專利名稱：一種抗鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌的多效價(jià)活疫苗、相關(guān)表達(dá)載體及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及多效價(jià)活疫苗技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種抗鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌的多效價(jià)活疫苗、相關(guān)表達(dá)載體及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中國(guó)是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)大國(guó)，但隨著高密度大規(guī)模養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展，病害問(wèn)題日益突出，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的威脅。據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，目前危害我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的疾病已達(dá) 400 500種，全國(guó)每年水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)病率達(dá)50%以上，損失率為20%左右。魚(yú)類(lèi)疾病達(dá)200 多種。其中，弧菌病和愛(ài)德華氏菌病是在水產(chǎn)養(yǎng)殖中經(jīng)常爆發(fā)的兩大類(lèi)疾病，致死率極高。弧菌病是最早發(fā)現(xiàn)的魚(yú)類(lèi)細(xì)菌性疾病之一。鰻弧菌(Vibrio anguillarum)是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見(jiàn)的一類(lèi)弧菌。它多在高鹽度的水體中流行，分布區(qū)域幾乎為世界性的，其發(fā)生沒(méi)有宿主的種屬選擇性差異，也無(wú)具體的季節(jié)和時(shí)間上的區(qū)分，其流行適宜溫度為25 320C，超過(guò)時(shí)流行極為迅速，幾日之內(nèi)即可造成養(yǎng)殖動(dòng)物的大量死亡，嚴(yán)重威脅經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)的養(yǎng)殖。遲鈍愛(ài)德華氏菌通常被分離于冷血?jiǎng)游锬c道及其他環(huán)境尤其是淡水中，在溫血?jiǎng)游锖腿酥幸部杀环蛛x到。遲鈍愛(ài)德華氏菌主要對(duì)鰻鱺、鲇魚(yú)和其他動(dòng)物致病，并且能感染人類(lèi)，引起疾病多表現(xiàn)為腹部膨脹，體表皮膚有不同程度的出血性潰爛。在世界不少國(guó)家和地區(qū)均有由該菌引起水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的病害發(fā)生及流行，并且造成得損失嚴(yán)重。長(zhǎng)期以來(lái)，人們使用藥物治療的方法來(lái)對(duì)抗水產(chǎn)病害。但是藥物在魚(yú)體內(nèi)的殘留， 產(chǎn)生耐藥性病原體；導(dǎo)致水體污染并破壞正常的生態(tài)環(huán)境等不良后果使人們意識(shí)到藥物治療的不足之處。而疫苗具有針對(duì)性強(qiáng)，抗病周期長(zhǎng)，可終身免疫，防治主動(dòng)等特點(diǎn)，因此成為了世界水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中研究和開(kāi)發(fā)的主要前沿和應(yīng)用領(lǐng)域。其中減毒活疫苗更以其給藥方便，免疫保護(hù)力高，成本低廉為人們所廣泛關(guān)注。微生物表面展示技術(shù)是利用基因重組方法把靶蛋白(外源肽段或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域)基因序列與特定的載體蛋白基因序列(又叫定位序列)融合后導(dǎo)人微生物宿主細(xì)胞，從而使靶蛋白表達(dá)并定位于微生物細(xì)胞表面。用這一技術(shù)設(shè)計(jì)疫苗可使表達(dá)的抗原充分展示在微生物的表面，其在免疫遞呈方面可能更為有效，為發(fā)展高效安全的活疫苗開(kāi)拓了更大的空間。利用這一技術(shù)在大腸桿菌等細(xì)菌的疫苗開(kāi)發(fā)中已得到了成功應(yīng)用(Stathopoulos C, et al. Characterization of Escherichia coli expressing anLpp-OmpA(46-159)-PhoA fusion protein localized in the outer membrane. App1. Microbiol. Biotechnol. 1996(45)，112-119)。在病原菌中展示外源抗原蛋白更可能起到多效價(jià)的作用。在水產(chǎn)養(yǎng)殖的環(huán)境中，魚(yú)類(lèi)易同時(shí)受到多種病原菌的侵害。因此，研究能同時(shí)抵抗多種病原菌的疫苗十分經(jīng)濟(jì)實(shí)用。目前，尚未見(jiàn)以鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌為主要防治對(duì)象的商品化多效價(jià)減毒活菌疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的就是針對(duì)以上存在的問(wèn)題與不足，提供一種抗鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌的多效價(jià)活疫苗、相關(guān)表達(dá)載體及應(yīng)用，該多效價(jià)活疫苗設(shè)計(jì)獨(dú)特巧妙，能同時(shí)抗鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌，與傳統(tǒng)疫苗比具有免疫保護(hù)效果更好的特點(diǎn)，使用簡(jiǎn)便，安全， 費(fèi)用低廉，為預(yù)防養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的疾病提供一種安全，有效，經(jīng)濟(jì)的方式，有實(shí)際的商業(yè)開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種重組表達(dá)載體，其特點(diǎn)是，包括表達(dá)載體和整合在所述表達(dá)載體上的外源核苷酸序列，所述外源核苷酸序列編碼丁香假單胞菌的冰核蛋白外膜定位元件和遲鈍愛(ài)德華氏菌的3-磷酸甘油脫氫酶的融合蛋白，其中所述冰核蛋白外膜定位元件用于介導(dǎo)所述3-磷酸甘油脫氫酶的外膜定位。所述遲鈍愛(ài)德華氏菌可以選擇任意的遲鈍愛(ài)德華氏菌。較佳地，所述遲鈍愛(ài)德華氏菌是遲鈍愛(ài)德華氏菌EIB202，保藏編號(hào)為CCTCC NO =M 208068。所述丁香假單胞菌可以選擇任意的丁香假單胞菌。較佳地，所述丁香假單胞菌是丁香假單胞菌丁香致病變種ICMP3023。所述表達(dá)載體可以選擇任何合適的表達(dá)載體。較佳地，所述表達(dá)載體為PUC18質(zhì)粒。所述冰核蛋白外膜定位元件可以是任何丁香假單胞菌的冰核蛋白外膜定位元件， 所述3-磷酸甘油脫氫酶可以是任何遲鈍愛(ài)德華氏菌的3-磷酸甘油脫氫酶。較佳地，所述冰核蛋白外膜定位元件的氨基酸序列如SEQ ID NO :9所示；所述3-磷酸甘油脫氫酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。因?yàn)槊艽a子的非唯一性，所述外源核苷酸序列中編碼所述冰核蛋白外膜定位元件的核苷酸序列可以是任意合適的序列。較佳地，所述外源核苷酸序列中編碼所述冰核蛋白外膜定位元件的核苷酸序列如SEQ ID NO :8所示；所述外源核苷酸序列中編碼所述3-磷酸甘油脫氫酶的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)其掌握的技術(shù)應(yīng)該知曉如何構(gòu)建上述重組表達(dá)載體，其中一種構(gòu)建方法可以是A)分別克隆編碼冰核蛋白外膜定位元件的核苷酸序列和編碼3-磷酸甘油脫氫酶的核苷酸序列；B)酶切編碼冰核蛋白外膜定位元件的核苷酸序列和表達(dá)載體；C)連接酶切的編碼冰核蛋白外膜定位元件的核苷酸序列和表達(dá)載體，構(gòu)成中間質(zhì)粒；D)酶切編碼3-磷酸甘油脫氫酶的核苷酸序列和中間質(zhì)粒；E)將酶切的編碼3-磷酸甘油脫氫酶的核苷酸序列和中間質(zhì)粒進(jìn)行連接。也就是說(shuō)，可以先將編碼冰核蛋白外膜定位元件的核苷酸序列構(gòu)建入表達(dá)載體， 再將編碼3-磷酸甘油脫氫酶的核苷酸序列構(gòu)建入表達(dá)載體。可理解，上述順序也可以倒過(guò)來(lái)，即先把編碼3-磷酸甘油脫氫酶的核苷酸序列構(gòu)建入表達(dá)載體，再將編碼冰核蛋白外膜定位元件的核苷酸序列構(gòu)建入表達(dá)載體。還可以先將編碼冰核蛋白外膜定位元件的核苷酸序列和編碼3-磷酸甘油脫氫酶的核苷酸序列連接，然后一起構(gòu)建入表達(dá)載體。這些過(guò)程本
4領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)其掌握的技術(shù)選擇合適的酶切位點(diǎn)即可完成。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種抗鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌的多效價(jià)活疫苗， 其特點(diǎn)是，由上述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化鰻弧菌減毒株獲得，其中所述表達(dá)載體是鰻弧菌表達(dá)載體。所謂“鰻弧菌表達(dá)載體”是指適于在鰻弧菌內(nèi)表達(dá)的載體。較佳地，所述鰻弧菌減毒株為鰻弧菌減毒株MVAV6203，保藏編號(hào)為CCTCC NO =M 204066。在本發(fā)明的第三方面，提供了上述的抗鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌的多效價(jià)活疫苗在預(yù)防鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌導(dǎo)致的魚(yú)類(lèi)疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明的抗鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌的多效價(jià)活疫苗通過(guò)構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化鰻弧菌減毒株獲得，其中重組表達(dá)載體表達(dá)的丁香假單胞菌的冰核蛋白外膜定位元件和遲鈍愛(ài)德華氏菌的3-磷酸甘油脫氫酶的融合蛋白通過(guò)冰核蛋白外膜定位元件將3-磷酸甘油脫氫酶展示在鰻弧菌減毒株細(xì)胞表面，設(shè)計(jì)獨(dú)特巧妙，能同時(shí)抗鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌，與傳統(tǒng)疫苗比具有免疫保護(hù)效果更好的特點(diǎn)，使用簡(jiǎn)便，安全，費(fèi)用低廉，為預(yù)防養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的疾病提供一種安全，有效，經(jīng)濟(jì)的方式，有實(shí)際的商業(yè)開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。本發(fā)明的抗鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌的多效價(jià)減毒活疫苗與傳統(tǒng)的疫苗相比具有如下優(yōu)點(diǎn)a.本發(fā)明開(kāi)發(fā)的抗鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌的多效價(jià)活疫苗具有能同時(shí)預(yù)防鰻弧菌病和遲鈍愛(ài)德華氏菌病的多效價(jià)功能。b.本發(fā)明的抗鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌的多效價(jià)活疫苗與傳統(tǒng)疫苗比具有免疫保護(hù)效果更好的特點(diǎn)；使用簡(jiǎn)便、安全，費(fèi)用低廉。c.本發(fā)明的抗鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌的多效價(jià)活疫苗采用了表面展示外源抗原的技術(shù)，更容易激發(fā)魚(yú)體的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生更好的免疫保護(hù)效果。所有這些技術(shù)安全特征都為本發(fā)明的抗鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌的多效價(jià)活疫苗的商業(yè)化進(jìn)程提供了現(xiàn)實(shí)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。


圖1是本發(fā)明構(gòu)建的pGapA40的質(zhì)粒圖譜。圖2是本發(fā)明構(gòu)建的pNgapA40的質(zhì)粒圖譜。圖3是本發(fā)明構(gòu)建的各疫苗候選株GAPDH總蛋白表達(dá)量的ELISA檢測(cè)結(jié)果柱狀圖。圖4是本發(fā)明構(gòu)建的疫苗株VA(pNG40)外膜展示GAPDH蛋白和胞內(nèi)表達(dá)GAPDH蛋白的ELISA檢測(cè)結(jié)果柱狀圖，其中OM表示外膜部分，CP表示胞內(nèi)部分，1-6為相應(yīng)的蛋白樣 圖5是本發(fā)明構(gòu)建的疫苗株VA(pNG40)外膜展示GAPDH蛋白和胞內(nèi)表達(dá)GAPDH蛋白的Wfestern blot檢測(cè)圖，其中M是蛋白分子量marker，其中OM表示外膜部分，CP表示胞內(nèi)部分。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建重組表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化進(jìn)鰻弧菌減毒株，從而表達(dá)編碼丁香假單胞菌的冰核蛋白外膜定位元件和遲鈍愛(ài)德華氏菌的3-磷酸甘油脫氫酶的融合蛋白， 并通過(guò)冰核蛋白外膜定位元件將3-磷酸甘油脫氫酶定位到鰻弧菌減毒株的細(xì)胞表面，從而形成抗鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌的多效價(jià)活疫苗。為更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面以所述丁香假單胞菌是丁香假單胞菌丁香致病變種(來(lái)源于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)為ICMP3023)的冰核蛋白外膜定位元件和遲鈍愛(ài)德華氏菌EIB202(來(lái)源于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCN0 =M 208068，保藏日期為2008年5月1日，具體參見(jiàn)中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)CN200910052707. 6)的 3-磷酸甘油脫氫酶為例，作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1重組表達(dá)載體的構(gòu)建1. 1引物設(shè)計(jì)根據(jù)SEQ ID NO :1 所示序列(gapA40)設(shè)計(jì)引物 gapA-Lo-F(SEQ ID NO :3 所示序列)，gapA-Lo-R(SEQ ID NO :4 所示序列)；gapA-N-F (SEQ ID NO :5 所示序列)， gapA-N-R(SEQ ID NO :4所示序列)；gapA_F(SEQ ID NO :6所示序列)，gapA_R(SEQ ID NO :7 所示序列)；根據(jù)SEQ ID NO 8所示序列設(shè)計(jì)N-F (SEQ ID NO :10所示序列)和N_R(SEQID NO 11所示序列)，上述引物的序列和其中的酶切位點(diǎn)如下所示 gapA-Lo-F CCGGAATTCATGACTATCAAAGTA (EcoRI 酶切位點(diǎn))gapA-Lo-R CCACTGCAGTTACTTAGAGATGTGTGCGA (PstI 酶切位點(diǎn))gapA-N-F CGCGGATCCATGACTATCAAAGTAGGTAT (BamHI 酶切位點(diǎn))gapA-N-R 同 gapA-Lo-RgapA-F TAGGAGAATTCGATGACTATCAAAGTAGG (EcoRI 酶切位點(diǎn))gapA-R CCACTGCAGTTACTTAGAGATGTGTGCGA (PstI 酶切位點(diǎn))N-F TAGGAGAATTCGGAGGATGCTGTAATGAATCTCG (EcoRI 酶切位點(diǎn))N-R CGCGGATCCAATCAGATCACTGTGGTTGCCAG (BamHI 酶切位點(diǎn))1.2常規(guī)PCR擴(kuò)增使用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以制備目的片段，其中具體使用的模板和引物對(duì)及制備的目標(biāo)片段如下所示以丁香假單胞菌丁香致病變種ICMP3023基因組為模板，以N-F和N-R為引物對(duì)， 擴(kuò)增冰核蛋白外膜定位元件的編碼序列InaVN(簡(jiǎn)稱N)。以遲鈍愛(ài)德華氏菌EIB202基因組為模板，以gapA-F和gapA_R為引物對(duì)，擴(kuò)增 3-磷酸甘油脫氫酶的編碼序列g(shù)apA401 (構(gòu)建PG40質(zhì)粒所用)。以遲鈍愛(ài)德華氏菌EIB202基因組為模板，以gapA_N_F和gapA-N-R為引物對(duì)，擴(kuò)增3-磷酸甘油脫氫酶的編碼序列g(shù)apA402 (構(gòu)建PNG40質(zhì)粒所用)。以遲鈍愛(ài)德華氏菌EIB202基因組為模板，以gapA40-Lo_F和gapA-Lo-R為引物對(duì)，擴(kuò)增3-磷酸甘油脫氫酶的編碼序列g(shù)apA403(構(gòu)建Plorf 1G40，PluG40, Pworf 1G40, PwuG40質(zhì)粒所用)。其中，菌株的基因組采用天根生化公司的細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行制備。 具體操作步驟參考產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。
將擴(kuò)增獲得的上述序列片段分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切下含有目的片段的凝膠后，采用天根生化公司(TIANGEN)的凝膠回收試劑盒回收DNA，具體操作步驟參考產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，其中，擴(kuò)增獲得的各序列片段的大小分別如下N為621bp，gapA40U gapA402、 gapA403大小均為996bp，均根據(jù)同一模板gapA40擴(kuò)增得到的序列，因?yàn)闃?gòu)建不同菌株時(shí)在兩端添加的酶切位點(diǎn)不同，所以分開(kāi)命名，其中g(shù)apA 401為EcoRI、I^stI酶切位點(diǎn)，gapA 402為BamHI.PstI酶切位點(diǎn)，gapA 403同樣為EcoRI、PstI酶切位點(diǎn)。1. 3常規(guī)質(zhì)粒酶切IfIigilK (Yang Ζ,Liu Q,ffang Q, Zhang Y. Novel bacterial surface display systems based on outer membrane anchoring elements from the marine bacterium Vibrio anguillarum. Appl Environ Microbiol.)構(gòu)建的 pUC18-lpp-omporfl-gfp 質(zhì)粒， pUC18-lpp-ompU-gfp 質(zhì)粒、pUC18-wza-omporf 1-gfp 質(zhì)粒、pUC18-wza-ompU-gfp 質(zhì)粒均米用雙酶EcoRI和I^stI酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可見(jiàn)酶切切除gfp部分的質(zhì)粒，將其分別純化回收。將PUC18質(zhì)粒用雙酶EcoRI和I^stI酶切，酶切后的質(zhì)粒回收純化，獲得酶切質(zhì)粒。1. 4重組質(zhì)粒構(gòu)建使用雙酶EcoRI和PstI酶切g(shù)apA401、gapA403片段，使用雙酶BamHI和PstI酶切g(shù)apA402片段。將酶切的gapA401片段與pUC18酶切質(zhì)粒用T4 DNA連接酶16°C連接過(guò)夜，得到重組質(zhì)粒PG40，即如圖1所示的pGapA40，其中ori-為復(fù)制起始區(qū)，Plac為Iac啟動(dòng)子，LacZ alpha-為半乳糖苷酶基因，Ampicillin-為氨芐青霉素抗性基因，EcoRI, BamHI, PstI為相應(yīng)的酶切位點(diǎn)。將gapA403片段分別與pUC18-lpp-omporfl-酶切質(zhì)粒、pUC18-lpp-ompU-酶切質(zhì)粒、pUC18-wza-omporfl-酶切質(zhì)粒、pUC18-wza-ompU-酶切質(zhì)粒用T4DNA連接酶16°C 連接過(guò)夜，分別得到重組質(zhì)粒Plorf 1G40，PluG40, Pworf 1G40, PwuG40。使用雙酶EcoRI和BamHI酶切N片段，將酶切片段回收純化。將酶切片段N與pUC18 酶切質(zhì)粒用jM DNA連接酶16°C連接過(guò)夜，得到中間質(zhì)粒。將中間質(zhì)粒使用雙酶BamHI和 PstI酶切后，回收酶切中間質(zhì)粒，將其與gapA402酶切片段用用T4 DNA連接酶16°C連接過(guò)夜，得到重組質(zhì)粒PNG40，即如圖2所示的pNGapA40。將上述重組質(zhì)粒分別用CaC12轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO，得到大腸桿菌重組菌株 ToplO(pG40)， ToplO(pNG40)， ToplO(Plorf1G40)， ToplO(PluG40)， ToplO(Pworf1G40)， ToplO (PwuG40)。實(shí)施例2鰻弧菌重組菌株構(gòu)建將鰻弧菌MVAV6203(來(lái)源于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO =M 204066，保藏日期為2004年9月7日，具體請(qǐng)參見(jiàn)中國(guó)專利ZL200410089496. 0，申請(qǐng)日為 2004年12月14日)接種于30ml高鹽LB培養(yǎng)液(為在LB培養(yǎng)基補(bǔ)加NaCl至終濃度為 2.5% )中，于30°C振搖培養(yǎng)過(guò)夜后，再以1 100 (ν/ν)轉(zhuǎn)接于IOOml新鮮高鹽LB培養(yǎng)液中，在30°C下以200rpm振蕩培養(yǎng)至0D600值為0. 4 0. 6時(shí)，離心收集菌體，將菌體在冰浴中放置20-30min后，用272mM的蔗糖緩沖液洗滌菌體3次，再用蔗糖緩沖液懸浮菌體，使菌體終濃度達(dá)到l*109cfu/ml以上，得到鰻弧菌MVAV6203的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。分別將重組菌株ToplO (pG40)、ToplO (pNG40)、ToplO (PlorflG40)、ToplO (PluG40)、ToplO (Pworf 1G40)、ToplO (PwuG40)進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，收集菌體，采用天根生化(TIANGEN)公司的細(xì)菌質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行制備，具體操作步驟參考產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，獲得相應(yīng)的重組質(zhì)粒 pG40、pNG40、PlorflG40、PluG40、Pworf 1G40, PwuG40。利用鰻弧菌MVAV6203的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞和重組質(zhì)粒pG40、pNG40、Plorf 1G40、 PluG40、PworflG40、PwuG40分別制備相應(yīng)的重組菌株，具體過(guò)程如下分別取100 μ 1感受態(tài)菌懸液于一個(gè)事先預(yù)冷的0. 2cm的電轉(zhuǎn)化杯(Bio-Rad， USA)中，分別加入重組質(zhì)粒DNA 10μ 1，混勻后在冰浴上放置lOmin，用電脈沖儀 (Bio-RadMicroPluser,USA)進(jìn)行電脈沖，其中，脈沖場(chǎng)強(qiáng)V = 2kV/cm，脈沖時(shí)間t = 3ms。電脈沖完畢后，菌懸液轉(zhuǎn)入1. 5ml的離心館，并加入Iml高鹽LB培養(yǎng)液，在30°C， 200rpm恢復(fù)培養(yǎng)池后，涂布于高鹽LB抗性平板(氨芐青霉素濃度200 μ g/ml), 30 °C 靜置培養(yǎng)20-24h,篩選陽(yáng)性克隆，得到重組菌株VA(pG40)、VA(pNG40)、VA(Plorf 1G40)、 VA (PluG40)、VA (PworflG40)及 VA (PwuG40)。實(shí)施例3多效價(jià)減毒活疫苗篩選分別將實(shí)施例2的步驟中獲得的重組菌株VA(pG40)、VA(pNG40)、VA (Plorf 1G40)、 VA(PluG40)、VA (Pworf 1G40)及 VA(PwuG40)接種于含 200 μ g/ml 氨芐青霉素的 LB 高鹽液體培養(yǎng)基中，200rpm，30°C培養(yǎng)過(guò)夜，次日按1 100 (ν/ν)接種于IOOml LB高鹽(Amp)培養(yǎng)基，30°C，200rpm培養(yǎng)20h，收獲培養(yǎng)液。將菌體沉淀經(jīng)PBS (PH = 7. 4)洗滌3次以后，用Iml PBS重懸，使用Nano Drop核酸定量?jī)x定至OD6tltl = 1，在冰浴中超聲5min至菌體完全破碎，將所得裂解液在4°C，8000g 離心2min，所得為全菌組分。將全菌組分進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。圖3顯示，在所有疫苗候選株中，VA (pNG40)的全菌GAPDH蛋白表達(dá)量為最大。由于全菌表達(dá)量是外膜展示蛋白表達(dá)量的前提，因此選取VA(pNG40)作為后續(xù)疫苗候選株。采用SLS法抽提VA(pNG40)的外膜組分，將所得外膜組分(OM)與胞內(nèi)組分(CP) 進(jìn)行ELISA檢測(cè)和Wfestern blot檢測(cè)，結(jié)果如圖4和圖5所示。候選株VA(pNG40)能成功將GAPDH蛋白展示到鰻弧菌表面，因此，具有多效價(jià)疫苗的應(yīng)用前景。實(shí)施例4多效價(jià)活疫苗對(duì)大菱鲆(Turbot)的免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)為確定候選株AV(pNG40)能否作為多效價(jià)減毒活疫苗應(yīng)用，發(fā)明人隨后又使用 VA(pNG40)對(duì)大菱鲆(Turbot)進(jìn)行了免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)，具體過(guò)程如下4. 1疫苗制備取AV (pNG40)接種于30ml高鹽LB液體培養(yǎng)基(Amp)中，于30°C，200rpm培養(yǎng)12h。 隨后將其按(ν/ν)接種于30ml高鹽LB液體培養(yǎng)基(Amp)中，30°C，200rpm培養(yǎng)20h。 離心收集菌體(4000g，lOmin，室溫)，以無(wú)菌人工海水(人工海水的配方為NaCl 28. 13g/ L, KCl 0. 77g/L, MgCl2 · 6H20, NaHC03 0. llg/L, MgS04 · 7H20 3. 50g/L，溶液配制好后，高壓滅菌，獲得無(wú)菌人工海水)洗滌3次，菌體用人工海水稀釋成l*106CFU/ml的菌懸液，每尾注射100 μ 1。4. 2免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用魚(yú)為體重7_14g，體長(zhǎng)8-lOcm的大菱鲆，實(shí)驗(yàn)前先置于水槽內(nèi)適應(yīng)養(yǎng)殖2 周，以剔除不正常個(gè)體。實(shí)驗(yàn)水槽每天使用海水水體替換2/3體積養(yǎng)殖水，水溫約為18°C。 將實(shí)驗(yàn)用魚(yú)免疫疫苗候選株VA(pNG40)。另設(shè)一平行對(duì)照組免疫PBS。免疫4周后，將免疫組分為 2 大組，分別用鰻弧菌野生株 MVM425 (Lingyun Zhou et al. , Secretory delivery of heterologous proteins in attenuated Vibrio anguillarum for potential use in vaccine design. Appl Microbiol Biotechnol Q008) 79 :1027-1034)和遲鈍愛(ài)德華氏菌野生株EI202進(jìn)行腹腔注射攻毒。感染試驗(yàn)分組與攻毒劑量如表1所示。
權(quán)利要求
1.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，包括表達(dá)載體和整合在所述表達(dá)載體上的外源核苷酸序列，所述外源核苷酸序列編碼丁香假單胞菌的冰核蛋白外膜定位元件和遲鈍愛(ài)德華氏菌的3-磷酸甘油脫氫酶的融合蛋白，其中所述冰核蛋白外膜定位元件介導(dǎo)用于所述 3-磷酸甘油脫氫酶的外膜定位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述遲鈍愛(ài)德華氏菌是遲鈍愛(ài)德華氏菌EIB202，保藏編號(hào)為CCTCC NO =M 208068。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述丁香假單胞菌是丁香假單胞菌丁香致病變種ICMP3023。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體為PUC18質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述冰核蛋白外膜定位元件的氨基酸序列如SEQ ID N0:9所示；所述3-磷酸甘油脫氫酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所7J\ ο
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述外源核苷酸序列中編碼所述冰核蛋白外膜定位元件的核苷酸序列如SEQ ID NO :8所示；所述外源核苷酸序列中編碼所述3-磷酸甘油脫氫酶的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
7.一種抗鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌的多效價(jià)活疫苗，其特征在于，由根據(jù)權(quán)利要求 1 6中任一項(xiàng)所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化鰻弧菌減毒株獲得，其中所述表達(dá)載體是鰻弧菌表達(dá)載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌的多效價(jià)活疫苗，其特征在于， 所述鰻弧菌減毒株為鰻弧菌減毒株MVAV6203，保藏編號(hào)為CCTCC NO =M 204066。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌的多效價(jià)活疫苗在預(yù)防鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌導(dǎo)致的魚(yú)類(lèi)疾病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌的多效價(jià)活疫苗，通過(guò)構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化鰻弧菌減毒株獲得，其中重組表達(dá)載體表達(dá)的丁香假單胞菌的冰核蛋白外膜定位元件和遲鈍愛(ài)德華氏菌的3-磷酸甘油脫氫酶的融合蛋白通過(guò)冰核蛋白外膜定位元件將3-磷酸甘油脫氫酶展示在鰻弧菌減毒株細(xì)胞表面，還提供了一種相關(guān)表達(dá)載體及應(yīng)用，本發(fā)明的抗鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌的多效價(jià)活疫苗設(shè)計(jì)獨(dú)特巧妙，能同時(shí)抗鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌，免疫保護(hù)效果好，使用簡(jiǎn)便，安全，費(fèi)用低廉，為預(yù)防養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的疾病提供一種安全，有效，經(jīng)濟(jì)的方式，有實(shí)際的商業(yè)開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P31/12GK102154348SQ20101060052
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月22日
發(fā)明者劉琴, 張?jiān)d, 王啟要, 鄭雁 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)