專利名稱：環(huán)孢素a和烷基化血清白蛋白的組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，涉及一種環(huán)孢素A和烷基化血清白蛋白的組合物及其 制備方法。
背景技術(shù)：
環(huán)孢素A(Cycl0Sp0rineA，CsA)是一種由11個氨基酸組成的環(huán)狀多肽。該藥于 1969年由Borel發(fā)現(xiàn)，從絲狀真菌(Tolypocladium inflatum)培養(yǎng)液中分離出來。1972 年發(fā)現(xiàn)其具有強(qiáng)大的免疫抑制能力，對T淋巴細(xì)胞活化和增殖有特異性的抑制作用，并與 1978年首次應(yīng)用于臨床。1983年美國FDA批準(zhǔn)用于臨床腎移植。瑞士諾華公司于1984 年成功上市了環(huán)孢素A產(chǎn)品山地明，并于1995年對山地明進(jìn)行劑型改造，形成了現(xiàn)在臨床 使用的新山地明微乳制劑。1991年，福建微生物研究與杭州中美華東制藥有限公司合作 取得了環(huán)孢素A的生產(chǎn)許可，第一個國產(chǎn)環(huán)孢素A制劑正式上市。目前，環(huán)孢素A已廣泛 用于實體器官和骨髓移植后的抗排異反應(yīng)以及自身免疫疾病如再生障礙性貧血、內(nèi)風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎等的治療，是一種非常受歡迎的強(qiáng)效免疫抑制劑。最近報道環(huán)孢素A由于其神經(jīng)激 肽-1 (NK-I)受體拮抗劑的藥理特性，也顯示出廣譜抗腫瘤作用。然而環(huán)孢素A存在嚴(yán)重的腎毒性、肝毒性、中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性及消化道反應(yīng)等， 限制了其臨床長期使用。另外，環(huán)孢素A制劑口服給藥吸收慢，生物利用度低，僅為20 30%。環(huán)孢素A具有強(qiáng)的疏水性，水溶性差(37°C下為7.3yg/ml)，難于制備適宜的制 劑。目前臨床最為常用的環(huán)孢素A制劑-山地明(Sandimmune)用65%以上的聚氧乙烯 蓖麻油(Cremophor EL)作增溶劑，此輔料易導(dǎo)致超敏反應(yīng)和肝腎毒性等。因此開發(fā)不含 Cremophor EL的環(huán)孢素A制劑具有重要意義。李魁興等(李魁興，張鈞壽，周建平，環(huán)孢 素A納米乳輸液劑的制備及含量測定，藥學(xué)進(jìn)展，2008，32 ) :173-176)以注射用大豆油為 油相，磷脂為乳化劑制備了穩(wěn)定的環(huán)孢素A納米乳輸液劑，避免了 Cremophor EL的毒性。 Aliabadi HM^ (Aliabadi HM,Mahmud A, Sharifabadi AD, Lavasanifar A 2005. Micelles of methoxy poly(ethylene oxide)-b-poly(epsilon-caprolactone)as vehicles for the solubilization and controlled delivery of cyclosporine A. J Control Release 104(2) :301-311)制備了環(huán)孢素A的PE0_b_PCL膠束制劑，濃度可達(dá)到1. 3mg/ml, 12h內(nèi)僅 有5. 8 %的環(huán)孢素A釋放，與Sandimmune (12h內(nèi)釋放77 %的環(huán)孢素A)相比具有更好的緩釋 特性。但這些制劑存在制備工藝復(fù)雜、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，因此，開發(fā)溶解性好、毒副作用小、 生產(chǎn)工藝簡單、穩(wěn)定性好的環(huán)孢素A制劑，是本領(lǐng)域研究人員急需解決的問題。鑒于環(huán)孢素A具有較高的血漿蛋白結(jié)合率(> 90% )，CN 1157185C公開了一種 采用高壓均質(zhì)或超聲的方法制備的環(huán)孢素A人血清白蛋白納米粒，載藥量約為10%，本發(fā) 明者采用CN 1157185C公開的制備方法制得相似載藥量的環(huán)孢素A人血清白蛋白結(jié)合納米 粒，室溫下穩(wěn)定性< 12h。CN 1270529A公開了一種環(huán)孢素A與加入一定添加劑的人血清白 蛋白或重組人血清白蛋白制備的納米粒(所加添加劑可達(dá)到避免蛋白質(zhì)和活性藥物作最 佳結(jié)合的蛋白質(zhì)聚集的目的)，載藥量分別為0.25%和0.52%。本發(fā)明將于血清白蛋白的空間結(jié)構(gòu)中引入一定量的疏水烷基鏈，該疏水基團(tuán)可顯著提高白蛋白空間構(gòu)象中疏水區(qū)域 的疏水性，從而增強(qiáng)白蛋白和藥物的疏水相互作用，極顯著提高藥物的載藥量以及改善體 內(nèi)外的穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)問題，提供一種環(huán)孢素A和烷基化血清白蛋白的組 合物，該組合物可克服現(xiàn)有環(huán)孢素A制劑存在嚴(yán)重毒副作用等缺陷，得到溶解性好、毒副作 用小、穩(wěn)定性好、儲藏運(yùn)輸方便的環(huán)孢素A納米制劑。本發(fā)明的另一個目的是提供該組合物的制備方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是提供一種環(huán)孢素A和烷基化血清白 蛋白的組合物，其由活性成分環(huán)孢素A與烷基化血清白蛋白組成，該烷基化血清白蛋白與 環(huán)孢素A具有更強(qiáng)的結(jié)合和負(fù)載能力。上述藥物組合物，按所述組合物總重計環(huán)孢素A為 30-45wt %，烷基化血清白蛋白為55-70wt % ；烷基化血清白蛋白中的烷基鏈長度為C2-C18， 烷基修飾量為10-50個烷基鏈/1個白蛋白分子，其中的血清白蛋白選自人血清白蛋白、重 組人血清白蛋白、豬血清白蛋白、牛血清白蛋白。提供一種環(huán)孢素A和烷基化血清白蛋白的組合物的制備方法，步驟如下1)烷基化血清白蛋白溶于水中；2)將環(huán)孢素A溶于藥學(xué)上可接受有機(jī)溶劑后滴加入上述溶液中，通過高壓均質(zhì)或 探頭超聲作用，藥物與烷基化血清白蛋白結(jié)合成納米粒子；3)將上述溶液通過透析或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等方式除去有機(jī)溶劑；0.45μπι微孔濾膜過 濾，得到環(huán)孢素A納米膠束溶液；4)在上述納米膠束溶液中加入一定比例的凍干保護(hù)劑，混勻，分裝，凍干制得環(huán)孢 素A烷基化血清白蛋白納米粒。上述的組合物制備方法中，溶解環(huán)孢素A的可接受的有機(jī)溶劑包括甲醇、乙醇、氯 仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醚，優(yōu)選乙醇。凍干制得的環(huán)孢素A烷基化血清白蛋白納米粒配以適 當(dāng)?shù)妮o料，制成片劑、顆粒劑、膠囊劑等固體口服制劑和注射用凍干粉針。這些劑型是按照 本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的方法制備。所用的輔料是常規(guī)的添加劑，例如淀粉、阿拉伯膠、 明膠、羥丙甲纖維素、硅石、聚乙二醇，含有本發(fā)明組合物的制劑中還可能含有其它輔料，例 如填充劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、防腐劑、矯味劑、色素等等。本發(fā)明公開了環(huán)孢素A和烷基化血清白蛋白的組合物，它是一種選用疏水烷基修 飾的血清白蛋白為載體對環(huán)孢素A進(jìn)行負(fù)載以及常用賦形劑制備的平均粒徑在210 士 30nm 的納米膠束制劑。本發(fā)明的設(shè)計依據(jù)一是天然高分子納米膠束可以作為疏水性藥物、蛋白和核酸 等藥物的載體，并具有高效、長效、安全性、靶向性等特點(diǎn)，蛋白質(zhì)分子中含有較多的極性基 團(tuán)，對很多藥物離子具有高度的親和力，而且這種結(jié)合多是可逆的，為制備高載藥量的制劑 奠定了基礎(chǔ)；同時，以疏水鏈修飾的天然親水性高分子所形成膠束的微觀結(jié)構(gòu)與經(jīng)典嵌段 共聚物膠束的“殼核”結(jié)構(gòu)不同，為多室結(jié)構(gòu)，其特殊的微觀結(jié)構(gòu)可能對藥物的增溶、載體的 穩(wěn)定性、藥物的釋放及體內(nèi)行為具有較大的影響；二是凍干粉末劑型能夠解決溶液劑存在 的由于聚集使粒徑增大以及貯存和運(yùn)輸穩(wěn)定性等問題。所以本發(fā)明是較為理想的納米膠束給藥系統(tǒng)，可用于器官或骨髓移植以及自身免疫疾病的長期安全有效的藥物治療。本發(fā)明與現(xiàn)有環(huán)孢素A制劑相比，具有“高載藥量、高包封率、高安全性、高穩(wěn)定 性、生產(chǎn)工藝簡單”等優(yōu)點(diǎn)。具體表現(xiàn)在一、采用疏水烷基修飾的血清白蛋白負(fù)載環(huán)孢素A，該藥物組合物載藥量高達(dá) 31. 14%,包封率高達(dá)81.41%，平均粒徑在210nm左右，藥物以分子或無定形形式存在于納 米粒中，電鏡下顯示納米粒子是規(guī)整的圓球形，可穩(wěn)定Mh以上。二、該組合物不含聚氧乙烯蓖麻油Cremophor EL，不會產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，刺激 性小，顯著改善了患者的臨床順應(yīng)性。三、該組合物可通過高壓均質(zhì)或超聲等作用力制備而成，易于實現(xiàn)工業(yè)化。四、該組合物以凍干粉末形式保存，能夠解決載藥納米粒溶液由于聚集使粒徑增 大以及貯存和運(yùn)輸穩(wěn)定性等問題。


圖1是各種物質(zhì)的X-射線衍射(XRD)圖譜其中，曲線a為烷基化血清白蛋白衍生 物；曲線b為環(huán)孢素A ；曲線c為環(huán)孢素A與烷基化血清白蛋白衍生物的物理混合物(含量 比與實施例相同)；曲線d為本發(fā)明實施例技術(shù)方案，環(huán)孢素A烷基化血清白蛋白組合物。圖2是本發(fā)明實施例提供的環(huán)孢素A烷基化血清白蛋白組合物的透射電鏡圖譜 (TEM)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體優(yōu)選實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但并不因此將本發(fā)明限制在所 述的實施例范圍之中。實施例1環(huán)孢素A辛基人血清白蛋白納米粒取辛基修飾的人血清白蛋白衍生物90mg，溶于15mL雙蒸水，室溫下攪拌0.證充分 溶脹；50mg環(huán)孢素A溶于1. 25mL甲醇，逐滴滴加到上述載體溶液中，攪拌；探頭超聲QOOw， 30min)；透析袋(MWC0 = 12，000 14，000)單蒸水透析8h，所得納米溶液過0. 45 μ m微孔 濾膜；濾液中加入(w/v)甘露醇，混勻，分裝，凍干即得。測試結(jié)果顯示，該環(huán)孢素A辛基人血清白蛋白納米粒載藥量為31. 14%，包封率為 81. 41%，平均粒徑為 199. lnm, zeta 電位為-31. 2mV。參見附圖1，圖1是各種物質(zhì)的X-射線衍射(XRD)圖譜其中，曲線a為烷基化血 清白蛋白衍生物；曲線b為環(huán)孢素A ；曲線c為環(huán)孢素A與烷基化血清白蛋白衍生物的物理 混合物(含量比與實施例相同)；曲線d為本發(fā)明實施例技術(shù)方案，環(huán)孢素A烷基化血清白 蛋白組合物。XRD結(jié)果顯示，環(huán)孢素A原料藥在5-20°間有強(qiáng)衍射峰；對比曲線a、b和c， 曲線c的吸收峰只是曲線a和b 二者的簡單疊加，說明在物理混合物中，環(huán)孢素A、烷基化血 清白蛋白的結(jié)晶形態(tài)未發(fā)生變化。對比曲線a、b和d，組合物中藥物的結(jié)晶衍射峰消失，表 明環(huán)孢素A與烷基化血清白蛋白相互作用后可能以分子或無定型狀態(tài)存在于納米粒內(nèi)部。參見附圖2，圖2是本發(fā)明實施例提供的環(huán)孢素A烷基化血清白蛋白組合物的透 射電鏡圖譜(TEM)。由TEM圖可以看到，該組合物在電鏡下為規(guī)整圓球形，殼核結(jié)構(gòu)較為清晰，粒子不粘連且粒徑分布較均勻，為200nm左右。較動態(tài)光散射法所得結(jié)果小。這是由于 兩種不同測定方法粒子所處的狀態(tài)不同，透射電鏡法是在干態(tài)下測得的膠束粒徑，為粒子 的真實粒徑，而動態(tài)光散射法是在溶液中測得的膠束流體力學(xué)直徑。
實施例2
環(huán)孢素A辛基重組人血清白蛋白納米粒取辛基修飾的重組人血清白蛋白衍生物90mg，溶于15mL雙蒸水，室溫下攪拌0. 5h 充分溶脹；50mg環(huán)孢素A溶于1. 25mL無水乙醇，逐滴滴加到上述載體溶液中，攪拌；高壓均 質(zhì)(200bar，循環(huán)2次；500bar，循環(huán)2次；800bar，循環(huán)3次)；透析袋(MWC0 = 12，000 14, 000)單蒸水透析他，所得納米溶液過0. 45μπι微孔濾膜；濾液中加入(w/v)甘露醇， 混勻，分裝，凍干即得。測試結(jié)果顯示，該環(huán)孢素A辛基重組人血清白蛋白納米粒載藥量為30. 48 %，包封 率為79. 36%，平均粒徑為193. lnm, zeta電位為-33. OmV。實施例3環(huán)孢素A辛基豬血清白蛋白納米粒取辛基修飾的豬血清白蛋白衍生物90mg，溶于15mL雙蒸水，室溫下攪拌0.證充分 溶脹；40mg環(huán)孢素A溶于1. OmL氯仿，逐滴滴加到上述載體溶液中，攪拌；探頭超聲QOOw， 30min)；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)池除去有機(jī)溶劑，所得納米溶液過0. 45 μ m微孔濾膜；濾液中加入 1% (w/v)甘露醇，混勻，分裝，凍干即得。測試結(jié)果顯示，該環(huán)孢素A辛基豬血清白蛋白納米粒載藥量為24.61%，包封率為 72. 20%，平均粒徑為 236. 5nm, zeta 電位為-33. 6mV。實施例4環(huán)孢素A辛基牛血清白蛋白納米粒取辛基修飾的牛血清白蛋白衍生物90mg，溶于15mL雙蒸水，室溫下攪拌0. 充 分溶脹；50mg環(huán)孢素A溶于1.25mL甲醇，逐滴滴加到上述載體溶液中，攪拌；高壓均質(zhì) (200bar,循環(huán) 2 次；500bar，循環(huán) 2 次；800bar，循環(huán) 3 次)；透析袋(MWC0 = 12，000 14, 000)單蒸水透析他，所得納米溶液過0.45μπι微孔濾膜；濾液中加入1.5% (w/v)甘露 醇，混勻，分裝，凍干即得。
測試結(jié)果顯示，該環(huán)孢素A辛基牛血清白蛋白納米粒載藥量為30.03%，包封率為 77. 69%，平均粒徑為 195. 8nm, zeta 電位為-30. lmV。實施例5環(huán)孢素A十二烷基重組人血清白蛋白納米粒取十二烷基修飾的重組人血清白蛋白衍生物90mg，溶于15mL雙蒸水，室溫下攪拌 0.證充分溶脹；50mg環(huán)孢素A溶于1. 25mL無水乙醇，逐滴滴加到上述載體溶液中，攪拌；探 頭超聲O00w，30min)；透析袋(麗CO = 12，000 14，000)單蒸水透析他，所得納米溶液過 0. 45 μ m微孔濾膜；濾液中加入(w/v)甘露醇，混勻，分裝，凍干即得。測試結(jié)果顯示，該環(huán)孢素A十二烷基重組人血清白蛋白納米粒載藥量為30.09%， 包封率為78. 32%，平均粒徑為204. 9nm, zeta電位為-34. 8mV。實施例6環(huán)孢素A十二烷基牛血清白蛋白納米粒
取十二烷基修飾的牛血清白蛋白衍生物90mg，溶于15mL雙蒸水，室溫下攪拌0. 5h 充分溶脹；50mg環(huán)孢素A溶于1. 25mL丙酮，逐滴滴加到上述載體溶液中，攪拌；高壓均質(zhì) (200bar，循環(huán)2次；500bar，循環(huán)2次；SOObar，循環(huán)3次)；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)池除去有機(jī)溶劑， 所得納米溶液過0.45 μ m微孔濾膜；濾液中加入(w/v)甘露醇，混勻，分裝，凍干即得。測試結(jié)果顯示，該環(huán)孢素A十二烷基牛血清白蛋白納米粒載藥量為23. 81 %，包封 率為56. 25%，平均粒徑為203. 9nm, zeta電位為-31. 9mV。實施例7
環(huán)孢素A十二烷基人血清白蛋白納米粒取十二烷基修飾的人血清白蛋白衍生物90mg，溶于15mL雙蒸水，室溫下攪拌0. 5h 充分溶脹；40mg環(huán)孢素A溶于LOmL乙酸乙酯，逐滴滴加到上述載體溶液中，攪拌；探頭超 聲O00W，30min)；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)池除去有機(jī)溶劑，所得納米溶液過0. 45 μ m微孔濾膜；濾 液中加入(w/v)甘露醇，混勻，分裝，凍干即得。測試結(jié)果顯示，該環(huán)孢素A十二烷基人血清白蛋白納米粒載藥量為23. 76 %，包封 率為70. 09%，平均粒徑為230. 3nm, zeta電位為-31. 6mV。實施例8環(huán)孢素A十二烷基豬血清白蛋白納米粒取十二烷基修飾的豬血清白蛋白衍生物90mg，溶于15mL雙蒸水，室溫下攪拌0. 5h 充分溶脹；50mg環(huán)孢素A溶于1. 25mL甲醇，逐滴滴加到上述載體溶液中，攪拌；高壓均質(zhì) (200bar,循環(huán) 2 次；500bar，循環(huán) 2 次；800bar，循環(huán) 3 次)；透析袋(MWC0 = 12，000 14，000)單蒸水透析他，所得納米溶液過0. 45μπι微孔濾膜；濾液中加入(w/v)甘露醇， 混勻，分裝，凍干即得。測試結(jié)果顯示，該環(huán)孢素A十二烷基豬血清白蛋白納米粒載藥量為30. 14%，包封 率為78. 11%，平均粒徑為197. 5nm, zeta電位為-31. 5mV。
權(quán)利要求
1.一種環(huán)孢素A藥物組合物，其特征在于它是由活性成分環(huán)孢素A和烷基化血清白蛋 白所制成的制劑環(huán)孢素A為5-50wt%，烷基化血清白蛋白為50-95wt%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，活性成分環(huán)孢素A與烷基化血清白 蛋白通過非共價鍵結(jié)合，按所述組合物總重計環(huán)孢素A為30-45wt%，烷基化血清白蛋白 為 55-70wt%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，烷基化血清白蛋白中的烷基鏈長 度為 C2-C18。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，烷基化血清白蛋白中的烷基修飾 量為10-50個烷基鏈/1個白蛋白分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，其中的血清白蛋白選自人血清白 蛋白、重組人血清白蛋白、豬血清白蛋白、牛血清白蛋白。
6.一種制備如權(quán)利要求1所述的環(huán)孢素A與烷基化血清白蛋白組合物的方法，其制備 步驟如下烷基化血清白蛋白衍生物溶于水中，將環(huán)孢素A用藥學(xué)上可接受的有機(jī)溶劑溶解后， 加入上述溶液中，經(jīng)高壓均質(zhì)或探頭超聲處理后，透析或蒸發(fā)法除去有機(jī)溶劑，以微孔濾膜 過濾，即得組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于可接受的有機(jī)溶劑包括 甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醚。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于可接受的有機(jī)溶劑優(yōu)選乙醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征是在組合物中加入適量輔料，用常規(guī)的 制備方法，可制成片劑、顆粒劑、膠囊劑或凍干粉針。
全文摘要
本發(fā)明涉藥物制劑領(lǐng)域，公開了一種環(huán)孢素A和烷基化血清白蛋白的組合物及其制備方法。該組合物具有高載藥量、高穩(wěn)定性的特點(diǎn)，并可克服現(xiàn)有環(huán)孢素A制劑存在的嚴(yán)重毒副作用等缺陷，本發(fā)明制備方法簡單、工藝成熟、適合工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號A61K38/13GK102038933SQ20101060019
公開日2011年5月4日 申請日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月22日
發(fā)明者周建平, 崔蓓, 彭小玲, 李靜, 霍美蓉 申請人:中國藥科大學(xué)