專利名稱：一組雞Cathelicidins抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一組雞Cathelicidins抗菌肽及其制備 方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，多種傳染性疾病困擾著我國(guó)的養(yǎng)殖業(yè)，抗生素自發(fā)現(xiàn)以來(lái)在預(yù)防細(xì)菌感 染、防治畜禽疾病方面發(fā)揮了重要作用，對(duì)促進(jìn)畜牧業(yè)生產(chǎn)的快速發(fā)展起到了巨大的推動(dòng) 作用，但長(zhǎng)期大量使用抗生素類藥物使得病原菌逐步產(chǎn)生耐藥性，為疾病防治工作增加了 難度。同時(shí)，抗生素引發(fā)的藥物殘留使得動(dòng)物性食品的安全性問(wèn)題日益突出，耐藥質(zhì)粒容易 交叉散播傳給人類，給人類健康和疾病的預(yù)防與治療帶來(lái)威脅，為此，國(guó)際社會(huì)提出減少抗 生素生長(zhǎng)促進(jìn)劑(AGP)使用量或取消某些抗生素的使用。從2006年1月開始，歐盟全面 禁止食品動(dòng)物使用抗生素類促生長(zhǎng)飼料添加劑，并于3月成立預(yù)防抗生素抗藥性擴(kuò)大研究 網(wǎng)，隨后日本和韓國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家也建立了相應(yīng)的條例，國(guó)際奧委會(huì)也要求北京為2008年奧 運(yùn)會(huì)提供符合歐盟要求的抗生素含量極低的安全肉食品。尋求抗生素替代品，研制既能有 效防控畜禽疾病、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，又無(wú)毒副作用、無(wú)殘留、不易產(chǎn)生耐藥性的綠色獸藥和飼 料添加劑，已成為動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)、食品加工、新獸藥研發(fā)等領(lǐng)域內(nèi)面臨的重大課題。抗菌肽(antimicrobial peptide)是在誘導(dǎo)條件下，動(dòng)物免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生的一 類對(duì)抗外源性病原體致病作用的防御性肽類活性物質(zhì)，是宿主免疫防御系統(tǒng)的一個(gè)重要組 成部分?？咕木哂懈咝АV譜的抗菌活性，對(duì)革蘭氏陰性菌(G_)、革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)、真 菌、原生生物、有被膜的病毒和腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)出較強(qiáng)的活性(Jenssen H，et al. Peptide AntimicrobialAgents. Clin Microbiol Rev, 2006,19(3) :491-511)。而絕大多數(shù)抗菌肽對(duì) 哺乳動(dòng)物正常細(xì)胞無(wú)害，具有不同于傳統(tǒng)抗生素的獨(dú)特抗菌機(jī)制，而且對(duì)機(jī)體無(wú)毒副作用、 無(wú)殘留，這將為解決細(xì)菌對(duì)青霉素等傳統(tǒng)抗生素日益增強(qiáng)的耐藥性這一棘手的全球性難題 提供新途徑，應(yīng)用前景十分廣闊。迄今已從包括動(dòng)物、植物、昆蟲、原核生物等多種生物體內(nèi) 分離、鑒定了千余種抗菌活性肽，有幾十種抗菌肽已進(jìn)入臨床試驗(yàn)或臨床前研究階段。目前在家禽體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)了三大類抗菌肽，即防御素類(Gallinacin)、 Cathelicidin類和肝內(nèi)表達(dá)抗菌肽2 (LEAP-2)。從目前相關(guān)研究結(jié)果來(lái)看，雞β-防御素在體外對(duì)多殺性巴氏桿菌及大腸 桿菌、白色念珠菌、腸炎沙門氏菌、空腸彎曲桿菌等均有抑菌作用(Harwig S S，et al. Gallinacins :cysteine-richantimicrobial peptides of chicken leukocytes. FEBS Lett,1994,342(3) :281-285 ；Evans E W,et al.Antimicrobial activity of chicken and turkey heterophil ρ印tides CHP1,CHP2,THPl,and THP3. Vet Microbiol,1995,47(3-4) 295-303)。Cathelicidins類抗菌肽是最初被發(fā)現(xiàn)于哺乳動(dòng)物的一類結(jié)構(gòu)多變的抗菌肽，因 其在信號(hào)肽與成熟肽之間含有一高度保守的Cathelin肽段而自成一家族。Cathelicidins 在體外具有強(qiáng)的廣譜抗革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌活性，包括抗生素抗性菌，有的在
450%血清和生理鹽濃度下仍有殺菌活性。同防御素一樣，Cathelicidins抗菌肽也是宿主 防御系統(tǒng)的重要組成部分，但它們通常更耐鹽和溶媒。除了主要的殺滅細(xì)菌、真菌和病毒 活性外，Cathelicidins還具有對(duì)免疫細(xì)胞的趨化作用、抑制組織損傷、促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)、結(jié) 合內(nèi)毒素、誘導(dǎo)血管生成等多種生物學(xué)功能(Zaiou M, et al. Cathelicidins, essential gene-encoded mammalian antibiotics. J Mol Med,2002,80(9) :549-61 ;Ramanathan B, et al. Cathelicidins !microbicidal activity, mechanisms ofaction, and roles in innate immunity. Microbes Infect,2002,4(3) :361-372 ；Carretero Μ, et al, Invitro and in vivo wound healing-promoting activities of human cathelicidin LL-37. J InvestDermatol, 2008,128 (1) :223-236.)。由于具有如此廣泛的生物學(xué)活性和功能， Cathelicidinds抗菌肽已成為免疫學(xué)、分子生物學(xué)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點(diǎn)，其藥用 開發(fā)前景十分廣闊。然而，家禽體內(nèi)天然抗菌肽的含量極低，分子量小，分離純化困難，無(wú)法滿足需要。 化學(xué)合成與基因工程方法就成為獲得抗菌肽的主要手段，但化學(xué)合成抗菌肽成本太高，也 難以應(yīng)用于臨床；因此，通過(guò)基因工程的方法在特定宿主內(nèi)大量表達(dá)抗菌肽就成為一條有 效的途徑。但由于抗菌肽本身對(duì)原核宿主菌有一定的殺傷作用，不適宜在原核系統(tǒng)中直接 表達(dá)，通常采用融合表達(dá)或真核表達(dá)等方式。大腸桿菌因其遺傳背景清晰、易于培養(yǎng)、周期 短、成本低廉而備受青睞，成為目前應(yīng)用最為廣泛的外源基因表達(dá)宿主之一，多種抗菌多肽 通過(guò)融合形式在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)，產(chǎn)物經(jīng)處理后可產(chǎn)生抗菌活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一組具有很強(qiáng)抗微生物活性的雞抗菌肽Cathelicidinl， 2，3，本發(fā)明利用基因工程技術(shù)從白來(lái)航雞的骨髓組織中克隆出Cathelicidins抗菌肽基 因(CathL-l，-2，-3)cDNA片段，并將其成熟肽編碼序列克隆至pET-30a(+)等融合表達(dá)載體 中，在E. coliRosetta(DE3)表達(dá)菌株中重組表達(dá)融合蛋白并對(duì)其進(jìn)行初步鑒定，表達(dá)產(chǎn)物 以可溶形式存在，不需蛋白酶切割，經(jīng)親和層析方法即可制備一組具有很強(qiáng)抗微生物活性 的雞重組抗菌肽Cathelicidinl，2，3。本發(fā)明還公開了該組雞Cathe 1 icidins抗菌肽的氨基酸序列及編碼所述雞 Cathelicidins抗菌肽的DNA序列。本發(fā)明同時(shí)提供了該組雞Cathelicidins抗菌肽的基因工程制備方法和固相化 學(xué)合成法。本發(fā)明還進(jìn)一步公開了該組雞Cathelicidins重組抗菌肽在制備治療雞細(xì)菌感 染藥物中的用途。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案本發(fā)明提供的一組 Cathelicidins抗菌肽，是白來(lái)航雞基因編碼的抗菌肽，屬于家禽Cathelicidins抗菌肽家 族，它們的這一系列序列被命名為Cathelicidin 1，2，3，其前體蛋白的氨基酸序列(從氨 基端至羧基端)如下Cathelicidinl (SEQ ID NO. 5)Met Leu Ser Cys Trp Val Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Gly Ala Cys Ala Leu Pro Ala Pro Leu GlyTyr Ser Gln Ala Leu Ala Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asn Gln Arg Pro Glu Val Gln Asn Ala Phe ArgLeu Leu Ser Ala Asp Pro Glu Pro Gly Pro Asn ValGln Leu Ser Ser Leu His Asn Leu Asn Phe ThrIle Met Glu Thr Arg Cys Gln Ala Arg Ser Gly Ala Gln Leu Asp Ser Cys Glu Phe Lys Glu Asp GlyLeu Val Lys Asp Cys Ala Ala Pro Val Val Leu Gln Gly Gly Arg Ala Val Leu Asp Val Thr Cys ValAsp Ser Met Ala Asp Pro Val Arg Val Lys Arg Val Trp Pro Leu Val lie Arg Thr Val lie Ala Gly TyrAsn Leu Tyr Arg Ala lie Lys Lys LysCathelicidin 2(SEQ ID NO. 10)
MetLeuSer Cys Trp Val Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly GlyValCysAlaLeuPro AlaProLeuSerTyr Pro Gln Ala Leu lie Gln Ala Val Asp SerTyrAsnGlnArgPro GluValGlnAsn Ala Phe ArgLeu Leu Ser Ala Asp Pro Glu ProGlyProGlyValAsp LeuSerThrLeu Arg Ala Leu Asn Phe ThrIle Met Glu Thr GluCysThrProSerAla ArgLeuProVal Asp Asp Cys Asp Phe Lys Glu Asn GlyVal lieArgAspCysSerGly ProValSerVal Leu Gln Asp Thr Pro Glu lie Asn Leu Arg Cys Arg AspAlaSerSer AspProValLeu Val Gln Arg Gly Arg Phe Gly Arg Phe Leu ArgLyslieArgArg
PheArg Pro Lys Val Thr lie Thr lie Gln Gly SerAlaArg Phe Gly Cathelicidin 3(SEQ ID NO. 15)MetLeuSer Cys Trp Val Leu Leu Leu Ala Leu Leu GlyGlyAlaCysAlaLeuPro AlaProLeuGlyTyr Ser Gln Ala Leu Ala Gln Ala Val AspSerTyrAsnGlnArgPro GluValGlnAsn Ala Phe ArgLeu Leu Ser Ala Asp Pro GluProGlyProAsnValGln LeuSerSerLeu His Asn Leu Asn Phe ThrIle Met Glu ThrArgCysGlnAlaArgSer GlyAlaGlnLeu Asp Ser Cys Glu Phe Lys Glu Asp GlyLeuValLysAspCysAlaAla ProValValLeu Gln Gly Gly Arg Ala Val Leu Asp Val Thr Cys ValAspSerMetAla AspProValArg Val Lys Arg Phe Trp Pro Leu Val ProValAlalieAsnThr
ValAla Ala Gly lie Asn Leu Tyr Lys Ala lie Arg Arg Lys雞抗菌肽CathelicidinU Cathelicidin2 和 Cathelicidin3，其核苷酸序列分別 如 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 6 和 SEQ ID NO. 11 所述。本發(fā)明的一組雞Cathelicidins抗菌肽，其編碼基因cathelicidin 1，2，3，來(lái)自 于自成年白來(lái)航雞骨髓組織中提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后，再以cDNA為模 板，分別用3對(duì)基因特異性引物CathLl P1/P2、CathL2 P1/P2和CathL3 P1/P2進(jìn)行PCR, 擴(kuò)增產(chǎn)物即為CatheliCidinl，2，3CDNA全序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離并回 收目的片段(見(jiàn)圖1)，將目的片段與克隆載體PMD18-T連接并轉(zhuǎn)化E.coli DH5 α感受態(tài)細(xì) 胞，陽(yáng)性菌株用Μ13 F/R引物測(cè)序，得到含cathelicidinl，2，3開放閱讀框(ORF)的完整核 苷酸序列，其ORF序列全長(zhǎng)分別為447bp、46^p、456bp，其自5，端至3，端的序列詳見(jiàn)序列 表(SEQ ID N0. 1、SEQ ID NO. 6 和 SEQ ID NO. 11)。本發(fā)明提供的一組雞Cathelicidins抗菌肽，其制備方法可以是固相化學(xué)合成 法，也可以將抗菌肽的編碼基因克隆到表達(dá)載體上，然后導(dǎo)入特定的宿主細(xì)胞中表達(dá)后獲 得。其中表達(dá)載體可以是質(zhì)粒或病毒中的一種，宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，包括大腸桿菌、 枯草芽孢桿菌等，宿主細(xì)胞也可以是真核細(xì)胞、包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞 等。制備的抗菌肽可通過(guò)質(zhì)譜法鑒定。本發(fā)明提供一種雞抗菌肽CatheliCidinl，2，3高效的基因工程制備方法，主要通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)將雞抗菌肽Cathelicidinl、雞抗菌肽Cathelicidin2和雞抗菌肽 Cathelicidin3成熟肽的編碼基因分別克隆到大腸桿菌融合表達(dá)載體pET30a(+)中，得到 融合表達(dá)載體 pET30-CathLlS、pET30_CathL2S、pET30_CathL3S ；(2)將 pET30-CathLlS、pET30_CathL2S、pET30_CathL3S 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Rosetta (DE3)菌株，得到重組大腸桿菌基因工程菌株；(3) 37°C下，在LB培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)物IPTG濃度為1. Ommol/L的條件下，對(duì)上述重組 大腸桿菌基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)；(4)離心收集上述表達(dá)菌體，超聲波破碎，分離細(xì)胞可溶組分與包涵體；(5) Ni2+-NTA Sepharose 4B親和層析柱純化融合蛋白。其具體步驟為(1)采用RT-PCR方法從白來(lái)航雞骨髓組織中擴(kuò)增編碼雞抗菌肽Cathelicidinl， 2，3前體蛋白的核苷酸序列(cDNA序列)，將所述基因分別克隆至PMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌DH5 α菌株，并進(jìn)行序列測(cè)定；(2)PCR方法擴(kuò)增編碼雞抗菌肽Cathelicidinl，2，3成熟肽的核苷酸序列，PCR產(chǎn) 物經(jīng)EcoR I和Bio I雙酶切后與同樣酶切的pET-30a(+)(或pET_32a(+))融合表達(dá)載體 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，小量提取質(zhì)粒，應(yīng)用PCR和質(zhì)粒酶切的方法篩選陽(yáng) 性克隆，通過(guò)DNA測(cè)序驗(yàn)證插入片段閱讀框的正確性，從而構(gòu)建出原核表達(dá)載體。將構(gòu)建的 融合表達(dá)載體分別命名為 pET30-CathLlS、pET30-CathL2S、pET30-CathL3S ；(3)將測(cè)序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒 pET30-CathLlS、pET30_CathL2S、pET30_CathL3S 分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DEiB)菌株，挑取陽(yáng)性菌株接種至LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)8 12h。次日離心取菌體重懸至新鮮LB培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)液OD6tltlnm值達(dá)到0. 5 0. 6時(shí)加 入IPTG使其終濃度為1. Ommol/L,開始進(jìn)行誘導(dǎo)；37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h，每隔1小時(shí)取樣lmL。 離心收集誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌體，用PBS緩沖液洗滌菌體2次，再加入裂解緩沖液(50mmol/L Tris-HCl,pH 8. 0,50mmol/L NaCl, lmmol/L EDTA，5%甘油，臨用前加入蛋白酶抑制劑 PMSF 至終濃度為lmmol/L)，冰浴中超聲破碎菌體，每次破碎k，間隔2s，功率600W，破碎lOmin。 超聲后12000r/min，4°C下離心lOmin，分離可溶組分與和包涵體，進(jìn)行SDS-PAGE電泳和 Western Blot檢測(cè)。濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為15%。將pET_30a(+)質(zhì)粒按同樣 方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)表達(dá)，取池誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物(上清)作為對(duì)照。Western Blot操作參 照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中的方法進(jìn)行。電泳后將SDS-PAGE凝膠中的條帶電轉(zhuǎn)移至硝酸 纖維素膜上，以鼠抗His單克隆抗體為一抗，羊抗鼠IgG-HRP為二抗，DAB為顯色底物進(jìn)行 Western-blot分析，鑒定表達(dá)產(chǎn)物。(4)融合蛋白表達(dá)條件優(yōu)化與表達(dá)產(chǎn)物的親和層析純化通過(guò)采用高滲培養(yǎng)基(即LB/SB培養(yǎng)基)、低溫(25°C或15 20°C)長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)、 調(diào)節(jié)誘導(dǎo)物IPTG的濃度等方法，抑制包涵體形成，提高表達(dá)產(chǎn)物中可溶性蛋白所占比例。 試驗(yàn)證明，在25°C、IPTG濃度為1. Ommol/L的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)8小時(shí)，可溶性目的蛋白所占 的比例較37°C條件下明顯提高，利于下游純化操作。按上述優(yōu)化后的條件進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，取誘導(dǎo)后的菌體，加 入適量結(jié)合緩沖液，冰浴中超聲波破碎菌體，分離包涵體和可溶組分，將裂解上清液上樣于固定化金屬配體親和柱層析柱(Ni2+-NTA Sepharose 4B柱)，樣品經(jīng)含0. 1 0. 5mol/L咪 唑的緩沖液梯度洗脫，收集融合蛋白洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。結(jié)果顯示，洗脫液中目的 蛋白在目標(biāo)位置呈現(xiàn)單一條帶，表明經(jīng)親和層析可獲得純度較高的融合蛋白，為成熟產(chǎn)物 的獲得創(chuàng)造條件。(5)采用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂孔穴擴(kuò)散法(AWDA)檢測(cè)重組雞抗菌肽Cathelicidin 1，2，3的 對(duì)指示菌株的體外抑菌活性。本發(fā)明的一組新的雞抗菌肽Cathelicidinl，2，3，還可方便地采用固相化學(xué)合成 方法進(jìn)行制備。從雞Cathelicidinl抗菌肽核苷酸序列推導(dǎo)出其前體蛋白的氨基酸序列 (Seq-I)，根據(jù)目前對(duì)雞Cathelicidins類抗菌肽成熟肽酶切加工位點(diǎn)(彈性蛋白酶切割 位點(diǎn))的認(rèn)識(shí)，即雞體內(nèi)彈性蛋白酶一般是從該基因第四個(gè)外顯子編碼氨基酸序列中的第 一個(gè)纈氨酸(Val)位點(diǎn)進(jìn)行切割加工，釋放出有生物學(xué)活性的成熟肽的N-端；結(jié)合對(duì)信 號(hào)肽與成熟肽間高度保守的Cathelin結(jié)構(gòu)域肽段的分析，可以推斷在其前體蛋白中，Arg 123-Lys 148為雞Cathelicidinl抗菌肽的成熟肽序列6eq_4)。根據(jù)編碼雞Cathelicidinl抗菌肽的核酸序列推導(dǎo)出成熟抗菌肽的氨基酸序列， 按照標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成程序用全自動(dòng)多肽合成儀合成其成熟肽序列(其N端至C端的氨基酸 序列為ArgVal Lys Arg Val Trp Pro Leu Val lie Arg Thr Val lie Ala Gly Tyr Asn Leu Tyr Arg Ala lie Lys LysLys，見(jiàn)序列表中。合成肽經(jīng)反相-高壓液相柱層析 (RP-HPLC,Column =X Bridget 6X250mm)脫鹽、純化，采用乙腈/水/三氟乙酸系統(tǒng)洗脫，合 成肽的樣品純度> 95% (95. 4% )。采用電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)測(cè)定其分子量為3142. 80， 與理論分子量(3141. 86)基本一致。本發(fā)明通過(guò)抑菌活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，利用Rosetta(DE;3)/pET30a表達(dá)體系表達(dá)的重 組Cathelicidins抗菌肽不需酶切等處理，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性、陰性菌均有很好的抑菌活性，對(duì) 金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌、藤黃微球菌、大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌C79-13、巴氏桿菌、鴨 疫里默氏桿菌、綠膿桿菌等標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離菌株均有較強(qiáng)的抑制作用。與常規(guī)藥敏 試驗(yàn)結(jié)果比對(duì)發(fā)現(xiàn)，藤黃微球菌、大腸桿菌等標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)試驗(yàn)中所使用的大多數(shù)抗生素類 藥物均耐藥，而重組Cathelicidins抗菌肽對(duì)這些菌株卻有明顯的抑制效果。表明重組 Cathelicidins抗菌肽對(duì)某些細(xì)菌菌株的抑制作用在一定程度上可能超過(guò)傳統(tǒng)抗生素。本發(fā)明通過(guò)抗菌肽Cathelicidinl對(duì)金黃色葡萄球菌急性感染抑菌活性的雛雞 試驗(yàn)顯示，抗菌肽給予5. Omg/kg劑量，就能達(dá)到100%殺菌抑制率，而作為抑殺金黃色葡萄 球菌的氨芐青霉素給予5. Omg/kg劑量未能達(dá)到明顯的殺菌抑制率，表明本發(fā)明抗菌肽對(duì) 金黃色葡萄球菌急性感染有很顯著的殺菌效果，因此本發(fā)明抗菌肽可應(yīng)用于制備治療革蘭 氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌或真菌感染引起的疾病的藥物，尤其是應(yīng)用于制備治療金黃色葡 萄球菌、芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌等的藥物。本發(fā)明抗菌肽同時(shí)還可以用于制備動(dòng)物 飼料添加劑和防腐劑。本發(fā)明的有益效果在于(1)本發(fā)明選擇大腸桿菌/融合表達(dá)載體作為外源基因的原核表達(dá)體系，選擇 pET30a等融合表達(dá)載體，使雞Cathelicidins抗菌肽獲得高效表達(dá)，并避免表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿 主細(xì)胞造成直接的殺傷性。(2)本發(fā)明提供的方法表達(dá)效率高，表達(dá)產(chǎn)物分離純化簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，易放大，穩(wěn)定性好，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，具有廣闊的應(yīng)用推廣前景。(3)本發(fā)明應(yīng)用基因工程技術(shù)在原核宿主細(xì)胞中高效表達(dá)雞Cathelicidins抗菌 肽，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該組抗菌肽對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌均有明顯的抑制作用。該組抗菌肽 可應(yīng)用于制備抗菌藥物，或用于制備動(dòng)物飼料添加劑和防腐劑。(4)與其它來(lái)源的堿性抗菌肽相比，該組抗菌肽還具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、人工合成方便、 抗菌譜系廣等有益特點(diǎn)。


圖1為PCR擴(kuò)增白來(lái)航雞Cathelicidinl，2，3抗菌肽基因產(chǎn)物的2 %瓊 脂糖凝膠電泳圖。在圖1中，1為DL15000 DNA marker，其中各核酸片段的堿基數(shù) 目(數(shù)目單位為 bp)分別為 15000，10000，7500，5000，2500，1000，250 ;2，3，4 分別為 Cathelicidin-I, -2，_3cDNA 序列的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；圖中 5 為 DL2000 DNA Marker，其中各 核酸片段的堿基數(shù)目(數(shù)目單位為bp)分別為2000，1000，750，500，250，100。圖2為含雞Cathelicidin-l，-2，-3基因cDNA序列的陽(yáng)性質(zhì)粒pMD-CathL酶切后 2%瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2中1為λ-EcoTH I digest DNA marker，其中各核酸片段的 堿基數(shù)目(數(shù)目單位為 bp)分別為 19329, 7743,6223,4254, 3472, 2690,1882,1489,925 ；2 為質(zhì)粒 pMD-CathLl/EcoR I+Hind III 雙酶切后條帶，3 為質(zhì)粒 pMD-CathLl/EcoR I+Not I 雙酶切后條帶，4為質(zhì)粒pMD-CathL2/EcoR Ι+HindIII雙酶切后條帶，5為質(zhì)粒pMD_CathL2/ EcoR I+Smal雙酶切后條帶，6為質(zhì)粒pMD-CathL3/EcoR Ι+HindIII雙酶切后條帶，7為質(zhì) 粒pMD-CathL3/EcoR I+Not I雙酶切后條帶，8為DL2000 DNA marker，其中各核酸片段的 堿基數(shù)目(數(shù)目單位為bp)分別為2000，1000，750，500，250，100。圖3為重組表達(dá)質(zhì)粒pET30_CathLS酶切后1. 5%瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3中1 為λ-EcoTHI digest DNA marker，其中各核酸片段的堿基數(shù)目(數(shù)目單位為bp)分別為 19329，7743，6223，4254，3472，2690，1882，1489，925 ;2 為質(zhì)粒 pET-30a Sma I+Xba I 雙酶 切后條帶；3為質(zhì)粒pET30-CathLlS Sma I+Xba I雙酶切后條帶；4為質(zhì)粒pET30_CathL2S Sma I+Xba I雙酶切后條帶；5為質(zhì)粒pET30_CathL3S Sma I+Xba I雙酶切后條帶。圖4為雞抗菌肽Cathe 1 icidin 1，2，3成熟肽片段融合表達(dá)載體pET30_CathLS 的構(gòu)建示意圖。在圖4中，5. 5Kb代表構(gòu)建的融合表達(dá)載體pET30-CathLS大小為5. 5Kb ； PI, P2分別代表Cathelicidinl, 2，3cDNA序列克隆所用的上、下游弓I物；MCS代表多克隆 位點(diǎn)；LacZ代表β -半乳糖苷酶的編碼基因；LacI代表Iac阻抑物的編碼基因；CathL代 表連接插入克隆載體的CatheliCidinl，2，3CDNA序列；CathLS代表連接插入表達(dá)載體的 CatheliCidinl，2，3成熟肽編碼序列；Amp代表氨芐青霉素抗性基因位點(diǎn)；Kan代表卡那霉 素抗性基因位點(diǎn)；pUCorigin，fl origin, pBR322 origin均代表復(fù)制起始位點(diǎn)。圖 5 為 SDS-PAGE 及 Western-Blot 分析雞 Cathelicidinl，2，3 成熟肽融合蛋白 的表達(dá)產(chǎn)物圖。其中，左側(cè)是SDS-PAGE電泳圖，右側(cè)是Wfestern blot圖。泳道1，1，是 空載體轉(zhuǎn)化菌株Rosetta (DE3)/pET30a IPTG誘導(dǎo)池菌體經(jīng)超聲破碎后可溶性蛋白；泳 道2，2’是預(yù)染低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker，其中各蛋白片段的分子量分別為117，85， 48，34，26，19kDa，KDa代表蛋白分子量的單位，即千道爾頓；泳道3，3，是Rosetta(DE3)/ PET30-CathLlS菌株IPTG誘導(dǎo)池菌體經(jīng)超聲破碎后可溶性蛋白；泳道4，4，是Rosetta (DE3)/pET30-CathLlS菌株IPTG誘導(dǎo)汕菌體經(jīng)超聲破碎后包涵體蛋白；泳道5，5， 是Rosetta (DE!3)/pET30-CathL2S菌株IPTG誘導(dǎo)池菌體經(jīng)超聲破碎后可溶性蛋白；泳道 6，6，是Rosetta (DE!3)/pET30-CathL2S菌株IPTG誘導(dǎo)汕菌體經(jīng)超聲破碎后包涵體蛋白； 泳道7，7，是Rosetta(DE；3)/pET30-CathL3S菌株IPTG誘導(dǎo)3h菌體經(jīng)超聲破碎后可溶性蛋 白；泳道8，8，是Rosetta (DE!3)/pET30-CathL3S菌株IPTG誘導(dǎo)汕菌體經(jīng)超聲破碎后包涵 體蛋白。圖6.固相化學(xué)合成雞抗菌肽Cathelicidinl的反相-高壓液相(RP-PHLC)色譜圖。圖7.固相化學(xué)合成雞抗菌肽Cathelicidinl的質(zhì)譜(ESI-MS)圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明 本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照 常規(guī)方法如Sambrook等編著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(Molecular cloning =Alaboratory manual, 2nded. New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1999)中所述的條件進(jìn) 行，或按照制造廠商提供的說(shuō)明書進(jìn)行。具體實(shí)施例中所使用的工具酶和其他試劑RNAiso Plus總RNA提取試劑、 ReverseTranscriptase M-MLV (Rnase H_)、核糖核酸酶抑制劑-RNAsin、Taq DNA 聚合酶、 限制性內(nèi)切酶、PMD18-T Vector、T4 DNA連接酶除特別指明外均為TAKARA公司產(chǎn)品；鼠 抗His單克隆抗體均購(gòu)自Tiangen公司；UNIQ-IO柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒和UNIQ-IO柱 式DNA膠回收試劑盒均為上海生工產(chǎn)品；IPTG為BBI公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG為 SouthernBiotech公司產(chǎn)品；預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)為i^ermentas (MBI)公司產(chǎn)品；金屬螯 合層析樹脂Ni2+-NTAkphar0se 4B購(gòu)自北京鼎國(guó)公司；細(xì)菌培養(yǎng)用TMP、TSA等固體培養(yǎng)基 為青島高科園海博生物技術(shù)公司產(chǎn)品，按說(shuō)明書提供方法制備；常規(guī)藥敏試紙片為杭州天 和微生物試劑有限公司產(chǎn)品，其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。實(shí)施例1 雞CatheliCidinl，2，3抗菌肽完整編碼基因的克隆及測(cè)序測(cè)定分析，具體包括1.引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中發(fā)表的原雞Cathelicidins類抗菌肽基因序列(DQ092!350， DQ092351，DQ092352, DQ092353)和PCR引物的設(shè)計(jì)原則，并借助計(jì)算機(jī)軟件DNASTAR進(jìn)行 輔助分析，設(shè)計(jì)了三對(duì)PCR基因特異性引物分別用于擴(kuò)增雞Cathelicidinl，2，3編碼基因 的 cDNA 序列，引物分別為表中 CathLl P1/P2、CathL2 P1/P2、CathL3 P1/P2，其中 Pl 為正 向引物，P2為反向引物。引物均由上海博尚公司合成。本實(shí)施例和實(shí)施例2中所用的引物序列如表1所示。在CathLlS F/R,CathL2S F/ R，CathL3S F/R引物對(duì)中，下劃線處的堿基分別代表在上下游引物中引入的EcoR I.Xho I 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。表1雞Cathelicidins類抗菌肽基因擴(kuò)增所用引物
權(quán)利要求
1.一組雞Cathelicidins抗菌肽，其特征是，其為雞抗菌肽Cathelicidinl、雞抗菌 肽Cathelicidin2和雞抗菌肽Cathelicidin3，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 6 和 SEQ ID NO. 11 所述。
2.如權(quán)利要求1所述的一組雞Cathelicidins抗菌肽，其特征是，所述雞抗菌肽 Cathelicidinl、雞抗菌肽Cathelicidin2和雞抗菌肽Cathelicidin3,其氨基酸序列分別 如 SEQ IDN0. 5、SEQ ID NO. 10 和 SEQ ID NO. 15 所述。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一組雞Cathelicidins抗菌肽的制備方法，其特征 是，所述制備方法為固相化學(xué)合成法或基因工程方法，所述基因工程方法是將雞抗菌肽 Cathelicidinl、雞抗菌肽Cathelicidin2和雞抗菌肽Cathelicidin3的編碼基因分別克隆 到表達(dá)載體上，然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞中表達(dá)；所述表達(dá)載體為質(zhì)?；虿《局械囊环N，所述宿主 細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求3所述的一組雞Cathelicidins抗菌肽的制備方法，其特征是，所述基因 工程方法為(1)將雞抗菌肽Cathelicidinl、雞抗菌肽 Cathelicidin2 和雞抗菌肽 Cathelicidin3 成熟肽的編碼基因分別克隆到大腸桿菌融合表達(dá)載體pET30a(+)中，得到融合表達(dá)載體 pET30-CathLlS、pET30_CathL2S、pET30_CathL3S ；(2)將pET30-CathLlS、pET30_CathL2S、pET30_CathL3S 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Rosetta (DE3)菌株，得到重組大腸桿菌基因工程菌株；(3)37°C下，在LB培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)物IPTG濃度為1. Ommol/L的條件下，對(duì)上述重組大腸 桿菌基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)；(4)離心收集上述表達(dá)菌體，超聲波破碎，分離細(xì)胞可溶組分與包涵體；(5)Ni2+-NTA Sepharose 4B親和層析柱純化融合蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的一組雞Cathelicidins抗菌肽的制備方法，其特征是，(1)PCR方法擴(kuò)增編碼雞抗菌肽Cathelicidinl，2，3成熟肽的核苷酸序列，PCR產(chǎn)物 經(jīng)EcoR I和B10 I雙酶切后與同樣酶切的pET-30a(+)融合表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a感受態(tài)細(xì)胞，小量提取質(zhì)粒，應(yīng)用PCR和質(zhì)粒酶切的方法篩選陽(yáng)性克隆，通過(guò)DNA測(cè)序 驗(yàn)證插入片段閱讀框的正確性，從而構(gòu)建出原核表達(dá)載體；將構(gòu)建的融合表達(dá)載體分別命 名為 pET30-CathLlS、pET30-CathL2S、pET30-CathL3S ；(2)將測(cè)序正確的質(zhì)粒pET30-CathLlS、pET30_CathL2S、pET30_CathL3S 分別轉(zhuǎn)化 大腸桿菌Rosetta(DEIB)菌株，獲得重組表達(dá)Cathelicidinsl，2，3成熟肽融合蛋白的工 程菌 Rosetta (DE3)/pET30-CathLlS、Rosetta (DE3)/pET30-CathL2S 和 Rosetta (DE3) / pET30-CathL3S ；挑取工程菌單菌落接種至LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)8 12h ；次日離心取菌 體重懸至新鮮LB培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)液OD6tltlnm值達(dá)到0. 5 0. 6時(shí)加入IPTG使其終濃度為 1. Ommol/L，開始進(jìn)行誘導(dǎo)；37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h，每隔1小時(shí)取樣ImL ；離心收集誘導(dǎo)培養(yǎng)后的 菌體，用PBS緩沖液洗滌菌體2次，再加入裂解緩沖液，冰浴中超聲破碎菌體，每次破碎^， 間隔2s，功率600W，破碎IOmin ；超聲后12000r/min，4°C下離心lOmin，分離可溶組分與和 包涵體，進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Wfestern Blot檢測(cè)；電泳后將SDS-PAGE凝膠中的條帶電轉(zhuǎn) 移至硝酸纖維素膜上，以鼠抗His單克隆抗體為一抗，羊抗鼠IgG-HRP為二抗，DAB為顯色 底物進(jìn)S^iestern-blot分析，鑒定表達(dá)產(chǎn)物；(3)然后進(jìn)行工程菌擴(kuò)大培養(yǎng)和目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，條件為25°C、IPTG濃度為 1. Ommol/L的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)8小時(shí)；取誘導(dǎo)后的菌體，加入結(jié)合緩沖液，冰浴中超聲波破 碎菌體，分離包涵體和可溶組分，將裂解上清液上樣于Ni2+-NTA Sepharose 4B親和層析柱， 樣品經(jīng)含0. 1 0. 5mol/L咪唑的緩沖液梯度洗脫，收集融合蛋白洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE檢 測(cè)。
6.如權(quán)利要求5所述的一組雞Cathelicidins抗菌肽的制備方法，其特征是，所述步驟 (1)擴(kuò)增編碼雞抗菌肽CatheliCidinl，2，3成熟肽的核苷酸序列的引物分別為CathLlS F/ R, CathL2SF/R, CathL3S F/R，其中 F 為正向引物，R 為反向引物，所述 CathLlS F/R, CathL2S F/R，CathL3S F/R的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 22-27所述。
7.如權(quán)利要求3所述的一組雞Cathelicidins抗菌肽的制備方法，其特征是，所述雞 抗菌肽Cathelicidinl的固相化學(xué)合成法為從雞抗菌肽Cathelicidinl核苷酸序列推 導(dǎo)出其前體蛋白的氨基酸序列，根據(jù)雞體內(nèi)彈性蛋白酶是從該基因第四個(gè)外顯子編碼氨基 酸序列中的第一個(gè)纈氨酸位點(diǎn)進(jìn)行切割加工，釋放出有生物學(xué)活性的成熟肽的N-端；結(jié) 合對(duì)信號(hào)肽與成熟肽間高度保守的Cathelin結(jié)構(gòu)域肽段的分析，推斷在其前體蛋白中， Argl23-Lysl48為雞Cathelicidinl抗菌肽的成熟肽序列；根據(jù)編碼雞Cathelicidinl抗 菌肽的核酸序列推導(dǎo)出成熟抗菌肽的氨基酸序列，按照標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成程序用全自動(dòng)多肽 合成儀合成其成熟肽序列SEQ IDN0. 4 ；合成肽經(jīng)反相-高壓液相柱層析脫鹽、純化，采用乙 腈/水/三氟乙酸系統(tǒng)洗脫，得到產(chǎn)物，采用電噴霧質(zhì)譜測(cè)定其分子量。
8.如權(quán)利要求4-7中任意一項(xiàng)所述的一組雞Cathelicidins抗菌肽的制備方法，其特 征是,雞抗菌肽Cathelicidinl、雞抗菌肽Cathelicidin2和雞抗菌肽Cathelicidin3的編 碼基因的獲取方法為自成年白來(lái)航雞骨髓組織中提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈 后，再以cDNA為模板，分別用3對(duì)基因特異性引物CathLl Pl/P2、CathL2 P1/P2和CathL3 P1 /P2進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物即為cathe 1 icidin 1，2，3cDNA全序列；PCR產(chǎn)物經(jīng)2 %瓊脂糖凝 膠電泳分離并回收目的片段，將目的片段與克隆載體PMD18-T連接并轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感 受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性菌株用M13 F/R引物測(cè)序，得到含cathelicidinl，2，3開放閱讀框的完整核 苷酸序列；所述CathLlPl/P2、CathL2 P1/P2、CathL3 P1/P2的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 16-21 所述。
9.權(quán)利要求1或2所述的一組雞Cathelicidins抗菌肽在制備治療革蘭氏陽(yáng)性菌、革 蘭氏陰性菌或真菌感染引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1或2所述的一組雞Cathelicidins抗菌肽在制備治療金黃色葡萄球菌、 芽孢桿菌、藤黃微球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、鴨疫里默氏桿菌或綠膿桿菌感染引 起的疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一組雞Cathelicidins抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用。雞抗菌肽Cathelicidin1、Cathelicidin2和Cathelicidin3的核苷酸序列和氨基酸序列如序列表所示。所述抗菌肽的制備方法為固相化學(xué)合成法或基因工程方法，所述基因工程方法是將雞抗菌肽Cathelicidin1-3成熟肽的編碼基因分別克隆到表達(dá)載體上，然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明應(yīng)用基因工程技術(shù)在原核宿主細(xì)胞中高效表達(dá)雞Cathelicidins抗菌肽，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該組抗菌肽對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌均有明顯的抑制作用。
文檔編號(hào)A61P31/10GK102127549SQ201010600240
公開日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月22日
發(fā)明者于可響, 吳靜, 姜亦飛, 宋敏訓(xùn), 李玉峰, 林樹乾, 馬秀麗, 黃兵 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所