專利名稱：癌抗原輔助肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及WTl輔助肽、編碼所述肽的多核苷酸、由所述肽誘導(dǎo)的WTl特異性輔助性T細(xì)胞、包含它們的用于治療/預(yù)防癌癥的藥物組合物。本申請(qǐng)要求2009年4月23日申請(qǐng)的日本專利申請(qǐng)?zhí)?009-105286的優(yōu)先權(quán)，日本專利申請(qǐng)?zhí)?009-105286的公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
背景技術(shù)：
WTl基因(維爾姆斯瘤(Wilms’ tumor) I基因)是一種被鑒定為兒童期腎癌維爾 姆斯瘤誘發(fā)基因的基因(非專利文獻(xiàn)I和2)，并且是具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。WTl基因最初被認(rèn)為是癌癥抑制基因。然而，隨后的研究表明，上述基因更合適充當(dāng)造血器官腫瘤和實(shí)體癌的癌基因(非專利文獻(xiàn)3-6)。由于WTl基因在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，因此已經(jīng)證實(shí)作為沒有突變的自身蛋白的WTl基因產(chǎn)物是否存在體內(nèi)免疫原性。結(jié)果表明，來源于在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的WTl基因的蛋白質(zhì)被胞內(nèi)加工成片段，所得到的肽與展示在細(xì)胞表面上的MHC I類分子形成復(fù)合物，通過WTl肽疫苗接種可誘導(dǎo)識(shí)別這類復(fù)合物的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(下文亦稱CTL)(非專利文獻(xiàn)7-9)。研究還表明，用WTl肽或WTl cDNA免疫的小鼠以高比率排斥植入的表達(dá)WTl基因的腫瘤細(xì)胞(非專利文獻(xiàn)7和10)，但內(nèi)源性表達(dá)WTl基因的正常組織不被誘導(dǎo)的CTL破壞(非專利文獻(xiàn)7)。在此之前，有研究強(qiáng)有力的表明，不僅僅在小鼠中而且還在人中可誘導(dǎo)WTl特異性CTL，而且這類CTL具有針對(duì)高表達(dá)WTl基因的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，但對(duì)于內(nèi)源性表達(dá)WTl基因的正常細(xì)胞沒有細(xì)胞毒活性(非專利文獻(xiàn)7和10-14)。另一方面，據(jù)報(bào)道，為了有效地誘導(dǎo)CTL，對(duì)癌抗原有特異性的輔助性T細(xì)胞的存在十分重要(非專利文獻(xiàn)15)。輔助性T細(xì)胞(⑶4陽性T細(xì)胞)通過識(shí)別MHC II類分子與抗原呈遞細(xì)胞上的抗原肽的復(fù)合物被誘導(dǎo)、增殖和激活?；罨妮o助性T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、IL-4、IL-5、IL-6或干擾素(IFN)等細(xì)胞因子并促進(jìn)B細(xì)胞和其它T細(xì)胞亞群的增殖、分化和成熟。因此，有研究認(rèn)為，與MHC II類分子結(jié)合的抗原肽通過誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞，有效地激活CTL等，并提高免疫功能(非專利文獻(xiàn)16)。在此之前，有關(guān)WTl僅報(bào)道了與MHC II類分子的HLA-DRB1*0401和HLA_DRB1*0405結(jié)合的抗原肽(非專利文獻(xiàn)17和專利文獻(xiàn)I)，有必要尋找針對(duì)其它亞型的抗原肽?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :國際公開號(hào)WO 2005/045027非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I =Daniel A. Haber 等，Cell. 1990 年 6 月 29 日；61 (7) : 1257-69。非專利文獻(xiàn)2 Call KM 等，Cell. 1990 年 2 月 9 日；60 (3) :509_20。非專利文獻(xiàn)3 =Menke AL 等，Int Rev Cytol. 1998 ；181 :151_212。綜述。非專利文獻(xiàn)4 :Yamagami T 等，Blood. 1996 年 4 月 I 日；87(7) :2878_84。
非專利文獻(xiàn)5 Inoue K 等，Blood. 1998 年 4 月 15 日；91 (8) :2969_76。非專利文獻(xiàn)6 =Tsuboi A 等，Leuk Res. 1999 年 5 月；23 (5) :499_505。非專利文獻(xiàn)7:0ka Y 等，J Immunol. 2000 年 2 月 15 日；164(4) :1873_80。非專利文獻(xiàn)8 =Melief CJ 等，Immunol Rev. 1995 年 6 月；145 :167_77。非專利文獻(xiàn)9:Ritz J，J Clin Oncol. 1994 年 2 月；12(2) :237_8。非專利文獻(xiàn)10 :Tsuboi A 等，J Clin Immunol. 2000 年 5 月；20(3) :195_202。非專利文獻(xiàn)11 0ka Y 等，Immunogenetics. 2000 年 2 月；51 (2) :99_107。非專利文獻(xiàn)12 0hminami H 等，Blood. 2000 年 I 月 I 日；95 (I) :286_93。 非專利文獻(xiàn)13 :Gao L 等，Blood. 2000 年 4 月 I 日；95(7) :2198_203。非專利文獻(xiàn)14 0hminami H 等，Blood. 2000 年 I 月 I 日；95 (I) :286_93。非專利文獻(xiàn)15 Cancer. Res. 62 :6438, 2002。非專利文獻(xiàn)16 J. Tmmun01. Immunother. ,24 :195, 2001。非專利文獻(xiàn)17 Cancer. TmmunoI. Immunother. 51 :271, 2002。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的技術(shù)問題因此，本發(fā)明要達(dá)到的目的是提供通過與各種MHC II類分子結(jié)合而誘導(dǎo)WTl特異性輔助性T細(xì)胞的肽、編碼所述肽的多核苷酸、由所述肽誘導(dǎo)的WTl輔助性T細(xì)胞以及包含它們的用于治療/預(yù)防癌癥的藥物組合物。解決技術(shù)問題的技術(shù)手段本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究以達(dá)到上述目的。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有編碼WTl蛋白的連續(xù)氨基酸序列的一部分的肽起癌抗原輔助肽的作用，換句話說，所述肽通過與MHC II類分子結(jié)合而展示在抗原呈遞細(xì)胞上，并且誘導(dǎo)WTl特異性輔助性T細(xì)胞，且顯示該肽可用于治療/預(yù)防癌癥的藥物組合物。因此，本發(fā)明提供(I) 一種肽，其具有由來源于WTl蛋白的連續(xù)氨基酸組成的氨基酸序列，并通過與MHC II類分子結(jié)合誘導(dǎo)WTl特異性輔助性T細(xì)胞，其中氨基酸序列選自(a) SEQ ID NO 3所述氨基酸序列；(b) SEQ ID NO :4所述氨基酸序列；(c)SEQ ID NO 5所述氨基酸序列；和(d) 一種氨基酸序列，其中(a)-(c)所述氨基酸序列中一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被取代、缺失或添加；(2)⑴中的肽，其中氨基酸序列是SEQ ID NO 3所述氨基酸序列；(3) (I)或(2)中的肽，其中 MHC II 類分子選自 DRBr0101、DRBr0405、DRBr0802、DRBr0803、DRBr0901、DRBri201、DRBri403、DRBri501、DRBri502、DPBr0201、DPBr0202、DPB 1*0402, DPB 1*050 U DPB 1*090 U DQB 1*030 U DQB 1*0302, DQB 1*040 U DQB 1*050 U DQB 1*060 UDQB1*0602 和 DRB5*0102 ；(4) (I)或(2)中的肽，其中 MHC II 類分子選自 DRBr0101、DRBr0405、DRBri502、DPB 1*020 U DPB 1*0202 和 DQB1*0601 ；
(5)編碼(1)-(4)中任一項(xiàng)的肽的多核苷酸；(6)包含(5)中的多核苷酸的表達(dá)載體；(7)抗(1)-(4)中任一項(xiàng)的肽或(5)的多核苷酸的抗體；(8) 一種用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，其包含(1)-(4)中任一項(xiàng)的肽、(5)中的多核苷酸或(6)中的載體；(9) 一種用于治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括將有效量的(1)-(4)中任一項(xiàng)的肽、(5)中的多核苷酸或(6)中的載體給予具有(3)或(4)中的MHC II類分子的受試者；(10) (1)-(4)中任一項(xiàng)的肽、(5)中的多核苷酸或(6)中的載體在治療或預(yù)防癌癥中的用途； (11)通過(3)或⑷中的MHC II類分子展示⑴-⑷中任一項(xiàng)的肽的抗原呈遞細(xì)胞；(12) 一種用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的方法，所述方法包括在(1)-(4)中任一項(xiàng)的肽的存在下培養(yǎng)不成熟的抗原呈遞細(xì)胞，并從不成熟的抗原呈遞細(xì)胞中誘導(dǎo)通過(3)或(4)中的MHC II類分子展示肽的抗原呈遞細(xì)胞；(13) (1)-(4)中任一項(xiàng)的肽所誘導(dǎo)的WTl特異性輔助性T細(xì)胞；(14) 一種用于誘導(dǎo)WTl特異性輔助性T細(xì)胞的方法，所述方法包括在(1)-(4)中任一項(xiàng)的肽的存在下培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞，并從外周血單核細(xì)胞中誘導(dǎo)WTl特異性輔助性T細(xì)胞；(15) 一種誘導(dǎo)WTl特異性輔助性T細(xì)胞的試劑盒，其包括(1)-(4)中任一項(xiàng)的肽作為必需成分；(16) 一種用于預(yù)防或治療癌癥的試劑盒，其包括(1)-(4)中任一項(xiàng)的肽、(5)中的多核苷酸或(6)中的載體作為必需成分；(17) 一種在具有(3)或⑷中的MHC II類分子的受試者中測定WTl特異性輔助性T細(xì)胞的存在情況或量的方法，所述方法包括以下步驟(a)使⑴-⑷中任一項(xiàng)的肽與得自受試者的樣品反應(yīng)；然后(b)測定樣品中所包含的細(xì)胞因子的存在情況或量。發(fā)明的有益效果按照本發(fā)明，可獲得與以下多種類型的MHC II類分子結(jié)合的WTl輔助肽例如DRBr0101、DRBr0405、DRBr0802、DRBr0803、DRBr0901、DRBri201、DRBri403、DRBri501、DRBri502、DPBr0201、DPBr0202、DPBr0402、DPBr0501、DPBr0901、DQBr0301、DQBr0302、DQB 1*040U DQB1*050U DQB1*060U DQB1*0602 和 DRB5*0102 ;還可獲得一種包含所述 WTl 輔助肽的用于治療/預(yù)防癌癥的藥物組合物。因此，在各類受試者(具體地講大多數(shù)日本人具有上述分子)中體內(nèi)和體外誘導(dǎo)WTl特異性輔助性T細(xì)胞是可能的。因?yàn)楸景l(fā)明誘導(dǎo)了WTl特異性輔助性T細(xì)胞，因此也可能在高表達(dá)WTl的癌中有效地激活T細(xì)胞和B細(xì)胞。附圖簡述圖I表示通過在用各種肽刺激各肽特異性T細(xì)胞系后測定細(xì)胞增殖得到的結(jié)果，所述細(xì)胞系通過用3種肽(mWTl35、mWTl8f^PmWTl294)的每一種進(jìn)行脈沖來制備。圖中，符號(hào)
表示無肽刺激。
圖2表示通過在抗MHC I類或II類抗體存在下用各種相應(yīng)肽刺激各肽特異性T細(xì)胞系后測定細(xì)胞增殖得到的結(jié)果，所述細(xì)胞系通過用3種肽(mWTl35、mWTl8f^PmWTl294)進(jìn)行脈沖制備。圖中，符號(hào)表示無肽刺激?？v坐標(biāo)中的符號(hào)“cpm”表示每分鐘計(jì)數(shù)。圖3表示通過測定各WTl肽特異性T細(xì)胞系響應(yīng)以下細(xì)胞進(jìn)行的細(xì)胞增殖而得到的結(jié)果C1498細(xì)胞、用3種肽(mWTl35、mffTl86和mWTl294)進(jìn)行脈沖的C1498細(xì)胞以及強(qiáng)制表達(dá)WTl蛋白的C1498細(xì)胞?？v坐標(biāo)中的符號(hào)“cpm”表示每分鐘計(jì)數(shù)。圖4表示通過在用3種肽(mWTl35、mffTl86和mWTl294)進(jìn)行脈沖制備的各肽特異性T細(xì)胞系中測定產(chǎn)IFN-Y能力得到的結(jié)果。 圖5表示通過測定3種肽(mWTl35、mffTl86和mWTl294)的CTL細(xì)胞毒活性而得到的結(jié)果。 表示使用用WTl126肽(MHC I類限制性肽)進(jìn)行脈沖的RMAS細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。〇表示使用對(duì)照RMAS細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖6表示在腫瘤植入實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行腫瘤植入和免疫的時(shí)間序列的示意圖。在給小鼠皮下植入表達(dá)WTl的白血病細(xì)胞后第7、14和21天用mWTl35輔助肽進(jìn)行免疫，以及在第29天進(jìn)行解剖。向下的白色箭頭表示皮內(nèi)給予對(duì)照(PBS) (IFA/30ia)的時(shí)間點(diǎn)。向下的黑色箭頭表示皮內(nèi)給予HiWTl35輔助肽(50 ii M/IFA/30 ill)的時(shí)間點(diǎn)。圖7表示用mWTl35輔助肽免疫的小鼠中的腫瘤大小和無病小鼠群的比例。在用HiWTl35輔助肽免疫的小鼠中，10只小鼠中有4只無病。另一方面，在用對(duì)照免疫的小鼠中，9只小鼠中不存在無病小鼠。圖8表示在用mWTl35輔助肽免疫的小鼠中的無病存活率。圖9表示CTL在用1^1135輔助肽免疫的小鼠中的細(xì)胞毒活性。 表示使用用mWTl126肽(MHC I肽)進(jìn)行脈沖的RMAS細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。〇表示使用對(duì)照RMAS細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圓括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示腫瘤大小(mm)。

圖10表示mWTl特異性CTL在對(duì)照小鼠中的細(xì)胞毒活性。 表示使用用mWTl126肽(MHC I肽)進(jìn)行脈沖的RMAS細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。〇表示使用對(duì)照RMAS細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圓括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示腫瘤大小(mm)。圖11表示當(dāng)給予mWTl35肽時(shí)，mWTl126肽特異性CTL的細(xì)胞毒活性(左)和WTl126四聚體陽性T細(xì)胞的比例(右)。圖12表示在具有MHC II類分子的各健康受試者的外周血單核細(xì)胞中，通過測定WTl35肽刺激的細(xì)胞增殖而得到的結(jié)果。圖13 表示當(dāng)將應(yīng)答物(Responder)[從 DRBl*0101/0405、DPBl*0201/0402和DQB1*0401/0501的陽性健康受試者(健康受試者A)中得到的PBMC]用刺激物(Stimulator)[從 DRB1*0405/0901、DPB1*0201/0501 和 DQB1*0303/0401 的陽性健康受試者(健康受試者B)中得到的PBMC]處理時(shí)，通過測定細(xì)胞增殖而得到的結(jié)果?？v坐標(biāo)表示所摻入的3H-胸苷的量(cpm)。橫坐標(biāo)表示所加入的各種抗體類型(無抗體、抗HLA-DR抗體、抗HLA-DP抗體和抗HLA-DQ抗體)。圖14 表示當(dāng)將應(yīng)答物[從 DRBl*0101/0405、DPBl*0201/0402 和 DQBr0401/0501的陽性健康受試者(健康受試者A)中得到的PBMC]用刺激物[從DRBr0405/0803、DPB1*0202/0501和DQB1*0401/0601的陽性健康受試者(健康受試者G)中得到的PBMC]處理時(shí)，通過測定細(xì)胞增殖而得到的結(jié)果?？v坐標(biāo)表示所摻入的3H-胸苷的量(cpm)。橫坐標(biāo)表示所加入的各種抗體類型(無抗體、抗HLA-DR抗體、抗HLA-DP抗體和抗HLA-DQ抗體)。圖15 表示當(dāng)將應(yīng)答物[從具有 DRBr0101/0405、DPBl*0201/0402 和DQB1*0401/0501 (健康受試者A)的健康受試者中得到的PBMC]用刺激物[從DRBr0101/0803、DPBr0501/_和DQBr0501/0601陽性健康受試者(健康受試者H)中得到的PBMC]處理時(shí)，通過測定細(xì)胞增殖而得到的結(jié)果?？v坐標(biāo)表示所摻入的3H-胸苷的量(cpm)。橫坐標(biāo)表示所加入的各種抗體類型(無抗體、抗HLA-DR抗體、抗HLA-DP抗體和抗HLA-DQ 抗體)。圖16 表示當(dāng)將應(yīng)答物[從 DRBl*0405/0803、DPB1*0202/0501 和 DQBr0401/0601的陽性健康受試者(健康受試者G)中得到的PBMC]用刺激物(導(dǎo)入DQBf0601基因的L細(xì)胞)處理時(shí)，通過測定產(chǎn)IFN-Y能力而得到的結(jié)果?？v坐標(biāo)表示T細(xì)胞中IFN-Y的量的比例。橫坐標(biāo)表示用WTl35肽的脈沖的存在與否(+或_)。圖17 表示當(dāng)將應(yīng)答物[從 DRB1*1502/1502、DPB1*0201/0901 和 DQBr0601/0601 的陽性健康受試者(健康受試者D)中得到的PBMC]用刺激物(從與應(yīng)答物中相同健康受試者中得到的PBMC)處理時(shí)，通過測定細(xì)胞增殖而得到的結(jié)果?？v坐標(biāo)表示所摻入的3H-胸苷的量(cpm)。橫坐標(biāo)表示所加入的各種抗體類型(無抗體、抗HLA-DR抗體、抗HLA-DP抗體和抗HLA-DQ抗體)。圖18 表示當(dāng)將應(yīng)答物[從 DRB1*0101/1501、DPBl*0201/0402 和 DQBr0501/0602的陽性健康受試者(健康受試者I)中得到的PBMC]用刺激物(從與應(yīng)答物中相同健康受試者中得到的PBMC)處理時(shí)，通過測定產(chǎn)IFN-Y能力而得到的結(jié)果。縱坐標(biāo)表示T細(xì)胞中IFN-Y的量的比例。橫坐標(biāo)表示用WTl35肽的脈沖的存在與否(+或_)。實(shí)施發(fā)明的方式一方面，本發(fā)明涉及具有由來源于小鼠或人WTl蛋白的氨基酸組成的氨基酸序列的肽。WTl基因在例如以下腫瘤和癌中高表達(dá)造血器官腫瘤，例如白血??；骨髓增生異常綜合征、多發(fā)性骨髓瘤和惡性淋巴瘤；實(shí)體癌，例如胃癌、腸癌、肺癌、乳腺癌、生殖細(xì)胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌和卵巢癌。因此，本發(fā)明的肽存在于大量表達(dá)WTl基因的癌細(xì)胞中。本發(fā)明的肽是這樣的肽，其具有由來源于SEQ ID NO 2中所述的人WTl蛋白的連續(xù)氨基酸組成的氨基酸序列，保持與下述MHC II類分子結(jié)合的能力，并具有誘導(dǎo)WTl特異性輔助性T細(xì)胞的能力。對(duì)于本發(fā)明的肽的氨基酸序列和長度沒有特殊限制，只要肽具有上述特征即可。然而，太長的肽易受蛋白酶作用的影響，而太短的肽無法很好地與肽容納溝結(jié)合。本發(fā)明的肽的長度優(yōu)選為10-25個(gè)氨基酸，更優(yōu)選15-21個(gè)氨基酸，進(jìn)一步優(yōu)選16-20個(gè)氨基酸，例如17個(gè)氨基酸、18個(gè)氨基酸或19個(gè)氨基酸。本發(fā)明的肽的具體實(shí)例是具有SEQ ID NO :3所述氨基酸序列、SEQ ID NO :4所述氨基酸序列和SEQ ID NO :5所述氨基酸序列的那些肽。同樣，本發(fā)明的肽包括上述肽的變體。變體可含有例如這樣的肽,其選自氨基酸序列中具有若干個(gè)氨基酸取代、缺失或添加的肽，例如1-9個(gè)、優(yōu)選1-5、1-4、1-3個(gè)、更優(yōu)選
1-2個(gè)氨基酸，進(jìn)一步優(yōu)選上述氨基酸序列之一中的一個(gè)氨基酸。肽的氨基酸的取代可在任何位置上和用任何類型的氨基酸進(jìn)行。優(yōu)選保守氨基酸取代。例如，Glu殘基可被Asp殘基取代，Phe殘基被Tyr殘基取代，Leu殘基被Ile殘基取代，Ala殘基被Ser殘基取代以及His殘基被Arg殘基取代。氨基酸的添加或缺失可優(yōu)選在肽中N端和C端進(jìn)行，但也可在內(nèi)部序列中進(jìn)行。本發(fā)明肽的優(yōu)選具體實(shí)例具有SEQ ID NO :3的序列。在這一方面，所有上述肽必須保持與MHC II類分子結(jié)合的能力，并具有誘導(dǎo)WTl特異性輔助性T細(xì)胞的能力。就此而論，本發(fā)明的肽結(jié)合的MHC II類分子可屬于HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP的任何亞類。優(yōu)選 MHC II 類分子是選自DRBr010U DRB1*0405、DRB 1*0802, DRB1*0803、DRBr0901、DRBri201、DRBri403、DRBri501、DRBri502、DPBr0201、DPBr0202、DPBr0402、DPB 1*050U DPB 1*090U DQB 1*030U DQB 1*0302, DQB 1*040U DQB 1*050U DQB 1*060U DQB 1*0602和 DRB5*0102o 更優(yōu)選 MHC II 類分子是 DRB1*0101、DRB1*0405、DRB1*1403、DRB1*1502、DPB 1*0201、DPB 1*0202、DPB 1*0901、DQB 1*0301、DQB 1*0601 或 DRB5*0102，最優(yōu)選 DRB1* 0101、DRB 1*0405, DRB1*1502、DPB1*020U DPB1*0202 或 DQB1*0601。在本說明書中，保持與 MHC II類分子結(jié)合的能力并具有誘導(dǎo)WTl特異性輔助性T細(xì)胞的能力的肽稱為WTl輔助肽。同樣，在下文描述的實(shí)施例中，具有SEQ ID NO :3所述氨基酸序列的肽稱為WTl35肽、WTl35輔助肽或WTl35肽。 同樣，本發(fā)明的肽可以是具有由來源于SEQ ID NO :1中所述的小鼠WTl蛋白的連續(xù)氨基酸組成的氨基酸序列的肽，且上述氨基酸序列可以是肽(SEQ ID NO :6)，其中在SEQID NO 4所述氨基酸序列9位上的氨基酸殘基被亮氨酸取代；或者肽(SEQ ID NO :7)，其中SEQ ID NO :5所述氨基酸序列11位上的氨基酸殘基被絲氨酸取代。而且，本發(fā)明的肽可含有這樣的肽，所述肽選自氨基酸序列中具有若干個(gè)氨基酸取代、缺失或添加的肽，例如1-9個(gè)、優(yōu)選1-5、1-4、1-3個(gè)、更優(yōu)選1-2個(gè)氨基酸，進(jìn)一步優(yōu)選SEQ ID NO :6或SEQ ID NO 7所述氨基酸序列中的一個(gè)氨基酸。在下文描述的實(shí)施例中，具有SEQ ID NO :6中所述氨基酸序列的肽亦稱mWTl86肽或mWTl86輔助肽，而具有SEQ ID NO : 7中所述氨基酸序列的肽亦稱mWTl294肽或mWTl294輔助肽。本發(fā)明的肽可來源于WTl蛋白，并可由上述連續(xù)氨基酸的序列組成或包含該序列。因此，本發(fā)明的肽可以是例如由上述氨基酸序列本身組成的肽或包含上述氨基酸序列的WTl蛋白或其部分。同樣，本發(fā)明的肽可以是通過修飾上述氨基酸序列而獲得的肽。上述氨基酸序列的氨基酸殘基可通過已知方法修飾。這類修飾可以是例如在構(gòu)成肽的氨基酸殘基側(cè)鏈的官能團(tuán)上的酯化、烷基化、鹵化、磷酸化、磺化、酰胺化等。同樣，可使不同的物質(zhì)與含有上述氨基酸序列的肽的N端和/或C端結(jié)合。例如可使氨基酸、肽、其類似物等與所述肽結(jié)合。如果這些物質(zhì)與本發(fā)明的肽的結(jié)合，則可通過例如體內(nèi)酶等或通過例如胞內(nèi)加工過程處理，使得最終產(chǎn)生由上述氨基酸序列構(gòu)成的肽，其作為與MHC II類分子的復(fù)合物展示在細(xì)胞表面上，由此能夠獲得對(duì)輔助性T細(xì)胞的誘導(dǎo)作用。這些物質(zhì)可以是調(diào)節(jié)本發(fā)明的肽的溶解度的物質(zhì)、提高肽的穩(wěn)定性(例如蛋白酶抗性)的物質(zhì)、使本發(fā)明的肽能夠特異遞送到例如指定組織或器官的物質(zhì)或者具有增強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞的攝取效率作用或其它作用的物質(zhì)。同樣，這些物質(zhì)可以是提高誘導(dǎo)CTL的能力的物質(zhì)，例如本發(fā)明的肽以外的輔助肽。本發(fā)明的肽的修飾可以是肽的N端氨基酸上氨基或C端氨基酸上羧基的修飾。N端氨基酸上氨基的修飾基團(tuán)包括例如1-3個(gè)具有1-6個(gè)碳原子的烷基、苯基、環(huán)烷基和?；ｕ；木唧w實(shí)例包括具有1-6個(gè)碳原子的烷酰基、具有1-6個(gè)碳原子的被苯基取代的烷?；⒈痪哂?-7個(gè)碳原子的環(huán)烷基取代的羰基、具有1-6個(gè)碳原子的烷基磺?；⒈交酋；?、具有2-6個(gè)碳原子的烷氧基羰基、被苯基取代的烷氧基羰基、被具有5-7個(gè)碳原子的環(huán)燒氧基取代的擬基、苯氧基擬基等。C端氣基酸上竣基具有修飾的妝包括例如酷化妝和酰胺化肽。酯的具體實(shí)例包括具有1-6個(gè)碳原子的烷基酯、具有0-6個(gè)碳原子的被苯基取代的烷基酯、具有5-7個(gè)碳原子的環(huán)烷基酯等，而酰胺的具體實(shí)例包括酰胺、被具有1-6個(gè)碳原子的一個(gè)或兩個(gè)烷基取代的酰胺，被一個(gè)或兩個(gè)具有0-6個(gè)碳原子的被苯基取代的烷基取代的酰胺、形成包括酰胺基的氮原子在內(nèi)的5-7元氮雜環(huán)烷烴的酰胺，等等。同樣，可通過使氨基酸殘基通過肽鍵以外的鍵(例如碳-碳鍵、碳-氮鍵和碳-硫鍵)彼此結(jié)合而進(jìn)行本發(fā)明的肽的修飾。而且，本發(fā)明的肽可含有一個(gè)或多個(gè)D-氨基酸。上文提及的本發(fā)明的肽、變體肽和修飾肽僅用于說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地采用、制備、評(píng)價(jià)和使用上述肽的其它變異體。可采用常規(guī)用于本領(lǐng)域的方法或其改進(jìn)方法合成本發(fā)明的肽。這類合成方法公開于例如 Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ；The Proteins,第 2 卷， Academic Press Inc. , New York,1976 ；Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. ,1975 ；Basis and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co. , Ltd. ,1985 !Developmentof Medicines (續(xù))，第 14卷,Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten Co. , 1991 等。同樣，可根據(jù)編碼本發(fā)明的肽的核苷酸序列的信息，應(yīng)用遺傳工程技術(shù)來制備本發(fā)明的肽。這類遺傳工程技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知?？砂凑障率鑫墨I(xiàn)[Molecular Cloning,T. Maniatis等，CSH Laboratory (1983) ；DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)]所述方法或下述方法和其它方法應(yīng)用這類技術(shù)?？赏ㄟ^已知方法，例如Cancer Immunol. Immunother. 51 :271 (2002)中描述的方法或本說明書實(shí)施例中描述的方法和其它方法，確定本發(fā)明的肽或其候選肽是否與上述MHC II類分子結(jié)合并誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞。由于本發(fā)明的肽激活輔助性T細(xì)胞(⑶4陽性T細(xì)胞)，因此該肽誘導(dǎo)和保持CTL的分化，并發(fā)揮激活效應(yīng)細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞)的作用。因此，可采用本發(fā)明的肽有效地治療或預(yù)防癌癥。另一方面，本發(fā)明涉及編碼上述WTl輔助肽的多核苷酸(下文亦稱WTl多核苷酸)。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA或RNA。本發(fā)明的多核苷酸的堿基序列可根據(jù)上述WTl輔助肽的氨基酸序列來確定?？赏ㄟ^例如DNA或RNA合成方法、PCR方法等制備多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸包括在嚴(yán)格條件下與編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸的互補(bǔ)序列雜交并編碼活性與本發(fā)明的肽的活性相當(dāng)?shù)碾牡亩嗪塑账帷Ｖ劣谛g(shù)語“在嚴(yán)格條件下雜交”，本文使用的雜交可按照例如以下文獻(xiàn)所述常規(guī)方法進(jìn)行=M0Iecular Cloning,第2版，Sambrook J. ,Frisch E. F. ,Maniatis T. ,Cold Spring Harbor Laboratory press 等。同樣，“嚴(yán)格條件”包括例如以下條件，其中在含有6 X SSC (10 X SSC是含有I. 5M NaCl和0. 15M檸檬酸三鈉的溶液)和50%甲酰胺的溶液中于45°C形成雜合體，然后用2XSSC于50°C洗漆(Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989),6. 3. 1-6. 3. 6)等。又一方面，本發(fā)明涉及包含上述多核苷酸的表達(dá)載體(下文亦稱WTl表達(dá)載體)?？筛鶕?jù)將表達(dá)載體導(dǎo)入其中的宿主的類型、導(dǎo)入目的等，適當(dāng)選擇表達(dá)載體的類型、除上述多核苷酸序列以外所包含的其它序列等。表達(dá)載體的實(shí)例包括質(zhì)粒、噬菌體載體、病毒載體等。在宿主是大腸桿菌(Escherichia coli)細(xì)胞的情況下,載體的實(shí)例包括質(zhì)粒載體,例如pUC118、pUC119、pBR322和pCR3 ;以及噬菌體載體，例如入ZAPII和Agtll0在宿主是酵母細(xì)胞的情況下，載體的實(shí)例包括PYES2、pYEUra3等。在宿主是昆蟲細(xì)胞的情況下，載體的實(shí)例為pAcSGHisNT-A等。在宿主是動(dòng)物細(xì)胞的情況下，載體的實(shí)例包括質(zhì)粒載體，例如pKCR、pCDM8、pGL2、pcDNA3. I、pRc/RSV和pRc/CMV ;病毒載體，例如反轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體和腺相關(guān)病毒載體。載體可任選含有以下因子例如表達(dá)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、編碼信號(hào)序列的基因、選擇用標(biāo)記基因和終止子。同樣，可將與硫氧還蛋白、His標(biāo)簽、GST (谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)等一起表達(dá)成融合蛋白的序列加入載體中以易于分離和純化。在這種情況下，可使用具有在宿主細(xì)胞中起作用的合適的啟動(dòng)子(lac、tac、trc、trp、CMV、SV40早期啟動(dòng)子等)的GST融合蛋白質(zhì)載體(pGEX4T等)、具有例如Myc和His等標(biāo)簽序列的載體(pcDNA3. I/Myc-His等)以及表達(dá)具有硫氧還蛋白和His標(biāo)簽等的融合蛋白的載體(pET32a)。當(dāng)將本發(fā)明的表達(dá)載體給予受試者以體內(nèi)產(chǎn)生WTl輔助肽時(shí)，由所述肽誘導(dǎo)的WTl特異性輔助性T細(xì)胞產(chǎn)生各種細(xì)胞因子(例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6或干擾素(IFN) 等)，并促進(jìn)B細(xì)胞和其它T細(xì)胞的增殖、分化和成熟。因此，可特別使用本發(fā)明的WTl表達(dá)載體破壞具有MHC I類分子并高表達(dá)WTl的腫瘤細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明涉及抗上述WTl輔助肽或編碼所述肽的多核苷酸的抗體(下文亦稱WTl抗體)。本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。已知制備這類抗體的方法，而且本發(fā)明的抗體也可按照以下這類常規(guī)方法制備(Current protocols in MolecularBiology, Ausubel 等(主編)，1987, John Wiley and Sons (出版)，第 11.12-11. 13節(jié)，Antibodies ；A Laboratory Manual, Lane, H. D.等(主編)，Cold Spring HarberLaboratory Press (出版)，New York, 1989)。本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，其包含上述WTl輔助肽、WTl多核苷酸或WTI表達(dá)載體。WTI基因在例如以下腫瘤和癌中高表達(dá)造血器官腫瘤，例如白血病、骨髓增生異常綜合征、多發(fā)性骨髓瘤和惡性淋巴瘤；以及實(shí)體癌，例如胃癌、腸癌、肺癌、乳腺癌、生殖細(xì)胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌和卵巢癌，因此，可使用本發(fā)明的藥物組合物治療或預(yù)防表達(dá)WTl基因的癌癥。當(dāng)將本發(fā)明的藥物組合物給予具有MHC II類分子的受試者時(shí)，由藥物組合物中包含的WTl輔助肽誘導(dǎo)的WTl特異性輔助性T細(xì)胞產(chǎn)生各種細(xì)胞因子(例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6或干擾素(IFN)等)，并促進(jìn)B細(xì)胞和其它T細(xì)胞亞群的增殖、分化和成熟。因此，可使用本發(fā)明的肽特異性破壞具有MHC I類分子和高表達(dá)WTl的腫瘤細(xì)胞。除上述WTl輔助肽、WTl多核苷酸或WTl表達(dá)載體作為有效組分以外，本發(fā)明的藥物組合物可包含例如載體、賦形劑等。本發(fā)明的藥物組合物中包含的WTl輔助肽誘導(dǎo)WTl特異性輔助性T細(xì)胞，因此本發(fā)明的藥物組合物可包含合適的佐劑，或者可與合適的佐劑一起給予以提高誘導(dǎo)效率。優(yōu)選的佐劑的實(shí)例包括但不限于弗氏完全或不完全佐劑、氫氧化鋁等。同樣，本發(fā)明的藥物組合物還可包含除上述WTl輔助肽以外的已知癌抗原肽，例如誘導(dǎo)WTl特異性CTL的WTl126肽,作為有效組分(Oka等，“Cancer immunotherapytargeting Wilms1 tumor gene WTl product (祀向維爾姆斯瘤基因WTl產(chǎn)物的癌癥免疫療法)”，Journal of Immunology, 164 :1873-1880, 2000 ;以及 Oka 等，“Human cytotoxicT-Iymphocyte responses specific for peptides of the wild-type Wilms ' tumorgene (WTl) product (對(duì)野生型維爾姆斯瘤基因(WTl)產(chǎn)物的肽有特異性的人細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞應(yīng)答)”，Immunogenetics, 51 :99-107, 2000)。此外，本發(fā)明的藥物組合物可與已知的癌抗原肽組合給予。例如可將已知的癌抗原肽(例如WTl126肽)在給予本發(fā)明的藥物組合物之前或之后給予。本發(fā)明的藥物組合物具有通過誘導(dǎo)WTl特異性輔助性T細(xì)胞激活B細(xì)胞或其它T細(xì)胞的特征，因此，可進(jìn)一步提高由給予已知的癌抗原肽所誘導(dǎo)的CTL的活性，并顯著提高治療效果。可根據(jù)疾病類型、受試者狀況和靶向部位等條件適當(dāng)選擇給予本發(fā)明的藥物組合物的方法。給予方法的實(shí)例包括但不限于皮內(nèi)給予、皮下給予、肌內(nèi)給予、靜脈內(nèi)給予、經(jīng)鼻給予、口服給予等。同樣，給予方法可以是淋巴細(xì)胞療法或DC(樹突細(xì)胞)療法?？筛鶕?jù)疾病類型、受試者狀況和靶向部位等條件適當(dāng)選擇本發(fā)明的藥物組合物所包含的肽的量、藥物組合物的形式和給藥頻率等?？偟膩碚f，每個(gè)劑量所給予的肽的量為0. OOOlmg-IOOOmg,優(yōu)選 0. OOlmg-lO, OOOmg0 另一方面，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括將有效量的上述藥物組合物給予具有上述MHC II類分子的受試者。待治療或預(yù)防的癌癥可以是任何癌癥，只要其表達(dá)WTl基因即可，包括例如造血器官腫瘤，例如白血病、骨髓增生異常綜合征、多發(fā)性骨髓瘤和惡性淋巴瘤；以及實(shí)體癌例如胃癌、腸癌、肺癌、乳腺癌、生殖細(xì)胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌和卵巢癌。另一方面，本發(fā)明涉及上述WTl輔助肽、WTl多核苷酸或WTl表達(dá)載體用于治療或預(yù)防癌癥中的用途。又一方面，本發(fā)明涉及WTl輔助肽在制備用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物中的用途。又一方面，本發(fā)明涉及WTl多核苷酸或WTl表達(dá)載體在制備含有上述WTl多核苷酸或WTl表達(dá)載體的藥物組合物中的用途。另一方面，本發(fā)明涉及包含上述WTl輔助肽、WTl多核苷酸或WTl表達(dá)載體的細(xì)胞?？赏ㄟ^例如使用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞等宿主細(xì)胞來制備本發(fā)明的細(xì)胞。用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可采用各種適當(dāng)選擇的方法進(jìn)行?？赏ㄟ^培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞、回收和純化所產(chǎn)生的WTl輔助肽，來制備本發(fā)明的肽。又一方面，本發(fā)明涉及抗原呈遞細(xì)胞(例如樹突細(xì)胞、B-淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)，其通過上述MHC II類分子展示上述WTl輔助肽。本發(fā)明的抗原呈遞細(xì)胞由上述WTl輔助肽誘導(dǎo)。使用本發(fā)明的抗原呈遞細(xì)胞有效地誘導(dǎo)WTl特異性輔助性T細(xì)胞。又一方面，本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)通過MHC II類分子展示W(wǎng)Tl輔助肽的抗原呈遞細(xì)胞的方法，所述方法包括在WTl輔助肽存在下培養(yǎng)不成熟的抗原呈遞細(xì)胞，并從不成熟的抗原呈遞細(xì)胞中誘導(dǎo)通過上述MHC II類分子展示W(wǎng)Tl輔助肽的抗原呈遞細(xì)胞。在本說明書中，不成熟的抗原呈遞細(xì)胞是指在成熟時(shí)變成樹突細(xì)胞、B-淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞的細(xì)胞。從中得到不成熟的抗原呈遞細(xì)胞的受試者可以是任何受試者，只要他們具有上述MHC II類分子即可。因?yàn)樵诶缤庵苎獑魏思?xì)胞等中含有不成熟的抗原呈遞細(xì)胞，因此可在上述WTl輔助肽存在下培養(yǎng)這類細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括將通過上述MHCII類分子展示W(wǎng)Tl輔助肽的抗原呈遞細(xì)胞給予具有與上述MHC II類分子相同的分子的受試者?？筛鶕?jù)疾病類型、受試者狀況和靶向部位等條件適當(dāng)選擇抗原呈遞細(xì)胞的給予方法。所述方法的實(shí)例包括但不限于靜脈內(nèi)給予、皮內(nèi)給予、皮下給予、肌內(nèi)給予、經(jīng)鼻給予、口服
給予等。又一方面，本發(fā)明涉及通過誘導(dǎo)通過上述MHC II類分子展示W(wǎng)Tl輔助肽的抗原呈遞細(xì)胞而預(yù)防或治療癌癥的方法，所述方法包括以下步驟(a)使樣品與編碼WTl蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)的核苷酸序列或具有其部分序列的核酸或上述WTl輔助肽反應(yīng)；(b)得到抗原呈遞細(xì)胞，所述抗原呈遞細(xì)胞通過上述MHC II類分子展示樣品中所包含的WTl輔助肽；和 (c)將抗原呈遞細(xì)胞給予具有與上述MHC II類分子相同的分子的受試者。上述方法中的樣品可以是任何樣品，只要其具有含有淋巴細(xì)胞或樹突細(xì)胞的可能性即可，包括例如得自受試者的樣品(例如血液)、細(xì)胞培養(yǎng)液等。上述方法中的反應(yīng)可采用常規(guī)技術(shù)進(jìn)行，優(yōu)選采用電穿孔?？乖蔬f細(xì)胞的獲得可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當(dāng)確定各個(gè)步驟中樣品細(xì)胞的培養(yǎng)條件?？乖蔬f細(xì)胞的給予方法可如上所述。再一方面，本發(fā)明涉及由上述WTl輔助肽誘導(dǎo)的WTl特異性輔助性T細(xì)胞。當(dāng)識(shí)別WTl輔助肽與MHC II類分子的復(fù)合物時(shí)，本發(fā)明的輔助性T細(xì)胞被誘導(dǎo)、增殖和激活?；罨腤Tl特異性輔助性T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6或干擾素(IFN)，并促進(jìn)B細(xì)胞和其它T細(xì)胞亞群的增殖、分化和成熟。因此，可使用本發(fā)明的輔助性T細(xì)胞特異性破壞具有MHC I類分子和高表達(dá)WTl的腫瘤細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)WTl特異性輔助性T細(xì)胞的方法，所述方法包括在WTl輔助肽存在下培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞，并從外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)WTl特異性輔助性T細(xì)胞。提供外周血單核細(xì)胞的受試者可以是任何受試者，只要他們具有上述MHC II類分子即可。通過在WTl輔助肽存在下培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞，從外周血單核細(xì)胞中的輔助性T細(xì)胞的前體細(xì)胞誘導(dǎo)WTl特異性輔助性T細(xì)胞。可通過將由本發(fā)明獲得的WTl特異性輔助性T細(xì)胞給予具有上述MHC II類分子的受試者，來治療或預(yù)防受試者的造血器官腫瘤和實(shí)體癌。就此而論，本說明書中的外周血單核細(xì)胞包括不成熟的抗原呈遞細(xì)胞，其是抗原呈遞細(xì)胞的前體細(xì)胞(例如樹突細(xì)胞、B-淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等的前體細(xì)胞)。因?yàn)槔缭谕庵苎獑魏思?xì)胞中含有不成熟的抗原呈遞細(xì)胞，因此可在上述WTl輔助肽存在下培養(yǎng)這類細(xì)胞。又一方面，本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)WTl特異性輔助性T細(xì)胞的試劑盒，其包括上述WTl輔助肽作為必需成分。優(yōu)選將試劑盒用于上述誘導(dǎo)WTl特異性輔助性T細(xì)胞的方法中。除上述WTl輔助肽以外，本發(fā)明的試劑盒可包括例如外周血單核細(xì)胞的獲取工具、佐劑、反應(yīng)容器等。一般而言，試劑盒中附有使用說明書?？墒褂帽景l(fā)明的試劑盒有效地誘導(dǎo)WTl特異性輔助性T細(xì)胞。又一方面，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括將WTl特異性輔助性T細(xì)胞給予具有上述MHC II類分子的受試者。WTl特異性輔助性T細(xì)胞的給予方法可根據(jù)疾病類型、受試者狀況和靶向部位等條件適當(dāng)選擇。給予方法的實(shí)例包括但不限于靜脈內(nèi)給予、皮內(nèi)給予、皮下給予、肌內(nèi)給予、經(jīng)鼻給予、口服給予等。此外，本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療癌癥的試劑盒，其包括上述WTl輔助肽、WTl多核苷酸或WTl表達(dá)載體作為必需成分。試劑盒是這樣的試劑盒，其特征在于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞，所述抗原呈遞細(xì)胞通過上述MHC II類分子展示上述WTl輔助肽。同樣，除上述必需成分以外，本發(fā)明的試劑盒可包括例如樣品的獲得工具、反應(yīng)容器等。一般而言，試劑盒附有使用說明書。可使用本發(fā)明的試劑盒有效獲得通過上述MHC II類分子展示W(wǎng)Tl輔助肽的抗原呈遞細(xì)胞，并通過給予所述細(xì)胞以治療或預(yù)防癌癥。另一方面，本發(fā)明涉及用于在具有上述MHC II類分子的受試者中測定WTl特異性輔助性T細(xì)胞的存在情況或量的方法，所述方法包括以下步驟(a)使上述WTl輔助肽與上述MHC II類分子的復(fù)合物與得自受試者的樣品反應(yīng)；然后(b)測定識(shí)別樣品中包含的復(fù)合物的輔助性T細(xì)胞的存在情況或量。
得自受試者的樣品可以是任何樣品，只要它們具有含有淋巴細(xì)胞的可能性即可，包括例如體液(例如血液和淋巴液)、組織等。WTl輔助性T細(xì)胞與MHC II類分子的復(fù)合物可以是例如采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(例如生物素-鏈霉抗生物素方法)形成的例如四聚體、五聚體等的形式。可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法測定識(shí)別這類復(fù)合物的輔助性T細(xì)胞的存在情況或量。在本發(fā)明的該方面中，可對(duì)上述復(fù)合物進(jìn)行標(biāo)記。至于標(biāo)記，可以使用已知標(biāo)記，例如熒光標(biāo)記和放射性標(biāo)記。通過標(biāo)記，可簡單快速地測定輔助性T細(xì)胞的存在情況或量。采用本發(fā)明這個(gè)方面的方法，使癌癥的診斷、預(yù)后等變得可行。因此，本發(fā)明還提供包含WTl輔助肽與上述MHC II類分子的復(fù)合物的組合物，其用于測定具有上述MHC II類分子的受試者中的WTl特異性輔助性T細(xì)胞的存在情況或量。同樣，本發(fā)明提供包含WTl輔助肽與上述MHC II類分子的復(fù)合物的試劑盒，其用于測定具有上述MHC II類分子的受試者中的WTl特異性輔助性T細(xì)胞的存在情況或量。又一方面，本發(fā)明涉及用于測定具有上述MHC II類分子的受試者中的WTl特異性輔助性T細(xì)胞的存在情況或量的方法，所述方法包括以下步驟(a)使上述WTl輔助肽與得自受試者的樣品反應(yīng)；然后(b)測定樣品中所包含的細(xì)胞因子的存在情況或量。得自受試者的樣品可以是任何樣品，只要它們具有含有淋巴細(xì)胞的可能性即可，包括例如外周血單核細(xì)胞、血液、體液、組織等，優(yōu)選外周血單核細(xì)胞。上述步驟(a)中的反應(yīng)可采用常規(guī)技術(shù)通過使得自受試者的上述樣品中的上述WTl輔助肽反應(yīng)來進(jìn)行。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可適當(dāng)?shù)卮_定各步驟中樣品細(xì)胞的培養(yǎng)條件。樣品中包含的細(xì)胞因子的存在情況或量可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法測定。細(xì)胞因子可以是能夠被輔助性T細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞因子，例如干擾素-Y和白介素-10。在本發(fā)明的該方面中，可對(duì)上述細(xì)胞因子進(jìn)行標(biāo)記。至于標(biāo)記，可以使用已知標(biāo)記，例如熒光標(biāo)記和放射性標(biāo)記。使用上述細(xì)胞因子的存在情況或量作為指標(biāo)，簡單快速地測定WTl特異性輔助性T細(xì)胞的存在情況或量變得是可行的。再一方面，本發(fā)明涉及使用WTl輔助肽與上述MHC II類分子的復(fù)合物獲得WTl特異性輔助性T細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟(a)使樣品與該復(fù)合物反應(yīng)；和(b)獲得包含在樣品中并識(shí)別復(fù)合物的輔助性T細(xì)胞。上文中描述了 WTl輔助肽與上述MHC II類分子的復(fù)合物。樣品可以是任何樣品，只要它們具有含有淋巴細(xì)胞的可能性即可，包括例如得自受試者的樣品(例如血液)、細(xì)胞培養(yǎng)液等。例如，識(shí)別復(fù)合物的輔助性T細(xì)胞的獲得可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行，例如FACS和MACS?？膳囵B(yǎng)所得到的WTl特異性輔助性T細(xì)胞，并將其用于治療或預(yù)防各種癌癥。因此，本發(fā)明還涉及WTl特異性輔助性T細(xì)胞，其可通過使用WTl輔助肽與上述MHC II類分子的復(fù)合物獲得WTl特異性輔助性T細(xì)胞的方法獲得。此外，本發(fā)明涉及用于獲得WTl特異性輔助性T細(xì)胞的試劑盒，其包括WTl輔助肽與上述MHC II類分子的復(fù)合物。又一方面，本發(fā)明涉及用于診斷癌癥的方法，所述方法包括使用上述WTl特異性輔助性T細(xì)胞、通過上述MHC II類分子展示W(wǎng)Tl輔助肽的上述抗原呈遞細(xì)胞或上述WTl抗體。優(yōu)選將WTl特異性輔助性T細(xì)胞用于本發(fā)明的診斷癌癥的方法中。例如可將上述輔助 性T細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞或抗體與得自具有上述MHC II類分子的受試者的樣品一起溫育，或者給予具有上述MHC II類分子的受試者，然后，例如，可測定輔助性T細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞或抗體的位置、部位、量等以診斷癌癥。可對(duì)上述輔助性T細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞或抗體進(jìn)行標(biāo)記。通過標(biāo)記，可有效地進(jìn)行本發(fā)明用于診斷癌癥的方法。又一方面，本發(fā)明涉及用于診斷癌癥的試劑盒，其包括上述WTl特異性輔助性T細(xì)胞、通過上述MHC II類分子展示W(wǎng)Tl輔助肽的抗原呈遞細(xì)胞或者抗WTl輔助肽的抗體或抗編碼所述肽的多核苷酸的抗體作為必需成分。下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體詳細(xì)的描述，但不應(yīng)將實(shí)施例理解為限制本發(fā)明。實(shí)施例I與MHC II類分子結(jié)合的候詵WTl肽的詵擇為了查找與MHC II類分子結(jié)合的肽序列，采用Rammensee等人所示的方法(Rammensee等，Immunogenetics 41 :178-228,1995)。具體而言，使用表中右端欄所述程序以及Rammensee等人的法則進(jìn)行選擇。通過該方法，將WTl35肽限制到表I和表2所示的肽序列，將WTl86肽限制到表3和表4所示肽序列，和將WTl294肽限制到表5和表6所示肽序列。表1-6中的左端欄表示作為候選肽序列的“適合性”。“〇”數(shù)越多，在Rammensee等人的法則中的適合性越高。無標(biāo)記表示適合性差。同樣，表1-6中“與MHC II類分子結(jié)合的候選肽序列”欄的括號(hào)中氨基酸組別表示可從括號(hào)中所列氨基酸中選擇一個(gè)氨基酸。例如描述[FLM]是指選自氨基酸組別F、L和M的一個(gè)氨基酸。同樣，描述[VYI (AL)]是指選自氨基酸組別V、Y和I的一個(gè)氨基酸，或者選自氨基酸組別A和L的一個(gè)氨基酸。“x”表示
其可以是任何氨基酸。右端欄表示用于列舉候選肽序列的程序的“程序名稱”。S [表 I]
與各種MHC II類分子結(jié)合的候選肽序列(WTl35肽)
適合性 MHCII類分子的類型與MHCII類分子結(jié)合的候選肽序3
ooo DPA1*0102/DPB1*0201[FLMVWY]xxx[FLMY]xx[IAMV]
DPAl *0103/DPB 1*0201[YLVFK]xx[DSQT]x[YFWV]xx[LV
o DPA1*0103/DPB1*0201[FLM]xxx[FL]xx[IA]
o DPAl *0201/DPB1 *0401[FLYM(IVA)]xxxxx[FLY (MVIA)]xx[VY o DPA1*0201/DPB1*0401[FLYMIVA]xxxxx[FLYMVIA]xx[VYI
DPAl *0201/DPB1*0901[RK]xxxx[AGL]xx[LV]
DPBl *0301x[R]xxxxxxx
DQA1:0101/DQB1*0501[L]xxx[YFW]
^ o DQA1:0102/DQB1*0602xxxxx[LIV(APST)]xx[AGST(LrVP)
o DQA1:0301/DQB1*0301xx[AGST]x[AVLI]
DQAl :0301/DQB1*0301[DEW]xx[AGST]x[ACLM]
DQA1:0301/DQB1*0302[RK]xxx[AG]xx[NED]
o DQA1:0301/DQB1*0302[TSW]xxxxxxx[RE]
ooo DQA1:0501/DQB1*0201[FWYILV]xx[DELVIH]x[PDE(H)] [ED]x[F\
ooo DQA1:0501/DQB1*0201[FWYILV]xx[DELVIH]x[PDEHPA][DE]x[F'
ooo DQA1:0501/DQB1*0301[FYIMLV]xxx[VLIMY]x[YFMLYI
o DQA1:0501/DQB1*0301[WYAVM]xx[A]x[AIVTS]xxx[QN
ooo DQBI *0602[AFCILMNQSTVWYDE]x[AFGILMNQSTW^
ILMNQSTWY]x[LIVAPST]xx[ASTGL
ooo DRB1*0101[YFWLIMVA]xx[LMAIVN]x[AGSTCP]xx[L^
]
ooo DRB1*0101[YVLFIAMW]xx[LAIVMNQ]x[AGSTCP]xx[
權(quán)利要求
1.ー種肽，其具有由來源于WTl蛋白的連續(xù)氨基酸組成的氨基酸序列，并通過與MHCII類分子結(jié)合誘導(dǎo)WTl特異性輔助性T細(xì)胞，其中所述氨基酸序列選自 (a)SEQ ID NO : 3所述氨基酸序列； (b)SEQID NO 4所述氨基酸序列； (C)SEQ ID NO 5所述氨基酸序列；和 (d)其中在(a)-(c)所述氨基酸序列中一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被取代、缺失或添加的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求I的肽，其中所述氨基酸序列是SEQID NO :3所述氨基酸序列。
3.權(quán)利要求I或2的肽，其中所述MHCII類分子選自DRBrOlOl、DRB 1*0405,DRBr0802、DRBr0803、DRBr0901、DRBri201、DRBri403、DRBri501、DRBri502、DPBr0201、DPB 1*0202、DPB 1*0402、DPB 1*0501、DPB 1*0901、DQB 1*0301、DQB 1*0302、DQB 1*0401、DQB 1*0501、DQB 1*060 U DQB 1*0602 和 DRB5*0102。
4.權(quán)利要求I或2的肽，其中所述MHCII類分子選自DRBfOlOl、DRB 1*0405,DRB1*1502, DPB 1*020U DPB 1*0202 和 DQB1*0601。
5.—種編碼權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的肽的多核苷酸。
6.—種包含權(quán)利要求5的多核苷酸的表達(dá)載體。
7.一種抗權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的肽或權(quán)利要求5的多核苷酸的抗體。
8.一種用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的肽、權(quán)利要求5的多核苷酸或權(quán)利要求6的載體。
9.一種用于治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括將有效量的權(quán)利要求1-4中任ー項(xiàng)的肽、權(quán)利要求5的多核苷酸或權(quán)利要求6的載體給予具有權(quán)利要求3或4的MHC II類分子的受試者。
10.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的肽、權(quán)利要求5的多核苷酸或權(quán)利要求6的載體用于治療或預(yù)防癌癥的用途。
11.通過權(quán)利要求3或4的MHCII類分子展示權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的肽的抗原呈遞細(xì)胞。
12.ー種用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的方法，所述方法包括在權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的肽存在下培養(yǎng)不成熟的抗原呈遞細(xì)胞，并從不成熟的抗原呈遞細(xì)胞中誘導(dǎo)通過權(quán)利要求3或4的MHC II類分子展示所述肽的抗原呈遞細(xì)胞。
13.由權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的肽誘導(dǎo)的WTl特異性輔助性T細(xì)胞。
14.ー種用于誘導(dǎo)WTl特異性輔助性T細(xì)胞的方法，所述方法包括在權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的肽存在下培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞，并從外周血單核細(xì)胞中誘導(dǎo)WTl特異性輔助性T細(xì)胞。
15.一種誘導(dǎo)WTl特異性輔助性T細(xì)胞的試劑盒，其包含權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的肽作為必需成分。
16.一種用于預(yù)防或治療癌癥的試劑盒，其包含權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的肽、權(quán)利要求5的多核苷酸或權(quán)利要求6的載體作為必需成分。
17.一種用于在具有權(quán)利要求3或4的MHC II類分子的受試者中測定WTl特異性輔助性T細(xì)胞的存在情況或量的方法，所述方法包括以下步驟( a)使權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的肽與得自受試者的樣品反應(yīng)；然后(b)測定樣品中所包含的細(xì)胞因子的存在情況或量。
全文摘要
本發(fā)明涉及WT1肽和包含WT1肽的藥物組合物等，所述WT1肽具有由來源于WT1蛋白的連續(xù)氨基酸組成的氨基酸序列，并通過與MHC II類分子結(jié)合而誘導(dǎo)WT1特異性輔助性T細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102803487SQ20108002899
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2010年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月23日
發(fā)明者杉山治夫 申請(qǐng)人:株式會(huì)社癌免疫研究所