 224)；(iν)包含 GYX1X2X3DX4YX5N 的 HVR-Hl，其中 X1 為 N 或 T J2 為 F 或 V J3 選自 I，M，R，和 S J4 選自丫，0，和1(;且)(5為 I 或 M(SEQ ID NO :225)；(ν)包含 GDINX1^yyC4X5X6HX7X8X9X1 J11X12X13 的 HVR-H2，其中 & 選自 A，L，N，和 P J2 選自 D，L，和 RJ3 選自 G，K，N，札3，和丫；)(4為6或5;)(5選自 G，I，K，R，S，T，和 V J6 選自 G，R， 和T ;X7選自I，V，和Y成為N或S ;X9選自A，N，和Q ；X10為K或V ；X11為F或Q ；X12為K或 T ；且 X13 選自 G，H，R,和 S (SEQ ID NO 226)；和(Vi)包含 X1Regvyhx2YDDYAx3DY 的 hvr-h3，其中 x1 選自 a，N，和 t 為 D 或 p ；且 & 為 M 或 W(SEQ ID NO :227)。
17.權(quán)利要求16的抗EGFL7抗體，其包含可變域，該可變域包含下述HVR序列⑴包含 ^CAXsXJsXJXJsXiA。ITYLX11 的 HVR-Ll，其中 & 選自 L，Q，R，S，和 T J2 選自 P， T，和W J3為H或S J4為D或Q 為G或S 為L或V ;X7為H或P J8選自I，L，P，T，和 Y;X9 選自 N，Q或S;X1(1選自A，G，和S;且X11為G或H(SEQ ID NO :222)；(ii)包含RVSNX1X2S的HVR-L2，其中)(1為D或R;且 選自A，G，F(xiàn)，I，和T(SEQID NO: 223)；(iii)包含X1QSX2X3VPLT 的 HVR-L3，其中 X1 選自 A，G，I，K，L，N，S，T，禾口 V J2 為 C 或 T ；且 & 為 F 或 H (SEQ ID NO 224)；(iν)包含 GYX1X2X3DX4YX5N 的 HVR-Hl，其中 X1 為 N 或 T J2 為 F 或 V J3 選自 I，M，R，和 S J4 選自丫，0，和1(;且)(5為 I 或 M(SEQ ID NO :225)；(ν)包含 GDINX1^yyC4X5X6HX7X8X9X1 J11X12X13 的 HVR-H2，其中 & 選自 A，L，N，和 P J2 選自 D，L，和 RJ3 選自 G，K，N，札3，和丫；)(4為6或5;)(5選自 G，I，K，R，S，T，和 V J6 選自 G，R， 和T ;X7選自I，V，和Y成為N或S ;X9選自A，N，和Q ；X10為K或V ；X11為F或Q ；X12為K或 T ；且 X13 選自 G，H，R,和 S (SEQ ID NO 226)；和(Vi)包含 X1Regvyhx2YDDYAx3DY 的 HVR-H3，其中 X1 選自 A，N，和 T 為 D 或 P ；且 & 為 M 或 W(SEQ ID NO :227)。
18.權(quán)利要求16或17的抗體，其中HVR-Ll包含選自SEQID NO :100和106-124的氨基酸序列，HVR-L2包含選自SEQ ID NO :101和125-129的氨基酸序列，HVR-L3包含選自 SEQ ID NO 102 和 130-145 的氨基酸序列，HVR-Hl 包含選自 SEQ ID NO :103 和 146-153 的氨基酸序列，HVR-H2包含選自SEQ ID NO :104和1M-187的氨基酸序列，且HVR-H3包含選自SEQ ID NO 105和188-192的氨基酸序列。
19.權(quán)利要求16-18任一項的抗體，其中重鏈包含下述框架序列包含 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 的 FR-Hl (SEQ ID NO :197)；包含 WVRQAPGKGLEWX:的 FR-H2，其中 & 為 I 或 V (SEQ ID NO 228)；包含 RXJ)(2SX3D)(4SX5X6TX7Y)(8QMNSLRAEDTAVYYC 的 FR-H3， 其中或VJ2為I或LJ3選自L，R，和VJ4為K或N J5選自K，N，R，和S J6為N或 S ;X7選自 A，L，和 V ；且或M(SEQ ID NO :229)；和包含 WGQGTLVTVSS 的 FR-H4(SEQ ID NO 200)。
20.權(quán)利要求19的抗體，其中重鏈包含下述框架序列包含 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 的 FR-Hl (SEQ ID NO :197)；包含 WVRQAPGKGLEWV 的 FR-H2 (SEQ ID NO 198)；包含 RFTISRDX1SKNI^2YLQMNSLRAEDTAVYYCAR 的 FR-H3，其中 ^C1 為 N 或 K ；且 & 選自 A，L，和 V (SEQ ID NO :230)；和包含 WGQGTLVTVSS 的 FR-H4 (SEQ ID NO :200)。
21.權(quán)利要求19或20的抗體，其中輕鏈包含下述框架序列包含 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 的 FR-Ll (SEQ ID NO :201)，包含 WYQQKPGKAPKLLIY 的 FR-L2 (SEQ ID NO 202)，包含 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 的 FR-L3 (SEQ ID NO 203)，包含 FGQGTKVEIK(SEQ ID NO :221)或 FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO :204)的 FR-L4。
22.權(quán)利要求16的抗體，其中輕鏈包含圖27(SEQ ID NO :193)所示18F7. v6的可變域序列。
23.權(quán)利要求16的抗體，其中輕鏈包含圖27(SEQ ID NO :194)所示18F7. v6k的可變域序列。
24.權(quán)利要求16的抗體，其中重鏈包含圖^(SEQID NO :195)所示18F7. v6的可變域序列。
25.權(quán)利要求16的抗體，其中重鏈包含圖^(SEQID NO :196)所示18F7. v6k的可變域序列。
26.權(quán)利要求16的抗體，其中輕鏈包含圖27(SEQ ID NO :193)所示18F7. v6的可變域序列且重鏈包含圖^(SEQ ID NO 195)所示18F7. v6的可變域序列。
27.權(quán)利要求16的抗體，其中輕鏈包含圖27(SEQ ID NO :194)所示18F7. v6k的可變域序列且重鏈包含圖^(SEQ ID NO 196)所示18F7. v6k的可變域序列。
28.權(quán)利要求16的抗體，其中框架序列的至少一部分為人共有框架序列。
29.權(quán)利要求28的抗體，其包含人κ亞組1共有框架序列。
30.權(quán)利要求28的抗體，其包含重鏈人亞組III共有框架序列。
31.權(quán)利要求1-30任一項的抗體，其中所述抗體為雙特異性抗體。
32.權(quán)利要求31的雙特異性抗體，其中所述雙特異性抗體結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF) ο
33.權(quán)利要求32的雙特異性抗體，其中所述雙特異性抗體與bevacizumab或 ranibizumab結(jié)合相同VEGF表位。
34.編碼權(quán)利要求1-33任一項的抗體的核酸。
35.包含權(quán)利要求34的核酸的載體。
36.包含權(quán)利要求34的核酸或權(quán)利要求35的載體的宿主細胞。
37.包含權(quán)利要求1-33任一項的抗體的組合物。
38.權(quán)利要求37的組合物，其中該組合物包含載體。
39.權(quán)利要求37或38的組合物，其為藥物組合物。
40.一種用于制備抗EGFL7抗體的方法，所述方法包括(a)在合適宿主細胞中表達權(quán)利要求35的載體，并(b)回收該抗體。
41.權(quán)利要求40的方法，其中該宿主細胞是原核的。
42.權(quán)利要求40的方法，其中該宿主細胞是真核的。
43.一種用于治療腫瘤、癌癥、或細胞增殖性病癥的方法，該方法包括將有效量的權(quán)利要求1-33任一項的抗EGFL7抗體施用于需要此類治療的個體。
44.權(quán)利要求43的方法，其中該癌癥選自下組乳腺癌，結(jié)腸直腸癌，肺癌，食管癌，膀胱癌，卵巢癌，胰腺癌，和肝細胞癌。
45.權(quán)利要求44的方法，其中該癌癥為乳腺癌、結(jié)腸直腸癌或肺癌。
46.權(quán)利要求43的方法，其中該細胞增殖性病癥為癌癥。
47.權(quán)利要求43-46任一項的方法，進一步包括對個體施用有效量的第二藥物，其中抗 EGFL7抗體為第一藥物。
48.權(quán)利要求47的方法，其中該第二藥物為另一種抗體、化療劑、細胞毒劑、抗血管發(fā)生劑、免疫抑制劑、前藥、細胞因子、細胞因子拮抗劑、細胞毒性放療劑、皮質(zhì)類固醇、止吐齊U、癌癥疫苗、止痛劑、或生長抑制劑。
49.權(quán)利要求48的方法，其中該第二藥物為抗VEGF抗體。
50.權(quán)利要求49的方法，其中該第二藥物為bevacizumab。
51.權(quán)利要求47-50任一項的方法，其中該第二藥物在施用抗EGFL7抗體之前或之后施用。
52.權(quán)利要求47-50任一項的方法，其中該第二藥物與抗EGFL7抗體同時施用。
53.一種在具有與血管發(fā)生有關(guān)的病理狀況的受試者中降低或抑制血管發(fā)生的方法， 包括對受試者施用權(quán)利要求1-33任一項的抗體，由此在受試者中降低或抑制血管發(fā)生。
54.權(quán)利要求53的方法，其中所述病理狀況為新生物狀況。
55.權(quán)利要求53的方法，其中所述病理狀況為非新生物狀況。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述非新生物狀況選自下組糖尿病性和其它增殖性視網(wǎng)膜病，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病，新生血管性青光眼，老年性黃斑變性，糖尿病性黃斑水腫，角膜新血管形成，角膜移植片新血管形成，視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜新血管形成。
57.一種在具有與血管發(fā)生有關(guān)的病理狀況的受試者中增強抗血管發(fā)生劑的功效的方法，包括對受試者施用與抗血管發(fā)生劑組合的有效量的權(quán)利要求1-33任一項的抗體，由此增強所述抗血管發(fā)生劑的抑制活性。
58.權(quán)利要求57的方法，其中該與血管發(fā)生有關(guān)的病理狀況為腫瘤、癌癥或細胞增殖性病癥。
59.權(quán)利要求57的方法，其中該與血管發(fā)生有關(guān)的病理狀況為非新生物狀況。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述非新生物狀況選自下組糖尿病性和其它增殖性視網(wǎng)膜病，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病，新生血管性青光眼，老年性黃斑變性，糖尿病性黃斑水腫，角膜新血管形成，角膜移植片新血管形成，視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜新血管形成。
61.權(quán)利要求57-60任一項的方法，其中所述抗血管發(fā)生劑在施用抗EGFL7抗體之前或之后施用。
62.權(quán)利要求57-60任一項的方法，其中所述抗血管發(fā)生劑與抗EGFL7抗體同時施用。
63.權(quán)利要求57-60任一項的方法，其中所述抗血管發(fā)生劑為抗VEGF劑。
64.權(quán)利要求63的方法，其中所述抗VEGF劑為抗VEGF抗體。
65.權(quán)利要求64的方法，其中所述抗VEGF抗體為bevacizumab。
66.權(quán)利要求64的方法，其中所述抗VEGF抗體為ranibizumab。
67.一種在受試者中降低或抑制腫瘤灌注和滲透性的方法，包括對受試者施用權(quán)利要求1-33任一項的抗體，由此在受試者中降低或抑制腫瘤灌注和滲透性。
68.權(quán)利要求67的方法，進一步包括施用抗血管發(fā)生劑。
69.權(quán)利要求68的方法，其中所述抗血管發(fā)生劑在施用抗EGFL7抗體之前或之后施用。
70.權(quán)利要求68的方法，其中所述抗血管發(fā)生劑與抗EGFL7抗體同時施用。
71.權(quán)利要求67-70任一項的方法，其中所述抗血管發(fā)生劑為抗VEGF劑。
72.權(quán)利要求71的方法，其中所述抗VEGF劑為抗VEGF抗體。
73.權(quán)利要求72的方法，其中所述抗VEGF抗體為bevacizumab。
全文摘要
本發(fā)明關(guān)注針對EGFL7的抗體及其用途。
文檔編號A61K39/395GK102459338SQ201080030170
公開日2012年5月16日 申請日期2010年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月8日
發(fā)明者J.弗雷德里克森, M.丹尼斯, 葉偉蘭 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司