專利名稱：含st-246的藥物組合物及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含ST-246的藥物組合物及其制備方法與應用。
背景技術：
ST-246是美國Siga公司研發(fā)的一種抗痘病毒藥物，ST-246的化學名為4_三 氟甲基-N-(3，3a，4，4a，5，5a，6，6a-八氫-1，3_ 二氧_4，6-亞乙烯基環(huán)丙基[f]異氮 雜-2 (IH)茚基)-苯甲酰胺{4-trifluoromethyl-N- (3，3a, 4，4a, 5，5a, 6,6a-octahydro-l， 3-dioxo_4，6-ethenoeyeloprop[f]isoindol-2(IH)-yl)-benzamide monohydrate}， ST-246存在立體異構體，Robert等人的國際專利申請W02004112718A2、W02008130348A1 已公開了該化合物、化合物的合成及其治療痘病毒及其相關感染疾病的應用，并對ST-246 的結構用1H-NMR進行了結構解析，并對性質進行了研究，如，所述的合成方法為，將環(huán)庚三 烯、馬來酸酐與二甲苯的混合物在氮氣保護下加熱回流反應得到固狀物后，用叔丁基甲醚 結晶，所得結晶產(chǎn)物和4-三氟甲基苯甲酰胼于乙醇中加熱回流反應后用乙酸乙酯正己 烷(1 1)重結晶得目的產(chǎn)物。但是對存在的立體化學未提及，包括立體異構體的表征及 其歸屬，按W02004112718A2所述方法制備的ST-246是否為純式I化合物還是式I化合物 和式II化合物的混合物及其相應的含量無法確定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種含ST-246的藥物組合物及其制備方法與應用。本發(fā)明所提供的藥物組合物，其組成包括式I所示的化合物和式II所示的化合 物，所述藥物組合物中式I所示化合物的質量含量大于等于98. 5%，式II所示化合物的質 量含量小于等于0.5% ； 所述藥物組合物中式I所示化合物的質量含量可進一步為大于等于99. 0%，式II 所示化合物的質量含量可進一步為小于0. 2%。本發(fā)明所述藥物組合物的制備方法(即高純度ST-246的制備方法)，包括下述步 驟氮氣保護下，將式III所示化合物與4-三氟甲基苯甲酰胼在有機溶劑中進行加熱反應， 得到所述藥物組合物的粗品； 所述方法還包括對藥物組合物粗品進行純化的步驟將所述藥物組合物溶于乙酸 乙酯中，然后依次用0. 2 0. 5mol/L鹽酸和水萃取，收集有機層，過濾，得到初步純化的藥 物組合物；再用體積比為1 1 1 1.5的乙酸乙酯-正己烷的混合溶劑進行重結晶，得 到純化的藥物組合物。其中，所述有機溶劑選自下述溶劑中的至少一種乙醇、乙酸乙酯、正己烷、四氫呋 喃、乙二醇獨甲醚和二氧六環(huán)；所述反應的反應溫度為65-85°C，反應時間為12-15小時。為了得到高純度的ST-246，上述方法中所用的式III所示化合物的原料中，式III 所示化合物的質量含量大于等于98. 5%，雜質式IV所示化合物的質量含量應小于1. 5%。式III、式IV所示化合物的含量測定方法可采用HPLC法進行檢測，色譜條件如下 色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相為體積比1 1的乙腈-質量濃度0.4% 磷酸二氫銨的混合溶液；流速為0. 5-lml/min ；檢測波長230nm，柱溫30°C。在該色譜條件 下，式III、式IV所示化合物可實現(xiàn)完全分離。上述高純的式III所示化合物可按照下述方法制備得到將環(huán)庚三烯、馬來酸酐 與二甲苯的混合物在氮氣保護下加熱回流反應12 18小時，然后將反應混合物冷卻至室 溫，過濾，收集固體，將固體干燥，得到類白色結晶性產(chǎn)物；將所得產(chǎn)物用叔丁基甲醚重結晶 得到式III所示化合物；所述反應的反應體系中環(huán)庚三烯與馬來酸酐的摩爾比為1 1 1 1.5。本發(fā)明所制備的藥物組合物中式I、式II所示化合物的含量可采用HPLC法進行
(式 III)。檢測，色譜條件如下色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相為體積比1 1的乙 腈_質量濃度0. 4%磷酸二氫銨的混合溶液；流速為0. 5-lml/min ；檢測波長230nm，柱溫 30°C，定量限為0. 02%。在該色譜條件下，式I、式II所示化合物可實現(xiàn)完全分離。為了更準確的測定藥物組合物中立體異構體ST-246’ (式II化合物)的含量，以 確保組合物中ST-246的高含量，本發(fā)明還制備了高純度的立體異構體ST-246’作為標準對 照。式II所示化合物的制備方法，包括下述步驟氮氣保護下，將式IV所示化合物與 4_三氟甲基苯甲酰胼在有機溶劑中進行加熱反應，得到式II所示化合物；
(式 II)(式 IV)。所述有機溶劑選自下述溶劑中的至少一種乙醇、乙酸乙酯、正己烷、四氫呋喃、乙 二醇獨甲醚和二氧六環(huán)；所述反應的反應溫度為65-85°C，反應時間為12-15小時。其中，式IV所示化合物可按照下述方法制備得到將環(huán)庚三烯、馬來酸酐與二甲 苯的混合物在氮氣保護下加熱回流反應12 18小時，然后將反應混合物冷卻至室溫，過 濾，收集濾液，將濾液減壓濃縮，濃縮物加入叔丁基甲醚中加熱溶解，放至室溫，待析出固 體后，過濾，得固體產(chǎn)物；將所得固體產(chǎn)物溶于乙酸乙酯進行硅膠柱層析，采用體積比為 1/13-1/9的乙醚/正己烷混合溶劑進行梯度洗脫，根據(jù)HPLC檢測結果，收集目標洗脫液，濃 縮，用二甲苯重結晶，得到式IV所示化合物；所述反應的反應體系中環(huán)庚三烯與馬來酸酐 的摩爾比為1 1 1 1. 5。式II所示化合物的制備方法還包括下述純化步驟將式II所示化合物溶于乙酸 乙酯中，然后依次用0. 2 0. 5mol/L鹽酸和水萃取，收集有機層，過濾，得到初步純化的式 II所示化合物；再用體積比為1 1 1 1.5的乙酸乙酯-正己烷的混合溶劑進行重結 晶，得到純化的式II所示化合物。式II所示化合物的純度檢測方法采用HPLC法進行檢測，色譜條件如下色譜柱填 充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相為體積比1 1的乙腈-質量濃度0. 4%磷酸二氫 銨的混合溶液；流速為0. 5-lml/min ；檢測波長230nm，柱溫30°C。按照上述方法制備的式II所示化合物的純度最高可達98. 0%以上，該產(chǎn)品可作 為ST-246，標準品使用。此外，在該色譜條件下色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相為乙 腈-質量濃度0.4%磷酸二氫銨(50 50, ν/ν)；流速為0. 5-lml/min;檢測波長230nm，柱 溫30°C ；對所制備的藥物組合物中含有的主要成分(式I、式II所示化合物)以及可能含 有的雜質如式III、式IV、式V、式VI和式VII化合物可以實現(xiàn)完全分離。
本發(fā)明的再一個目的是提供所述藥物組合物的應用。本發(fā)明所提供的藥物組合物的應用是其在制備抗痘病毒藥物中的應用。以所述藥物組合物為活性成分制備的抗痘病毒藥物也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述藥物組合物的治療有效劑量為250_800mg，優(yōu)選為400mg。所述抗痘病毒藥物可由活性組分和藥用載體制成口服制劑。所述口服制劑的劑型 優(yōu)選為片劑、膠囊劑、粉劑或顆粒劑。本發(fā)明的抗痘病毒藥物可以是按常規(guī)制劑方法制備成的片劑，其中所述藥學上可 接受載體包括藥用片劑的稀釋劑、粘合劑、崩解劑和潤滑劑；其中稀釋劑可選擇微晶纖維 素、淀粉、預膠化淀粉、乳糖、糊精、甘露醇、聚乙烯醇中的一種或多種。粘合劑可選擇淀粉 漿、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素和明膠漿中的一種。崩解劑可選擇 淀粉、羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮中的一種。潤滑劑可選擇滑石粉、硬脂酸鎂、微粉 硅膠中的一種或兩種。本發(fā)明片劑的制備方法是式I、式II組合物和稀釋劑、崩解劑分別 研細過篩，混合均勻，用黏合劑制成軟材，篩濾制粒，置50-60°C條件下干燥，再篩濾整粒后 加入潤滑劑，混合均勻，壓片。本發(fā)明的的抗痘病毒藥物可以是按常規(guī)制劑方法制備成的膠囊劑，其中所述藥學 上可接受載體包括微晶纖維素、淀粉、乳糖、糊精、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基淀粉 鈉、微粉硅膠或40CP-100CP乙基纖維素、硬醋酸鈉中的一種或幾種，本發(fā)明膠囊劑的制備 方法是式I組合物和所述藥學上可接受載體分別研細過篩，混合均勻，裝膠囊，或用黏合劑 制成軟材，篩濾制粒，置50-60°C條件下干燥，再篩濾整拉后加入潤滑劑，混合均勻，裝膠囊。本發(fā)明的的抗痘病毒藥物可以是按常規(guī)制劑方法制備成的顆粒劑，其中所述藥學 上可接受載體包括成型劑，可選用如β-環(huán)糊精、乳糖和糊精中的至少一種，矯味劑可選 用，如蔗糖、碳酸鈉、椰子香精中的至少一種，崩解劑可選用，如可溶性淀粉、羧甲基淀粉鈉 中的一種；粘合劑可選用，如羥丙基甲基纖維素或其它臨床上可接受的結構類似物。本發(fā)明 顆粒劑的制備方法為按處方量取式I組合物與上述輔料混合后，噴霧干燥，干式制粒，整粒 即得產(chǎn)品；或將原輔料混合按處方量加入粘合劑，制成軟材，將上述軟材經(jīng)12目篩制粒，再 于30-75°C干燥，12目篩整粒，將整粒好的顆粒加入已過80目篩的椰子香精混合均勻，分裝 即得顆粒劑。本發(fā)明的的抗痘病毒藥物可以是按常規(guī)制劑方法制備成粉劑，其中所述藥學上可 接受載體包括藥用的稀釋劑，其中稀釋劑可選擇微晶纖維素、淀粉、乳糖、預膠化淀粉、糊 精中的一種或多種。本發(fā)明制備粉劑方法是含式I化合物的組合物和稀釋劑分別研細過 篩，混合均勻，分裝。本發(fā)明意義在于本發(fā)明提供了式I化合物含量高的藥物組合物及其制備方法， 通式還提供了該藥物組合物的質量控制方法。體外抗痘病毒活性試驗表明，S-246含量高 的藥物組合物對痘苗病毒天壇株感染的Vero E6細胞具有保護作用。


圖1為式III化合物的1H-NMR(CDCl3)圖譜。圖2為式III化合物的N. 0. E(DMSO)圖譜。圖3為式I化合物的1H-NMR(CDCl3)圖譜。
圖4為式I化合物的N. 0. E (DMSO)圖譜。圖5為式I化合物的13C-WR(DMSO)圖譜。圖6為式I化合物的紅外光譜。圖7為式I化合物的1H-1H COSY(DMSO)圖譜。圖 8 式 I 化合物的 13C-1H COSY(DMSO)圖譜。圖9式I化合物的13O1H HMBC (DMSO)圖譜。圖10為式I化合物的DEPT (DMSO)圖譜。圖11為式I化合物的X-射線晶體衍射圖譜。圖12為式IV化合物的1H-NMR(CDCl3)圖譜。圖13為式IV化合物的N. 0. E (DMSO)圖譜。圖14為式II化合物的1H-NMR(CDCl3)圖譜。圖15為式II化合物的N. 0. E(DMSO)圖譜。圖16為式II化合物的X-射線晶體衍射圖譜。圖17為含式I化合物的組合物的HPLC圖譜。圖18為式II化合物的HPLC圖譜。圖19為式III化合物的HPLC圖譜。圖20為式IV化合物的HPLC圖譜。圖21為式V化合物的HPLC圖譜。圖22為式VI化合物的HPLC圖譜。圖23為式VII化合物的HPLC圖譜。圖24式I、式II、式III、式IV、式V、式VI和VII化合物的混合物的HPLC圖譜。
具體實施例方式下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材 料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。下述實施例中所用的4-三氟甲基苯甲酰胼(式V化合物)可按照下述方法制備
得到 1、中間體4-三氟甲基苯甲酸乙酯(式VI化合物)的合成在攪拌和冷卻下，30min內(nèi)將178. 5g(l. 5mol)氯化亞砜滴加到190g(Imol) 4_三氟 甲基苯甲酸(式VII化合物)和1.5L無水乙醇的混合物中。滴加完后，緩緩升溫至78°C， 并在此溫度下回流6h，TLC跟蹤反應至結束，蒸出過量的乙醇和氯化亞砜后，加入2L水，靜 置分層，分出有機相，水層用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相并用IL飽和碳酸鈉溶液洗滌， 無水硫酸鈉干燥，蒸出乙酸乙酯，得無透明液體產(chǎn)物202. 7g(93. 0% )0 b. p. 81°C /5mmHg。
2、4_三氟甲基苯甲酰胼(式V化合物)的合成將4-三氟甲基苯甲酸乙酯218g (l.Omol)，85 %水合胼114g(1.5mol)于 500mL乙醇溶液中攪拌回流240min，TLC跟蹤反應至結束。冷卻結晶，過濾，干燥得到 182. 5g(88.8%)無色晶體。m ρ 116 118°C。薄層檢測展開劑甲醇-石油醚_乙酸乙 酯(10 10 1)，Rf = 0.8。1H-WR(CDCl3) δ 7. 883(d，2H) ； δ 7. 729(d，2H) ； δ 7. 722(s， 1H, ΗΝ) ； δ 4. 182 (s，2Η，NH2)。實施例1、制備反式-四環(huán)[3. 2. 2. O24]壬烷_6_烯-面內(nèi)_8_面內(nèi)_9_ 二羧酸酐 (式III化合物)將環(huán)庚三烯(50g，0.543mol)、馬來酸酐(61. 3g，0. 624mol)與二甲苯(300ml)的混 合物在氮氣保護下加熱至120°C反應15小時，然后將反應混合物冷卻至室溫，形成固狀物 后，過濾，粗品干燥，得到80g(83.7%)的類白色結晶性產(chǎn)物。將粗品80g加入叔丁基甲醚 400ml中，加熱回流，趁熱過濾，濾液置5°C條件下過夜，濾出固體，加入到叔丁基甲醚400ml 中，加熱回流，趁熱過濾，濾液置5°C條件下過夜，濾出固體，再加入到叔丁基甲醚350ml中， 加熱回流，趁熱過濾，濾液置5°C條件下過夜，濾出固體干燥，得白色結晶目的物68g(叔丁 基甲醚重結晶三次)。m.p. 100 101 °C。1H-WR(CDCl3) [ δ 5. 888(q，2H，J = 3· 6)，δ 3. 254(t，2H，J = 1. 8), δ 3. 464 (2Η, J =1. 8)，δ . 114(m，2H，J = 1. 8)，δ 0· 259 (m，1Η, J = 3. 6)，δ 0· 374 (m，1Η, J = 7. 2)。Ms 191. 1。1H-NMR 圖譜(圖 1)及 Ν· 0· E 圖譜(圖 2)顯示，當照射 2、4 氫[δ 1. 114(m,2H)] 時，其8、9氫和3’氫信號增強，而3氫信號不變，說明該結構符合面內(nèi)式構型。采用HPLC法對制備的式III所示化合物的含量進行測定，色譜條件如下色譜柱 填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相為體積比1 1的乙腈-0.4%磷酸二氫銨的混合 溶液；流速為0. 5-lml/min ；檢測波長230nm，柱溫30°C。式III所示化合物的HPLC圖譜如 圖19所示。采用面積歸一化法計算得到式III化合物的純度> 98. 5%實施例2、制備含式I化合物的藥物組合物(即高純度的ST-246)在氮氣保護下，將實施例式III化合物(30g，0. 16mol)和4_三氟甲基苯甲酰胼 (37g，0. 18mol)于1000ml乙醇的溶液中加熱回流(79°C )反應13小時，減壓蒸去乙醇，析 出白色結晶固體，將固體溶于乙酸乙酯1500ml中，溶液依次用0. 5mol/L的鹽酸(2X500ml) 和水(500ml)萃取，收集有機層，過濾，得目的產(chǎn)物固體36g，濾液用無水硫酸鈉干燥，濃縮， 過濾得目的產(chǎn)物6g，共得產(chǎn)物43. 8g(收率70. 0&)，乙酸乙酯-正己烷(1 1)重結晶，得白 色結晶性粉末40. 8g(總收率64. 7% ) ；m. p. 194 196°C。薄層檢測展開劑正己烷_乙 醚-醋酸(3 4 1)，Rf = 0.8。1H-WR(CDCl3) δ 8. 428 (s, 1H) ； δ 7. 888 (d, 2H, J = 7. 8) ； δ 7. 659 (d, 2H, J = 7. 8) ； δ 5. 836 (s,2H) ； δ 3. 145 (2Η) ； δ 3. 456 (2Η) ； δ 1. 153 (m, 2H) ； δ 0. 259 (m, 1H, J = 3. 0) ；0. 323 (m，1H，J = 7. 8) ；1H-NMR 圖譜(圖 3)及 N. 0. E 圖譜顯示(圖 4)，當照射 10、11 氫[δ 1. 153(m，2H)]時，其3、4氫和12’氫信號增強，而12氫信號不變，說明該結構符合反 式構型。Ms 376. 1元素分析儀器型號EA1108型元素分析儀測定。
測定結果59.96，4. 08，7. 34，符合分子式 C19H15F3N2O3. H2O采用HPLC法對所制備的高純度ST-246的質量進行檢測，色譜條件如下色譜柱填 充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相為體積比1 1的乙腈-0.4%磷酸二氫銨的混合溶 液；流速為0. 5-lml/min ；檢測波長230nm,柱溫30°C。高純度ST-246的HPLC圖譜如圖17 所示。以實施例4制備的式II化合物作為檢測高純度ST-246中ST-246’的標準品。測得 式I化合物的含量為99. 85%，式II質量含量為0. 08%。實施例3、制備反式-四環(huán)[3. 2. 2. O24]壬烷_6_烯-面外_8_面外_9_ 二羧酸酐 (式IV化合物)將環(huán)庚三烯(50g，0.543mol)、馬來酸酐(61. 3g，0. 624mol)與二甲苯(300mL)的混 合物在氮氣保護下加熱回流反應20小時，然后將反應混合物冷卻至室溫，過濾，將濾出的 母液真空濃縮成固體后，取固體加入叔丁基甲醚IOOml中，加熱溶解，放至室溫，待析出固 體后，過濾，固體溶于乙酸乙酯IOOml中，拌入IOg硅膠，蒸去溶劑，晾干，上80g硅膠柱，用 體積比為1/13-1/9的乙醚/正己烷的混合溶液(即1/13、1/12、1/11、1/10、1/9)作洗脫劑 進行梯度洗脫，每個梯度洗脫3 5個柱體積，根據(jù)HPLC檢測結果收集目標洗脫液，濃縮， 用二甲苯重結晶得目標化合物。1H-NMR (CDCl3) δ 5. 950 (q, 2H) , δ 3· 080 (s，2Η)，δ 3. 415 (2Η), δ 1· 136 (m，2Η)， δ 0. 147 (m, 1Η)，δ 0. 233 (m, 1Η) ；1H-NMR 及 N. 0. E 圖譜顯示(圖 19，20)，當照射 2、4 氫 [δ 1. 136(m，2H)]時，其8、9氫和3’信號不變，說明該結構符合面外式構型。Ms 191. 1 ;m. ρ· 112 113°C。采用HPLC法對制備的式IV所示化合物的含量進行測定，色譜條件如下色譜柱填 充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相為體積比1 1的乙腈-0.4%磷酸二氫銨的混合溶 液；流速為0. 5-lml/min ；檢測波長230nm，柱溫30°C。式IV所示化合物的HPLC圖譜如圖 20所示。采用面積歸一化法計算得到式IV化合物的純度> 98. 5%。實施例4、制備式II化合物(即ST-246’標準品)在氮氣保護下，將式IV化合物(3g，0.016mol)和4_三氟甲基苯甲酰胼(3. 7g， 0. OlSmol)于IOOml乙醇的溶液加熱回流(79°C )反應13小時，減壓蒸去乙醇，析出白色 結晶固體，將固體溶于乙酸乙酯150ml中，溶液用0. 5mol/L的鹽酸(2X50ml)和水(50ml) 萃取，有機層，過濾，得目的產(chǎn)物固體3. 4g，濾液用無水硫酸鈉干燥，濃縮，過濾得目的產(chǎn) 物0.6g，共得產(chǎn)物4.0g(收率67.8% )，乙酸乙酯-正己烷(1 1)重結晶，得白色結晶 性粉末3. 2g(總收率54. 2% ) ；m.p. 174-176°C。薄層檢測展開劑正己烷-乙醚-醋酸 (3 4 1)，Rf = 0. 8。1H-NMR(CDCl3) δ 9. 101 (s, 1H) ； δ 7. 846(d，2H，J = 7. 8) ； δ 7. 582 (d，2H， J = 7. 8) ； δ 5. 939 (q, 2H, J = 3. 6) ； δ 3. 392 (s,2H) ； δ 2. 836 (s,2H) ； δ 3. 456 (2Η)； δ 1. 117(m，2H) ； δ 0. 218 (d，1H, J = 5. 4) ； δ 0. 114(m, 1Η) (m, 1Η, J = 3. 0) ；1H-NMR 圖譜及 N. 0. E圖譜顯示(圖14，15)，當照射10、11氫[δ 1. 117(m,2H)]時，其3、4氫和12’氫信號 不變，說明該結構符合順式構型。Ms 376.1元素分析儀器型號EA1108型元素分析儀測定。測定結果:C%為60. 64，3. 98，7. 45，符合分子式 C19H15F3N2O3. H2O
采用HPLC法對制備的式II化合物的含量進行測定，色譜條件如下色譜柱填充劑 為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相為體積比1 1的乙腈-0. 4%磷酸二氫銨的混合溶液； 流速為0. 5-lml/min ；檢測波長230nm，柱溫30°C。式II化合物的HPLC圖譜如圖18所示。 采用面積歸一化法計算計算得到式II化合物的純度> 98. 0%，該化合物可作為檢測實施 例2制備的高純度ST-246中ST-246，含量的標準品。實施例5、含有式I組合物制成的片劑處方實施例2制備的式I組合物 200g乳糖IOOg微晶纖維素60g預膠化淀粉40g羧甲基淀粉鈉40g微粉硅膠4g硬脂酸鎂4g0. 3% HPMC適量_1000 片制備方法取式I組合物與乳糖、微晶纖維素200 100 40配比微粉化，得微粉 混合物，將處方量微粉化物與微晶纖維素、預膠化淀粉、微粉硅膠及羧甲基淀粉鈉充分研磨 混勻后，加入適量0.3% HPMC水溶液制軟材，20目篩制粒，40°C恒溫干燥后，加入硬脂酸鎂 混合均勻后，20目篩整粒，壓片即得。實施例6、含式I組合物制成的顆粒劑處方實施例2制備的式I組合物 200g乳糖400g蔗糖IOOg椰子香精30g交聯(lián)聚維酮30g_1000 袋制備方法取式I組合物、乳糖、蔗糖、椰子香精、交聯(lián)聚維酮，分別研細過60目篩， 按處方量取主藥與上述輔料混合后，噴霧干燥，干式制粒，整粒即得產(chǎn)品；或將原輔料混合 按處方量加入粘合劑，制成軟材，將上述軟材經(jīng)12目篩制粒，再于60°C干燥，12目篩整粒， 將整粒好的顆粒加入已過80目篩的椰子香精混合均勻，分裝即得顆粒劑。實施例7、含有式I組合物制成的膠囊劑處方實施例2制備的式I組合物 200g微晶纖維素150g乳糖150g羧甲基淀粉鈉30g硬脂酸鎂6g2%羥丙基纖維素適量
_1000 粒制備方法取式I組合物、微晶纖維素、乳糖、羧甲基淀粉鈉，別研細過60目篩，按 處方量取主藥與上述輔料，混合均勻，用黏合劑2%羥丙基纖維素制成軟材，18目篩篩濾制 粒，置60°C條件下干燥，整粒后加入硬脂酸鎂，混合均勻，裝膠囊。實施例8、式I組合物體外抗痘病毒活性1、實驗材料病毒痘苗病毒天壇株，中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所保 證可在符合國家和軍隊有關規(guī)定且經(jīng)相關部門批準后向公眾提供；參考文獻金奇，陳南 海，姚二梅等.痘苗病毒天壇株基因組旁側區(qū)結構及開放讀碼框架的分析.病毒學報.1997 年3月，第13卷，第1期。細胞=Vero E6，中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所保證可 在符合國家和軍隊有關規(guī)定且經(jīng)相關部門批準后向公眾提供；參考文獻WANG Lin, LI Rong-song. GUO Hai-yan, and etal.Developmen t of a screen ing method for poten tial an ti-SARS compounds based on Vero-E6 cells.中草藥.第 35 卷第 9 期· 2004 年 9 月· 1019-1023。供試品式I組合物，其中式I質量含量為99. 85%，式II質量含量為0. 08%。2、實驗方法(1)細胞病變法(CPE)法將病毒從-70°C冰箱中取出，放冰浴中融化。用細胞維 持液將病毒稀釋成IO-IOOTCID5(i，放冰浴中。棄去已長成單層細胞的96孔板中的培養(yǎng)液。 向正常細胞對照孔中加入細胞維持液，每孔100 μ 1，共3個復孔。用稀釋的病毒懸液感染病 毒對照孔、西多福韋陽性藥物對照孔和試驗孔中的細胞，每孔 οομ 1，37°C吸附1. 5h。棄病 毒液，向病毒對照孔中加入細胞維持液，每孔100 μ 1，共3個復孔；向西多福韋陽性藥物對 照孔中加入西多福韋溶液(濃度為100 μ g/ml)，每孔100 μ 1，共3個復孔；向試驗孔中加入 含有不同濃度待測化合物的維持液，每孔100 μ 1，每個濃度3個復孔。將96孔板置于37°C、 5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日在倒置顯微鏡下觀察并記錄細胞病變情況。直到病毒對照孔出 現(xiàn)4個“ + ”細胞病變時為實驗終點。用軟件計算抑制50%細胞病變的組合物濃度(IC5tl)。(2)中性紅染色法同細胞病變法。每日在倒置顯微鏡下觀察并記錄細胞病變情 況。直到病毒對照孔出現(xiàn)4個“ + ”的細胞病變時為實驗終點。每孔加入0. 中性紅25μ 1， 于37°C放置1.5h，然后將每孔中的液體吸出。用PBS洗2次。加醋酸乙醇，每孔100 μ 1。 設空白對照。用酶標儀在492nm處測定OD值。計算細胞存活率和死亡率，然后用軟件計算 組合物的IC5Q。(3)空斑減數(shù)實驗準備長成單層細胞的24孔板，棄培養(yǎng)液，每孔加入100 200PFU的病毒懸液 150 μ 1，再加入350 μ 1細胞維持液，37°C吸附1. 5h。棄病毒液，加入不同濃度的藥物溶液， 每孔1ml，每個濃度各設3個復孔。設正常細胞對照、病毒對照、利巴韋林陽性藥物對照，每 個對照設3個復孔。37°C,5% CO2培養(yǎng)72h。棄孔中液體，用0. 1 %結晶紫溶液染色，350 μ 1/ 孔。室溫放置lh。棄染色液，蝕斑可見易數(shù)。計數(shù)蝕斑，用軟件計算組合物的IC5Q。3、實驗結果
本實驗室采用CPE法、中性紅染色法和蝕斑降低實驗測定含ST-246的組合物對痘 苗病毒天壇株感染的Vero E6細胞的保護作用(見表1、2、3)。表1. ST-246對痘苗病毒的IC5tl (CPE法) 表2. ST-246對痘苗病毒的IC5tl (中性紅染色法)
供試品IC50 (|imol/L)
實驗一實驗二 實驗三^S
含 ST-246 的組合物 0.0170j041 0.0180.025±0.014表3. ST-246對痘苗病毒的IC5tl (蝕斑降低實驗)
供試品[C5O (μηιοΙ/L)實驗一實驗二 實驗三x±S含ST-246的組合物0.0011460.001 0.0011770.0011 ±0.00009
權利要求
一種抗痘病毒的藥物組合物，其組成包括式I所示的化合物和式II所示的化合物，所述藥物組合物中式I所示化合物的質量含量大于等于98.5％，式II所示化合物的質量含量小于等于0.5％；FSA00000222128000011.tif
2.根據(jù)權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物按照權利要求3-7 中任一項所述的方法進行制備。
3.權利要求1所述藥物組合物的制備方法，包括下述步驟氮氣保護下，將式III所示 化合物與4-三氟甲基苯甲酰胼在有機溶劑中進行加熱反應，得到所述藥物組合物； (式 III)。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于所述有機溶劑選自下述溶劑中的至少一 種乙醇、乙酸乙酯、正己烷、四氫呋喃、乙二醇獨甲醚和二氧六環(huán)，優(yōu)選溶劑為乙醇；所述 反應的反應溫度為65-85°C，反應時間為12-15小時；式III所示化合物的原料中，式III所 示化合物的質量含量大于等于98. 5%，雜質式IV所示化合物的質量含量小于1. 5% ； (式 IV)。
5.根據(jù)權利要求3或4所述的方法，其特征在于式III所示化合物按照下述方法制 備得到將環(huán)庚三烯、馬來酸酐與二甲苯的混合物在氮氣保護下加熱回流反應12-18小時， 然后將反應混合物冷卻至室溫，過濾，收集固體，將固體干燥，得到結晶性產(chǎn)物；將所得產(chǎn)物 用叔丁基甲醚重結晶得到式III所示化合物；所述反應的反應體系中環(huán)庚三烯與馬來酸酐 的摩爾比為1 1-1 1.5。
6.根據(jù)權利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于所述藥物組合物的制備方法還 包括下述純化步驟將所述藥物組合物溶于乙酸乙酯中，然后依次用0. 2-0. 5mol/L鹽酸和 水萃取，收集有機層，過濾，得到初步純化的藥物組合物；再用體積比為1 1-1 1.5的乙 酸乙酯_正己烷的混合溶劑進行重結晶，得到純化的藥物組合物。
7.根據(jù)權利要求3-6中所述的方法，其特征在于式I、式II、式III、式IV所示化合 物的含量測定方法均采用HPLC法進行檢測，色譜條件如下色譜柱填充劑為十八烷基硅烷 鍵合硅膠；流動相為體積比1 1的乙腈和質量濃度0.4%磷酸二氫銨的混合溶液；流速為 0. 5-lml/min ；檢測波長 230nm，柱溫 30°C。
8.權利要求1或2所述藥物組合物在制備抗痘病毒藥物中的應用。
9.一種抗痘病毒藥物，其活性成分為權利要求1或2所述藥物組合物。
10.根據(jù)權利要求9所述的抗痘病毒藥物，其特征在于所述抗痘病毒藥物為口服制 劑；所述抗痘病毒藥物的劑型為片劑、膠囊劑、粉劑或顆粒劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含ST-246的藥物組合物及其制備方法與應用。本發(fā)明所提供的藥物組合物，其組成包括式I所示的化合物(ST-246)和式II所示的化合物(ST-246的立體異構體)，所述藥物組合物中式I所示化合物的質量含量大于等于98.5％，式II所示化合物的質量含量小于等于0.5％。該藥物組合物的制備方法包括下述步驟氮氣保護下，將式III所示化合物與4-三氟甲基苯甲酰肼在有機溶劑中進行加熱反應，得到所述藥物組合物。以所述藥物組合物為活性成分，加入藥用載體，可制備成抗痘病毒藥物。
文檔編號A61P31/12GK101912389SQ20101024853
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月9日 優(yōu)先權日2010年8月9日
發(fā)明者丁建新, 姜洋, 孫雅潔, 宋亞彬, 張東娜, 李海晶, 王洪權, 竇茜茜, 貝祝春 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所