專利名稱：抗-間皮素免疫綴合物及其應(yīng)用的制作方法
抗-間皮素免疫綴合物及其應(yīng)用本發(fā)明提供了免疫綴合物，所述免疫綴合物包含具有對(duì)間皮素(mesothelin)蛋白的特異性的抗體或其片段以及治療劑。這種免疫綴合物的組合物可以用于治療、預(yù)防或診斷間皮素相關(guān)病癥，例如癌癥。
背景技術(shù)：
癌癥的發(fā)生最常見(jiàn)地與老化有關(guān)，由此所有新癌癥病例中的65%是65歲及以上的患者。在美國(guó)，癌癥是第二大死亡原因，排名第一的是心臟病。實(shí)際上，美國(guó)癌癥學(xué)會(huì) (American Cancer Society)已經(jīng)估計(jì)，假定當(dāng)前的死亡率保持不變，在美國(guó)將有1/4的人死于癌癥。僅在美國(guó)，預(yù)期在2008年有1，437，180個(gè)新癌癥病例，且565，650人死于癌癥?；诳贵w的療法被證實(shí)可以非常有效地治療各種癌癥，包括實(shí)體瘤。例如，赫賽汀 已經(jīng)成功地用于治療乳腺癌。開(kāi)發(fā)成功的基于抗體的療法的關(guān)鍵是，分離出抗體，所述抗體針對(duì)經(jīng)發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞上優(yōu)先表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白。間皮素前體多肽是一種糖磷脂酰肌醇(GPI)-錨定的、糖基化的細(xì)胞表面蛋白，其被蛋白水解地裂解成30 kDa N-端分泌型多肽和40 kDa C-端多肽，其主要以膜-結(jié)合的、GPI-錨定的形式存在(Chang，K.和 I. Pastan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1996) 93 (1) 136)，且在本文中命名為間皮素。間皮素被某些腫瘤細(xì)胞(特別是間皮瘤細(xì)胞、胰腺腫瘤細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞)優(yōu)先表達(dá)，同時(shí)它在正常組織中的表達(dá)受到限制，使它成為開(kāi)發(fā)腫瘤療法的一種有吸引力的靶標(biāo) (Argani, P. ^A , Clin. Cancer Res. (2001) 7(12) 3862; Hassan, R., ^A , Clin. Cancer Res. (2004) 10(12 Pt 1) :3937)。間皮素的功能是未知的，在間皮素基因表達(dá)缺陷型的小鼠中，沒(méi)有觀察到明顯的生殖異常、血液學(xué)異常或解剖學(xué)異常(Berii, Τ. K.和I. Pastan, Mol. Cell. Biol. (2000) 20(8) :2902) 已經(jīng)提出，將針對(duì)表達(dá)間皮素的癌細(xì)胞的、基于抗體的靶向療法用于治療肺癌、 卵巢癌和胰腺癌。Mab Kl是被描述的第一種針對(duì)膜-結(jié)合的間皮素多肽的抗體(Chang， K.，藥Λ，Int. J. Cancer, (1992) 50 (3) 373) 通過(guò)免疫小鼠，制備 Mab Kl0 由于該抗體的低親和力和差的內(nèi)化率，認(rèn)為由與化學(xué)修飾的截短形式的假單胞菌外毒素A相連的 Mab Kl組成的免疫毒素不適用于臨床開(kāi)發(fā)(Hassan, R.，，J. Immunother. (2000) 23(4) :473; Hassan, R. , , Clin. Cancer Res. (2004) 10(12 Pt 1): 3937)。隨后， 開(kāi)發(fā)了具有更高親和力的單鏈抗體，包括SSl-(dsFv)-PE38，其表現(xiàn)出在體外殺死腫瘤細(xì)胞的活性(Hassan, R.，藥Λ，Clin. Cancer Res. (2002) 8(11) 3520)以及在表達(dá)人間皮素的腫瘤的鼠模型中的效力(Fan, D., #U , Mol. CancerTher. (2002) 1(8) 595)。 這些數(shù)據(jù)證實(shí)了間皮素是開(kāi)發(fā)用于治療多種癌癥的免疫療法的一種有吸引力的靶標(biāo)。已經(jīng)證實(shí)，SSl-(dsFv)-PE38具有快速的血液清除率，且報(bào)道了通過(guò)聚乙二醇化融合蛋白來(lái)增加分子量的嘗試(Filpula, D. , , Bioconjugate Chem. (2007) 18(3) 773)。MS-I、MS-2和MS-3是結(jié)合間皮素的抗體，它們?cè)诩?xì)胞表面處引起免疫效應(yīng)活性， 這是由于它們的人IgGl同種型和內(nèi)化進(jìn)表達(dá)間皮素的細(xì)胞中(W0 2006/099141 A2)。這些抗體之一，即未綴合的、嵌合的(小鼠/人)IgGl抗-間皮素抗體MORAb 009，目前正在臨床試驗(yàn)中測(cè)試用于治療胰腺癌的治療效果。假定的MORAb 009作用機(jī)理是，觸發(fā)免疫效應(yīng)功能諸如ADCC和功能阻斷。具有改善的與攻擊性癌癥(諸如卵巢癌、胰腺癌和肺癌)做斗爭(zhēng)的效力的新療法是非常合乎需要的，并代表著本領(lǐng)域的進(jìn)展。這樣，本發(fā)明公開(kāi)了新的免疫綴合物組合物，其可用于治療、預(yù)防和/或診斷間皮素相關(guān)病癥，例如癌癥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及免疫綴合物，所述免疫綴合物包含結(jié)合間皮素的抗體(例如，單克隆抗體)或其片段，所述抗體或其片段綴合到細(xì)胞毒性劑(例如，美坦辛類(maytansinoid)或其衍生物)上，且/或所述免疫綴合物與一種或更多種額外的抗癌劑共同施用或共同配制。本發(fā)明的免疫綴合物可以用于治療和/或診斷和/或監(jiān)測(cè)間皮素相關(guān)病癥，例如癌癥。本發(fā)明的一個(gè)目的是，提供免疫綴合物，所述免疫綴合物包含對(duì)間皮素前體多肽的40 kDa C-端胞外部分是高度選擇性的且在有癌抗原125 (CA125; MUC16)存在下不結(jié)合間皮素的抗體或其抗原結(jié)合抗體片段或其變體，和效應(yīng)物部分。在PCT/EP2008/009756 中，已經(jīng)描述了間皮素抗體的具體性質(zhì)，且在本發(fā)明的一個(gè)方面，它們的在有CA125存在下特異性地與間皮素發(fā)生免疫反應(yīng)的特殊能力與細(xì)胞毒性劑(例如美坦辛類)綴合的組合，會(huì)提供勝過(guò)功能阻斷抗體的提高的效能，所述功能阻斷抗體與CA125競(jìng)爭(zhēng)間皮素結(jié)合。在一個(gè)方面，本發(fā)明的抗體或其片段是IgG抗體或IgG片段。所述抗體或片段也可以是 IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA 或 IgM 抗體、Fab 片段、F (ab’)2 片段、 scFv片段、Fv片段、雙特異抗體、直鏈抗體、單鏈抗體、生物特異性的抗體、多特異性的抗體或嵌合的抗體(例如包含移植到人或非人抗體結(jié)合區(qū)上的人抗體支架，或移植到人或非人抗體結(jié)合區(qū)上的非人抗體支架)。所述嵌合的抗體可以包括，例如，來(lái)自非人來(lái)源(例如， 牛、小鼠、美洲駝羊、駱駝或兔)的抗體支架區(qū)。關(guān)于抗體工程化的其它信息，可以參考文獻(xiàn)， 例如，HolIiger 和 Hudson, Nature Biotechnology, (2005 年 9 月)23: 11洸_1136，它通過(guò)引用并入本文。前述片段可以從免疫球蛋白得到，或通過(guò)合適的方式(例如重組表達(dá))以片段形式制備。本發(fā)明的抗體或抗體片段也可以是人源化的，其中所述CDR序列或區(qū)域(例如 ⑶Rl、⑶R2、⑶R3)可以是非人的，例如鼠的。本發(fā)明的抗體或抗體片段，或包含所述抗體或片段的組合物，可以包括綴合到抗體或其片段上的細(xì)胞毒性劑。在一個(gè)方面，所述細(xì)胞毒性劑是美坦辛類或其衍生物，但是，也提供了其它細(xì)胞毒性劑，它們可以包括，例如，和其它細(xì)胞毒性劑，例如，aplidin、 auristatin、阿扎立平、阿那曲唑、氮胞苷、博來(lái)霉素、硼替佐米、苔蘚抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜樹(shù)堿、10-羥基喜樹(shù)堿、卡莫司汀、西樂(lè)葆、苯丁酸氮芥、順鉬、伊立替康(CPT-I 1)、 SN-38、卡鉬、克拉屈濱、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達(dá)卡巴嗪、多西他賽、更生霉素、道諾霉素葡萄糖醛酸苷、柔紅霉素、地塞米松、己烯雌酚、多柔比星、多柔比星葡萄糖醛酸苷、表柔比星葡萄糖醛酸苷、炔雌醇、雌莫司汀、依托泊苷、依托泊苷葡萄糖醛酸苷、依托泊苷磷酸鹽、氮尿苷(FUdR)、3’，5’-0-二油?；?FudR (FUdR-d0)、氟達(dá)拉濱、氟他胺、氟尿嘧啶、氟甲睪酮、吉西他濱、己酸羥孕酮、羥基脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、L-門冬酰胺酶、亞葉酸、洛莫司汀、氮芥、醋酸甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、美法侖、巰嘌呤、6-巰嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光輝霉素、絲裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、潑尼松、丙卡巴胼、紫杉醇、噴司他丁、PSI-341、司莫司汀、鏈佐星、他莫昔芬、紫杉烷類、泰素、丙酸睪酮、沙利度胺、硫鳥(niǎo)嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、烏拉莫司汀、萬(wàn)珂、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春瑞濱、長(zhǎng)春新堿、蓖麻蛋白、相思豆毒蛋白、 ribomiclease、onconase、rapLRI、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、白樹(shù)毒素、白喉毒素或它們的組合。任一種細(xì)胞毒性劑也可以包括其功能類似物或其衍生物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了免疫綴合物，其中所述細(xì)胞毒性劑是非免疫原性的， 即不會(huì)通過(guò)向藥物制劑貢獻(xiàn)人或哺乳動(dòng)物B細(xì)胞表位或T細(xì)胞表位而增加親代抗體的免疫原性。除了所述抗體和片段(含有或沒(méi)有前述綴合的細(xì)胞毒性劑)以外，本發(fā)明的組合物可以包含各種抗癌劑，它們可以包括，例如，博來(lái)霉素、多西他賽(泰索帝)、多柔比星、依達(dá)曲沙、厄洛替尼(塔西法)、依托泊苷、非那雄胺(保列治)、氟他胺(Eulexin)、 吉西他濱(健擇)、吉非替尼(Lrresa)、醋酸戈舍瑞林(諾雷德)、格拉司瓊(凱特瑞)、伊馬替尼(格列衛(wèi))、伊立替康(Campto/Camptosar)、昂丹司瓊(樞復(fù)寧)、紫杉醇(泰素)、培門冬酶(Oncaspar)、鹽酸毛果蕓香堿(Salagen)、卟吩姆鈉(Photofrin)、 白介素-2 (Proleukin)、利妥昔單抗(Rituxan)、托泊替康(和美新)、曲妥單抗(赫賽汀)、Triapine、長(zhǎng)春新堿和酒石酸長(zhǎng)春瑞濱(諾維本)，或它們的治療性抗體或片段，或抗血管生成劑，例如，血管生成抑制因子、貝伐單抗(Avastin )、索拉非尼(Nexavar )、 baculostatin、canstatin、maspin、抗-VEGF抗體或肽、抗-胎盤生長(zhǎng)因子抗體或肽、 抗-Flk-I抗體、抗-Fit- 1抗體或肽、層粘連蛋白肽、纖連蛋白肽、纖溶酶原活化劑抑制劑、 組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、白介素12、ΙΡ-Ι0、Gro-β、凝血酶敏感蛋白、2-甲氧雌二醇、增殖蛋白-相關(guān)的蛋白、羧基酰氨三唑(carboxiamidotriazole)、CM101、馬立馬司他、 聚硫酸戊聚糖、血管生成素2、干擾素-α、除莠霉素A、PNU145156EU6K催乳素片段、利諾胺、沙利度胺、己酮可可堿、染料木黃酮、ΤΝΡ-470、內(nèi)皮他丁、紫杉醇、accutin、西多福韋、長(zhǎng)春新堿、博來(lái)霉素、AGM- 1470、血小板因子4或米諾環(huán)素。在另一個(gè)方面，本發(fā)明另外提供了用于治療間皮素相關(guān)病癥的方法，其中施用治療有效量的本發(fā)明的免疫綴合物，或包含本發(fā)明免疫綴合物的本發(fā)明的組合物。所述間皮素相關(guān)病癥可以包括，例如，癌癥，例如，實(shí)體瘤癌。所述實(shí)體瘤可以是在下述部位中或源自下述部位卵巢、胰腺、呼吸道、肺、結(jié)腸、胃、食管、子宮頸、肝臟、乳房、頭和頸。公開(kāi)了這些和其它實(shí)施方案，或者，它們從下面的詳細(xì)描述顯而易見(jiàn)，并被包括在下面的詳細(xì)描述中。


圖1顯示了抗間皮素-免疫綴合物MF-T-SPDB-DM4對(duì)在間皮素轉(zhuǎn)染的異種移植物模型中(A)以及在未轉(zhuǎn)染的對(duì)照腫瘤中(B)的間皮素-轉(zhuǎn)染的人胰腺癌細(xì)胞的抗腫瘤效能。圖2顯示了具有穩(wěn)定的和可裂解的、以及極性的和非極性的連接物的抗-間皮素免疫綴合物在HeLaMATU異種移植物模型(其含有內(nèi)源地表達(dá)間皮素的癌細(xì)胞)中的抗腫瘤效能。圖3顯示了具有穩(wěn)定的和可裂解的、以及極性的和非極性的連接物的抗-間皮素免疫綴合物在間皮素轉(zhuǎn)染的異種移植物模型中(A)以及在未轉(zhuǎn)染的對(duì)照腫瘤中(B)的抗腫瘤效能。圖4顯示了 MF-T-SPDP-DM4對(duì)間皮素陽(yáng)性的HelaMatu細(xì)胞的毒性的劑量響應(yīng)曲線的一個(gè)實(shí)施例。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)了新穎的免疫綴合物，其對(duì)間皮素是特異性的，或具有對(duì)間皮素的高親和力，且可以給受試者遞送治療益處。本發(fā)明的免疫綴合物可以用于本文更完整地描述的許多情況。應(yīng)當(dāng)理解，本文所述的本發(fā)明不限于本文關(guān)于本發(fā)明的任何方面闡述的具體細(xì)節(jié)，包括，描述的抗-間皮素抗體、免疫綴合物、處理方法、方案、細(xì)胞系、動(dòng)物種或?qū)?、?gòu)建體和試劑，這些本身可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解，本文使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述具體實(shí)施方案的目的，無(wú)意限制本發(fā)明的范圍。定義
除非另有定義，在本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。但是，下面的參考文獻(xiàn)可以為本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員提供在本發(fā)明中使用的許多術(shù)語(yǔ)的一般定義，且可以參照和使用，只要這樣的定義與本領(lǐng)域通常理解的含義相一致。這樣的參考文獻(xiàn)包括、但不限于=Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (1994年第 2版)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker編，1988)； Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)；禾口Lackie 等人，The Dictionary of Cell & Molecular Biology (1999 年第 3 版)；禾口 Cellular and Molecular Immunology, Abbas, Lichtman 和Pober編，第2版，W. B. Saunders Company?？梢圆殚啽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員可得到的任何其它技術(shù)資源，只要本文使用的術(shù)語(yǔ)的定義具有本領(lǐng)域通常理解的含義。為了本發(fā)明的目的，進(jìn)一步定義下述術(shù)語(yǔ)。其它術(shù)語(yǔ)在說(shuō)明書的別處予以定義。在本文中和在所附的權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”以及“該”包括復(fù)數(shù)所指， 除非上下文另外清楚地指明。因而，例如，提及的“一個(gè)基因”是指一個(gè)或更多個(gè)基因，并包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物，以此類推。本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”包括從自然界分離的或通過(guò)重組方式制備的免疫球蛋白分子(例如，任意類型，包括IgG, IgE, IgM, IgD, IgA和IgY，和/或任意類別，包括，IgGU 1862、1863、1864、1841和18々2)?？贵w也意在包括結(jié)合抗原的抗體片段，諸如Fab、F(ab’)2、 scFv (單鏈Fvs)、Fv、單鏈抗體、雙特異抗體、二硫鍵連接的Fv (sdFv)和包含VL或VH結(jié)構(gòu)域的片段，它們從完整的免疫球蛋白制備，或通過(guò)重組方式制備。本發(fā)明的抗體和/或結(jié)合抗原的抗體片段可以是單特異性的(例如單克隆的)、 雙特異性的、三特異性的，或具有更大的多特異性。多特異性的抗體可以對(duì)抗原的不同表位是特異性的，或者可以對(duì)超過(guò)一種抗原的表位是特異性的。參見(jiàn)，例如，PCT公開(kāi)WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt,等人，1991，J. Immunol. 147:60 69;美國(guó)專利號(hào) 4, 474, 893; 4，714，681; 4, 925, 648; 5，573，920; 5, 601, 819; Kostelny等人，1992，J. ImmunoL 148:1547 1553，它們各自通過(guò)引用并入本文。結(jié)合抗原的抗體片段可以包含單獨(dú)的可變區(qū)，或與所有或一部分下述區(qū)域組合的可變區(qū)鉸鏈區(qū)、CH1、CH2、CH3和CL結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明也包括結(jié)合抗原的抗體片段，其還包含可變區(qū)與鉸鏈區(qū)、CHI、CH2、CH3和CL結(jié)構(gòu)域的任意組合。優(yōu)選地，所述抗體或結(jié)合抗原的抗體片段是人、人源化的、鼠(例如，小鼠和大鼠)、驢、綿羊、兔、山羊、豚鼠、駱駝科、馬或雞。本文使用的“人”抗體包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗體，且包括從人免疫球蛋白文庫(kù)、從人B細(xì)胞、或從一種或更多種人免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分離的抗體，如下文所述，和例如Kucherlapati等人在美國(guó)專利號(hào)5，939，598中所述。術(shù)語(yǔ)抗體也延伸至這樣的其它蛋白支架其能夠?qū)⒖贵w⑶R 插入物定向?yàn)榕c在天然抗體中發(fā)現(xiàn)的相同活性結(jié)合構(gòu)象，使得與CDR的來(lái)源天然抗體的結(jié)合活性相比，維持用這些嵌合蛋白所觀察到的靶抗原的結(jié)合。本文使用的術(shù)語(yǔ)“人源化的”形式的非人(例如，鼠)抗體是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。通常，人源化的抗體是這樣的人免疫球蛋白(受體抗體)其中受體的高變區(qū)殘基(例如互補(bǔ)性決定區(qū)“CDR”)被替換為來(lái)自非人物種(諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物)(供體抗體)的具有希望的特異性、親和力和能力的高變區(qū)殘基(CDR)。在有些情況下，人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基可以被替換為對(duì)應(yīng)的非人殘基。此外，人源化的抗體可以包含在受體抗體中或在供體抗體中不存在的殘基。進(jìn)行這樣的修飾，以進(jìn)一步優(yōu)化抗體性能。一般而言，人源化的抗體可以包含基本上所有的至少一個(gè)或通常2個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中所有的或基本上所有的高變區(qū)對(duì)應(yīng)著非人免疫球蛋白的高變區(qū)，且所有的或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化的抗體任選地也可以包含免疫球蛋白恒定區(qū) (Fe)(通常是人免疫球蛋白的Fe)的至少一部分。關(guān)于綜述，參見(jiàn)Jones，等人，(Nature 321:522-525，1986) ； Reichmann,等人，(Nature 332:323-329, 1988)；和 Preste, (Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596，1992)。人源化的抗體的制備，可以參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào) 7，049，135,6, 828，422,6, 753，136,6, 706，484,6, 696，248,6, 692，935,6, 667，150、 6，653，068,6, 300，064,6, 294，353 和 5，514，548，它們各自整體并入本文。本文使用的術(shù)語(yǔ)“單鏈Fv”或“sFv”抗體片段包括抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單個(gè)多肽鏈中。通常，F(xiàn)v多肽另外包含在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽連接物，其使sFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于綜述，參見(jiàn)Pluckthun(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 禾口 Moore 編著，Springer-Verlag, New York,第沈9-315頁(yè)，1994)，其通過(guò)引用整體并入本文。術(shù)語(yǔ)“雙特異抗體”表示具有兩個(gè)抗原結(jié)合部位的小抗體片段，該片段在相同多肽鏈(VH-VL)中包含連接到輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)上的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)。通過(guò)使用連接物(其長(zhǎng)度不足以使得在相同鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間發(fā)生配對(duì))，強(qiáng)制所述結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，并創(chuàng)建兩個(gè)抗原結(jié)合部位。雙特異抗體更完全地記載在，例如EP 404,097; WO 93/11161;和Hollinger等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448， 1993)，它們各自通過(guò)引用并入。表述“直鏈抗體”表示本領(lǐng)域所述的抗體，例如，在通過(guò)引用并入本文的Zapata等人(ProteinEng. 8(10) 1057-1062, 1995)中所述的抗體。簡(jiǎn)而言之，這樣的抗體包含一對(duì)串聯(lián)的Fd段(VH-CH1-VH- CHl)，它們形成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)。直鏈抗體可以是雙特異性的或單特異性的。本文使用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”表示從一群基本上同源的抗體獲得的抗體，也就是說(shuō)，包含除了可能的天然發(fā)生的突變(其可能以較小量存在)外是相同的群體的各個(gè)抗體。 單克隆抗體是高度特異性的，也就是說(shuō)，針對(duì)單一抗原位點(diǎn)。此外，與通常包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制品相比，每個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。修飾語(yǔ)“單克隆”表明所述抗體從一群基本上同源的抗體獲得的特征，而不應(yīng)理解為需要通過(guò)任何特定方法來(lái)生產(chǎn)所述抗體。例如，要根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體，可以通過(guò)由Kohler等人(Nature 256:495，197 首次描述的雜交瘤方法來(lái)制備，或可以通過(guò)重組DNA方法(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)4，816，567)來(lái)制備。還可以使用例如Clackson，等人 (Nature 352 624-6 , 1991)和 Marks,等人(J. Mol. Biol. 222:581-597，1991)描述的技術(shù)，從噬菌體抗體文庫(kù)分離單克隆抗體。單克隆抗體在本文中也包括“嵌合的”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的對(duì)應(yīng)序列相同或同源，同時(shí)鏈的其余部分與源自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的對(duì)應(yīng)序列相同或同源，以及這種抗體的片段，只要它們表現(xiàn)出所需要的生物學(xué)活性即可(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)4，816，567; 和 Morrison,等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855，1984，它們各自通過(guò)引用并入)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“生物樣品”或“患者樣品”表示從生物體或從生物體的組分(例如，細(xì)胞)得到的樣品。所述樣品可以屬于任意生物組織或流體。所述樣品可以是“臨床樣品”，即源自患者的樣品。這樣的樣品包括、但不限于痰、血液、血清、血漿、血細(xì)胞(例如，白細(xì)胞)、組織樣品、活組織檢查樣品、尿、腹膜液和胸膜液、唾液、精液、乳房滲出物、腦脊液、淚水、粘液、淋巴、胞質(zhì)溶膠、腹水、羊水、膀胱洗液和支氣管肺泡灌洗液或源自它的細(xì)胞，以及其它體液樣品。所述患者樣品可以是新鮮的或冷凍的，且可以用肝素、檸檬酸鹽或 EDTA處理。生物樣品還可以包括組織切片，例如為了組織學(xué)目的制作的冷凍切片。術(shù)語(yǔ)“癌癥”包括、但不限于實(shí)體瘤，例如胰腺癌、乳腺癌、呼吸道癌、腦癌、生殖器癌、消化道癌、泌尿道癌、眼癌、肝癌、皮膚癌、頭頸部癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌和它們的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。該術(shù)語(yǔ)也包括肉瘤、淋巴瘤、白血病、和漿細(xì)胞骨髓瘤。呼吸道腫瘤包括、但不限于小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌以及支氣管腺瘤和胸膜肺母細(xì)胞瘤。乳腺腫瘤包括、但不限于浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、浸潤(rùn)性小葉癌、原位管癌和小葉原位癌。腦腫瘤包括、但不限于腦干和下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤、小腦星形細(xì)胞瘤、大腦星形細(xì)胞瘤、 髓母細(xì)胞瘤、室管膜瘤以及神經(jīng)外胚層腫瘤和松果體腫瘤。男性生殖器腫瘤包括、但不限于前列腺癌和睪丸癌。女性生殖器腫瘤包括、但不限于子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、卵巢癌、陰道癌和外陰癌以及子宮肉瘤。消化道腫瘤包括、但不限于肛門癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、食道癌、膽囊癌、胃癌、胰腺癌、直腸癌、小腸癌和唾液腺癌。泌尿道腫瘤包括、但不限于膀胱癌、陰莖癌、腎癌、腎盂癌、輸尿管癌和尿道癌。眼癌包括、但不限于眼內(nèi)黑素瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。肝腫瘤包括、但不限于肝細(xì)胞癌(有或無(wú)纖維板層變異的肝細(xì)胞癌)、膽管上皮癌(肝內(nèi)膽管癌)和混合型肝細(xì)胞膽管上皮癌。皮膚癌包括、但不限于鱗狀細(xì)胞癌、卡波西肉瘤、惡性黑素瘤、默克爾細(xì)胞皮膚癌和非黑素瘤皮膚癌。頭頸部癌包括、但不限于喉/ 下咽/鼻咽/ 口咽癌，以及唇癌和口腔癌。淋巴瘤包括、但不限于AIDS相關(guān)的淋巴瘤、非霍金奇淋巴瘤、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、霍金奇病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤。肉瘤包括、但不限于軟組織肉瘤、骨肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、淋巴肉瘤和橫紋肌肉瘤。白血病包括、但不限于急性髓細(xì)胞性白血病、急性成淋巴細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、慢性髓性白血病和多毛細(xì)胞白血病。在本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“表位”是指抗體通過(guò)抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的抗原(例如間皮素蛋白)上的任意抗原決定簇。決定簇或抗原決定簇通常由分子(諸如氨基酸或糖側(cè)鏈) 的化學(xué)活性表面簇組成，且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。術(shù)語(yǔ)“特異性地免疫反應(yīng)性的”表示抗體和具有被抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)所識(shí)別的表位的蛋白、化合物或抗原之間的結(jié)合反應(yīng)。該結(jié)合反應(yīng)決定了具有識(shí)別的表位的蛋白、 抗原或表位在蛋白的異質(zhì)群體和其它生物學(xué)中的存在。在免疫測(cè)定的背景下，特異性地免疫反應(yīng)性的抗體可以結(jié)合具有識(shí)別的表位的蛋白，且如果結(jié)合，則以比樣品中存在的缺少該表位的其它蛋白更低的可檢測(cè)程度進(jìn)行結(jié)合。在體內(nèi)背景下，“特異性地免疫反應(yīng)性的” 可以表示動(dòng)物形成針對(duì)疫苗或抗原的免疫應(yīng)答的條件，例如針對(duì)抗原的體液應(yīng)答(在免疫反應(yīng)條件下抗體的生成，所述抗體針對(duì)呈遞到其的疫苗、蛋白、化合物或抗原)或細(xì)胞-介導(dǎo)的應(yīng)答(在本文中也稱作“細(xì)胞免疫應(yīng)答”，即由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的、針對(duì)呈遞到其的疫苗、蛋白、化合物或抗原的應(yīng)答)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“免疫反應(yīng)性的條件”用于免疫測(cè)定或體外反應(yīng)的背景中，其中提供或調(diào)節(jié)反應(yīng)的物理?xiàng)l件，包括例如溫度、鹽濃度、PH、試劑和它們的濃度、和抗原和與所述抗原特異性地免疫反應(yīng)性的相應(yīng)抗體的濃度，以允許相應(yīng)抗體結(jié)合抗原。免疫反應(yīng)性的條件取決于抗體結(jié)合反應(yīng)的形式，且通常是在免疫測(cè)定方案中使用的那些。關(guān)于免疫測(cè)定形式和條件的描述，參見(jiàn)Harlow和Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York。本文使用的術(shù)語(yǔ) “患者”或“受試者”包括哺乳動(dòng)物(例如，人和動(dòng)物)。本文使用的術(shù)語(yǔ)特定抗體與間皮素的‘不變結(jié)合’表示它的結(jié)合間皮素的能力， 所述間皮素在廣范圍的表達(dá)間皮素的癌細(xì)胞系上，所述癌細(xì)胞系表達(dá)不同形式的間皮素。不變結(jié)合可以由下述事實(shí)造成，但是不限于此抗體或其抗原結(jié)合抗體片段或其變體識(shí)別間皮素的表位，所述表位未被與間皮素相互作用的另一種胞外抗原(諸如癌抗原125 (CA12Q)掩蔽。對(duì)于不變結(jié)合抗體，通過(guò)FACS滴定測(cè)得在2種不同癌細(xì)胞系上的EC50值可能相差不超過(guò)10倍、或優(yōu)選5倍、和最優(yōu)選1至3倍。本文使用的術(shù)語(yǔ)“免疫綴合物”表示這樣的綴合物分子其包含與細(xì)胞毒性劑(例如，美坦辛類或其衍生物)結(jié)合(優(yōu)選地經(jīng)由合適的連接基團(tuán)或其前體)的至少一種抗體或其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明的免疫綴合物
本發(fā)明涉及通過(guò)提供抗-間皮素免疫綴合物來(lái)抑制間皮素-陽(yáng)性的癌細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤性疾病的進(jìn)展的方法。提供的免疫綴合物的抗體部分是對(duì)間皮素前體多肽的40 kDa C-端結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 36)特異性地免疫反應(yīng)性的，該C-端結(jié)構(gòu)域在本文中稱作‘間皮素’。在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述抗體、結(jié)合抗原的抗體片段、以及本發(fā)明的抗體和片段的變體已經(jīng)描述在PCT/EP2008/009756中，且包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)。在本發(fā)明中預(yù)見(jiàn)到的抗體或結(jié)合抗原的抗體片段的變體是，其中維持了抗體或結(jié)合抗原的抗體片段對(duì)間皮素的結(jié)合活性的分子。本發(fā)明也涉及免疫綴合物，所述免疫綴合物由不同于在PCT/EP2008/009756中已經(jīng)描述的那些、且已經(jīng)連接到化學(xué)治療劑(例如美坦辛類或其衍生物)上的抗-間皮素抗體、結(jié)合抗原的抗體片段、以及本發(fā)明的抗體和片段的變體組成?？梢杂糜诒景l(fā)明中的美坦辛類是本領(lǐng)域眾所周知的，且可以根據(jù)已知的方法從天然來(lái)源分離，或根據(jù)已知的方法合成地制備。合適的美坦辛類的實(shí)例包括美登醇和美登醇類似物。合適的美登醇類似物的實(shí)例包括具有修飾的芳族環(huán)的那些和具有在其它位置的修飾的那些。具有修飾的芳族環(huán)的合適的美登醇類似物的具體實(shí)例包括
(1)C-19-脫氯(美國(guó)專利號(hào)4，256，746)(通過(guò)安絲菌素P2的LAH還原制備)；
(2)C-20-羥基(或C-20-脫甲基)+/-C-19-脫氯(美國(guó)專利號(hào)4，361，650和 4，307，016)(使用鏈霉菌屬或放線菌屬進(jìn)行脫甲基化，或使用LAH進(jìn)行脫氯，進(jìn)行制備)； 禾口
(3)C-20-脫甲氧基、C-20-酰氧基(-0C0R)、+/-脫氯(美國(guó)專利號(hào)4，四4，757)(通過(guò)使用酰氯進(jìn)行?；瘉?lái)制備)。具有其它位置的修飾的合適的美登醇類似物的具體實(shí)例包括
(1)C-9-SH (美國(guó)專利號(hào)4，424，219)(通過(guò)美登醇與H2S或P2S5的反應(yīng)來(lái)制備)；
(2)C-14-烷氧基甲基(脫甲氧基/CH20R)(美國(guó)專利號(hào)4，331，598)；
(3)C-14-羥甲基或酰氧基甲基(CH20H或CH20Ac)(美國(guó)專利號(hào)4，450，254)(從諾卡氏菌屬制備)；
(4)C-15-羥基/酰氧基(美國(guó)專利號(hào)4，364，866)(通過(guò)鏈霉菌屬對(duì)美登醇的轉(zhuǎn)化來(lái)制備)；
(5)C-15-甲氧基(美國(guó)專利號(hào) 4，313，946 和 4，315，929)(從 Trewia nudiflora 分離)；
(6)C-18-N-脫甲基(美國(guó)專利號(hào)4，362，663和4，322，348)(通過(guò)鏈霉菌屬對(duì)美登醇的脫甲基化來(lái)制備)；和
(7)4，5-脫氧(美國(guó)專利號(hào)4，371，53 (通過(guò)美登醇的三氯化鈦/LAH還原來(lái)制備)。在美國(guó)專利號(hào)5，208，020、5，416，064和7，276，497中，充分地公開(kāi)了可用于本發(fā)明中的含有硫醇的美坦辛類的合成。具有在C-3位置、C-14位置、C-15位置或C_20位置處的硫醇部分的美坦辛類都預(yù)期是有用的。C-3位置是優(yōu)選的，且美登醇的C-3位置是特別優(yōu)選的。也優(yōu)選的是，含有N-甲基-丙氨酸的C-3硫醇部分美坦辛類，和含有N-甲基-半胱氨酸的C-3硫醇部分美坦辛類，以及各自的類似物。優(yōu)選的美坦辛類是在美國(guó)專利5，208，020,5, 416，064、 6，333. 410,6, 441，163,6, 716，821、RE39, 151 和 7，276，497 中所述的那些，它們各自通過(guò)引用整體并入本文。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酯化的美登醇選自N2’_脫乙?；?N2，-(3-巰基-1-氧代丙基)-美坦辛(DM1, CAS登記號(hào)139504-50-0)、N2，-脫乙酰基-N2，- (4-巰基-1-氧代戊基)-美坦辛(DM3，CAS登記號(hào)796073-54-6)和N2，-脫乙?；?N2，-(4-甲基-4-巰基-1-氧代戊基)_美坦辛(DM4 CAS登記號(hào)796073-69-3)。貫穿本文件，提及下述的本發(fā)明的代表性的抗體“MF-J”、“M0R06640”、“MF_2^” 和“MF-T”。MF-J代表具有與SEQ ID NO: 28 (DNA)/SEQ ID NO: 20 (蛋白)相對(duì)應(yīng)的重鏈可變區(qū)和與SEQ ID NO: 32 (DNA)/SEQ ID NO: 24 (蛋白)相對(duì)應(yīng)的輕鏈可變區(qū)的抗體。 MOR 06640代表具有與SEQ ID N0: 29 (DNA)/SEQ ID NO: 21 (蛋白)相對(duì)應(yīng)的重鏈可變區(qū)和與SEQ ID NO: 33 (DNA)/SEQ ID NO: 25 (蛋白)相對(duì)應(yīng)的輕鏈可變區(qū)的抗體。MF-226 代表具有與SEQ ID NO: 30 (DNA)/SEQ ID NO: 22 (蛋白)相對(duì)應(yīng)的重鏈可變區(qū)和與SEQ ID NO: 34 (DNA) /SEQ ID NO: 26 (蛋白)相對(duì)應(yīng)的輕鏈可變區(qū)的抗體。MF-T代表具有與 SEQ ID NO: 31 (DNA)/SEQ ID NO: 23 (蛋白)相對(duì)應(yīng)的重鏈可變區(qū)和與SEQ ID NO: 35 (DNA)/SEQ ID NO: 27 (蛋白)相對(duì)應(yīng)的輕鏈可變區(qū)的抗體。本發(fā)明不限于在這里用作實(shí)施例的這些抗體。其它有用的抗體公開(kāi)在例如PCT/EP2008/009756中。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了免疫綴合物，所述免疫綴合物在有癌抗原125 (CA 125/MUC 16)存在下對(duì)間皮素是特異性地免疫反應(yīng)性的，因此有效地靶向表達(dá)間皮素和 CA125的癌細(xì)胞，例如0VCAR-3細(xì)胞。在其它方面，本發(fā)明提供了免疫綴合物，所述免疫綴合物對(duì)抗體MOR 06640或 MF-T的表位的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸是特異性地免疫反應(yīng)性的。在某些方面，所述免疫綴合物對(duì)抗體MOR 06640或MF-T的表位的至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)或至少6個(gè)氨基酸是特異性地免疫反應(yīng)性的。在某些方面，本發(fā)明的免疫綴合物對(duì)抗體MOR 06640所識(shí)別的表位的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸是特異性地免疫反應(yīng)性的。在替代方面，本發(fā)明的抗體對(duì)抗體MF-T所識(shí)別的表位的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸是特異性地免疫反應(yīng)性的。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了免疫綴合物，所述免疫綴合物具有這樣的抗原-結(jié)合區(qū)其對(duì)間皮素的一個(gè)或更多個(gè)區(qū)域是特異性地免疫反應(yīng)性的或具有高親和力，所述間皮素的氨基酸序列如SEQ ID N0: 36所示。如果親和力測(cè)量結(jié)果是至少100 nM (Fab片段的單價(jià)親和力)，則稱作免疫綴合物對(duì)于抗原具有“高親和力”。本發(fā)明的免疫綴合物優(yōu)選地可以是對(duì)間皮素特異性地免疫反應(yīng)性的，具有小于約100 nM、更優(yōu)選地小于約60 nM、和甚至更優(yōu)選地小于約30 nM的親和力。進(jìn)一步優(yōu)選的是，以小于約10 nM和更優(yōu)選地小于約3 nM的親和力結(jié)合間皮素的抗體。例如，本發(fā)明的抗體對(duì)間皮素的親和力可以是約9.1 nM或0. 9 nM (IgGl形式的單價(jià)親和力)。使用方法
術(shù)語(yǔ)“治療”包括任意過(guò)程、動(dòng)作、施用、治療等，其中給包括人類在內(nèi)的受試者(或患者)提供醫(yī)學(xué)輔助，其目的是直接地或間接地改善受試者的狀況，或減慢受試者的狀況或病癥的進(jìn)展，或改善在治療下的疾病或病癥的至少一種癥狀。術(shù)語(yǔ)“聯(lián)合治療”或“共同治療”是指，施用兩種或更多種治療劑來(lái)治療疾病、狀況和/或病癥。這樣的施用包括以基本上同時(shí)的方式共同施用兩種或更多種治療劑，諸如在具有固定比例的活性成分的單個(gè)膠囊中，或在每種抑制劑多個(gè)單獨(dú)的膠囊中。另外，這樣的施用包括以先后方式使用每類治療劑。2種或更多種先后地共同施用的治療劑的施用次序沒(méi)有限制。短語(yǔ)“治療有效量”是指達(dá)到下述目的所施用的每種藥劑的量改善疾病、狀況和/或病癥嚴(yán)重性和/或其癥狀，同時(shí)避免與施用的治療性處理有關(guān)的不利副作用或使其最小化。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”是指，適用于藥學(xué)產(chǎn)品中的主題項(xiàng)目。預(yù)期本發(fā)明的免疫綴合物作為治療劑是有價(jià)值的。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括治療患者(包括哺乳動(dòng)物)的不同狀況的方法，所述方法包括給所述患者施用組合物，所述組合物含有一定量的本發(fā)明的免疫綴合物，其可以有效地治療目標(biāo)狀況。本發(fā)明的免疫綴合物可以用于治療或預(yù)防與間皮素蛋白有關(guān)的疾病和/或行為。這些疾病和/或行為包括例如癌癥，例如胰腺癌、卵巢癌、胃癌、食管癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、肝癌、呼吸道癌和肺癌。本發(fā)明也涉及改善病癥的癥狀的方法，在所述病癥中，間皮素升高或以其它方式異常表達(dá)。這些病癥包括、但不限于胰腺癌、卵巢癌、胃癌、食管癌、宮頸癌、 結(jié)腸癌、肝癌、呼吸道癌和肺癌(參見(jiàn)，例如，(Liao，Cancer Res. 57:2827-2831, 1997; Turner, Hum. Pathol. 28:740-744，1997; Liao,等人，Am. J. Pathol. 145:598-609， 1994; Saarnio,等人，Am. J. Pathol. 153:279-285，1998; Vermylen,等人，Eur. Respir. J. 14:806-811, 1999)。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，給具有病癥的患者施用治療上有效劑量的本發(fā)明的免疫綴合物，在所述病癥中，間皮素升高。本發(fā)明的免疫綴合物可以單獨(dú)地施用，或與一種或更多種額外的治療劑組合地施用。聯(lián)合治療包括施用含有本發(fā)明免疫綴合物和一種或更多種額外治療劑的單一藥物劑量制劑，以及施用在它自己的單獨(dú)的藥物劑量制劑中的本發(fā)明的免疫綴合物和每種額外治療劑。例如，本發(fā)明的免疫綴合物和治療劑可以在單個(gè)口服劑量組合物中一起施用給患者， 或每種藥劑可以在單獨(dú)的口服劑量制劑中施用。在使用單獨(dú)的劑量制劑的情況下，本發(fā)明的免疫綴合物和一種或更多種額外的治療劑可以基本上同時(shí)(例如，并存地)施用，或在分別錯(cuò)開(kāi)的時(shí)間(例如，先后地)施用。藥劑的施用次序沒(méi)有限制。例如，在一個(gè)方面，預(yù)見(jiàn)到將本發(fā)明的抗-間皮素免疫綴合物與一種或更多種抗癌劑一起共同施用(以增強(qiáng)抗-間皮素免疫綴合物或抗癌劑或二者的作用)，用于治療間皮素相關(guān)病癥，例如，癌癥。這樣的聯(lián)合治療也可以用于預(yù)防癌癥、預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)、預(yù)防癌癥傳播或轉(zhuǎn)移、或減輕或改善與癌癥有關(guān)的癥狀。一種或更多種抗癌劑可以包括本領(lǐng)域任意已知的和合適的化合物，例如，化療劑 (chemoagent)、其它免疫治療劑、癌癥疫苗、抗血管生成劑、細(xì)胞因子、激素療法、基因療法、 和放射療法。化療劑(或“抗癌劑”或“抗腫瘤劑”或“癌癥治療劑”)表示輔助治療癌癥的任意分子或化合物。本發(fā)明所預(yù)見(jiàn)到的化療劑的實(shí)例包括但不限于胞嘧啶阿糖胞苷、紫杉烷類(例如，紫杉醇、多西他賽)、抗微管蛋白劑(例如紫杉醇、多西他賽、埃博霉素B、或其類似物)、大環(huán)內(nèi)酯類(例如，根霉素)、順鉬、卡鉬、多柔比星、替尼泊苷(tenoposide)、 米托蒽醌(mitozantron)、discodermolide、軟珊瑚醇(eleutherobine)、2_ 氯脫氧腺苷、烷化劑(例如環(huán)磷酰胺、氮芥、塞替派(thioepa)、苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀0XNU)、環(huán)磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素
C、以及順式二氯二胺鉬(II)(DDP)——順鉬、硫替派)、抗生素(例如更生霉素(從前的放線菌素)、博來(lái)霉素、光輝霉素、安曲霉素)、抗代謝物(例如甲氨蝶呤、6-巰嘌呤、6-硫鳥(niǎo)嘌呤、阿糖胞苷、flaV0pirid0l、5-氟尿嘧啶、氟達(dá)拉濱、吉西他濱、達(dá)卡巴嗪、替莫唑胺)、門冬酰胺酶、卡介菌、白喉毒素、六甲基三聚氰胺、羥基脲、LYS0DREN. RTM.、核苷類似物、植物生物堿(例如，泰素、紫杉醇、喜樹(shù)堿、托泊替康、伊立替康(CAMPT0SAR、CPT-11)、長(zhǎng)春新堿、 長(zhǎng)春花生物堿例如長(zhǎng)春堿)、鬼白毒素(包括衍生物例如表鬼白毒素、VP-16 (依托泊苷)、 VM-26 (替尼泊苷))、細(xì)胞松弛素B、秋水仙堿、短桿菌肽D、溴化乙錠、依米丁、絲裂霉素、 丙卡巴胼、氮芥、蒽環(huán)類抗生素(例如柔紅霉素(以前的道諾霉素)、多柔比星、多柔比星脂質(zhì)體)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracindione)、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素
D、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、嘌呤霉素、抗有絲分裂劑、相思豆毒蛋白、蓖麻蛋白Α、假單胞菌外毒素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、血小板衍生的生長(zhǎng)因子、組織纖溶酶原活化劑、阿地白介素、allutamine、阿那曲唑、比卡魯胺、biaomycin、白消安、卡培他濱、卡鉬、苯丁酸氮芥 (chlorabusil)、克拉屈濱、cylarabine> daclinomyciru 雌莫司夕丁、氣尿 Ρ (floxuridhe) > 吉西他濱、gosereine、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺(itosfamide)、醋酸亮丙瑞林(lauprolide acetate)、左旋咪唑、洛莫司汀(lomusline)、氮芥、magestrol、乙酸鹽、巰基嘌呤、美司鈉、 mitolanc、培門冬酶(pegaspergase)、噴司他丁 (pentoslatin)、光輝霉素(picamycin)、利妥昔單抗(riuxlmab)、campath-1、鏈佐星(straplozocin)、硫鳥(niǎo)嘌呤、維甲酸、長(zhǎng)春瑞濱或者它們的任何片段、家族成員或衍生物，包括其藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明也預(yù)見(jiàn)到包含一種或更多種化療劑(例如FLAG、CHOP)的組合物。FLAG包括氟達(dá)拉濱、胞嘧啶阿糖胞苷 (Ara-C)和G-CSF。CHOP包括環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿、多柔比星和潑尼松。所述化療劑可以是抗血管生成劑，例如，血管生成抑制因子、貝伐單抗 (Avastin )、索拉非尼 (Nexavar )、baculostatin、canstatin、乳腺絲氨酸蛋白酶抑制物 (maspin)、抗-VEGF抗體或肽、抗-胎盤生長(zhǎng)因子抗體或肽、抗-Flk- 1抗體、抗-Fit- 1抗體或肽、層粘連蛋白肽、纖連蛋白肽、纖溶酶原活化劑抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、白介素12、IP-10、Gro-i3、凝血酶敏感蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白-相關(guān)的蛋白、 羧基酰氨三唑、CMW1、馬立馬司他、聚硫酸戊聚糖、血管生成素2、干擾素-α、除莠霉素Α、 PNU145156EU6K催乳素片段、利諾胺、沙利度胺、己酮可可堿、染料木黃酮、ΤΝΡ-470、內(nèi)皮他丁、紫杉醇、accutin、西多福韋、長(zhǎng)春新堿、博來(lái)霉素、AGM- 1470、血小板因子4或米諾環(huán)
ο在一個(gè)方面，所述化療劑是劑量范圍為100-1000 mg/m2/周期的吉西他濱。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化療劑是劑量范圍為200-4000 mg/m2/周期的達(dá)卡巴嗪。在另一個(gè)方面， 所述劑量范圍是700-1000 mg/m2/周期。在另一個(gè)方面，所述化療劑是劑量范圍為25-50 mg/m2/周期的氟達(dá)拉濱。在另一個(gè)方面，所述化療劑是劑量范圍為200-2000 mg/m2/周期的胞嘧啶阿糖胞苷(Ara-C)。在另一個(gè)方面，所述化療劑是劑量范圍為1. 5-7. 5 mg/kg/周期的多西他賽。在另一個(gè)方面，所述化療劑是劑量范圍為5-15 mg/kg/周期的紫杉醇。在另一個(gè)方面，所述化療劑是劑量范圍為5-20 mg/kg/周期的順鉬。在其它方面，所述化療劑是劑量范圍為5-20 mg/kg/周期的5-氟尿嘧啶。在另一個(gè)方面，所述化療劑是劑量范圍為 2-8 mg/kg/周期的多柔比星。在其它方面，所述化療劑是劑量范圍為40-160 mg/kg/周期的表鬼臼毒素。在另一個(gè)方面，所述化療劑是劑量范圍為50-200 mg/kg/周期的環(huán)磷酰胺。 在另一個(gè)方面，所述化療劑是劑量范圍為50-150 mg/m2/周期的伊立替康。在其它方面，所述化療劑是劑量范圍為3. 7-18. 5 mg/m2/周期的長(zhǎng)春堿。在另一個(gè)方面，所述化療劑是劑量范圍為0. 7-2 mg/m2/周期的長(zhǎng)春新堿。在一個(gè)方面，所述化療劑是劑量范圍為3. 3-1000 mg/m /周期的甲氨蝶呤。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的抗-間皮素免疫綴合物與一種或更多種免疫治療劑組合施用，所述免疫治療劑諸如抗體或免疫調(diào)節(jié)劑，包括、但不限于赫賽汀 、Retuxan , OvaRex> Panorex> BEC2>IMC-C225、Vitaxin、Campath I/H、Smart MI95、LymphoCide、Smart I D 10和0ncolym、rituxan、利妥昔單抗、吉姆單抗或曲妥單抗。本發(fā)明也預(yù)見(jiàn)到，本發(fā)明的抗-間皮素免疫綴合物與一種或更多種抗血管生成劑一起施用，所述抗血管生成劑包括、但不限于血管生成抑制因子、沙利度胺、kringle 5、內(nèi)皮他丁、krpin (絲氨酸蛋白酶抑制劑)抗凝血酶、纖連蛋白的四kDa N-端蛋白水解片段和40 kDa C-端蛋白水解片段、催乳素的16 kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的7. 8 kDa蛋白水解片段、與血小板因子-4的片段相對(duì)應(yīng)的β-氨基酸肽(Maione等，1990， Cancer Res. 51: 2077)、與膠原I片段相對(duì)應(yīng)的14-氨基酸肽(Tolma等，1993，J. Cell Biol. 122: 497)、與凝血酶敏感蛋白I片段相對(duì)應(yīng)的19氨基酸肽(Tolsma等，1993，J. Cell Biol. 122: 497)、與 SPARC 片段相對(duì)應(yīng)的 20 氨基酸肽(Sage 等，1995，J. Cell. Biochem. 57: 13 )，或者其任何片段、家族成員或衍生物，包括其藥學(xué)上可接受的鹽。還已經(jīng)描述了抑制血管生成并且與層粘連蛋白、纖連蛋白、原膠原和EGF的片段相對(duì)應(yīng)的其它肽(綜述參見(jiàn) Cao，1998，Prog. Mol. Subcell. Biol. 20: 161)。已經(jīng)證實(shí)，阻滯與 RGD 蛋白(即具有肽基序Arg-Gly-Asp)結(jié)合的某些整聯(lián)蛋白的單克隆抗體和環(huán)五肽具有抗血管形成活性(Brooks等，1994，Science 264: 569; Hammes等，1996，Nature Medicine 2: 5 )。此外，拮抗劑對(duì)尿激酶纖溶酶原活化劑受體的抑制，會(huì)抑制血管生成、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移(Min等，1996，Cancer Res. 56: 2428-33; Crowley等，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5021)。本發(fā)明也預(yù)見(jiàn)到這樣的抗血管生成劑的使用。在另一個(gè)方面，與輻射療法相組合地施用本發(fā)明的抗-間皮素免疫綴合物。本發(fā)明的抗-間皮素免疫綴合物也可以與一種或更多種細(xì)胞因子組合地施用，所述細(xì)胞因子包括、但不限于淋巴因子、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子-樣細(xì)胞因子、淋巴毒素-α、淋巴毒素-β、干擾素-β、巨噬細(xì)胞炎性蛋白、粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子、白介素(包括但不限于白介素-1、白介素-2、白介素-6、白介素-12、白介素-15、白介素-18)、 0X40、CD27、CD30、CD40或CD137配體、Fas-Pas配體、4-IBBL、內(nèi)皮單核細(xì)胞活化蛋白、或者它們的任何片段、家族成員或衍生物，包括其藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明的抗-間皮素免疫綴合物也可以與癌癥疫苗組合地施用，癌癥疫苗的實(shí)例包括但不限于自體的細(xì)胞或組織、非自體的細(xì)胞或組織、癌胚抗原、甲胎蛋白、人絨毛膜促性腺激素、BCG活疫苗、黑素細(xì)胞譜系蛋白(例如gapW0、MART-l/MelanA、TRP-I (gp75)、 酪氨酸酶、廣泛分享的腫瘤相關(guān)的抗原包括腫瘤特異性的抗原(例如BAGE、GAGE-U GAGE-2、MAGE-U MAGE-3、N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶_V、pl5)、腫瘤相關(guān)的突變抗原(β -連環(huán)蛋白、MUM-I、⑶Κ4)、非黑素瘤抗原(例如HER-2/neu (乳腺癌和卵巢癌)、人5乳頭瘤病毒-E6、E7 (宮頸癌)、MUC-I (乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌)。關(guān)于由T-細(xì)胞識(shí)別的人腫瘤抗原，通常參見(jiàn)Robbins 和 Kawakami, 1996，Curr. Opin. Immunol. 8: 6沘。癌癥疫苗可以是或不是純化的制品。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-間皮素免疫綴合物與激素治療組合地使用。激素治療性處理包括激素激動(dòng)劑、激素拮抗劑(例如氟他胺、他莫昔芬、醋酸亮丙瑞林 (LUPRON)、LH-RH拮抗劑)、激素生物合成和加工的抑制劑、以及留類(例如地塞米松、類維生素A、倍他米松、皮質(zhì)醇、可的松、潑尼松、脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素、雌激素、睪酮、孕酮)、抗孕激素(例如，米非司酮、奧那司酮)，和抗雄激素(例如，醋酸環(huán)丙孕酮)。本發(fā)明的抗-間皮素免疫綴合物可以與抗-MDR (多藥抗藥性)表型藥劑組合地使用，例如共同施用。許多人癌癥固有地表達(dá)或自發(fā)地發(fā)展同時(shí)對(duì)幾類抗癌藥的抗性，盡管每種藥物類別具有不同的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理。該現(xiàn)象(其可以在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中模仿) 通常稱作多藥抗藥性(“MDR”)或多藥抗藥性表型。MDR表型代表人患者中的癌癥的成功化療治療的重大障礙。惡性腫瘤對(duì)多種化學(xué)治療劑的抗藥性是治療失敗的一個(gè)主要原因(Wittes等人，Cancer Treat. Rep. 70:105 (1986) ； Bradley, G.等人，Biochim. Biophys. Acta 948:87 (1988) ； Griswald, D. P.等人，CancerTreat. Rep. 65(S2) :51 (1981)； Osteen, R. Τ.(編)，Cancer Manual, (1990))。最初對(duì)細(xì)胞毒性劑敏感的腫瘤經(jīng)常復(fù)發(fā)，或變得可耐受多種化學(xué)治療藥物(Riordan等人，Wiarmacol. Ther. 28:51 (1985)； Gottesman 等人，Trends Pharmacol. Sci. 9:54 (1988) ； Moscow 等人，J. Natl. Cancer Inst. 80:14 (1988) ； Croop, J. Μ.等人，J. Clin. Invest. 81:1303 (1988))。 從腫瘤得到并在有選擇性的細(xì)胞毒性藥物存在下培養(yǎng)的細(xì)胞或組織，可以產(chǎn)生對(duì)該類中的其它藥物以及其它類藥物(包括，但不限于、蒽環(huán)類抗生素、長(zhǎng)春花生物堿和表鬼白毒素)的交叉抗藥性(Riordan 等人，Pharmacol. Ther. 28:51 (1985) ； Gottesman 等人，J. Biol. Chem. 263:12163 (1988))。因而，獲得的對(duì)單一藥物的抗藥性會(huì)同時(shí)產(chǎn)生對(duì)結(jié)構(gòu)上和功能上不相關(guān)的不同藥物集合的抗藥性。這樣的抗藥性可以成為實(shí)體形式腫瘤和液體形式腫瘤(例如血液癌癥或基于淋巴的癌癥)的問(wèn)題。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中多藥抗藥性的一個(gè)主要機(jī)理涉及170 kDa質(zhì)膜糖蛋白泵系統(tǒng)的表達(dá)增加(Juranka 等人，F(xiàn)ASEB J 3:2583 (1989) ； Bradley, G.等人，Biochem. Biophys. Acta 948:87 (1988))。已經(jīng)從培養(yǎng)的人細(xì)胞克隆出編碼該泵系統(tǒng)(有時(shí)稱作多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)的基因，且通常稱作mdrl。該基因在幾類正常組織中表達(dá)，但是尚未鑒別出這些組織中為mdrl基因產(chǎn)物而運(yùn)輸?shù)纳淼孜?。MDIU產(chǎn)物是ABC運(yùn)載體蛋白超家族(一組具有能量-依賴性的輸出功能的蛋白)的一個(gè)成員。mdrl基因的蛋白產(chǎn)物(通常稱作P-糖蛋白(“P-170”、“P-gp”))是一種170 kDa跨-質(zhì)膜蛋白，其構(gòu)成前述的能量-依賴性的流出泵。細(xì)胞表面上P-gp的表達(dá)足以使細(xì)胞耐受多種細(xì)胞毒性的藥物，包括許多抗癌劑。 P-gp-介導(dǎo)的MDR似乎是不同類型的腫瘤中的腫瘤抗藥性的重要臨床組分，且mdrl基因表達(dá)與不同類型的癌癥對(duì)化學(xué)療法的抗性有關(guān)。mdrl基因的核苷酸序列(Gros，P.等人， Cell 47:371 (1986) ； Chen, C.等人，Cell 47:381 (1986))表明，它編碼與P-糖蛋白類似或相同的多肽，且它們是與細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白類似的高度保守的膜蛋白類別的成員，并參與正常的生理運(yùn)輸過(guò)程。mdrl基因的序列分析表明，Pgp由分布在2個(gè)同源的03%同一性) 一半之間的1280個(gè)氨基酸組成。該分子的每一半具有6個(gè)疏水跨膜結(jié)構(gòu)域，且各自具有在大細(xì)胞質(zhì)環(huán)內(nèi)的一個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)。僅約8%的分子是細(xì)胞外的，且碳水化合物部分(大約 30 kDa)結(jié)合在該區(qū)域中的部位上。因而，應(yīng)當(dāng)理解，具有“多藥抗藥性”或“多藥抗性的”表型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的特征在于，從細(xì)胞內(nèi)環(huán)境隔離、輸出或排除多種細(xì)胞毒性物質(zhì)(例如，化學(xué)治療藥)的能力。 細(xì)胞可以獲得該表型，作為通過(guò)暴露于單一化學(xué)治療藥(選擇毒素)所施加的選擇壓力的結(jié)果?；蛘?，細(xì)胞可以在毒素暴露之前表現(xiàn)出該表型，因?yàn)榧?xì)胞毒性物質(zhì)的輸出可能涉及與細(xì)胞分泌產(chǎn)物、代謝物等的正常輸出共有的機(jī)理。多藥抗藥性與簡(jiǎn)單地獲得對(duì)選擇毒素的抗藥性的差別在于，細(xì)胞獲得輸出該細(xì)胞以前沒(méi)有暴露的額外細(xì)胞毒素(其它化學(xué)治療藥)的能力。例如，Mirski等人(1987)，47 Cancer Res. 2594-2598描述了多藥抗性的細(xì)胞群體的分離，其中在有作為選擇毒素的阿霉素(多柔比星)存在下，培養(yǎng)從從人小細(xì)胞肺癌衍生出的H69細(xì)胞系。發(fā)現(xiàn)存活的細(xì)胞會(huì)耐受下述藥物的細(xì)胞毒性效應(yīng)蒽環(huán)類抗生素類似物(例如，道諾霉素、表柔比星、美諾立爾和米托蒽醌)、阿西維辛、依托泊苷、 短桿菌肽D、秋水仙堿和長(zhǎng)春花-衍生的生物堿(長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿)以及阿霉素?？梢詰?yīng)用類似的選擇培養(yǎng)技術(shù)，以制備額外的多藥抗性的細(xì)胞群體。因此，本發(fā)明的藥物組合物可以另外包括起抑制MDR表型和/或與MDR表型有關(guān)的狀況的作用的化合物。這樣的化合物可以包括本領(lǐng)域的任意已知的MDR抑制劑化合物，例如，對(duì)MDR組分特異性的抗體 (例如抗-MDR運(yùn)載體抗體)或MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的小分子抑制劑，具體地包括他莫昔芬、維拉帕米和環(huán)孢霉素A，它們是已知會(huì)逆轉(zhuǎn)或抑制多藥抗藥性的藥劑(Lavie等人J. Biol. Chem. 271: 19530-10536, 1996，通過(guò)引用并入本文)。這樣的化合物可以參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5，773，280,6, 225，325和5，403，574，它們各自通過(guò)引用并入本文。這樣的MDR抑制劑化合物可以與本發(fā)明的抗-間皮素免疫綴合物共同施用，用于不同目的，所述目的包括在檢測(cè)到MDR表型以后，逆轉(zhuǎn)MDR表型，以輔助或增強(qiáng)化療治療。MDR抑制劑，例如他莫昔芬、維拉帕米或環(huán)孢霉素A，可以與本發(fā)明的化合物聯(lián)合使用，以輔助檢測(cè)MDR表型。根據(jù)該方面， MDR抑制劑可以增強(qiáng)本發(fā)明化合物在MDR癌細(xì)胞中的攝入和積累，因?yàn)樵谟蠱DR抑制劑存在下，會(huì)減少M(fèi)DR運(yùn)輸系統(tǒng)的運(yùn)輸或“泵出”成像化合物(相對(duì)于底物結(jié)構(gòu)域)的能力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-間皮素免疫綴合物與基因治療方案聯(lián)合使用，用于治療癌癥。使用分泌白介素-2的重組細(xì)胞的基因治療可以與本發(fā)明的免疫綴合物組合地施用，以預(yù)防或治療癌癥，尤其是乳腺癌(參見(jiàn)，例如，Deshmuld1等人，2001，J. Neurosurg. 94:287)。為了評(píng)估特定免疫綴合物在治療上可用于治療癌癥的能力，作為一個(gè)實(shí)例，可以在小鼠異種移植物腫瘤模型中在體內(nèi)測(cè)試免疫綴合物。治療模型的實(shí)施例詳述在實(shí)施例1 和2中。使用在實(shí)施例3中所述的抗體依賴性的細(xì)胞-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性試驗(yàn)，也可以測(cè)試抗體活性。藥物組合物和劑量
本文所述的免疫綴合物可以提供在包含藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物中。藥學(xué)上可接受的載體可以是無(wú)熱原的。所述組合物可以單獨(dú)施用，或與至少一種其它藥劑(諸如穩(wěn)定化化合物)組合地施用，其可以在任意無(wú)菌的、生物相容的藥用載體(包括，但不限于、鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖和水)中施用?？梢圆捎枚喾N水性載體，包括，但不限于鹽水、甘氨酸等。這些溶液是無(wú)菌的，且通常不含有微粒物質(zhì)。通過(guò)常規(guī)的、眾所周知的滅菌技術(shù)(例如， 過(guò)濾)，可以滅菌這些溶液。通常，短語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”是本領(lǐng)域公知的，且包括藥學(xué)上可接受的物質(zhì)、組合物或媒介物，其適合將本發(fā)明的化合物施用給哺乳動(dòng)物。所述載體包括在將主題藥劑從身體的一個(gè)器官或部分?jǐn)y帶或運(yùn)輸?shù)缴眢w的另一個(gè)器官或部分所涉及的液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包囊材料。每種載體必須是“可接受的”，其含義是，與制劑的其它成分相容，且對(duì)患者無(wú)害?？梢杂米魉帉W(xué)上可接受的載體的物質(zhì)的一些實(shí)例包括 糖類，諸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，諸如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素和它的衍生物， 諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；粉末化的黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石粉；賦形劑，諸如可可脂和栓劑蠟類；油，諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；二醇類，諸如丙二醇；多元醇，諸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，諸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩沖劑，諸如氫氧化鎂和氫氧化鋁；海藻酸；無(wú)熱原的水；等滲鹽
16水；林格氏溶液；乙醇；磷酸鹽緩沖溶液；和其它無(wú)毒的、適合用于藥物制劑中的物質(zhì)。潤(rùn)濕齊U、乳化劑和潤(rùn)滑劑(諸如月桂基硫酸鈉和硬脂酸鎂)以及著色劑、脫膜劑、包衣劑、甜味齊U、矯味劑和芳香劑、防腐劑和抗氧化劑，也可以存在于本發(fā)明的免疫綴合物組合物中。藥學(xué)上可接受的抗氧化劑的實(shí)例包括水溶性的抗氧化劑，諸如抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等；油-溶性的抗氧化劑，諸如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁羥茴醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、沒(méi)食子酸丙酯、α-生育酚等；和金屬螯合齊U，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。所述組合物可以含有接近生理?xiàng)l件所需的藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，諸如ρΗ調(diào)節(jié)劑和緩沖劑等。本發(fā)明的免疫綴合物在這樣的藥物制劑中的濃度可以廣泛地變化，且可以根據(jù)選擇的具體給藥模式，主要基于流體體積、粘度等進(jìn)行選擇。如果需要的話，可以在藥物組合物中包含超過(guò)一類抗體或免疫綴合物(例如，對(duì)于間皮素結(jié)合而言具有不同Ka的抗體)。所述組合物可以單獨(dú)地或與其它藥劑、藥物或激素組合地施用給患者。除了活性成分以外，這些藥物組合物可以含有合適的藥學(xué)上可接受的載體，包括便于將活性化合物加工成可以在藥學(xué)上使用的制品的賦形劑和輔料。本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)任意數(shù)目的途徑來(lái)施用，所述途徑包括，但不限于口服、靜脈內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、動(dòng)脈內(nèi)的、骨髓內(nèi)的、 鞘內(nèi)的、心室內(nèi)的、透皮的、皮下的、腹膜內(nèi)的、鼻內(nèi)的、腸胃外的、局部的、舌下的或直腸的方式。本發(fā)明的組合物另外包括合適的免疫載體，例如，蛋白、多肽或肽諸如白蛋白、血藍(lán)蛋白、甲狀腺球蛋白和其衍生物、特別是牛血清白蛋白(BSA)和鑰孔戚血藍(lán)素(KLH)、多糖、碳水化合物、聚合物和固相。其它蛋白衍生的或非蛋白衍生的物質(zhì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在涉及疫苗(例如與本發(fā)明的抗體在一起的癌癥疫苗)的方面，可以在有或沒(méi)有佐劑存在下，施用本發(fā)明的組合物。可以在沒(méi)有佐劑存在下進(jìn)行施用，以便避免任何佐劑誘導(dǎo)的毒性。本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員(例如專注于癌癥的醫(yī)生)會(huì)明白和理解如何確定是否使用佐劑，且可以取決于受試者的醫(yī)療史、家族數(shù)據(jù)、毒性數(shù)據(jù)、變態(tài)反應(yīng)-有關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果等。在使用佐劑的實(shí)施方案中，有利地，佐劑會(huì)促進(jìn)保護(hù)性抗體(諸如保護(hù)性IgG抗體)的形式。本發(fā)明預(yù)見(jiàn)到本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任意合適的佐劑，并容易地適用于本發(fā)明。適用于給動(dòng)物接種疫苗的佐劑可以包括、但不限于氫氧化鋁、皂苷和它的純化組分 Quit Α、完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)。已經(jīng)證實(shí)，硫酸葡聚糖是針對(duì)葡萄球菌細(xì)胞表面抗原的IgG2抗體的有效刺激物，且也適合作為佐劑。技術(shù)人員會(huì)明白，有些佐劑對(duì)于獸醫(yī)應(yīng)用而言可以是更優(yōu)選的，而其它佐劑對(duì)于用于人類而言是優(yōu)選的，且在將化合物施用給人類之前，技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)考慮佐劑毒性。通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的任意方法(參見(jiàn)，例如，Remington’ s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. , Easton, Pa., 20th edition, 2000)，可以制備適用于腸胃外的、皮下的、靜脈內(nèi)的、肌肉內(nèi)的給藥等的制劑、合適的藥用載體以及配制和給藥的技術(shù)。用于本發(fā)明化合物的口服給藥的液體劑型包括藥學(xué)上可接受的乳劑、微乳劑、溶液、 懸浮液、糖漿劑和酏劑。除了活性成分以外，液體劑型可以含有本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑， 例如，水或其它溶劑、增溶劑和乳化劑，諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(具體地，棉籽油、花生油、玉米油、胚油(germ oil)、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫呋喃醇、聚乙二醇和脫水山梨糖醇的脂肪酸酯、及其混合物。本文使用的短語(yǔ)“腸胃外給藥”和“腸胃外地施用的”是指除了腸給藥和局部給藥以外的給藥模式，通常通過(guò)注射，包括但不限于靜脈內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、動(dòng)脈內(nèi)的、鞘內(nèi)的、 囊內(nèi)的、眶內(nèi)的、心內(nèi)的、真皮內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、經(jīng)氣管的、皮下的、表皮下的、關(guān)節(jié)內(nèi)的、囊下的、蛛網(wǎng)膜下的、椎管內(nèi)的和胸骨內(nèi)的注射和輸注。治療上有效劑量的確定，是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。治療上有效劑量表示，與在沒(méi)有治療上有效劑量存在下觀察到的效能相比，可以用于有效地治療疾病(例如， 癌癥)的免疫綴合物的量。在動(dòng)物模型(例如，大鼠、小鼠、兔、狗或豬)中可以初步估計(jì)治療上有效劑量。所述動(dòng)物模型也可以用于確定適當(dāng)?shù)臐舛确秶徒o藥途徑。然后可以使用這樣的信息來(lái)確定在人類中有用的給藥劑量和途徑。通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)規(guī)程，可以確定免疫綴合物的治療效果和毒性(例如，ED50——在50%群體中治療上有效的劑量，和 LD50——使50%群體致死的劑量)。毒性效果與治療效果的劑量比是治療指數(shù)，它可以表達(dá)為L(zhǎng)D50/ED50之比。從動(dòng)物研究得到的數(shù)據(jù)可以用于制定用于人類的劑量范圍。在這樣的組合物中含有的劑量可以是在包括ED50、且?guī)缀醪痪哂谢虿痪哂卸拘缘难h(huán)濃度范圍內(nèi)。 根據(jù)采用的劑型、患者的敏感度和給藥途徑，劑量在該范圍內(nèi)變化。從業(yè)人員在考慮與需要治療的患者有關(guān)的因素以后，可以確定確切的劑量?？梢哉{(diào)節(jié)劑量和給藥，以提供足夠的免疫綴合物水平，或維持希望的效果?？梢钥紤]的因素包括疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性、受試者的一般健康、受試者的年齡、體重和性別、飲食、給藥時(shí)間和頻率、藥物組合、對(duì)治療的反應(yīng)敏感性和耐受性/應(yīng)答。使用已經(jīng)確立的技術(shù)，可以構(gòu)建編碼本發(fā)明的免疫綴合物的多核苷酸，并離體地或在體內(nèi)導(dǎo)入細(xì)胞中，所述技術(shù)包括，但不限于轉(zhuǎn)鐵蛋白-聚陽(yáng)離子-介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移、使用裸露的或包囊的核酸的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體-介導(dǎo)的細(xì)胞融合、DNA-包被的膠乳珠的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、原生質(zhì)體融合、病毒感染、電穿孔、“基因槍”和DEAE-或磷酸鈣-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。免疫綴合物的毒簇組分的有效體內(nèi)劑量是在約5 μ g至約500 μ g/kg患者體重的范圍內(nèi)。本發(fā)明的含有免疫綴合物的藥物組合物的給藥模式可以是任意合適的途徑，其遞送抗體給宿主。作為一個(gè)實(shí)例，本發(fā)明的藥物組合物可以用于腸胃外給藥(例如，皮下的、肌肉內(nèi)的、靜脈內(nèi)的或鼻內(nèi)的給藥)。在本公開(kāi)內(nèi)容中引用的所有專利和專利申請(qǐng)都明確地通過(guò)引用并入本文。上面的公開(kāi)內(nèi)容一般地描述了本發(fā)明。通過(guò)參考下面的具體實(shí)施例，可以得到更完整的理解，所述實(shí)施例僅為了例證目的而提供，無(wú)意限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1:免疫綴合物在表達(dá)間皮素的人胰腺癌異種移植物小鼠模型中的效能為了分析抗-間皮素免疫綴合物是否能夠減少腫瘤的間皮素依賴性方式的生長(zhǎng)，用間
皮素穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染了人胰腺癌細(xì)胞(MiaPaCa-幻，并用于建立皮下地生長(zhǎng)的腫瘤小鼠模型。 在效能研究中，使用人結(jié)腸癌細(xì)胞系HD9建立間皮素陰性對(duì)照腫瘤。在補(bǔ)充了 10% (ν/ν) FCS,2. 5% (ν/ν)馬血清、1.5 g/Ι碳酸氫鈉、4. 5 g/Ι葡萄糖、4mM谷氨酰胺和0.4% (ν/ν)潮霉素的DMEM培養(yǎng)基中，MiaPaCa細(xì)胞維持貼壁培養(yǎng)。在含有1.5 mM谷氨酰胺、2. 2g/l碳酸氫鈉和10% (v/v) FCS的McCoy氏^1培養(yǎng)基中培養(yǎng)Η ^9細(xì)胞。通過(guò)FACS證實(shí)MiaPaCa-2 細(xì)胞的間皮素表達(dá)和間皮素在HD9細(xì)胞中的缺失(未顯示)。為了評(píng)估腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)，給雌性NMRI裸鼠的右側(cè)腹皮下地接種3 χ IOf5MiaPaCaj細(xì)胞或1 χ 106Η ^9細(xì)胞， 所述細(xì)胞重新懸浮于50% Matrigel 和50%培養(yǎng)基中。已經(jīng)在0. 01 mg/kg、0. 03 mg/kg、 0. 05 mg/kg和0.2 mg/kg的治療劑量(與毒簇的量有關(guān))，測(cè)試了作為抗-間皮素免疫綴合物的 MF-J-SPDB-DM4、MF-T-SPDB-DM4、MF226-SPDB-DM4 和 M0R6640-SPDB-DM4。通過(guò)下述方法，制備 MF-J-SPDB-DM4、MF-T-SPDB-DM4、MF226-SPDB-DM4 和 M0R6640-SPDB-DM4 用 4-[2_吡啶基二硫代]丁酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDB)修飾抗-間皮素抗體，以導(dǎo)入二硫代吡啶基。使用8 mg/mL的抗體(比SPDB (在KOH中的 20mM儲(chǔ)備溶液)約6倍摩爾過(guò)量)，修飾抗體。使修飾的抗體與比硫代吡啶基1. 7倍摩爾過(guò)量的游離硫醇形式的美坦辛類反應(yīng)。在有3% 二甲基乙酰胺(3% ν/ν)存在下，與2. 5 mg/ml的抗體在室溫反應(yīng)20小時(shí)。 使用脫鹽kphadex G25柱，從未反應(yīng)的藥物和反應(yīng)副產(chǎn)物中純化綴合反應(yīng)混合物。通過(guò)測(cè)量在252 11111和沘0 nm的吸光度，使用消光系數(shù)224000 M^cm"1 (對(duì)于抗體)和5180 M^cm"1 (對(duì)于0114在^Onm)，計(jì)算每個(gè)抗體的美坦辛類分子的數(shù)目。252 nm/280 nm吸光度比值是 0. 37 (對(duì)于抗體)和5. 05 (對(duì)于DM4)。在腫瘤細(xì)胞接種后第5天，在腫瘤建立以后開(kāi)始治療，繼之以在腫瘤細(xì)胞接種后第8和12天進(jìn)行另外2次治療。用0.2 mg/kg的非靶向免疫綴合物(抗-溶菌酶-SPDB-DM4)或等體積的單獨(dú)媒介物(10 mM組氨酸、130 mM甘氨酸、5% (w/v)蔗糖、pH 5.5)，治療對(duì)照小鼠。通過(guò)靜脈內(nèi)給藥，以100 μΙ/lOg體重的劑量體積，進(jìn)行治療。每組由6只動(dòng)物組成。每天檢查小鼠的健康狀態(tài)。使用電子測(cè)徑器，測(cè)量皮下腫瘤的長(zhǎng)度和寬度，每周2次。通過(guò)下式計(jì)算腫瘤面積腫瘤面積[mm2]=長(zhǎng)度[mm] χ寬度[mm]。記錄在實(shí)驗(yàn)期間得到的所有數(shù)據(jù)。不同治療劑量的抗間皮素免疫綴合物MF-T-SPDB-DM4對(duì)間皮素-轉(zhuǎn)染的人胰腺癌細(xì)胞的抗腫瘤效能的一個(gè)實(shí)施例如圖1所示。給雌性NMRI裸鼠的右側(cè)腹接種3 χ IO6間皮素陽(yáng)性的MiaPaCa-2人胰腺癌細(xì)胞(A)或1 χ IO6間皮素陰性的HD9人結(jié)腸癌細(xì)胞(B)，所述細(xì)胞重新懸浮于50% MatrigelT750%培養(yǎng)基中。在腫瘤細(xì)胞接種后 5、8 和 12 天，小鼠接受 0. 01,0. 03,0. 05,0. 2 mg/kg MF-T-SPDB-DM4 (所有濃度與毒簇的量有關(guān))或單獨(dú)的媒介物。每周測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)度和寬度2次，并通過(guò)寬度乘以長(zhǎng)度，計(jì)算腫瘤面積。繪制每組和每個(gè)測(cè)量時(shí)間點(diǎn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。所有η = 6。星號(hào)指示 P-值 < 0.05。攜帶腫瘤的小鼠的治療揭示，在0. 03 mg/kg,0. 05 mg/kg和0. 2 mg/kg的劑量測(cè)試的所有抗-間皮素免疫綴合物都能夠抑制間皮素陽(yáng)性的MiaPaCa-2腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)。劑量為 0. 05 mg/kg和0. 2 mg/kg的MF-T-SPDB-DM4完全根除了腫瘤，在132天的觀察期結(jié)束之前， 腫瘤沒(méi)有再生。0. 05 mg/kg的非靶向?qū)φ湛?溶菌酶-SPDB-DM4對(duì)間皮素陽(yáng)性的MiaPaCa 腫瘤生長(zhǎng)沒(méi)有影響(表1)。與未治療的和媒介物治療的腫瘤相比，最高劑量的0.2 mg/kg MF-T-SPDB-DM4沒(méi)有顯著減少間皮素陰性的Η ^9腫瘤的生長(zhǎng)。這證實(shí)，MF_T_SPDB_DM4的強(qiáng)腫瘤抑制效能依賴于間皮素在腫瘤內(nèi)的表達(dá)。表1:抗-間皮素免疫綴合物在間皮素陽(yáng)性的MiaPaCa異種移植物腫瘤模型中的腫瘤抑制效能
權(quán)利要求
1.一種免疫綴合物，其包含細(xì)胞毒性劑和含有對(duì)間皮素(SEQ ID NO:36)特異性的抗原-結(jié)合區(qū)的人或人源化的抗體或其功能片段，其中所述抗體或其功能片段表現(xiàn)出對(duì)間皮素的不變結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫綴合物，其包含與間皮素(SEQID NO:36)特異性地免疫反應(yīng)性的人抗體或抗體片段，其中所述抗體結(jié)合位點(diǎn)包括至少一個(gè)CDR1、CDR2或CDR3 a)所述CDRl 選自SEQ ID NO 1、2、3、10、11 和 12，b)所述CDR2 選自SEQ ID NO 4、5、6、13、14 和 15，c)所述CDR3 選自SEQ ID NO 7、8、9、16、17、18 和 19。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫綴合物，其中所述細(xì)胞毒性劑由美坦辛類或其衍生物組成。
4.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫綴合物和其藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
5.一種用于治療與不希望的間皮素存在有關(guān)的病癥或狀況的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供免疫綴合物，所述免疫綴合物由結(jié)合間皮素的抗體(例如，單克隆抗體)或抗體片段組成，所述抗體或抗體片段綴合到細(xì)胞毒性劑(例如，美坦辛或其衍生物)上，且/或所述免疫綴合物與一種或更多種額外的抗癌劑共同施用或共同配制。本發(fā)明的免疫綴合物可以用于本發(fā)明的方法中，以治療和/或診斷和/或監(jiān)測(cè)癌癥，例如實(shí)體瘤。所述綴合物包含含有對(duì)膜-錨定的40kDa間皮素多肽是特異性的抗原-結(jié)合區(qū)的抗體和功能片段，所述間皮素多肽在幾種腫瘤中過(guò)表達(dá)，所述腫瘤例如胰腺腫瘤和卵巢腫瘤、間皮瘤和肺癌細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102458477SQ201080029126
公開(kāi)日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月29日
發(fā)明者卡納特 A., C. 科皮茨 C., 海斯勒 I., 舒馬歇 J., 貝爾赫斯特 K. 申請(qǐng)人:拜耳制藥股份公司