專利名稱：金絲桃苷的提取方法及其制備藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種金絲桃苷的提取方法及其制備藥物的用途。
背景技術(shù)：
目前流行性感冒病毒日益嚴(yán)重，并且流行性感冒病毒與呼吸道疾病及引起的全身 性疾病密切相關(guān)，我國是流感高發(fā)國家之一，不但人口眾多，而且生活習(xí)慣也有利于流感病 毒的轉(zhuǎn)播，每年人平均發(fā)病次數(shù)達(dá)到0. 3 0. 7次不等，重點(diǎn)人群達(dá)到2 4次。流感對(duì)人 類存在嚴(yán)重威脅，尤其是新發(fā)品種流感病毒，其不但引起繼發(fā)性其它微生物感染，而且會(huì)直 接導(dǎo)致器官破壞和變態(tài)反應(yīng)致人死亡。但目前并沒有有效的治療流行性感冒病毒及其疾病 (流感)的方法和治療手段，如針對(duì)臨床癥狀進(jìn)行炎癥反應(yīng)治療，治標(biāo)不治本。目前最常見 的預(yù)防和治療流行性感冒病毒的方法是使用流感病毒疫苗接種，非特異性抗病毒中藥或西 藥磷酸奧司他韋(達(dá)菲)_神經(jīng)氨酸酶抑制劑。然而流感病毒疫苗預(yù)防接種弊端在于接種 人群有選擇性，不是人人可以接種。此外，流感病毒疫苗保護(hù)率不高，保護(hù)時(shí)間也較短(3 6個(gè)月)。目前大多數(shù)非特異性抗病毒中藥雖然宣稱有抗病毒作用，但是并非針對(duì)流感病 毒，且抗病毒作用機(jī)理不清楚。在我們以往研究的許多種治療外感風(fēng)寒，西醫(yī)所認(rèn)為的感冒 的中藥組方并沒有直接抗流感病毒的作用。簡(jiǎn)單的說，不是所有的治療感冒的中藥組方都 有明確的抑制流感病毒的作用。西藥“磷酸奧司他韋(達(dá)菲，(3R，4R，5S)-4-乙酰胺-5-氨 基-3(1-丙氧乙酯)-1_環(huán)己烯-1羧酸乙酯磷酸鹽)”是神經(jīng)氨酸酶抑制劑，對(duì)流感病毒進(jìn) 入細(xì)胞有特異性抑制作用，但是不僅價(jià)格昂貴，而且有一些患者服用后出現(xiàn)嘔吐、惡心、失 眠、頭痛、腹痛、腹瀉、頭暈、疲勞、鼻塞、咽痛和咳嗽等副反應(yīng)。達(dá)菲是在體內(nèi)被位于肝臟和 腸道的酯酶轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物而起著抑制神經(jīng)氨酸酶作用，如果患者肝臟和腸道器官功 能不正常也將影響其藥效。此外，腎功能不全患者也要慎用。傳統(tǒng)的中醫(yī)學(xué)認(rèn)為山香圓葉具有清熱解毒，利咽消腫，活血止痛。臨床用于乳蛾喉 痹，咽喉腫痛，瘡瘍腫毒，跌撲傷痛；貫葉金絲桃具有舒肝解郁，清熱利濕，消腫止痛。用于情 志不暢，氣滯郁悶，關(guān)節(jié)腫痛，小便不利。金絲桃苷是山香圓葉和貫葉金絲桃的主要成分之 一，金絲桃苷對(duì)心肌缺血再灌注，腦缺血再灌注，腦梗塞都顯示良好的保護(hù)作用，還具有鎮(zhèn) 痛，抗氧化，保護(hù)心肌、肝臟作用。但并未發(fā)現(xiàn)其具有抑制流感病毒感染、復(fù)制的作用，也未 發(fā)現(xiàn)其具有抑制神經(jīng)氨酸酶的作用，并且金絲桃苷是從中藥黃蜀葵花進(jìn)行提取，如申請(qǐng)?zhí)?200810195922. 7中所提到的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種金絲桃苷，其可以抑制流感病毒神經(jīng)氨酸酶水解細(xì)胞表 面唾液酸，導(dǎo)致流感病毒不能與細(xì)胞表面受體結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，以及減少流感病毒在細(xì) 胞內(nèi)的產(chǎn)生，從而有效地針對(duì)性地抑制流感病毒復(fù)制，更重要地是本發(fā)明提供的金絲桃苷 可以克服現(xiàn)有藥物的副反應(yīng)弊端。本發(fā)明提供的所述金絲桃苷的分子式=C21H2tlO12,分子量464. 38，所述金絲桃苷的結(jié)構(gòu)式如下
所述金絲桃苷采用如下的提取方法獲得取山香圓葉或貫葉金絲桃，加5 15倍 量的30% 90%乙醇回流提取1 3次，每次回流提取1 3小時(shí)，濾過；合并濾液，回收 乙醇，水溶液通過大孔吸附樹脂柱洗脫，收集洗脫部分，減壓濃縮，干燥，得金絲桃苷的混合 總苷，經(jīng)分離，合并金絲桃苷流份，結(jié)晶，得到金絲桃苷純品。優(yōu)選的，其中水溶液通過大孔樹脂柱，分別用水、5% 10%乙醇、35% 55%乙 醇、0. 5 1. 5%氫氧化鈉溶液洗脫，收集35% 55%乙醇洗脫部分，減壓濃縮，干燥。優(yōu)選的，其中所述金絲桃苷采用如下的提取方法獲得取山香圓葉，加12倍量 70%乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，濾渣再加10倍量70%乙醇回流提取1. 5小時(shí)，濾過，合并 兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過大孔樹脂柱，分別用水、10%乙醇、45%乙醇、氫氧化 鈉溶液洗脫，收集45%乙醇洗脫部分，減壓濃縮，干燥。優(yōu)選的，其中所述金絲桃苷采用如下的提取方法獲得取山香圓葉，加15倍量 60%乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，濾渣再加9倍量60%乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，合并兩次 提取液，回收乙醇，水溶液通過大孔樹脂柱，分別用水、8%乙醇、40%乙醇、1.2%氫氧化鈉 溶液洗脫，收集40%乙醇洗脫部分，減壓濃縮，干燥。優(yōu)選的，其中所述金絲桃苷采用如下的提取方法獲得取山香圓葉，加9倍量65% 乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，濾渣再加9倍量65%乙醇回流提取1. 5小時(shí)，濾過，合并兩次提 取液，回收乙醇，水溶液通過大孔樹脂柱，分別用水、5%乙醇、35 %乙醇、0. 8%氫氧化鈉溶 液洗脫，收集35%乙醇洗脫部分，減壓濃縮，干燥。優(yōu)選的，其中所述金絲桃苷采用如下的提取方法獲得取山香圓葉，加10倍量 70%乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，濾渣再加8倍量70%乙醇回流提取1. 5小時(shí)，濾過，合并兩 次提取液，回收乙醇，水溶液通過大孔樹脂柱，分別用水、7%乙醇、40%乙醇、1.3%氫氧化 鈉溶液洗脫，收集40%乙醇洗脫部分，減壓濃縮，干燥。優(yōu)選的，其中所述金絲桃苷采用如下的提取方法獲得取山香圓葉，加8倍量65% 乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，濾渣再加7倍量65%乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，合并兩次提取 液，回收乙醇，水溶液通過大孔樹脂柱，分別用水、5%乙醇、45%乙醇、1.4%氫氧化鈉溶液 洗脫，收集45%乙醇洗脫部分，減壓濃縮，干燥。優(yōu)選的，其中所述金絲桃苷采用如下的提取方法獲得取貫葉金絲桃，加12倍量 70%乙醇回流提取1. 5小時(shí)，濾過，濾渣再加10倍量70 %乙醇回流提取1. 5小時(shí)，濾過，合 并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過大孔樹脂柱，分別用水、10%乙醇、45%乙醇、0.6%氫氧化鈉溶液洗脫，收集45%乙醇洗脫部分，減壓濃縮，干燥。優(yōu)選的，其中所述金絲桃苷采用如下的提取方法獲得取貫葉金絲桃，加15倍量 60%乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，濾渣再加9倍量60%乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，合并兩次 提取液，回收乙醇，水溶液通過大孔樹脂柱，分別用水、8%乙醇、40%乙醇、0.9%氫氧化鈉 溶液洗脫，收集40%乙醇洗脫部分，減壓濃縮，干燥。優(yōu)選的，其中所述金絲桃苷采用如下的提取方法獲得取貫葉金絲桃，加9倍量 65%乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，濾渣再加9倍量65%乙醇回流提取1. 5小時(shí)，濾過，合并兩 次提取液，回收乙醇，水溶液通過大孔樹脂柱，分別用水、5%乙醇、35%乙醇、1. 氫氧化 鈉溶液洗脫，收集35%乙醇洗脫部分，減壓濃縮，干燥。優(yōu)選的，其中水溶液通過已處理好的DlOl大孔樹脂柱洗脫，混合總苷經(jīng)硅膠柱層 析、S^hadex LH-20柱層析分離，合并金絲桃苷流份，結(jié)晶，得到金絲桃苷純品。本發(fā)明的另一目的是提供了金絲桃苷制備預(yù)防和治療流感及其并發(fā)癥疾病的藥 物的用途。優(yōu)選的，金絲桃苷用于抑制流感病毒。優(yōu)選的，金絲桃苷用于抑制流感病毒FMl。
優(yōu)選的，金絲桃苷用于抑制神經(jīng)氨酸酶。優(yōu)選的，其并發(fā)癥是指腎功能衰竭。優(yōu)選的，其并發(fā)癥是指脾損傷或/和肺損傷。最后，本發(fā)明還提供了一種金絲桃苷制劑，該制劑以本發(fā)明上述的金絲桃苷為主 要活性成分。本發(fā)明所述的金絲桃苷可以是從含金絲桃苷的各種藥材中如山香圓葉、貫葉金絲 桃中提取獲得金絲桃苷粗品或金絲桃苷單體化合物。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，本發(fā)明的金絲桃苷是有效的抑制神經(jīng)氨酸酶成分，金絲桃苷隨著 使用劑量大小變化，其抑制神經(jīng)氨酸酶活性的能力，即神經(jīng)氨酸酶抑制率的高低也相應(yīng)發(fā) 生變化，并且成正相關(guān)，金絲桃苷能夠通過抑制流感病毒表面神經(jīng)氨酸酶，進(jìn)而抑制流感病 毒進(jìn)入細(xì)胞里面、抑制已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞里面的流感病毒復(fù)制、增殖，從而減少了流感病毒對(duì)細(xì) 胞的感染、生長，以及預(yù)防和治療流感及其并發(fā)癥，還可以抑制流感病毒神經(jīng)氨酸酶水解細(xì) 胞表面唾液酸，導(dǎo)致流感病毒不能與細(xì)胞表面受體結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，以及減少流感病毒 在細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)生，更重要地是本發(fā)明提供的金絲桃苷可以克服現(xiàn)有藥物的副反應(yīng)弊端。而醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究人員無法預(yù)先在不做抑制流感病毒感染、復(fù)制，或抑制神經(jīng)氨 酸酶的實(shí)驗(yàn)的前提下，預(yù)先得知金絲桃苷具有預(yù)防和治療流感病毒性感冒的良好效果，綜 上所述，本發(fā)明提供的金絲桃苷及其用途帶來顯著的技術(shù)效果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1取山香圓葉1000g，W 12倍量70%乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，濾渣再加10倍 量70%乙醇回流提取1. 5小時(shí)，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過已處理好的 DlOl大孔樹脂柱，分別用水、10 %乙醇、45%乙醇、1 %氫氧化鈉溶液洗脫，收集45%乙醇洗 脫部分，減壓濃縮，干燥，得30%以上金絲桃苷的混合總苷，經(jīng)硅膠柱層析、S^hadex LH-20
6柱層析分離，合并金絲桃苷流份，結(jié)晶，得到金絲桃苷(0. 75g，純度98. 5% )純品，經(jīng)分別 與金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品的UV、IR, ESI-MS^iH-NMR, 13C-NMR比較，確定了金絲桃苷的結(jié)構(gòu)。實(shí)施例2取山香圓葉1000g，W 15倍量60%乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，濾渣再加9倍量 60%乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過已處理好的DlOl 大孔樹脂柱，分別用水、8%乙醇、40%乙醇、1. 2%氫氧化鈉溶液洗脫，收集40%乙醇洗脫部 分，減壓濃縮，干燥，得30%以上金絲桃苷的混合總苷，經(jīng)硅膠柱層析、S^hadex LH-20柱層 析分離，合并金絲桃苷流份，結(jié)晶，得到金絲桃苷(0. 82g，純度98.7%)純品，經(jīng)分別與金 絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品的UV、IR, ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR比較，確定了金絲桃苷的結(jié)構(gòu)。實(shí)施例3取山香圓葉lOOOg，加9倍量65%乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，濾渣再加9倍量65% 乙醇回流提取1. 5小時(shí)，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過已處理好的DlOl大 孔樹脂柱，分別用水、5%乙醇、35%乙醇、0.8%氫氧化鈉溶液洗脫，收集35%乙醇洗脫部 分，減壓濃縮，干燥，得30%以上金絲桃苷的混合總苷，經(jīng)硅膠柱層析、S^hadex LH-20柱層 析分離，合并金絲桃苷流份，結(jié)晶，得到金絲桃苷(0. 73g，純度98.4% )純品，經(jīng)分別與金 絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品的UV、IR, ESI-MS^iH-NMR, 13C-NMR比較，確定了金絲桃苷的結(jié)構(gòu)。實(shí)施例4取山香圓葉lOOOg，加10倍量70%乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，濾渣再加8倍 量70%乙醇回流提取1.5小時(shí)，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過已處理好 的DlOl大孔樹脂柱，分別用水、7%乙醇、40%乙醇、1. 3%氫氧化鈉溶液洗脫，收集40%乙 醇洗脫部分，減壓濃縮，干燥，得30%以上金絲桃苷的混合總苷，經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex LH-20柱層析分離，合并金絲桃苷流份，結(jié)晶，得到金絲桃苷(0. 74g，純度98. 9%)純品，經(jīng) 分別與金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品的UV、IR、ESI-MS^H-NMR^C-NMR比較，確定了金絲桃苷的結(jié)構(gòu)。實(shí)施例5取山香圓葉lOOOg，加8倍量65 %乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，濾渣再加7倍量65 % 乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過已處理好的DlOl大孔 樹脂柱，分別用水、5%乙醇、45%乙醇、1.4%氫氧化鈉溶液洗脫，收集45%乙醇洗脫部分， 減壓濃縮，干燥，得30%以上金絲桃苷的混合總苷，經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex LH-20柱層析 分離，合并金絲桃苷流份，結(jié)晶，得到金絲桃苷(0. 63g，純度98.5% )純品，經(jīng)分別與金絲 桃苷標(biāo)準(zhǔn)品的UV、IR, ESI-MS^iH-NMR, 13C-NMR比較，確定了金絲桃苷的結(jié)構(gòu)。實(shí)施例6取貫葉金絲桃lOOOg，加12倍量70%乙醇回流提取1. 5小時(shí)，濾過，濾渣再加10 倍量70%乙醇回流提取1. 5小時(shí)，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過已處理好 的DlO 1大孔樹脂柱，分別用水、10 %乙醇、45 %乙醇、0. 6 %氫氧化鈉溶液洗脫，收集45 %乙 醇洗脫部分，減壓濃縮，干燥，得30 %以上金絲桃苷的混合總苷，經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex LH-20柱層析分離，合并金絲桃苷流份，結(jié)晶，得到金絲桃苷(8. 5g，純度98. 6% )純品，經(jīng) 分別與金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品的UVUKESI-MS/H-NMR^C-NMR比較，確定了金絲桃苷的結(jié)構(gòu)。實(shí)施例7取貫葉金絲桃lOOOg，加15倍量60%乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，濾渣再加9倍量60 %乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過已處理好的D101 大孔樹脂柱，分別用水、8%乙醇、40%乙醇、0. 9%氫氧化鈉溶液洗脫，收集40%乙醇洗脫部 分，減壓濃縮，干燥，得30%以上金絲桃苷的混合總苷，經(jīng)硅膠柱層析、Si^phadex LH-20柱層 析分離，合并金絲桃苷流份，結(jié)晶，得到金絲桃苷(9. 2g，純度98. 5% )純品，經(jīng)分別與金絲 桃苷標(biāo)準(zhǔn)品的UV、IR, ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR比較，確定了金絲桃苷的結(jié)構(gòu)。實(shí)施例8取貫葉金絲桃lOOOg，加9倍量65%乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，濾渣再加9倍 量65%乙醇回流提取1. 5小時(shí)，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過已處理好 的DlOl大孔樹脂柱，分別用水、5%乙醇、35%乙醇、1. 1 %氫氧化鈉溶液洗脫，收集35%乙 醇洗脫部分，減壓濃縮，干燥，得30%以上金絲桃苷的混合總苷，經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex LH-20柱層析分離，合并金絲桃苷流份，結(jié)晶，得到金絲桃苷(8. 3g，純度98. 9% )純品，經(jīng) 分別與金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品的UV、IR.ESI-MS/H-NMR.^C-NMR比較，確定了金絲桃苷的結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)1 金絲桃苷對(duì)神經(jīng)氨酸酶活性的抑制作用取實(shí)施例1制備方法所獲得的金絲桃苷，加適量水使溶解，應(yīng)用神經(jīng)氨酸酶抑制 劑鑒定試劑盒測(cè)定金絲桃苷抑制神經(jīng)氨酸酶(Ni)的效價(jià)見表1。(1).標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)備a.在96孔熒光酶標(biāo)板內(nèi)每孔加入70 μ 1神經(jīng)氨酸酶檢測(cè)緩 沖液；b.每孔再分別加入0、1、2、5、7. 5、10μ 1 H5m神經(jīng)氨酸酶；c.每孔再加入0 20 μ 1 Milli-Q 水。(2).樣品檢測(cè)的準(zhǔn)備a.在96孔熒光酶標(biāo)板內(nèi)每孔加入70 μ 1神經(jīng)氨酸酶檢測(cè) 緩沖液；b.每孔再加入10 μ 1 Η5Ν1神經(jīng)氨酸酶；C.每孔再加入0 10 μ 1金絲桃苷樣品； d.每孔再加入0 10 μ 1 Milli-Q水。(3).檢測(cè)步驟a.振動(dòng)混勻約Imin ；b. 37°C孵育2min使抑制劑和H5W神經(jīng)氨酸酶充分相互作用，做標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品 也一起孵育；C.每孔加入10 μ 1神經(jīng)氨酸酶熒光底物；d.再振動(dòng)混勻約Imin ；e. 37°C孵育20 30min后進(jìn)行熒光測(cè)定。激發(fā)波長為360nm，發(fā)射波長為440nm。(4).根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品對(duì)于H5W神經(jīng)氨酸酶的抑制百分比，以及做濃度 曲線后計(jì)算出金絲桃苷對(duì)于H5m神經(jīng)氨酸酶的IC50。金絲桃苷達(dá)到對(duì)神經(jīng)氨酸酶的抑制 率 IC50 為 0. 05g/L。見表 1。表1.金絲桃苷抑制神經(jīng)氨酸酶的活性 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以清楚地看到
(1).金絲桃苷能夠提取出有效的抑制神經(jīng)氨酸酶成分；(2).金絲桃苷隨著使用劑量大小變化，其抑制神經(jīng)氨酸酶活性的能力，即神經(jīng)氨 酸酶抑制率的高低也相應(yīng)發(fā)生變化，并且成正相關(guān)；(3).由上述實(shí)驗(yàn)可見，金絲桃苷能夠通過抑制流感病毒表面神經(jīng)氨酸酶，進(jìn)而抑 制流感病毒進(jìn)入細(xì)胞里面、抑制已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞里面的流感病毒復(fù)制、增殖，從而減少了流感 病毒對(duì)細(xì)胞的感染、生長，以及預(yù)防和治療流感及其并發(fā)癥。醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究人員無法預(yù)先 在不做抑制流感病毒感染、復(fù)制，或抑制神經(jīng)氨酸酶的實(shí)驗(yàn)的前提下，預(yù)先得知金絲桃苷具 有預(yù)防和治療流感病毒性感冒的良好效果。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)2 金絲桃苷對(duì)流感病毒感染雞胚的抑制作用取實(shí)施例1制備方法所獲得的金絲桃苷，應(yīng)用流感病毒亞甲型鼠肺適應(yīng)株(FMl) (HlNl)鑒定金絲桃苷抑制FMl流感病毒在雞胚中復(fù)制和抑制的能力。(1).將FMl流感病 毒液接種于IOd齡無特定病原體雞胚尿囊腔內(nèi)，每胚0. 2ml，37°C孵育72h，觀察并計(jì)算半數(shù) 雞胚感染量(EID50)。(2).金絲桃苷對(duì)雞胚的毒性作用采用，無菌生理鹽水對(duì)金絲桃苷作 系列稀釋后接種于IOd齡無特定病原體雞胚尿囊腔內(nèi)，每胚0. 2ml，每個(gè)濃度接種6胚，37°C 孵育，觀察雞胚生長發(fā)育情況，以雞胚可存活96h的最大濃度作為藥物的TD。(3).金絲桃 苷在雞胚中對(duì)流感病毒的抑制作用采用，0. Iml的流感病毒液和不同稀釋度的金絲桃苷混 合，37°C作用2h，接種于IOd齡無特定病原體雞胚尿囊腔，每組接種6胚，37°C孵育72h。病 毒攻擊量為50EID50，同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照、無菌生理鹽水正常對(duì)照，計(jì)算金絲桃苷對(duì)病毒抑制 作用的半數(shù)有效劑量(ED50)。(1).FM1流感病毒對(duì)雞胚的毒力經(jīng)Reed-Muench法計(jì)算，其EID50為10_5_°7。(2). 金絲桃苷接種于雞胚后，其生長發(fā)育與正常對(duì)照組基本一致。96h雞胚均存活。雞胚給予金 絲桃苷原液未見雞胚死亡，所以可認(rèn)為TDO為2. Og/L。(3).金絲桃苷在雞胚中對(duì)流感病毒 的抑制作用見表2。表2.金絲桃苷對(duì)流感病毒感染雞胚的抑制作用 與病毒對(duì)照組比較卞< 0. 05由表2可知，金絲桃苷在0.0625 0.5g/L對(duì)流感病毒有顯著的抑制作用(P< 0. 05)，ED50 為 0. 0976g士0. 0035g/L, TI 為 61. 48 士 2. 27。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)3 金絲桃苷對(duì)FMl流感病毒影響取實(shí)施例1制備方法所獲得的金絲桃苷，應(yīng)用流感病毒亞甲型鼠肺適應(yīng)株(FMl) (HlNl)鑒定金絲桃苷抑制FMl流感病毒毒力的能力。(1). FMl對(duì)狗腎傳代細(xì)胞(MDCK)的毒 力測(cè)定采用細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50)微量法。(2).金絲桃苷對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性測(cè)定采用 無血清的DMEM對(duì)金絲桃苷作系列稀釋后接種于已形成單層的MDCK細(xì)胞孔中，每孔100 μ 1， 每個(gè)稀釋度重復(fù)4個(gè)孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。將培養(yǎng)板置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)， 每日觀察細(xì)胞病變(CPE)，連續(xù)觀察3d，以“+ ++++”記錄結(jié)果，按Reed-Muench法計(jì)算藥 物半數(shù)中毒濃度(TD50)和最大無毒濃度(TDO)。(3).金絲桃苷抑制FMl流感病毒作用測(cè) 定MDCK細(xì)胞5X105/ml，每孔100μ 1，分別于96孔板中，37°C、5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，次 日吸去孔中培養(yǎng)液，加入100TCID50流感病毒液，每孔100μ 1，37°C吸附Ih后吸去上清液。 用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，以藥物的TDO為第1孔，再用無血清的DMEM液對(duì)金絲桃苷 作系列稀釋，分別加入上述已感染病毒的細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照和正常對(duì)照組，37°C、5% CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)，每日觀察流感病毒產(chǎn)生的MDCK細(xì)胞病變特征，即單層細(xì)胞變性變圓等，連 續(xù)3d，計(jì)算出藥物的50%抑制病變濃度(IC50)及治療指數(shù)(Tl)。TI的計(jì)算TI = TD50/ IC50, TI值越大，表明藥物的安全范圍越大。以Kmskal-Walis和Mann-Whitney檢驗(yàn)法比 較試驗(yàn)組與病毒對(duì)照組細(xì)胞病變的差異，對(duì)藥物劑量和對(duì)病毒感染細(xì)胞避免發(fā)生細(xì)胞病變 (CPE)的抑制率進(jìn)行相關(guān)性分析，判斷是否存在量效反應(yīng)關(guān)系。(1). FMl流感病毒對(duì)MDCK細(xì)胞的毒力經(jīng)Reed-Muench法計(jì)算，其TCID50為10_4 81。 (2).金絲桃苷MDCK細(xì)胞的TDO分別為0.80g士0.03g/L。(3).將金絲桃苷作系列稀釋后， 對(duì)100TCID50流感病毒進(jìn)行抑制試驗(yàn)，計(jì)算藥物的半數(shù)有效量IC50及TI值大小，結(jié)果見表 3。 表3.金絲桃苷對(duì)FMl流感病毒的IC5tl (g/L)及TI (χ士 s) 由表3可知，金絲桃苷的IC50低，TI高。金絲桃苷抑制FMl流感病毒致細(xì)胞病變 的作用均隨著藥物劑量的增加而增強(qiáng)。對(duì)藥物劑量和藥物對(duì)CPE的抑制率進(jìn)行的相關(guān)性分 析表明，金絲桃苷的劑量與藥物對(duì)CPE抑制率之間呈明顯的正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)4 金絲桃苷對(duì)小鼠體內(nèi)感染流感病毒FMl株的脾指數(shù)和肺指數(shù)的影響取實(shí)施例1制備方法所獲得的金絲桃苷，應(yīng)用流感病毒亞甲型鼠肺適應(yīng)株(FMl) (HlNl)鑒定金絲桃苷對(duì)小鼠體內(nèi)感染流感病毒FMl株的死亡保護(hù)作用。(1).流感病毒FMl 株病毒做10倍倍比稀釋后分別接種每組10只BALB/C小鼠，雌雄各半。乙醚輕度麻醉后， 每組分別給與不同稀釋度的病毒，每只小鼠滴鼻接種20μ 1。觀察IOd的小鼠死亡情況，按 Reed-Muench法計(jì)算LD50為10_136。故確定實(shí)驗(yàn)所用的造模濃度為10LD50。(2).金絲桃 苷對(duì)小鼠體內(nèi)感染流感病毒FMl株的死亡保護(hù)作用正常對(duì)照組、流感病毒FMl株病毒對(duì)照 組、金絲桃苷0. 125g/L、0. 25g/L、0. 5g/L、l. Og/L劑量組等分別灌胃，灌胃容量均為0. 4ml/
3d后，除正常對(duì)照組外各組在乙醚輕度麻醉下用10LD50流感病毒FMl株滴鼻感染小鼠 同時(shí)正常對(duì)照組給予同體積的生理鹽水。給藥的4組繼續(xù)給藥，正常對(duì)照組和 流感病毒FMl株病毒對(duì)照組給生理鹽水8天，劑量同上。逐日觀察動(dòng)物發(fā)病和記錄死亡數(shù)， 共觀察14天，計(jì)算死亡率(死亡率=每組死亡數(shù)/每組小鼠總數(shù)X 100% )，結(jié)果見表4。 (3).金絲桃苷對(duì)小鼠體內(nèi)感染流感病毒FMl株肺指數(shù)的影響正常對(duì)照組、流感病毒FMl 株病毒對(duì)照組、金絲桃苷0. 125g/L、0. 25g/L、0. 5g/L、l. Og/L劑量組等分別灌胃，灌胃容量 均為0. 4ml/只。3天后，除正常對(duì)照組外各組在乙醚輕度麻醉下用1. 0LD50流感病毒FMl 株滴鼻感染小鼠20 μ 1/只。同時(shí)正常對(duì)照組給予同體積的生理鹽水。給藥的4組繼續(xù)給 藥，正常對(duì)照組和流感病毒FMl株病毒對(duì)照組給生理鹽水8天，劑量同上。于病毒感染后第 8天處死小鼠，稱體重，取肺稱肺重，計(jì)算肺指數(shù)(肺指數(shù)=肺質(zhì)量/體質(zhì)量Χ100% )；此 外，取脾稱脾重，計(jì)算脾指數(shù)(脾指數(shù)=脾質(zhì)量/體質(zhì)量X 100% )，結(jié)果見表5。
表4.金絲桃苷對(duì)小鼠體內(nèi)感染流感病毒FMl株的死亡保護(hù)結(jié)果
注※※P < 0. OlVS流感病毒模型組 ※？ < 0. 05VS流感病毒模型組 表5.金絲桃苷對(duì)小鼠體內(nèi)感染流感病毒FMl株的脾指數(shù)和肺指數(shù)的影響
組別動(dòng)物數(shù) 量(只)攻毒劑量 (LD50)觀察天 數(shù)(天)脾指數(shù)肺指數(shù)肺指數(shù)抑制 率(％)正常對(duì)照組10-80.35±0.040.97±0.10517.8流感病毒模型組10180.45±0.13#1.18±0.103#—金絲桃苷1.0g/L 組10180.34 士 0.06s"0.98±0.078糸16.9 糾0.5g/L 組10180.34±0.33^1.09±0.221濃7.6^0.25g/L 組1018OJSiO.lf1.11±0.1865.90.125g/L 組1018OMiOf1.14±0.126#3.4
注#P < 0.05VS正常對(duì)照組注※※ρ < 0.001VS流感病毒模型組 ※？ < 0. 05VS流感病毒模型組(1).由表4可知，金絲桃苷在0.25 1.0g/L對(duì)流感病毒感染小鼠有顯著的保護(hù) 作用(P < 0.01)。(2).由表5可知，金絲桃苷在0. 5 1. Og/L對(duì)流感病毒感染小鼠的肺指數(shù)抑制率 有顯著的作用(ρ <0.01)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)5 金絲桃苷對(duì)腎功能損傷的影響1) SD大鼠，200 240g，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司，動(dòng)物合格證號(hào) SCXK(滬)2003-00022)試劑及藥物腺嘌呤，腺嘌呤，(含量> 98%，為進(jìn)口分裝，中國上海，批號(hào) 20010520)，實(shí)施例1制備方法所獲得的金絲桃苷；3)試驗(yàn)方法雄性SD大鼠，體重220g左右，先用普通飼料喂養(yǎng)10天正常生長后， 按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組、給藥實(shí)驗(yàn)組和造模對(duì)照組，每組13 15只。給藥實(shí)驗(yàn)組和造 模對(duì)照組用腺嘌呤灌胃制作慢性腎功能衰竭(CRF)模型，以腺嘌呤320mg/(kg*d)灌胃，用 蒸餾水制成混懸液約2ml/只，共20天；20天后給藥，給藥實(shí)驗(yàn)組以金絲桃苷2. Og/(kg -d) 灌胃，金絲桃苷以蒸餾水制成混懸溶液(0. 25g/ml)，每次約2ml/只，分次灌胃，正常對(duì)照組 和造模對(duì)照組以等體積水灌胃，給藥35天后將大鼠用乙醚麻醉，鼠尾動(dòng)脈采血觀察各項(xiàng)指 標(biāo)。4)結(jié)果表6.金絲桃苷對(duì)CRF大鼠腎功能的影響 注經(jīng)T檢驗(yàn)，給藥金絲桃苷與造模對(duì)照組和正常對(duì)照組比較“*”表示P < 0. 05， “**” 表示 P < 0. 01本實(shí)驗(yàn)用腺瞟呤灌胃建立大鼠CRF模型后，造模對(duì)照組大鼠精神萎靡，體重明顯 降低，血清BuruSer明顯升高，Hb明顯下降，Ret明顯升高，表明大鼠腎功能受損，經(jīng)給予金 絲桃苷后大鼠與正常對(duì)照組差異不顯著，而與模型組比較差異十分顯著，故金絲桃苷對(duì)腎 臟無毒性作用。綜上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，本發(fā)明的金絲桃苷是有效的抑制神經(jīng)氨酸酶成分，金絲桃苷 隨著使用劑量大小變化，其抑制神經(jīng)氨酸酶活性的能力，即神經(jīng)氨酸酶抑制率的高低也相 應(yīng)發(fā)生變化，并且成正相關(guān)，金絲桃苷能夠通過抑制流感病毒表面神經(jīng)氨酸酶，進(jìn)而抑制流 感病毒進(jìn)入細(xì)胞里面、抑制已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞里面的流感病毒復(fù)制、增殖，從而減少了流感病毒 對(duì)細(xì)胞的感染、生長，以及預(yù)防和治療流感及其并發(fā)癥，還可以抑制流感病毒神經(jīng)氨酸酶水解細(xì)胞表面唾液酸，導(dǎo)致流感病毒不能與細(xì)胞表面受體結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，以及減少流感 病毒在細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)生，更重要地是本發(fā)明提供的金絲桃苷可以克服現(xiàn)有藥物的副反應(yīng)弊端。 而醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究人員無法預(yù)先在不做抑制流感病毒感染、復(fù)制，或抑制神經(jīng)氨 酸酶的實(shí)驗(yàn)的前提下，預(yù)先得知金絲桃苷具有預(yù)防和治療流感病毒性感冒的良好效果。
權(quán)利要求
一種金絲桃苷的提取方法，其中所述金絲桃苷的分子式C21H20O12，分子量464.38，所述金絲桃苷的結(jié)構(gòu)式如下所述金絲桃苷采用如下的提取方法獲得取山香圓葉或貫葉金絲桃，加5～15倍量的30％～90％乙醇回流提取1～3次，每次回流提取1～3小時(shí)，濾過；合并濾液，回收乙醇，水溶液通過大孔樹脂柱，洗脫，收集洗脫部分，減壓濃縮，干燥，得金絲桃苷的混合總苷，經(jīng)分離，合并金絲桃苷流份，結(jié)晶，得到金絲桃苷純品。FSA00000229930300011.tif
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中水溶液通過大孔樹脂柱，分別用水、5% 10%乙醇、 35% 55%乙醇、0. 5 1. 5%氫氧化鈉溶液洗脫，收集35% 55%乙醇洗脫部分，減壓濃 縮，干燥。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述金絲桃苷采用如下的提取方法獲得取山 香圓葉，加12倍量70%乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，濾渣再加10倍量70%乙醇回流提取1. 5 小時(shí)，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過大孔樹脂柱，分別用水、10%乙醇、45% 乙醇、氫氧化鈉溶液洗脫，收集45%乙醇洗脫部分，減壓濃縮，干燥。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述金絲桃苷采用如下的提取方法獲得取山 香圓葉，加15倍量60%乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，濾渣再加9倍量60%乙醇回流提取2 小時(shí)，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過大孔樹脂柱，分別用水、8%乙醇、40% 乙醇、1.2%氫氧化鈉溶液洗脫，收集40%乙醇洗脫部分，減壓濃縮，干燥。
5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述金絲桃苷采用如下的提取方法獲得取山 香圓葉，加9倍量65%乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，濾渣再加9倍量65%乙醇回流提取1. 5 小時(shí)，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過大孔樹脂柱，分別用水、5%乙醇、35% 乙醇、0.8%氫氧化鈉溶液洗脫，收集35%乙醇洗脫部分，減壓濃縮，干燥。
6.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述金絲桃苷采用如下的提取方法獲得取山 香圓葉，加10倍量70%乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，濾渣再加8倍量70%乙醇回流提取1. 5 小時(shí)，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過大孔樹脂柱，分別用水、7 %乙醇、40% 乙醇、1.3%氫氧化鈉溶液洗脫，收集40%乙醇洗脫部分，減壓濃縮，干燥。
7.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述金絲桃苷采用如下的提取方法獲得取山 香圓葉，加8倍量65%乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，濾渣再加7倍量65%乙醇回流提取2小 時(shí)，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過大孔樹脂柱，分別用水、5 %乙醇、45 %乙 醇、1. 4 %氫氧化鈉溶液洗脫，收集45 %乙醇洗脫部分，減壓濃縮，干燥。
8.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述金絲桃苷采用如下的提取方法獲得取貫 葉金絲桃，加12倍量70%乙醇回流提取1. 5小時(shí)，濾過，濾渣再加10倍量70%乙醇回流提取1. 5小時(shí)，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過大孔樹脂柱，分別用水、10 %乙 醇、45%乙醇、0.6%氫氧化鈉溶液洗脫，收集45%乙醇洗脫部分，減壓濃縮，干燥。
9.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述金絲桃苷采用如下的提取方法獲得取貫 葉金絲桃，加15倍量60%乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，濾渣再加9倍量60%乙醇回流提取 2小時(shí)，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過大孔樹脂柱，分別用水、8%乙醇、40% 乙醇、0.9%氫氧化鈉溶液洗脫，收集40%乙醇洗脫部分，減壓濃縮，干燥。
10.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述金絲桃苷采用如下的提取方法獲得取貫 葉金絲桃，加9倍量65%乙醇回流提取2小時(shí)，濾過，濾渣再加9倍量65%乙醇回流提取1. 5 小時(shí)，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過大孔樹脂柱，分別用水、5%乙醇、35% 乙醇、1. 氫氧化鈉溶液洗脫，收集35%乙醇洗脫部分，減壓濃縮，干燥。
11.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中水溶液通過已處理好的大孔樹脂柱洗脫，混合 總苷經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex LH-20柱層析分離，合并金絲桃苷流份，結(jié)晶，得到金絲桃苷 純品。
12.金絲桃苷用于制備預(yù)防和治療流感及其并發(fā)癥疾病的藥物的用途。
13.如權(quán)利要求12所述的用途，其中所述金絲桃苷用于抑制流感病毒。
14.如權(quán)利要求13所述的用途，其中所述金絲桃苷用于抑制流感病毒FM1。
15.如權(quán)利要求12所述的用途，其中所述金絲桃苷用于抑制神經(jīng)氨酸酶。
16.如權(quán)利要求12所述的用途，其中所述并發(fā)癥是指腎功能衰竭。
17.如權(quán)利要求12所述的用途，其中所述并發(fā)癥是指脾損傷或/和肺損傷。
18.—種金絲桃苷制劑，該制劑以權(quán)利要求1所述的提取方法獲得的金絲桃苷為主要 活性成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種金絲桃苷的提取方法及其制備藥物的用途，所述金絲桃苷采用如下的提取方法獲得取山香圓葉或貫葉金絲桃，加5～15倍量的30％90％乙醇回流提取1～3次，每次回流提取1～3小時(shí)，濾過；合并濾液，回收乙醇，水溶液通過大孔吸附樹脂柱洗脫，收集洗脫部分，減壓濃縮，干燥，得金絲桃苷的混合總苷，經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex LH-20柱層析分離，合并金絲桃苷流份，結(jié)晶，得到金絲桃苷純品，金絲桃苷可作神經(jīng)氨酸酶抑制劑用在預(yù)防和治療流感，制成藥學(xué)上可以接受的劑型。
文檔編號(hào)A61P1/00GK101891785SQ20101025379
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月16日
發(fā)明者劉地發(fā), 葉勁英, 呂武清, 李志勇, 楊小玲, 程帆, 蔡永紅, 謝寧 申請(qǐng)人:江西山香藥業(yè)有限公司;江西青峰藥物研究有限公司