專利名稱：用胞外拮抗物和胞內(nèi)拮抗物抑制受體酪氨酸激酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用胞外RTK拮抗物和胞內(nèi)RTK拮抗物抑制受體酪氨酸激酶(RTKs)的 方法。特別地，本發(fā)明涉及通過給予胞外和胞內(nèi)RTK拮抗物來治療哺乳動物中的酪氨酸激 酶_依賴性疾病和狀況的方法。
背景技術(shù)：
RTKs是跨膜蛋白質(zhì)，其涉及幾種細(xì)胞過程的控制和調(diào)節(jié)，例如細(xì)胞增殖和分化、促 進(jìn)細(xì)胞的存活、以及細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)。RTKs的配體是可溶的或膜結(jié)合的肽或蛋白質(zhì)激素。 通常，配體結(jié)合到RTK上刺激受體的酪氨酸激酶活性，隨后刺激生化和物理變化的信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)級聯(lián)，最后導(dǎo)致DNA合成和細(xì)胞分裂。這種受體的例子包括表皮生長因子受體(EGFR)、胰 島素受體、血小板衍生的生長因子受體(PDGFR)、血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)、成纖維 細(xì)胞生長因子受體(FGFR)、肝細(xì)胞生長因子受體(HGFR)以及神經(jīng)生長因子受體(NGFR)。通常，RTKs具有胞外區(qū)域、跨膜的疏水結(jié)構(gòu)域和具有激酶結(jié)構(gòu)域的胞內(nèi)區(qū)域。當(dāng) 配體結(jié)合到這種RTK細(xì)胞表面的胞外結(jié)合區(qū)域時(shí)，在受體中就產(chǎn)生了構(gòu)象變化，暴露胞內(nèi) 酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的磷酸化位點(diǎn)。受體中的構(gòu)象變化也能夠在與相關(guān)的RTK進(jìn)行同或者異 二聚化后產(chǎn)生。這些結(jié)構(gòu)域的磷酸化刺激酪氨酸激酶活性，起始一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，又導(dǎo)致 基因激活和細(xì)胞周期的進(jìn)展并最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖和分化。另外，配體的結(jié)合引起許多RTKs 二聚化，然后每個受體單體的蛋白激酶在二聚體 配偶體的胞內(nèi)區(qū)域中磷酸化一系列獨(dú)特的酪氨酸殘基，這是一種稱為自身磷酸化的過程。 自身磷酸化通常分兩個階段發(fā)生。首先，催化位點(diǎn)附近的在磷酸化邊緣的酪氨酸殘基被磷 酸化。這將導(dǎo)致推動ATP或蛋白質(zhì)底物結(jié)合到受體上的構(gòu)象變化。然后磷酸化受體作為其它參與RTK-介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)的錨定位點(diǎn)。這些 蛋白質(zhì)包括連接物蛋白質(zhì)GRB2，它結(jié)合到活化的RTK上的一個特定磷酸酪氨酸上并結(jié)合到 另外一個胞內(nèi)蛋白質(zhì)Sos上，又與無活性的Ras-GDP復(fù)合物相互作用(Ras是一種GTP-結(jié) 合的開關(guān)蛋白質(zhì)，在與結(jié)合GTP的活性“開”狀態(tài)和與結(jié)合GDP的無活性“關(guān)”狀態(tài)之間交 替)。然后Sos的鳥嘌呤核苷酸-交換因子(GEF)活性促進(jìn)活性Ras-GTP復(fù)合物的形成。然 后Ras誘導(dǎo)激酶級聯(lián)反應(yīng)，最終激活MAP激酶。特別地，活化的Ras結(jié)合到一種絲氨酸_蘇 氨酸激酶Raf的N末端結(jié)構(gòu)域上。Raf又結(jié)合并磷酸化一種雙特異性的蛋白激酶MEK，它能 將酪氨酸和絲氨酸殘基都磷酸化并且激活另外一種絲氨酸_蘇氨酸激酶MAP激酶。MAP激 酶磷酸化許多不同的介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的蛋白質(zhì)，包括核轉(zhuǎn)錄因子。與RTKs相關(guān)的信號傳遞途徑的異常被認(rèn)為導(dǎo)致了許多病理結(jié)果，包括癌癥、心血 管病、炎性疾病和其它增殖性疾病。例如，一些RTKs在人癌癥研究中被確定為與生長因子 受體突變形式有關(guān)，它們甚至在沒有生長因子時(shí)向細(xì)胞發(fā)送增殖信號。一種在neu基因座被編碼的這樣的突變受體被認(rèn)為導(dǎo)致了某些人乳腺癌的不受控制的增殖。RTKs的特定成員 也與各種人類癌癥相關(guān)。參與腫瘤形成的一種RTK是EGF受體家族，它包括EGF受體(EGFR，也稱為erbB_l/ HER1)、HER2 (也叫做 c-neu/erbB-2)、erbB_3/HER3 以及 erbB_4/HER4。例如，EGFR 和 HER2 被認(rèn)為在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長和存活的過程中起了關(guān)鍵作用。特別地，EGFR涉及影響存活、 防止凋亡、去分化、轉(zhuǎn)移(包括細(xì)胞遷移和侵入)的幾種途徑，EGFR也與血管發(fā)生、實(shí)體腫 瘤通過形成新血管來產(chǎn)生它們自己的血管系統(tǒng)的能力有關(guān)。據(jù)報(bào)導(dǎo)，許多人腫瘤表達(dá)或過量表達(dá)一種或多種EGF受體家族成員。特別地，EGFR 的存在似乎與不良預(yù)后、增長的腫瘤擴(kuò)散危險(xiǎn)以及某些類型腫瘤更短的整體存活率有關(guān)。 據(jù)認(rèn)為對晚期疾病的標(biāo)準(zhǔn)化療和放療的不良的整體反應(yīng)可能是因?yàn)镋GFR在沒有被這種標(biāo) 準(zhǔn)方法所殺死的腫瘤細(xì)胞內(nèi)修復(fù)損傷的能力。另外，研究表明HER2陽性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌是 一種生長特別迅速的疾病，結(jié)果導(dǎo)致與HER2陰性的乳腺癌相比更大可能性的復(fù)發(fā)、更差的 預(yù)后以及大約一半的生命預(yù)期。在25-30%的原發(fā)性乳腺癌中觀察到了 HER2蛋白質(zhì)的過量 表達(dá)。VEGFR家族成員也與腫瘤形成有關(guān)。例如，這些受體被認(rèn)為在腫瘤形成、血管發(fā)生 和腫瘤生長中起作用。VEGFRs在例如胚胎發(fā)生和腫瘤形成的過程中在內(nèi)皮細(xì)胞上選擇性表 達(dá)，已經(jīng)開發(fā)了阻斷內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的VEGF受體的信號傳遞來減少腫瘤生長的VEGFR拮抗 物。VEGF受體也在一些非內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，如產(chǎn)生VEGF的腫瘤細(xì)胞，其中產(chǎn)生了一種不依 賴內(nèi)皮的自分泌環(huán)來支持腫瘤生長。因此，通過開發(fā)合適的RTKs的抑制劑、調(diào)節(jié)劑或調(diào)節(jié)物，可以調(diào)節(jié)RTKs的信號傳 遞途徑來治療或預(yù)防這些病理結(jié)果。因?yàn)镋GFR和VEGFR參與腫瘤形成，這些RTKs被特異 性靶向用于抗癌藥物治療。這種治療主要包括一種阻止配體結(jié)合到受體胞外結(jié)構(gòu)域上的單 克隆抗體，或是一種可直接作用于RTK的胞內(nèi)區(qū)域來防止信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的合成酪氨酸激酶抑制 劑。在當(dāng)前的臨床試驗(yàn)中有各種各樣的單克隆抗體抑制劑。一個這樣的例子是 cetuximab，它是一種嵌合的(人/小鼠)單克隆抗體，能阻止配體結(jié)合到EGFR上，防止受體 激活以及抑制培養(yǎng)中細(xì)胞的生長。另外一個例子是ABX-EGF，它是一種據(jù)報(bào)導(dǎo)能阻止EGF和 TFG-α結(jié)合的EGFR特異性的全人單克隆抗體。Hercept in (司徒曼布(trastuzumab)) 是一種被批準(zhǔn)用于HER2陽性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌治療的人源化抗體，其設(shè)計(jì)為靶向并阻止 HER2蛋白質(zhì)的過量表達(dá)功能。另外，當(dāng)前的臨床試驗(yàn)是在各種小分子抑制劑上進(jìn)行的。酪氨酸激酶抑制劑的一 個例子就是Iressa ，它是一種據(jù)報(bào)道能抑制EGFR酪氨酸激酶活性的小分子表皮生長因子 受體酪氨酸激酶抑制劑，它對于一定范圍的表達(dá)功能性EGFR的人癌細(xì)胞來說是細(xì)胞抑制 劑，能抑制腫瘤細(xì)胞通過P27上調(diào)的增殖。盡管當(dāng)前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)靶向RTKs的小分子療法來抑制可受影響的腫瘤，但只要持續(xù) 用藥，有時(shí)它們有很嚴(yán)重的副作用。據(jù)報(bào)道，一旦停止給予小分子，腫瘤會重新生長，甚至比 在治療之前的生長速度更快。此外，持續(xù)使用小分子酪氨酸激酶抑制劑顯示出會導(dǎo)致其它 的副作用，諸如皮疹、腹瀉、粘膜炎以及中性粒細(xì)胞減少癥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供通過使用胞外RTK拮抗物和胞內(nèi)RTK拮抗物來抑制受體酪氨酸激酶 (RTKs)的方法。特別地，本發(fā)明提供一種通過給予胞外和胞內(nèi)RTK拮抗物來治療哺乳動物 的諸如腫瘤生長的酪氨酸激酶_依賴性疾病或狀況的方法。與單獨(dú)給予胞外RTK拮抗物 或單獨(dú)給予胞內(nèi)RTK拮抗物相比，這種治療方法導(dǎo)致了腫瘤生長抑制的增強(qiáng)的或協(xié)同的效 應(yīng)。本發(fā)明也提供包含胞外RTK拮抗物和胞內(nèi)RTK拮抗物的藥物組合物。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種用胞外RTK拮抗物和胞內(nèi)RTK拮抗物來抑制RTKs的方法。RTK是 一種跨膜的、具有胞外區(qū)域、跨膜疏水結(jié)構(gòu)域和具有激酶結(jié)構(gòu)域的胞內(nèi)區(qū)域的細(xì)胞表面受 體。胞外區(qū)域的激活可以通過配體結(jié)合或者與另一個RTK的同或異二聚化而發(fā)生，隨后胞 內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域被激活。當(dāng)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域被激活以及酪氨酸激酶活性被刺激后，就起始了一個 RTK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而激活各種基因、起始細(xì)胞周期的進(jìn)行、最終起始細(xì)胞增殖和分化。RTK 優(yōu)選是 EGFR 家族成員，諸如 EGFR 或 erbB-1、erbB-2、erbB-3 或 erbB-4。RTK 更優(yōu)選是EGFR，它是一種結(jié)合于例如EGF、TNF-α、雙調(diào)蛋白、結(jié)合肝素的EGF(HB-EGF)、β 動物纖維素、印iregulin以及NRG2_a的170kDa的跨膜糖蛋白。RTK也優(yōu)選HER2，一種編碼 185kDa跨膜受體蛋白質(zhì)的原癌基因。RTK也可以是VEGF受體(VEGFR)家族的成員，其包括 VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、神經(jīng)氈蛋白-1和神經(jīng)租蛋白-2。結(jié)合于VEGFR-I和VEGFR-2 的配體包括 VEGF(VEGF121，VEGFR145，VEGF165，VEGFR189 和 VEGF2J 的同種型。可結(jié)合于根據(jù)本發(fā)明的拮抗物的其它RTKs的非限制例子包括PDGF受體(PDGFR) 家族成員，諸如PDGFR-α (其結(jié)合于PDGF-AA，PDGF-BB和PDGF-AB)和PDGFR-β (其結(jié)合于 PDGF-BB) ；FGF受體(FGFR)家族成員，諸如!7GRF-I和FGFR-2 ；HGF受體(HGFR)家族成員； NGR受體(NGFR)家族成員，諸如CD27和CD40 ；以及胰島素受體家族成員，諸如胰島素受體 (IR)，1型胰島素樣生長因子I受體(IGF-IR)以及胰島素受體相關(guān)受體(IRR)。根據(jù)本發(fā)明的上下文，胞外RTK拮抗物通過RTK拮抗物與受體胞外結(jié)合區(qū)域之間 的足夠的物理或化學(xué)相互作用來與RTK胞外結(jié)合區(qū)域相互作用，這樣酪氨酸激酶活性就得 到抑制。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到RTK拮抗物與胞外結(jié)合區(qū)域之間的這種化學(xué)相互作用的 例子包括締合或鍵合，這是現(xiàn)有技術(shù)公知的，其包括共價(jià)鍵合、離子鍵鍵合、氫鍵鍵合以及 類似的鍵合。根據(jù)本發(fā)明的上下文，胞內(nèi)RTK拮抗物通過防止受體磷酸化和/或其它參與各種 RTK信號傳遞途徑的蛋白質(zhì)的磷酸化來抑制酪氨酸激酶活性。胞內(nèi)RTK拮抗物對RTK的酪 氨酸激酶活性的抑制可通過結(jié)合到具有激酶結(jié)構(gòu)域的胞內(nèi)區(qū)域上或抑制其激活、或者通過 結(jié)合到任何參與RTK信號傳遞途徑的胞內(nèi)蛋白質(zhì)上或抑制其激活。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)意識到的是，盡管胞外拮抗物和胞內(nèi)拮抗物都起到抑制相同RTK途徑 的作用，這些途徑可以是截然不同的信號傳遞途徑。因此，這些途徑可以彼此完全獨(dú)立地起 作用，胞外途徑可以在胞內(nèi)途徑?jīng)]有被激活的時(shí)候被激活，反之亦然。此外，每個途徑的作 用機(jī)制可以不同；因此也導(dǎo)致不同的激活和信號。雖然不希望被理論所束縛，但是據(jù)認(rèn)為胞外RTK拮抗物抑制了 RTK激活后RTK胞 外區(qū)域的構(gòu)象變化所起始的所有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)。這種抑制包括表面RTKs和那些已經(jīng)被細(xì)胞內(nèi)化的RTKs。例如，據(jù)認(rèn)為激活的RTKs可以通過包被有網(wǎng)格蛋白的小窩進(jìn)入核內(nèi)體，但 仍然保持它們的信號傳遞活性。在內(nèi)化之后，這些受體或者循環(huán)回到細(xì)胞表面或者在核內(nèi) 體或溶酶體中降解。配體結(jié)合到受體上可能會促進(jìn)受體的再循環(huán)，而結(jié)合其它受體(即同 或異二聚體)或者拮抗物到這個受體上可能會促進(jìn)RTK的降解。根據(jù)本發(fā)明上下文，胞外和胞內(nèi)RTK拮抗物可以是生物分子、小分子或其它任何 的通過與受體胞外結(jié)合區(qū)域的相互作用抑制RTK激活(即胞外拮抗物)或通過與胞內(nèi)酪氨 酸激酶結(jié)構(gòu)域或其它任何參與該途徑的胞內(nèi)蛋白質(zhì)的相互作用抑制磷酸化(即胞內(nèi)拮抗 物)，從而最終抑制基因激活或細(xì)胞增殖的物質(zhì)。通常，RTK拮抗物減少RTK的激活，不必完 全防止或停止RTK的激活。根據(jù)本發(fā)明上下文，生物分子包括所有氨基酸、核苷酸、脂和通常具有大于650D 分子量的單糖聚合物。因此，生物分子包括例如寡肽、多肽、肽和蛋白質(zhì)、諸如DNA和RNA的 寡核苷酸和多核苷酸以及寡糖和多糖。生物分子進(jìn)一步包括上述任何分子的衍生物。例如， 生物分子衍生物包括脂和糖基化衍生物或寡肽、多肽、肽和蛋白質(zhì)。生物分子衍生物進(jìn)一步 包括寡糖和多糖的脂衍生物，例如脂多糖。最典型的生物分子是抗體或其功能性衍生物。根據(jù)本發(fā)明的這種抗體可以是例如天然存在的抗體，二價(jià)片斷如(Fab' )2， 單價(jià)片斷如Fab，單鏈抗體如單鏈FvS(SCFv)，單結(jié)構(gòu)域抗體，多價(jià)單鏈抗體，雙抗體 (diabodies)，三抗體(triabodies)以及類似物，它們可以是單或雙-特異性的，與抗原特 異性結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的抗體也可以是單結(jié)構(gòu)域抗體，它結(jié)合效率很高，包括一個提供有效 結(jié)合的單一抗體可變結(jié)構(gòu)域。也可以使用重鏈的同二聚體抗體，其缺少輕鏈和第一恒定結(jié) 構(gòu)域。通常，本發(fā)明的抗體包括人Vh和\構(gòu)架區(qū)(FWs)，也包括人互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs)。 整個Vh和\可變結(jié)構(gòu)域優(yōu)選是人的或源自人的序列。同樣的，本發(fā)明的抗體的可變結(jié)構(gòu)域 可以是一種完整抗體重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，或者它可以是天然存在的結(jié)構(gòu)域的功能性等 價(jià)物或突變體或衍生物，或是利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)構(gòu)建的合成結(jié)構(gòu)域。例如，將 相應(yīng)于缺失至少一個氨基酸的抗體可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域連接到一起是可能的。最重要的特 征是每個結(jié)構(gòu)域與互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域締合形成一個抗原_結(jié)合位點(diǎn)的能力。來自經(jīng)選擇的來源的\和Vh結(jié)構(gòu)域可被插入到具有功能性人類恒定結(jié)構(gòu)域的嵌 合抗體上。本發(fā)明的抗體也可以被“人源化”，包含一個或多個移植到人構(gòu)架區(qū)(FRs)的源 自非人類的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)?；蛘?，人結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體可以由轉(zhuǎn)基因動物獲得，未重排 的人Ig基因片段被引入到其中，并且將其中的內(nèi)源小鼠Ig基因滅活(綜述于Brilggemarm 和Taussig (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8，455-458)。由這種小鼠產(chǎn)生的單克隆抗體是人 抗體?？贵w的功能性等價(jià)物也是本發(fā)明考慮的，其包括具有與全長抗體可變或高變區(qū)氨 基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽。這里“基本相同的”氨基酸序列定義為與另一種氨 基酸序列具有至少70%、優(yōu)選至少約80%、更優(yōu)選至少約90%同源性的序列，其通過根據(jù) Pearson 和 Lipman，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85，2444-8 (1988)的 FASTA 檢索方法確定。 本發(fā)明的抗體也包括那些結(jié)合性質(zhì)(例如親和性和特異性)通過直接突變、親和力成熟方 法、噬菌體展示或者鏈改組(chain shuffling)得到改善的抗體。優(yōu)選使用抗體或抗體混合物作為胞外RTK拮抗物?？贵w結(jié)合到胞外結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選中和RTK激活，比如通過阻止受體二聚化和/或配體結(jié)合。胞外RTK拮抗物更優(yōu)選是EGFR 抗體。這種EGFR抗體的一個例子是cetuximab (IMC-C225)，它是一種嵌合的(人/ 小鼠)IgG單克隆抗體。參見例如美國專利No. 4，943，533 (Mendelsohn等)；美國專 利 No. 6, 217, 866(Schlessinger 等)；美國申請 Nos. 08/973, 065(Goldstein 等)和 09/635，974 (Teufel) ；WO 99/60023 (Waksal 等)和 WO 00/69459。cetuximab 特異性結(jié)合 到EGFR上并阻止配體例如EGF的結(jié)合。這種阻斷干擾了 EGFR激活的效果，結(jié)果抑制了腫 瘤的生長、腫瘤的侵入、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞修復(fù)和血管發(fā)生。另外，或作為其它可能，cetuximab可 能促進(jìn)受體_抗體復(fù)合物的內(nèi)化，防止受體通過其配體或任何其它機(jī)制被進(jìn)一步刺激。EGFR抗體的另外一個例子是ABX-EGF，它是一種特異于EGFR的全人IgG2單克隆抗 體。ABX-EGF以很高的特異性與EGFR結(jié)合，阻止EGFR結(jié)合到它的兩個配體EGF和TGF- α 上。參見例如Figlin等2001年5月12-15日在舊金山，CA，ASCO的第37屆年會上發(fā)表的摘 要1102。ABX-EGF的序列和特征記載于美國專利No. 6，235，883 (Abgenix, Inc.)第28欄62 行到第29欄36行以及附圖
29-34，以前作為克隆E7. 6. 3被公知。參見Yang等，Critical Rev. Oncol. /Hematol.，38(1) 17—23，2001。Herceptin (司徒曼布)是一種重組的DNA-來源的人源化單克隆抗體，其在 基于細(xì)胞的分析中以高親和力(5nM的Kd)選擇性地結(jié)合到人EGFR2蛋白質(zhì)HER2的胞外結(jié) 構(gòu)域上。該抗體是一種含有人構(gòu)架區(qū)的IgG1 kappa，并具有結(jié)合到HER2上的鼠抗體(4D5) 的互補(bǔ)決定區(qū)。參見例如國際專利公開No. WO 01/89566 (Mas s)?？梢杂米鞲鶕?jù)本發(fā)明的胞外RTK的其它EGFR抗體包括EMD 72000 (Merck KGaA)， 它是一種鼠抗-EGFR單克隆抗體EMD 55900的人源化型式；h_R3 (TheraCIM)，它是一種人 源化的抗-EGFR單克隆抗體；Y10，它是一種鼠單克隆抗體，是通過抗人EGFRvIII突變的鼠 同源物而產(chǎn)生的。參見美國專利 Nos. 5，558，864 (Bendig 等)，5，884，093 (Kettleborough 等)，5，891，996(Mateo de Acosta del Rio 等)。根據(jù)本發(fā)明的胞外RTK拮抗物也可以是VEGFR抗體。產(chǎn)生VEGFR抗體的細(xì)胞系 包括產(chǎn)生大鼠抗-小鼠VEGFR-2單克隆抗體的DC101雜交瘤細(xì)胞系(ATCC HB 11534)； 產(chǎn)生小鼠抗_小鼠VEGFR-2單克隆抗體MAb25的M25. 18A1雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞系(ATCC HB 12152)；產(chǎn)生小鼠抗-小鼠VEGFR-2單克隆抗體MAb 73的M73. 24雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞系 (ATCC HB12153)；以及產(chǎn)生結(jié)合到可溶的、細(xì)胞表面-表達(dá)的VEGFR-I上的MAb6. 12的細(xì) 胞系(ATCC PTA-3344)。其它產(chǎn)生抗-VEGFR-I抗體的雜交瘤細(xì)胞包括但不限于雜交瘤細(xì) 胞 KMl73O (保藏為 FERM BP-5697) ；KM1731 (保藏為 FERM BP-5718) ；KM1732 (保藏為 FERM BP-5698) ；KM1748(保藏為 FERM BP-5699)；以及 KM1750 (保藏為 FERM BP-5700)，它們記載 于WO 98/22616,WO 99/59636、澳大利亞受理的申請no. AU1998 50666 B2以及加拿大申請 no. CA 2328893。VEGFR-2 特異性抗體的更多例子包括 IMC-1C11(參見 WO 00/44777 (Zhu 等)；WO 01/90192 (Zhu))和 IMC-2C6 (參見 Lu 等，2002 ；PCT/US02/20332 (Zhu))。其它VEGFR拮抗物是本領(lǐng)域公知的。VEGFR拮抗物的一些例子記載于美國申 請 Nos.07/813，593 ；07/906，397 ；07/946，507 ；07/977，451 ；08/055，269 ；08/252，517 ； 08/601, 891 ；09/021, 324 ；09/208, 786 和 09/919，408(均由 Lemischka 等申請)； 美國專禾Ij No. 5, 840, 301 (Rockwell 等)；美國申請 Nos. 08/706, 804 ；08/866，969 ；08/967，113 ；09/047, 807 ；09/401, 163 和 09/798，689(均由 Rockwell 等申請)；美國申請 No. 09/540, 770 (Witte 等)和 PCT/US01/06966 (Liao 等)。美國專利 No. 5, 861, 301 (Terman 等)，Terman 等 Oncogene 6 1677-1683 (1991 年 9 月)，WO 94/10202(Ferrara 等) 和TO 95/21865 (Ludwig)披露了 VEGFR拮抗物特別是抗-VEGFR-2抗體。另外，PCT/ US95/01678 (Kyowa Hakko)記載了抗-VEreR-2抗體?？?VEGFR抗體也記載于美國申請 No. 09/976, 787 (Zhu 等)。美國專利 Nos. 6，177，401 (Ullrich 等)、5，712，395 (App 等)和 5，981，569 (App等)記載了為有機(jī)分子的VEGFR抗體。此外，針對KDR和VEGFR-I的雙特異 性抗體(BsAbs)是公知的，它們是具有兩種不同抗原-結(jié)合特異性或位點(diǎn)的抗體。參見例 如美國申請 No. 09/865, 198 (Zhu) ；60/301, 299 (Zhu)。一種特定的 VEGF 拮抗物是 Avast in (bevacizumab，Genentech)，是一種重組的、 抗VEGF的人源化的單克隆抗體(rhuMAb-VEGF)。被設(shè)計(jì)來結(jié)合并抑制VEGF的Avastin參 與轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的III期臨床研究，其主要終點(diǎn)是改善總體存活率。胞內(nèi)RTK拮抗物優(yōu)選小分子。小分子的一些例子包括有機(jī)化合物、有機(jī)金屬化合 物、有機(jī)化合物和有機(jī)金屬化合物的鹽、以及無機(jī)化合物。小分子中的原子通過共價(jià)鍵和離 子鍵連接在一起；前者對于諸如小分子酪氨酸激酶抑制劑的小有機(jī)化合物來說是典型的， 而后者是小無機(jī)化合物的典型。原子在小有機(jī)分子中的排列可能表現(xiàn)為鏈，例如碳_碳鏈 或碳_雜原子鏈，或者可能表現(xiàn)為含有碳原子的環(huán)，例如苯或多環(huán)體系，或是碳和雜原子的 組合，即諸如嘧啶或喹唑啉的雜環(huán)。盡管小分子可以具有任何分子量。但是它們通常包括 不被認(rèn)為是生物分子的分子，除非它們的分子量不大于650D。小分子既包括自然界發(fā)現(xiàn)的 化合物如激素、神經(jīng)遞質(zhì)、核苷酸、氨基酸、糖、脂及其衍生物，也包括由傳統(tǒng)的有機(jī)合成、生 物介導(dǎo)的合成或它們的組合而合成制備的化合物。參見例如Ganesan，Drug Discov. Today 7(1) 47-55(2002 年 1 月)；Lou, Drug Discov. Today, 6 (24) :1288_1294 (2001 年 12 月)。用來作為根據(jù)本發(fā)明的胞內(nèi)RTK拮抗物的小分子更優(yōu)選是一種與ATP競爭結(jié)合 到具有激酶結(jié)構(gòu)域的EGFR胞內(nèi)結(jié)合區(qū)域上或結(jié)合到參與EGFR激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋 白質(zhì)上的胞內(nèi)EGFR拮抗物。這種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的例子包括ras-促分裂原活化的蛋白激 酶(MAPK)途徑、磷脂酰肌醇_3激酶(PI3K)-Akt途徑、應(yīng)激活化的蛋白激酶(SAPK)途徑以 及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物和轉(zhuǎn)錄激活劑(STAT)途徑。參與這種途徑的蛋白質(zhì)(根據(jù)本發(fā)明的小分子 EGFR拮抗物可以結(jié)合到其上)的非限制性例子包括GRB-2、SOS、Ras、Raf、MEK, MAPK和基 質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)。小分子EGFR拮抗物的一個例子是IRESSA (ZD1939)，它是一種作為ATP-模擬物 抑制EGFR起作用的喹唑啉衍生物。參見美國專利No. 5，616，582 (Zeneca Limited) ；WO 96/33980 (Zeneca Limited)第 4 頁；也可參見 Rowinsky 等 2001 年 5 月 12-15 日在舊金山， CA舉行的ASCO第37屆年會上發(fā)表的摘要5 ;Anido等2001年5月12-15日在舊金山，CA 舉行的ASCO第37屆年會上發(fā)表的摘要1712。小分子EGFR拮抗物的另外一個例子是TARCEVA (0SI-774)，它是一種4_(取代的 苯基氨基)喹唑啉衍生物[6，7-雙(2-甲氧基-乙氧基)_喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯 基)胺鹽酸鹽JEGFR抑制劑。參見W096/30347 (Pfizer Inc.)例如第2頁12行到第4頁 34 行以及第 19 頁 14-17 行。也可參見 Moyer 等，Cancer Res. ,57 4838-48 (1997) ；Pollack 等，J. Pharmacol.，291 :739_48 (1999)。TARCEVA 可以通過抑制EGFR的磷酸化及其下游的導(dǎo)致p27-介導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯的PI3/Akt和MAP(促分裂原活化的蛋白)激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途 徑來起作用。參見Hidalgo等在2001年5月12-15日在舊金山，CA舉行的ASCO第37屆 年會上發(fā)表的摘要281。據(jù)報(bào)導(dǎo)其它小分子也可以抑制EGFR，其中的許多被認(rèn)為結(jié)合到EGFFR的酪氨 酸激酶結(jié)構(gòu)域上。這些小分子包括三環(huán)化合物，諸如在美國專利No. 5，679，683中記載 的化合物；喹唑啉衍生物，諸如在美國專利No. 5，616，582中記載的衍生物；以及吲哚化 合物，諸如在美國專利No. 5，196，446中記載的化合物。這種小分子EGFR拮抗物的例子 記載于 WO 91/116051、WO 96/30347、WO 96/33980、WO 97/27199 (Zeneca Limited)、WO 97/30034(Zeneca Limited),WO 97/42187(Zeneca Limited),WO 97/49688(Pfizer Inc.)、 WO 98/33798(Warner Lambert Company)> WO 00/18761(American Cyanamid Company)禾口 WO 00/31048 (Warner Lambert Company)。天然來源的EGFR酪氨酸激酶抑制劑包括染料木 黃酮、除莠霉素A、槲皮素和制表菌素。特定的小分子EGFR拮抗物的例子包括Cl-1033 (Pfizer)，它是一種酪氨酸激 酶，特別是EGFR的喹唑啉(N- [4- (3-氯-4-氟-苯基氨基)-7- (3-嗎啉_4_基-丙氧 基)-喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺)抑制劑，其記載于WO 00/31048第8頁22-26行； PKI166 (Novartis)，它是EGFR的吡咯并嘧啶抑制劑，其記載于WO 97/27199第10-12頁； GW2016 (GlaxoSmithKline)，它是 EGFR 和 HER2 的抑制劑；EKB569 (Wyeth)，據(jù)報(bào)導(dǎo)它可以 抑制在體內(nèi)或體外過量表達(dá)EGFR或HER2的腫瘤細(xì)胞的生長；AG-1478 (Tryphostin)， 它是一種抑制來自EGFR和erbB-2的信號傳遞的喹唑啉小分子；AG-1478 (Sugen， Pharmacia andRepligen)，它是一種也能抑制蛋白激酶CK2的雙底物抑制劑； PD153035 (Parke-Davis)，據(jù)報(bào)導(dǎo)它可以抑制EGFR激酶活性和腫瘤生長，誘導(dǎo)培養(yǎng)中細(xì)胞 的凋亡，并增強(qiáng)化療劑的細(xì)胞毒性；SPM-924(SchwarZPharma)，它是一種用于治療前列腺 癌的酪氨酸激酶抑制劑；CP-546，989 (OSI Pharmaceut ical s)，據(jù)報(bào)導(dǎo)它是一種治療實(shí)體 瘤的抑制劑；ADL-681，它是一種用于治療癌癥的EGFR激酶抑制劑；PD158780，據(jù)報(bào)導(dǎo)它 是一種可以在小鼠體內(nèi)抑制A4431異種移植腫瘤生長速度的吡咯并嘧啶；CP-358、774， 據(jù)報(bào)道它是一種可以抑制在小鼠體內(nèi)HN5異種移植的自身磷酸化的喹唑啉；ZD1839，據(jù) 報(bào)導(dǎo)它是一種在小鼠異種移植模型包括陰門、NSCLC、前列腺、卵巢和結(jié)直腸癌中具有抗 腫瘤活性的喹唑啉；CGP 59326A，據(jù)報(bào)導(dǎo)它是一種抑制小鼠體內(nèi)EGFR-陽性的異種移植 物生長的吡咯并嘧啶；PD 165557 (Pfizer) ； CGP54211 和 CGP53353 (Novartis)，它們是 dianiInophthalimides ο胞內(nèi)TRK拮抗物也可以是ras蛋白的抑制劑，ras蛋白是一種參與EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 途徑的蛋白質(zhì)。這種抑制劑能夠靶向法尼基轉(zhuǎn)移酶，一種可以激活ras蛋白的酶，這種抑 制劑包括例如Rl 15777 Zamestra(Ortho-Biotech)，它被用來與吉西他濱(gemcitabine) 聯(lián)合治療ras-依賴性腫瘤；SCH66336 (Schering Plough)，據(jù)報(bào)導(dǎo)用于治療各種實(shí)體瘤，包 括轉(zhuǎn)移性膀胱癌、晚期胰腺癌以及頭頸部鱗狀細(xì)胞癌；BMS-214662 Ptase (Bristol-Myers Squibb)，據(jù)報(bào)導(dǎo)用于治療急性白血病、骨髓發(fā)育異常綜合征以及慢性髓細(xì)胞白血??； L-778，123 (Merck)，它是一種肽模擬法尼基蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移酶(FPTase)抑制劑，據(jù)報(bào)導(dǎo)用于治 療復(fù)發(fā)性或難治的實(shí)體瘤；CP-609-754(0SIPharmaceuticals and Pf izer)，它是一種 ras 法尼基化抑制劑，據(jù)報(bào)導(dǎo)用于治療實(shí)體瘤癌癥；以及AZD-3409 (AstraZeneca)，它是一種用于治療實(shí)體瘤的法尼基蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移酶抑制劑。胞內(nèi)RTK拮抗物也可以是ras-raf 調(diào)節(jié)劑，諸如 43-9006 (Onyx Pharmaceuticals/ Bayer)，它是一種靶向ras基因具有突變的細(xì)胞以抑制raf激酶并阻斷ras信號傳 遞途徑來治療結(jié)腸、肺、胰腺和其它癌癥以及其它增殖性疾病的小分子；ras拮抗物 FTS(Thyreos),據(jù)報(bào)導(dǎo)可使突變r(jià)as蛋白質(zhì)失活用于治療黑素瘤、胰腺、結(jié)腸、肺、乳腺以及 其它癌癥。不必是小分子和/或僅特異于EGFR的拮抗物的胞內(nèi)RTK拮抗物的其它例子是 苯乙烯基-取代的雜芳基化合物，諸如記載于美國專利No. 5，656，655中的化合物；雙 單-以及二環(huán)芳基和雜芳基化合物，諸如記載于美國專利No. 5，646，153中的化合物；在 Fry 等(265 Sciencel093_1095 (1994 年八月))記載的 PD 153035 ；諸如那些在 Osherov 等 (J. Biol. Chem.，Vol. 268，No. 15pp. 11134-11142(1993))中記載的 tyrphostins ；以及在 Panek 等(J. Pharm and Exp. Therapeutics, Vo. 283, No. 3, pp. 1433-1444(1997))中記載的 PD166285 (6-芳基-pyriodo [2, 3-d]嘧啶)。胞內(nèi)RTK拮抗物也可以是小分子VEGFR拮抗物，諸如AXD-6474 (AstraZeneca)，據(jù) 報(bào)導(dǎo)它是一種血管發(fā)生抑制劑；CEP-5214，它是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑；或者ZD-6474，它是 一種VEGFR酪氨酸激酶的抑制劑，據(jù)報(bào)導(dǎo)它破壞血管發(fā)生的信號傳遞途徑用于治療晚期實(shí) 體瘤。上述胞外和胞內(nèi)RTK拮抗物僅僅是例證性的，其它抑制酪氨酸激酶活性的胞外和 胞內(nèi)RTK拮抗物對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的和/或容易鑒別的，因此也在本發(fā)明的范 圍之內(nèi)。要鑒別其它這樣的拮抗物，可以進(jìn)行各種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的酪氨酸激酶抑制 分析。例如，因?yàn)楸景l(fā)明的拮抗物通常參與磷酸化事件的抑制或調(diào)節(jié)，所以磷酸化分析 可能對確定在本發(fā)明上下文有用的拮抗物方面是有用的。這種分析可以檢測重組激酶受體 的自磷酸化水平和/或天然或合成底物的磷酸化。磷酸化可以通過例如在ELISA分析或 western印跡中使用磷酸酪氨酸特異性的抗體來檢測。這種確定酪氨酸激酶活性的磷酸化 分析在 Panek 等，J. Pharmacol. Exp. Thera.，283 1433-44 (1997)和 Batley 等，Life Sci.， 62:143-50(1998)中描述過。諸如那些用于磷酸化和ELISA分析的常規(guī)分析的詳細(xì)描述可 以從許多出版物上獲得，包括 Sambrook，J.等，(1989)Molecular Cloning =ALaboratory Manual, 2nd ed. ,Cold Spring Harbor Laboratory Press。此外，可以利用檢測蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，其中被測定的蛋白質(zhì)由酪氨酸激酶活性 調(diào)節(jié)。這些方法包括用于檢測蛋白質(zhì)表達(dá)的免疫組織化學(xué)(IHC)、用于檢測基因擴(kuò)增的 熒光原位雜交(FISH)、競爭性放射性配體結(jié)合分析、諸如Northern和Southern印跡的 固體基質(zhì)印跡技術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)以及ELISA。參見例如Grandis 等，Cancer, 78 1284-92. (1996) ；Shimizu 等，Japan J. Cancer Res. ,85 :567_71 (1994)； Sauter 等，Am. J Path.，148 1047-53 (1996) ；Collins, Glia, 15 :289_96 (1995) ；Radinsky 等，Clin. Cancer Res.，1 :19_31(1995) ；Petridesetal.，CancerRes. ,50 :3934_39 (1990)； Hoffmann 等，Anticancer Res. ,17 4419-26 (1997) ；Wikstrand 等，Cancer Res. ,55 3140-48(1995)。也可以利用體內(nèi)分析來檢測酪氨酸激酶抑制。例如，受體酪氨酸激酶抑制可以通過使用受體配體刺激的細(xì)胞系在存在抑制劑和沒有抑制劑的情況下的促有絲分裂分析來 觀察。例如，VEGF刺激的HUVEC細(xì)胞可以用來分析VEGFR抑制。另外一種方法涉及測試表 達(dá)EGFR或VEGF的腫瘤細(xì)胞的生長抑制，使用例如注入小鼠體內(nèi)的人腫瘤細(xì)胞。參見美國 專利 No. 6，365，157 (Rockwell 等).另一方面，本發(fā)明提供通過給予治療有效量的胞外RTK拮抗物和胞內(nèi)RTK拮抗物 治療哺乳動物酪氨酸激酶_依賴性疾病和狀況的方法。治療這些狀況和失調(diào)包括減少酪氨 酸激酶依賴性疾病的影響，預(yù)防、抑制酪氨酸激酶依賴性疾病的擴(kuò)散，或減輕酪氨酸激酶依 賴性疾病的癥狀。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能很容易地使用公知的常規(guī)測試來診斷這種狀況和失調(diào)。給予胞外和胞內(nèi)RTK拮抗物包括通過任何可以達(dá)到所追求結(jié)果的方法把RTK拮抗 物送遞給哺乳動物。RTK拮抗物可以例如口服、經(jīng)腸道外(靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi))、局部給藥、經(jīng) 皮或吸入給藥。胞外RTK拮抗物和胞內(nèi)RTK拮抗物可以同時(shí)或順序給藥。這里所使用的術(shù) 語哺乳動物打算包括但不限于人、實(shí)驗(yàn)動物、家養(yǎng)寵物以及家畜。給予治療有效量的意思是 當(dāng)給予哺乳動物本發(fā)明的化合物的量能有效產(chǎn)生期望的治療效果，例如抑制激酶活性。盡管不打算限定到任何特定的機(jī)制上，可以由本發(fā)明的方法治療或預(yù)防的疾病和 狀況包括與細(xì)胞增殖有關(guān)的疾病和狀況，諸如腫瘤、心血管病、炎癥以及其它增殖性疾病。 可以治療的腫瘤包括原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤、以及難治的腫瘤。難治的腫瘤包括那些對單獨(dú) 用化學(xué)治療劑、單獨(dú)用抗體、單獨(dú)放射或者它們的組合治療沒有反應(yīng)或者有抗性的腫瘤。難 治的腫瘤也包括那些看起來被用這種試劑的治療所抑制的腫瘤，但是又在停止治療后最多 5年復(fù)發(fā)，有時(shí)最多10年或更長。此外，可以用本發(fā)明的胞外和胞內(nèi)RTK拮抗物治療的腫瘤包括那些以正常水平表 達(dá)RTKs并以RTK活性的正常水平為特征的腫瘤。拮抗物對治療過量表達(dá)RTKs的腫瘤也有 用，例如正常水平的10、100或1000倍的水平。這種過量表達(dá)可能是因?yàn)槔缡荏w基因擴(kuò) 增、轉(zhuǎn)錄增加或者蛋白質(zhì)更新降低(受體穩(wěn)定性增加)。此外，本發(fā)明的拮抗物適用于治療因?yàn)槔鐝膶?dǎo)致不受調(diào)節(jié)的受體活性的突變產(chǎn) 生的受體信號傳遞缺失而顯示出增加的RTK活性的腫瘤。這種突變受體可以不依靠配體 結(jié)合來刺激。參見例如 Pedersen 等，Ann. Oncol.，12 (6) :745_60 (2001)。(III 型 EGFR 突 變——不同地命名為EGFRvIII、de2-7EGFR或AEGFR——缺少由外顯子2_7編碼的胞外配 體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一部分)；也可以參見Wikstrand等，CancerRes. ,55 :3140_8 (1995)。例如EGFR的增強(qiáng)活性和過量表達(dá)經(jīng)常與腫瘤的進(jìn)展相關(guān)，腫瘤細(xì)胞膜上的EGF 受體的擴(kuò)增和/或過量表達(dá)與對化療和放射抗性的低反應(yīng)速度相關(guān)聯(lián)。在另外一個例子 中，在25% -30%原發(fā)性乳腺癌中觀察到了 HER2蛋白質(zhì)的過量表達(dá)，其可通過使用IHC分 析確定(例如Here印Test )，基因擴(kuò)增可通過使用固定腫瘤塊的FISH分析確定(例如 PathVysion )。因此，使用本發(fā)明的胞外和胞內(nèi)拮抗物可治療的、表達(dá)EGFR并由EGFR配體刺激的 腫瘤包括癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肉瘤、腺癌、腺肉瘤、以及腺瘤。這樣的腫瘤基本上可發(fā)生于身體 的所有部分，包括例如乳腺、心臟、肺、小腸、結(jié)腸、脾、腎、膀胱、頭頸部、卵巢、前列腺、腦、胰 腺、皮膚、骨、骨髓、血液、胸腺、子宮、睪丸、子宮頸或者肝臟。可根據(jù)本發(fā)明治療的、觀察到 過量表達(dá)EGFR的腫瘤包括但不限于結(jié)直腸以及頭頸部腫瘤，特別是頭頸部的鱗狀細(xì)胞癌，諸如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的腦部腫瘤，以及肺部、乳腺、胰腺、食道、膀胱、腎臟、卵巢、子宮頸和前 列腺的腫瘤。觀察到具有組成型活性的(即不受調(diào)節(jié)的)受體酪氨酸激酶活性的腫瘤的非 限制性例子包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌以及前列腺癌。本發(fā)明的胞外和胞內(nèi)RTK拮抗物也對治療表達(dá)VEGF受體特別是KDR的腫瘤有用。 這種腫瘤的特點(diǎn)是對存在于它們環(huán)境中的VEGF敏感，并且進(jìn)一步地可能是在自分泌激發(fā) 環(huán)中產(chǎn)生和由VEGF刺激的。因此該方法對治療沒有血管形成或沒有充分的血管形成的實(shí) 體或非實(shí)體腫瘤有效?？梢赃@樣治療的實(shí)體腫瘤的例子包括乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺 癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和淋巴瘤。非實(shí)體腫瘤的例子包括白血病、多發(fā)性骨髓瘤和淋巴瘤。白血病 的一些例子包括急性髓細(xì)胞白血病(AML)、慢性髓細(xì)胞白血病(CML)、急性淋巴細(xì)胞白血病 (ALL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、紅細(xì)胞白血病或單核細(xì)胞白血病。淋巴瘤的一些例子包 括何杰金氏(Hodgkin' s)和非何杰金氏淋巴瘤。本發(fā)明的胞外和胞內(nèi)RTK拮抗物也可用于抑制血管發(fā)生。血管內(nèi)皮細(xì)胞的VEGFR 刺激與生血管疾病和腫瘤的血管形成有關(guān)。典型地，血管內(nèi)皮是以旁分泌方式由來自其它 來源(例如腫瘤細(xì)胞)的VEGF激發(fā)的。因此，本發(fā)明的方法可以有效治療具有血管化腫瘤 或贅生物或生血管疾病的患者。這樣的腫瘤和贅生物包括例如惡性腫瘤和贅生物，諸如母 細(xì)胞瘤、癌或肉瘤，以及高度的血管瘤和贅生物?？捎杀景l(fā)明的方法治療的癌癥包括例如 腦、泌尿生殖道、淋巴系統(tǒng)、胃、腎、結(jié)腸、咽喉和肺和骨的癌癥。非限制性的例子進(jìn)一步包括 表皮樣瘤、鱗狀細(xì)胞瘤、諸如頭頸部的瘤、結(jié)直腸瘤、前列腺瘤、乳腺瘤、肺腫瘤、包括肺部腺 癌以及小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺腫瘤、胰腺瘤、甲狀腺瘤、卵巢瘤以及肝瘤。本發(fā)明的方法也可用于治療血管化皮膚癌，包括鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、以及可 通過抑制諸如人惡性角化細(xì)胞的惡性角化細(xì)胞生長而被治療的皮膚癌。其它可被治療的癌 癥包括卡波西肉瘤、CNS贅生物(成神經(jīng)細(xì)胞瘤、毛細(xì)血管成血管細(xì)胞瘤、腦膜瘤以及腦轉(zhuǎn) 移瘤)、黑素瘤、胃腸道和腎癌及肉瘤、橫紋肌肉瘤、包括多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的成膠質(zhì)細(xì)胞 瘤以及平滑肌肉瘤。本方面也考慮可使用胞外和胞內(nèi)RTK拮抗物來治療或預(yù)防以過量的血管發(fā)生 為特征的病理狀況，包括例如血管發(fā)生和/或炎癥，諸如動脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (RA)、新生血管性青光眼、增殖性視網(wǎng)膜病包括增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑變性、血管 瘤、血管纖維瘤以及牛皮癬。其它非贅生性血管發(fā)生性疾病的非限制性例子是早發(fā)性視網(wǎng) 膜病(晶狀體后纖維瘤)、角膜移植排斥、胰島素依賴性糖尿病、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、 克隆氏病、自身免疫性腎炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、急性胰腺炎、同種異體移植排斥、過敏性 炎癥、接觸性皮炎和遲發(fā)型超敏反應(yīng)、炎性腸病、感染性休克、骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、由神 經(jīng)性炎癥誘發(fā)的認(rèn)知缺陷、Osier-Weber綜合征、再狹窄，以及真菌性、寄生蟲性和病毒性感 染包括巨細(xì)胞病毒感染。上述疾病和狀況僅僅是例證性的，本發(fā)明的方法不限于僅治療例 證性疾病和狀況，也包括可被激酶調(diào)節(jié)治療的任何疾病或狀況。此外，體內(nèi)和體外使用本發(fā)明的化合物用于現(xiàn)有技術(shù)公知的研究或診斷方法也包 括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的另一方面涉及藥物組合物，該組合物含有本發(fā)明的拮抗物或其藥學(xué)上可 接受的鹽、水合物或前藥，并與藥學(xué)上可接受的載體組合。這種組合物可以是胞外RTK拮抗 物和胞內(nèi)RTK拮抗物的分開的組合物，或是一種既含有胞外又含有胞內(nèi)RTK拮抗物的單一
12組合物。本發(fā)明的組合物可以是固體或液體形式(溶液或懸浮液)。給藥途徑包括例如口 服、經(jīng)腸道外(靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi))、局部給藥、經(jīng)皮以及通過吸入給藥。對于口服給藥，RTK拮抗物可以以例如帶有惰性稀釋液或可吸收載體的液體形式 給藥，或者混合到固體劑型中?？诜后w和固體劑型的例子包括例如溶液、懸浮液、糖漿、乳 狀液、片劑、錠劑、膠囊(包括軟明膠膠囊)以及類似物?？诜┬涂膳渲瞥沙掷m(xù)釋放產(chǎn)品， 其使用例如包衣來延遲分解或控制活性化合物的擴(kuò)散。必要時(shí)，組合物也可以包括增溶劑。可注射劑型的例子包括無菌的可注射液體，包括例如溶液、乳狀液和懸浮液?？勺?射劑型進(jìn)一步包括固體，例如注射前在液體中重配、溶解或懸浮的無菌粉末。無菌的可注射 溶液的制備通過將需要的量的RTK拮抗物與上文列舉的各種其它成分在適當(dāng)溶劑中混合、 接著根據(jù)需要進(jìn)行過濾滅菌。載體典型地包括例如無菌水、鹽水、可注射的有機(jī)酯、花生油、 蔬菜油以及類似物。緩沖試劑、防腐劑以及類似物可以以可給藥的形式包括在內(nèi)。無菌制 劑的制備可通過加熱、輻射、微過濾、和/或通過加入各種殺菌劑和殺真菌劑，例如對羥基 苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞以及類似物。對于局部給藥，本發(fā)明的RTK拮抗物可例如以凝膠、霜劑、或軟膏劑、或涂劑的形 式給藥。用于這種應(yīng)用的代表性載體包括疏水的或親水的基料、油質(zhì)的或含醇的液體、以及 干粉。RTK拮抗物也可加入到凝膠或基質(zhì)中用于藥膏，任選地提供了用于化合物通過皮膚屏 障的受控釋放。RTK拮抗物也可經(jīng)公知方法配制成用于直腸給藥。對于經(jīng)吸入給藥，本發(fā)明的RTK拮抗物可溶于或懸浮于或者吸附于合適的載體， 用于噴霧器、氣霧劑或干粉吸入器中。合適的劑量可以由醫(yī)師或合格的醫(yī)學(xué)專業(yè)人員確定，并取決于諸如治療的疾病 的性質(zhì)、給藥途徑、治療持續(xù)時(shí)間以及患者狀況這樣的因素。本發(fā)明的RTK拮抗物按所需 的頻次給藥以獲得期望的治療效果。給藥頻次將取決于例如使用的劑型的性質(zhì)以及治療 的疾病。當(dāng)前的胞外EGFR拮抗物的典型劑量是400mg/m2加載量、250mg/m2每周的輸注 (cetuximab) ； 1. 5mg/kg每周的輸注(ABX-EGF)；以及作為90分鐘輸注的4mg/kg加載劑量 以及作為30分鐘輸注的2mg/kg的維持劑量(司徒曼布)。當(dāng)前的胞內(nèi)EGFR拮抗物的典型 劑量是250mg/天口服給藥(Iressa) ； 150mg/天口服給藥(Tarceva)；以及560mg/周口服 給藥(CI-1033)。因?yàn)楸景l(fā)明提供了可以通過兩種不同的獨(dú)立機(jī)制起作用的治療，這樣的治療就提 供了與單獨(dú)給予胞外拮抗物或胞內(nèi)拮抗物相比增強(qiáng)的或者協(xié)同的腫瘤抑制效果。而且，因 為本發(fā)明提供了用胞外RTK拮抗物和胞內(nèi)RTK拮抗物進(jìn)行的治療，治療有效劑量可以比單 獨(dú)的胞外RTK拮抗物或者單獨(dú)的胞內(nèi)RTK拮抗物的治療有效劑量低。不象當(dāng)前的治療為抑制腫瘤生長需要連續(xù)給藥，本發(fā)明的聯(lián)合治療允許胞外和胞 內(nèi)RTK拮抗物的間斷給藥來抑制腫瘤生長。例如，兩次治療可以同時(shí)給藥。或者，兩次治療 可以順序給藥。而且，兩次治療還可以周期性給藥。這樣，兩種拮抗物可以在一段時(shí)間后同 時(shí)給藥，然后單獨(dú)給予一種或者另一種。當(dāng)然，可以使用任何給藥組合或順序。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的胞外和胞內(nèi)RTK拮抗物配制成與其它治療活性化 合物共同使用，或者聯(lián)合其它治療技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)行給藥。任何現(xiàn)有技術(shù)中公知的常規(guī)治療 都可以與本發(fā)明的方法聯(lián)合使用。
例如，胞外和胞內(nèi)RTK拮抗物可與一種或多種其它抗腫瘤劑聯(lián)合給藥。參見例 如美國專利No. 6，217，866 (Schlessinger等)(抗EGFR抗體與抗腫瘤劑聯(lián)合)；美國專 利申請No. 09/312，286 (Waksal等)(抗EGFR抗體與放射線聯(lián)合)?？梢允褂萌魏魏线m 的抗腫瘤劑，例如化療劑或放射線。化療劑的例子包括但不限于順鉬(cisplatin)、阿霉 素(doxorubicin)、紫杉醇(paclitaxel)、伊立替康(irinotecan) (CPT-11)、托普泰肯 (topotecan)以及奧沙利鉬(oxaliplatin)或者它們的組合。當(dāng)抗腫瘤劑是放射線時(shí)，放射 源對治療中的患者來說可以是外部的(外部射線放射療法——EBRT)或者內(nèi)部的(短程放 射治療——BT)。給予的抗腫瘤劑的劑量取決于許多因素，包括例如試劑類型、治療的腫瘤 的類型和嚴(yán)重性以及試劑的給藥途徑。然而應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，本發(fā)明不限于任何特定劑量。此外，胞外和胞內(nèi)RTK拮抗物可與一種或多種合適的佐劑聯(lián)合給藥，例如細(xì)胞因 子(例如IL-10和IL-13)或者其它免疫刺激物。參見例如Larriv6e等.，Int' IJ Mol. Med.，5 447-56(2000)。上述說明書中所闡明的僅僅是例證本發(fā)明的，并不打算限制。對所公開的實(shí)施方 式可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行具體表現(xiàn)本發(fā)明的精神和實(shí)質(zhì)的更改，這樣的更改在本發(fā)明 的范圍之內(nèi)。此外，這里引用的所有參考文獻(xiàn)均以其整體引入作為參考。
1權(quán)利要求
在哺乳動物中抑制受體酪氨酸激酶(RTK)的方法，包括給予哺乳動物胞外RTK拮抗物和胞內(nèi)RTK拮抗物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中該方法用于治療哺乳動物中的腫瘤生長或血管發(fā)生。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中RTK是表皮生長因子受體(EGFR)。
4.權(quán)利要求3的方法，其中胞外RTK拮抗物是cetuximab、ABX-EGF,EMD 72000、h_R3 或者ΥΙΟ。
5.權(quán)利要求3的方法，其中胞內(nèi)RTK拮抗物是ZD1939或0SI-774。
6.權(quán)利要求1或2的方法，其中RTK是HER2受體。
7.權(quán)利要求6的方法，其中胞外RTK拮抗物是司徒曼布。
8.權(quán)利要求1或2的方法，其中RTK是血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)。
9.權(quán)利要求8的方法，其中胞外RTK拮抗物是bevacizumab。
10.權(quán)利要求1或2的方法，其中胞內(nèi)RTK拮抗物抑制ras蛋白或ras-raf調(diào)節(jié)劑。
11.權(quán)利要求1-10任何一項(xiàng)的方法，其中該方法進(jìn)一步包括給予抗腫瘤劑。
12.包括胞外RTK拮抗物和胞內(nèi)RTK拮抗物的藥物組合物。
13.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中RTK是表皮生長因子受體(EGFR)。
14.權(quán)利要求13的藥物組合物，其中胞外RTK拮抗物是cetuximab、ABX-EGF,EMD 72000、h-R3 或者 ΥΙΟ。
15.權(quán)利要求13或14的藥物組合物，其中胞內(nèi)RTK拮抗物是ZD1939或0SI-774。
16.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中RTK是HER2受體。
17.權(quán)利要求16的藥物組合物，其中胞外RTK拮抗物是司徒曼布。
18.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中RTK是血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)。
19.權(quán)利要求18的藥物組合物，其中胞外RTK拮抗物是bevacizumab。
20.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中胞內(nèi)RTK拮抗物抑制ras蛋白或ras-raf調(diào)節(jié)劑。
21.權(quán)利要求12-20任何一項(xiàng)的藥物組合物，其中該藥物組合物進(jìn)一步包括抗腫瘤劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用胞外拮抗物和胞內(nèi)拮抗物抑制受體酪氨酸激酶的方法。胞外RTK拮抗物是一種通過與受體的胞外結(jié)合區(qū)域相互作用來抑制受體酪氨酸激酶激活的生物分子或小分子。胞內(nèi)RTK拮抗物是一種通過與具有激酶結(jié)構(gòu)域的受體胞內(nèi)區(qū)域相互作用或者通過與參與受體酪氨酸激酶信號傳遞途徑的胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用來抑制受體酪氨酸激酶的酪氨酸激酶活性的生物分子或小分子。本發(fā)明也提供了通過給予胞外和胞內(nèi)RTK拮抗物的組合來治療酪氨酸激酶-依賴性疾病的方法，以及用于這種方法的組合物。
文檔編號A61K39/385GK101966338SQ20101050593
公開日2011年2月9日 申請日期2004年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月9日
發(fā)明者塞繆爾·瓦克薩爾 申請人:塞繆爾·瓦克薩爾