專利名稱：一種新的腫瘤樹突狀細(xì)胞治療性疫苗的制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及一種新型高效樹突狀細(xì)胞腫瘤治療性疫苗的制備方法以及該類疫苗在各類腫瘤治療預(yù)防中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤的主動性免疫治療是治療及預(yù)防腫瘤或感染性疾病的有效手段，自從人類采用接種牛痘預(yù)防天花以來，人類在感染性疾病的預(yù)防及控制上取得了很大的進(jìn)展，目前在我國已經(jīng)基本消滅了天花、脊髓灰質(zhì)炎等感染性疾病，但在其他重大疾病的治療方面如腫瘤等疾病的預(yù)防及治療方面，仍然缺乏有效的手段。腫瘤的免疫治療是繼手術(shù)、放療、化療之后的一個新的治療模式，腫瘤免疫治療的中心環(huán)節(jié)就是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性和非特異性的抗腫瘤免疫。采用腫瘤疫苗去誘導(dǎo)特異性的抗腫瘤免疫，對于抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移更為重要，目前盡管已知一些腫瘤抗原，但對于大多數(shù)腫瘤來說，腫瘤抗原仍是未知的。目前常用的腫瘤疫苗包括采用全細(xì)胞瘤苗、腫瘤細(xì)胞的裂解物、腫瘤抗原致敏的樹突狀細(xì)胞瘤苗、基因工程疫苗等，取得了一定的療效，但也明顯存在不足。1.腫瘤相關(guān)抗原肽疫苗。目前人類已經(jīng)獲得了四類腫瘤相關(guān)抗原，(1)腫瘤特異性抗原，包括MAGE-I、MAGE-3、GAGE、RAGE等，這類抗原在正常組織除了睪丸和胎盤外不表達(dá)，只在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)；(2)腫瘤分化抗原，包括MART-1、gp-100、酪氨酸激酶相關(guān)蛋白-1，分布于黑色素細(xì)胞瘤；C3)突變基因編碼蛋白，如MUM-I等這些基因分布廣泛，但在腫瘤組織中突變而成為腫瘤抗原；(4)在腫瘤組織高表達(dá)的一類抗原，如HER2-neU等。目前采用合成抗原肽或基因工程表達(dá)及DNA疫苗的方式制備該類疫苗。2.樹突狀細(xì)胞瘤苗。樹突狀細(xì)胞是體內(nèi)最強(qiáng)的專職性抗原遞呈細(xì)胞，是抗腫瘤免疫應(yīng)答的始作俑者，采用腫瘤細(xì)胞裂解物或腫瘤相關(guān)抗原肽致敏樹突狀細(xì)胞回輸體內(nèi)，可以誘導(dǎo)抗原特異性的免疫應(yīng)答，目前該類療法已經(jīng)進(jìn)入臨床I -III期試驗(yàn)3.抗獨(dú)特型抗體疫苗?？躬?dú)特型抗體可以模仿蛋白和抗原肽，在部分試驗(yàn)中人們已經(jīng)可以應(yīng)用抗獨(dú)特型抗體誘導(dǎo)針對腫瘤相關(guān)抗原的特異性的免疫反應(yīng)，該類疫苗的優(yōu)勢在于可以產(chǎn)生比抗原肽更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。4.基因修飾的腫瘤疫苗。采用病毒或基因修飾腫瘤細(xì)胞作為瘤苗是研究較多的一類腫瘤疫苗，主要是采用細(xì)胞因子基因、共刺激分子等、希望提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性，誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答。然而，目前以上4種腫瘤疫苗均存在明顯不足，許多腫瘤抗原不明確，無法誘導(dǎo)腫瘤特異性的CTL，而采用樹突狀細(xì)胞瘤苗和基因修飾的腫瘤細(xì)胞瘤苗，也存在體外操作復(fù)雜、質(zhì)量難以控制、療效有限等因素。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的療效好、操作簡便的新腫瘤疫苗。 發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種高效的用于腫瘤治療及預(yù)防的疫苗成分，該疫苗成分是采用細(xì)胞經(jīng)化療藥物5-FU后的含腫瘤抗原的上清液；本發(fā)明的另一目的是提供所述含腫瘤抗原的上清液的制法及用途。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種含腫瘤抗原的上清液，所述的上清液是由腫瘤細(xì)胞經(jīng)化療藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)誘導(dǎo)培養(yǎng)后的，經(jīng)離心去除腫瘤細(xì)胞和固態(tài)雜質(zhì)后獲得的上清液，并且所述的上清液具有以下特征(a)包含以下免疫刺激分子HMGB1 ；(b)含有選自下組的免疫分子腫瘤抗原、MHC分子、粘附分子或共刺激分子；和(c)含有熱休克蛋白分子。在另一優(yōu)選例中，所述的上清液還具有以下特性(d)可以刺激樹突狀細(xì)胞分泌選自下組的細(xì)胞因子和趨化因子IL_li3、IL-12、 TNF-α 和 MIP-I α (CCL3)、ΜΙΡ—3 β (CCL19)和 IP-IO (CXCLlO)；(e)所述的含腫瘤抗原的上清液在體外可以趨化和激活樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞，誘導(dǎo)抗原特異性和非特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)。在另一優(yōu)選例中，所述的上清液是用如下方法制備的(a)將所述的腫瘤細(xì)胞在37士3°C下用化療藥物5_FU誘導(dǎo)培養(yǎng)0. 5-48小時，獲得培養(yǎng)液；和(b)對步驟(a)的培養(yǎng)液進(jìn)行離心，從而獲得培養(yǎng)上清。在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤細(xì)胞是選自下組腫瘤的細(xì)胞肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、黑色素瘤、腎癌、前列腺癌、惡性淋巴瘤、白血病、宮頸癌、卵巢癌、鼻咽癌、口腔癌、骨肉瘤、腦膠質(zhì)瘤、膀胱癌、多發(fā)性骨髓瘤。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種致敏的樹突狀細(xì)胞，所述的樹突狀細(xì)胞是用本發(fā)明第一方面中所述的含腫瘤抗原的上清液致敏的。在另一優(yōu)選例中，所述的致敏的樹突狀細(xì)胞具有以下特性⑴分泌選自下組的細(xì)胞因子和趨化因子IL_1 β、IL-12、TNF- α和 MIP-I α (CCL3)、ΜΙΡ-3 β (CCL19)和 IP-IO (CXCLlO)；(ii)分泌 MHC II 分子 HLA-DR ；(iii)分泌共刺激分子CD80，CD86 ；(iv)刺激同種異體的T細(xì)胞增殖。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，它含有有效量的本發(fā)明第二方面中所述的致敏的樹突狀細(xì)胞，和藥學(xué)上可接受的載體?；蛘?，所述的藥物組合物含有有效量的本發(fā)明第一方面中所述的含腫瘤抗原的上清液，和藥學(xué)上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物是疫苗組合物。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種制備含腫瘤抗原的上清液的方法，包括以下步驟(a)將所述的腫瘤細(xì)胞在37士3°C下用化療藥物5_FU誘導(dǎo)培養(yǎng)0. 5-48小時，獲得培養(yǎng)液；和(b)對步驟(a)的培養(yǎng)液進(jìn)行離心，從而獲得培養(yǎng)上清。在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，在濃度為1.0X KTfiM至1.0X 10_2M(較佳地0. 5-1. 5 X 10_3M)的5-FU存在下，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，腫瘤細(xì)胞的數(shù)量為IX IO5至IX IO7個細(xì)胞/ml， 較佳地0. 5X IO6個細(xì)胞/ml至5X106個細(xì)胞/ml。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，離心在5000-20000rpm下進(jìn)行。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種制備本發(fā)明上述的致敏的樹突狀細(xì)胞的方法， 其特征在于，包括以下步驟用本發(fā)明第一方面中所述的含腫瘤抗原的上清液，按50μ g/ΙΟ6個樹突狀細(xì)胞的劑量(或按50 μ g/ml樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)液的劑量)致敏樹突狀細(xì)胞，從而獲得致敏的樹突狀細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的被致敏的樹突狀細(xì)胞是培養(yǎng)5-7天的樹突狀細(xì)胞。在本發(fā)明的第五方面，提供了本發(fā)明上述的含腫瘤抗原的上清液或所述的致敏的樹突狀細(xì)胞的用途，它們被用于制備預(yù)防或治療腫瘤藥物。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種預(yù)防或治療腫瘤的方法，該方法包括，給個體施用安全有效量的本發(fā)明的上述的含腫瘤抗原的上清液或所述的致敏的樹突狀細(xì)胞的。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再
--累述。


圖1顯示了本發(fā)明一個實(shí)例中，用化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原，負(fù)載并活化樹突狀細(xì)胞的顯微鏡觀察結(jié)果。圖2顯示了化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原包含免疫刺激分子Hsp70。圖3顯示了化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原包含免疫刺激分子HMGBl。圖4顯示了化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原，可以刺激樹突狀細(xì)胞成熟并表達(dá)MHC II分子HLA-DR，共刺激分子CD80，CD86。圖5顯示了化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原，可以刺激樹突狀細(xì)胞成熟并表達(dá)多種細(xì)胞因子。圖6顯示了化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原，可以刺激樹突狀細(xì)胞成熟并表達(dá)多種趨化因子。圖7顯示了化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞刺激同種異體的T細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。圖8顯示了化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞對腫瘤的抑制作用。圖9顯示了化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞對荷瘤宿主生存期的延長作用。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞經(jīng)化療藥物5-FU誘導(dǎo)后的含腫瘤抗原的上清液是一種新的可用于制備腫瘤的疫苗的抗原材料，可以很好地解決疾病抗原不明確、難以誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的不足，同時可以明顯提高療效，具有制備簡便、特異性高、誘導(dǎo)免疫應(yīng)答強(qiáng)、療效好等特點(diǎn)，這類疫苗是一種經(jīng)化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原， 負(fù)載并活化樹突狀細(xì)胞，制備成腫瘤治療性的疫苗。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明的經(jīng)化療藥物5-FU誘導(dǎo)培養(yǎng)后獲得的上清液，含有腫瘤抗原，并且具有自身獨(dú)特的生物學(xué)特性，具體表現(xiàn)在(1)化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原具體為5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞；(2)化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原可以包含免疫刺激分子，如Hsp70，HMGBl(3)化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原可以刺激樹突狀細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如 IL-I β、IL-12、TNF- α 和 MIP-I α (CCL3)、ΜΙΡ-3 β (CCL19)和 IP-IO (CXCLlO)等；(4)化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原含有腫瘤相關(guān)及特異性抗原分子；(5)體外可以趨化和激活樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)抗原特異性和非特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能；本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，5-FU誘導(dǎo)后含腫瘤抗原的上清液可以顯著趨化DC和T細(xì)胞， 并且被所述含腫瘤抗原的上清液所致敏的樹突狀細(xì)胞可有效地激發(fā)針對腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)。制備方法本發(fā)明還提供這種所述含腫瘤抗原的上清液的制備方法，它主要包括步驟(a)將所述的腫瘤細(xì)胞在37士3°C下用化療藥物5_FU誘導(dǎo)培養(yǎng)0. 5-48小時，獲得培養(yǎng)液；和(b)對步驟(a)的培養(yǎng)液進(jìn)行離心，從而獲得培養(yǎng)上清。在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，在濃度為1.0X KTfiM至1.0X 10_2M(較佳地
0.5-1. 5 X 10_3M)的5-FU存在下，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，離心在5000-20000rpm下進(jìn)行。另一方面，本發(fā)明還提供了被上述上清液的致敏的樹突狀細(xì)胞的方法，包括以下步驟用本發(fā)明第一方面中所述的含腫瘤抗原的上清液，致敏樹突狀細(xì)胞，從而獲得致敏的樹突狀細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的被致敏的樹突狀細(xì)胞是培養(yǎng)5-7天的樹突狀細(xì)胞。在本發(fā)明的一個具體實(shí)例中，本發(fā)明方法包括(1)收集培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中的人腫瘤細(xì)胞， 調(diào)整濃度至l-2X106/ml，，加入終濃度為0. 5-1. 5X10_3M的5-Fu，5_Fu的優(yōu)化終濃度為
1.OX 101，然后在370C孵箱中孵育12-24小時(2)8000-10000rpm離心5_10分鐘，收集上清；獲得由化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原(3)取此化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原50mg/ml致敏48h的第6天DC，即獲得此種新型高效的用于腫瘤治療及預(yù)防的疫苗。組合物和用途本發(fā)明還提供了一種藥物組合物或免疫組合物。在所述組合物中，含有藥學(xué)上可接受的載體(包括稀釋劑、賦形劑等)以及有效量的本發(fā)明經(jīng)所述上清液致敏的樹突狀細(xì)胞。所述的致敏的樹突狀細(xì)胞的數(shù)量通常為1萬-100000萬個細(xì)胞/劑，較佳地為100 萬-10000萬個細(xì)胞/劑。
本文所用的術(shù)語“有效量”指治療劑治療、緩解或預(yù)防目標(biāo)疾病或狀況的量，或是表現(xiàn)出可檢測的治療或預(yù)防效果的量。對于某一對象的精確有效量取決于該對象的體型和健康狀況、病癥的性質(zhì)和程度、以及選擇給予的治療劑和/或治療劑的組合。因此，預(yù)先指定準(zhǔn)確的有效量是沒用的。然而，對于某給定的狀況而言，可以用常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定該有效量，臨床醫(yī)師是能夠判斷出來的。藥物組合物還可含有藥學(xué)上可接受的載體。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑(例如腫瘤抗原)給藥的載體。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受該組合物的個體有害的抗體，且給藥后沒有過分的毒性。這些載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在 Remington' s PharmaceuticalSciences (Mack Pub. Co. , N. J. 1991) 中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。治療性組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外， 這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)等。此外，免疫組合物中還可以含有免疫佐劑。通常，可將治療性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液中、液體載體的固體形式。—旦配成本發(fā)明的組合物，可將其直接給予對象。待預(yù)防或治療的對象可以是動物；尤其是人。本發(fā)明的含致敏的樹突狀細(xì)胞的治療或預(yù)防性藥物組合物(包括疫苗)，可以經(jīng)皮下、皮內(nèi)、腔內(nèi)、瘤內(nèi)或病變部位、淋巴結(jié)、靜脈注射或埋植等方式應(yīng)用。治療劑量方案可以是單劑方案或多劑方案。本發(fā)明的新型的腫瘤疫苗(即致敏的樹突狀細(xì)胞)可用于治療和預(yù)防腫瘤發(fā)生， 對已發(fā)生的腫瘤具有治療作用。代表性的例子包括(但并不限于)各種腫瘤如肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、黑色素瘤、腎癌、前列腺癌、惡性淋巴瘤、白血病、 宮頸癌、卵巢癌、鼻咽癌、口腔癌、骨肉瘤、腦膠質(zhì)瘤、膀胱癌、多發(fā)性骨髓瘤等的預(yù)防及治療。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明的致敏的樹突狀細(xì)胞可分泌多種趨化因子、共刺激分子、MHC分子以及攜帶腫瘤抗原信息。這種新型疫苗，可以有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高效的抗腫瘤免疫應(yīng)答，有效激發(fā)起特異性和非特異性抗腫瘤免疫，對腫瘤進(jìn)行治療以及預(yù)防其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。(2)這種新型高效的腫瘤疫苗，未經(jīng)基因修飾和外源基因?qū)耄虼藢C(jī)體潛在危害作用小，沒有倫理的難題，無個體限制性。制備簡單易行，是一種極有臨床應(yīng)用前景的新型生物制劑和疫苗，具有重要的應(yīng)用價值和良好的市場前景，對有效控制腫瘤的發(fā)生發(fā)展、 改善惡性腫瘤治療現(xiàn)狀具有重要意義，將有極大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York =ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)為重量百分比和重量份數(shù)。實(shí)施例1
新型高效腫瘤疫苗的制備收集培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)人腫瘤細(xì)胞(人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480)，調(diào)整濃度至IX 106/ml，加入終濃度為1. OX 10_3M的5_Fu，然后在37°C孵箱中孵育12小時，IOOOOrpm離心10分鐘，收集上清，作為腫瘤抗原。將如上獲得的由化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原，按腫瘤抗原50 μ g/106DC致敏48h的第6天DC，即獲得此種新型高效的用于腫瘤治療及預(yù)防的疫苗。顯微鏡下觀察結(jié)果，如圖1 所示。實(shí)施例2化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原包含免疫刺激分子Hsp70，HMGBl收集培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中的人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480， 調(diào)整濃度至1 X 106/ml，Iml/孔置于M孔板中，每孔分別加入0. 5X 101，1.0X 101， 1.5X1(^M&5-FU，于作用后的0、4、12、M小時后收集細(xì)胞及上清，用熱休克蛋白 70 (Hsp70)，高速泳動族蛋白Bl (HMGBl)Flisa kit (RD公司)，檢測細(xì)胞上清中免疫刺激分子的濃度。結(jié)果如圖2，圖3所示。結(jié)果表明化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原包含免疫刺激分子 Hsp70 和 HMGB1。實(shí)施例3化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原，可以刺激樹突狀細(xì)胞成熟并表達(dá)多種細(xì)胞因子和趨化因子收集培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中的人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480， 調(diào)整濃度IX 106/ml，置于培養(yǎng)瓶中，加入終濃度為1. 0X10_3M的5-FU，然后在37°C孵箱中孵育12小時，IOOOOrpm離心5_10分鐘，收集上清。將培養(yǎng)至第六天的DC，用人DC完全培養(yǎng)基(RPMI-1640 完全培養(yǎng)基，500U/ml rhGM-CSF、10ng/ml rhIL-4)調(diào)整細(xì)胞濃度為 2 X IO5 細(xì)胞/ml濃度，加入50 μ g/ml SW480細(xì)胞裂解液來源的抗原，4小時后收集細(xì)胞，F(xiàn)ACS標(biāo)記后，于流式細(xì)胞儀上記數(shù)，如圖4所示。收集上清，用細(xì)胞因子IL-I β、IL-12、TNF-α和與趨化因子MIP-I α、ΜΙΡ-3β和IP-IO的Elisa kit (RD公司)，檢測細(xì)胞上清中細(xì)胞因子和趨化因子的濃度。結(jié)果如圖5-6所示。圖5顯示，化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原，可以刺激樹突狀細(xì)胞成熟并表達(dá)多種細(xì)胞因子，包括 IL-I β、TNF-α、IL-12。圖6顯示，化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原，可以刺激樹突狀細(xì)胞成熟并表達(dá)多種趨化因子，其中包括MIP-la、MIP-3 0、IP-IO0實(shí)施例4化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞刺激同種異體的T細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用正常人外周血經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液(FiCOll-Hypaquel077)梯度離心后，收集富含單個核細(xì)胞的界面細(xì)胞，RPMI1640洗3遍，充分去除Ficoll-Hypaque 1077和血小板， 將其重懸于RPMI1640中，置37°C、5% CO2孵箱培養(yǎng)2小時，收集非貼壁細(xì)胞，用5 % FBS 的RPMI1640重懸，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2X 106/ml，此懸液中富含T淋巴細(xì)胞(反應(yīng)細(xì)胞)。將T淋巴細(xì)胞按2X 105/100 μ 1/孔加入96孔板，刺激細(xì)胞為化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原 50 μ g/ml致敏48h的第6天患者的新鮮制備的APDC，經(jīng)絲裂霉素C(25 μ g/ml)、37°C、5% CO2孵育1小時后，用5% FCS的RPMI1640充分洗滌去除絲裂霉素C，設(shè)置5X 104、1X 104、 2Χ 103/100 μ1/孔的刺激細(xì)胞，加入96孔板。每實(shí)驗(yàn)組設(shè)立3個復(fù)孔。設(shè)置陽性對照孔， PHA (5 μ g/ml)+T淋巴細(xì)胞；和陰性對照孔，單獨(dú)T淋巴細(xì)胞+1640。每組設(shè)3復(fù)孔。置37°C、 5% CO2孵箱中孵育96小時，于孵育結(jié)束前4小時加入5mg/ml的MTT (10 μ 1/孔)。將培養(yǎng)板200 X g離心10分鐘，棄去100 μ 1/孔的上清，加入DMSO溶液100 μ 1，37°C放置待甲臜結(jié)晶完全溶解后，于570nm處測定光密度值。結(jié)果表明，該化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原可以直接刺激或增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞刺激同種異體T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)。結(jié)果如圖7所示。結(jié)果顯示了化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞刺激同種異體的T細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。實(shí)施例5化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原，負(fù)載并活化樹突狀細(xì)胞，制備成腫瘤治療性疫苗對腫瘤生長的抑制作用頸椎脫位法處死HLA_A2/Kb小鼠，無菌取股骨，無血清RPMI1640培養(yǎng)基沖洗出骨髓細(xì)胞，IOOOgX 5分鐘離心后小心吸棄培養(yǎng)基上清，3-5ml的Tris-NH4Cl溶液溶去紅細(xì)胞， 加入抗la、B220、⑶4、⑶8單抗(終濃度均為10 μ g/ml)及補(bǔ)體(10 1稀釋)，37°C水浴 45分鐘溶除T、B及Ia+細(xì)胞，洗兩次后，以IX IO6細(xì)胞/孔加入M孔板培養(yǎng)，加lOng/ml mGM-CSF、lng/ml mIL-4,培養(yǎng)3天后，吸棄培養(yǎng)基及懸浮細(xì)胞，重新加入新鮮RPMI1640完全培養(yǎng)基及mGM-CSF、mIL-4，繼續(xù)培養(yǎng)3天后，吹打下疏松貼壁的增殖性細(xì)胞聚集體，收集后置新培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，3天后收集懸浮細(xì)胞即為富集的骨髓來源的樹突狀細(xì)胞。收集上述培養(yǎng)至第六天的小鼠DC，用小鼠DC培養(yǎng)基(RPMI1640完全培養(yǎng)基，IOng/ ml mGM-CSF、lng/ml mIL-4)調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X IO6細(xì)胞/ml濃度，分入M孔板，每孔lml， 孔數(shù)與需免疫的小鼠的只數(shù)相同，按照實(shí)驗(yàn)分組分別加入PBS、50ug/ml的化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原，并設(shè)置相同孔數(shù)的未加任何刺激的DC作為空白對照組，4小時后收集細(xì)胞，棄培養(yǎng)基上清，PBS離心洗滌細(xì)胞兩次以除去原培養(yǎng)基中存在的刺激物，最后用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為IXlO6細(xì)胞/ΙΟΟμ 1濃度，共200μ 1，隨即用于免疫小鼠。分別皮下注射IXIO6pbmc， 每只小鼠共免疫三次，間隔一周。末次免疫7天后，從各組隨機(jī)取三只小鼠，無菌操作摘取小鼠脾臟，作成T細(xì)胞，備用。6-8周齡的雌性裸鼠共15只，分為5組，每組5只，在每只小鼠的右側(cè)腹部皮下一點(diǎn)接種體外培養(yǎng)擴(kuò)增的活力良好的SW480腫瘤細(xì)胞，劑量為5Χ IO6細(xì)胞/鼠。3天后腫瘤長至30-50mm2大小后，尾靜脈回輸至荷瘤裸鼠體內(nèi)，數(shù)量為1 X IO8細(xì)胞 /500 μ 1 ·鼠，第一次回輸后7天進(jìn)行第二次回輸。每間隔2天對每只小鼠的腫瘤大小進(jìn)行測量，記為(mm2) 士SD，并觀察其存活期。當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到3cm時，處死小鼠，并在統(tǒng)計(jì)生存率時，將當(dāng)日記為死亡日期，結(jié)果表明采用本發(fā)明提供的新型腫瘤高效疫苗，可以明顯抑制腫瘤的生長如圖 8所示，延長荷瘤小鼠的存活時間如圖9所示。此外，重復(fù)實(shí)施例1，用人乳腺癌細(xì)胞SK-BR3、人前列腺癌細(xì)胞PC-3、人宮頸癌細(xì)胞HeLa替換結(jié)腸癌細(xì)胞SW480，制得經(jīng)化療藥物5-FU誘導(dǎo)的含腫瘤抗原的上清液，以及被所述上清液致敏DC細(xì)胞。結(jié)果，也獲得了類似的結(jié)果(抑制腫瘤的生長，并延長存活時間)。
討論常規(guī)化療藥物均為細(xì)胞毒性藥物，大多數(shù)化療藥物通過誘導(dǎo)凋亡等機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞的同時，也可殺傷機(jī)體正常的細(xì)胞，抑制患者的免疫功能。因此傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，化療之后機(jī)體免疫功能低下，化療藥物在某種程度上抑制免疫系統(tǒng)的功能。隨著對化療藥物的研究不斷深入，近年來的研究表明化療可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性、增強(qiáng)腫瘤抗原表達(dá)及表面共刺激分子等的表達(dá)、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對CTL的敏感性、減少免疫抑制因子和免疫抑制細(xì)胞的數(shù)量并抑制其功能進(jìn)而遏抑免疫抑制效應(yīng)。(一 )化療藥物可以抑制免疫抑制細(xì)胞和免疫抑制性細(xì)胞因子的產(chǎn)生①化療減少Treg細(xì)胞的數(shù)量并抑制其功能研究表明在卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、肝癌等多種腫瘤患者外周血中和腫瘤局部，Treg細(xì)胞比例增高，且數(shù)量與患者腫瘤進(jìn)展程度和預(yù)后，生存率呈負(fù)相關(guān)。 Curiel等證明在卵巢癌患者中，⑶4+⑶25+FOXp3+Treg抑制腫瘤特異性T細(xì)胞的免疫活性， 有助于腫瘤的生長、進(jìn)展。另外，Treg數(shù)目增多也與死亡危險率增高以及生存率降低有關(guān)。 Lutsiak等發(fā)現(xiàn)小劑量的CTX不僅能減少Treg細(xì)胞的數(shù)量，還能通過下調(diào)GITR和R)Xp3的表達(dá)而抑制Treg細(xì)胞的功能。除CTX外，迄今還發(fā)現(xiàn)其他一些化療藥物可以對Treg細(xì)胞起抑制作用，如Beyer等檢測73例接受氟達(dá)拉濱化療方案的B細(xì)胞慢性淋巴性白血病患者化療前、后(化療后第7天)的外周血，結(jié)果顯示化療后，Treg抑制功能明顯減弱，Treg數(shù)目明顯減少。吉西他濱與OXA等多藥聯(lián)合治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者也可明顯降低Treg細(xì)胞的數(shù)量②消除髓樣來源抑制細(xì)胞(myeloidderived suppressor cells, MDSCs)髓樣來源抑制細(xì)胞MDSCs是一組由粒細(xì)胞，單核/巨噬細(xì)胞和處于早期分化階段的髓系前體細(xì)胞組成的細(xì)胞群。腫瘤患者的外周血及腫瘤組織中MDSCs數(shù)量和比例均有大幅度的增加，貫穿腫瘤發(fā)生的整個過程，且與腫瘤的大小和惡性程度有一定的相關(guān)性。 MDSCs—方面可以表達(dá)多種促血管形成因子，如VEGF和MMPs，促進(jìn)腫瘤血管的形成。另一方面MDSCs可以通過表達(dá)高水平的ARGI、iN0S和ROS抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性抗腫瘤免疫及 NK和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)天然抗腫瘤免疫。研究報道部分化療藥物可以選擇性的消除MDSC并保留T細(xì)胞亞群進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤免疫和腫瘤疫苗的效應(yīng)。吉西他濱在建立的小鼠腫瘤模型中， 吉西他濱可以有效的減少在荷瘤小鼠脾臟中MDSC的數(shù)量，但并不減少CD4和CD8T細(xì)胞，還可以增強(qiáng)腫瘤特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，激活NK細(xì)胞，提高疫苗效應(yīng)。另外，還有一類分化誘導(dǎo)劑也可以作用于腫瘤病人減少M(fèi)DSC的積聚。全反式維甲酸ATRA，維生素A的衍生物，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化促M(fèi)DSC成熟，減弱免疫抑制效應(yīng)。用ATRA治療荷瘤小鼠，可以恢復(fù)T細(xì)胞反應(yīng)，減少在脾臟、淋巴結(jié)和骨髓中MDSC的數(shù)量并誘導(dǎo)其分化為成熟的DC，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。此外，對轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌病人給于ATRA治療可以減少M(fèi)DSC的數(shù)量并增強(qiáng)腫瘤特異性T細(xì)胞應(yīng)答(二)化療藥物可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性化療藥物可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡促進(jìn)各種內(nèi)源性免疫刺激分子的釋放。這些分子在正常狀態(tài)下存在于活細(xì)胞內(nèi)的一群分子，維持細(xì)胞內(nèi)各種功能，腫瘤細(xì)胞經(jīng)過外界刺激時，如化療藥物處理過后，可形成特殊的誘導(dǎo)免疫原性的細(xì)胞死亡，主要特點(diǎn)是刺激細(xì)胞免疫刺激分子表達(dá)至細(xì)胞膜上，或釋放至細(xì)胞外，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，激活抗原提呈細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤免疫效應(yīng)。這些免疫刺激分子主要包括熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)，高速泳動族蛋白 Bl (highmobility group box 1，HMGB1)，鈣網(wǎng)織蛋白 (calreticulin, CRT)等?；熕幬镞€可以促進(jìn)腫瘤抗原的表達(dá)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增強(qiáng)其MHC- I類分子、共刺激分子的表達(dá)，從而改變腫瘤細(xì)胞的免疫原性。MHC I類分子是抗原提呈系統(tǒng)中的重要成分，腫瘤細(xì)胞MHC I類分子及共刺激分子是效應(yīng)T細(xì)胞識別、殺傷腫瘤細(xì)胞所必須。而CEA 抗原被認(rèn)為是鑒定結(jié)腸癌等癌癥的重要指標(biāo)，且作為促進(jìn)機(jī)體的免疫應(yīng)答的腫瘤相關(guān)抗原疫苗已應(yīng)用于多種臨床試驗(yàn)中。本發(fā)明研制了一種新型高效樹突狀細(xì)胞腫瘤治療性疫苗，其可以有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高效的抗腫瘤免疫應(yīng)答，有效激發(fā)起特異性和非特異性抗腫瘤免疫，對腫瘤進(jìn)行治療以及預(yù)防其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)證實(shí)化療藥物一方面誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的凋亡和大量免疫刺激分子的釋放， 其誘導(dǎo)了后續(xù)的固有免疫和獲得性免疫效應(yīng)這些分子可以促進(jìn)DC等抗原遞呈細(xì)胞 (antigen presentation cell, APC)的成熟、誘導(dǎo)這些細(xì)胞分泌大量的趨化因子和細(xì)胞因子。一方面招募NK、巨噬細(xì)胞等固有免疫效應(yīng)細(xì)胞，殺傷腫瘤細(xì)胞，另一方面進(jìn)一步招募非成熟DC等具有攝取抗原能力的APC，攝取被遞呈化療誘導(dǎo)的凋亡釋放的腫瘤抗原，從而誘導(dǎo)后續(xù)的獲得性免疫應(yīng)答。另一方面化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原、MHC- I 類分子和fas，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對免疫效應(yīng)細(xì)胞的敏感性，去除免疫抑制細(xì)胞的效應(yīng)，從而增強(qiáng)誘發(fā)的固有和獲得性免疫效應(yīng)，起到殺傷腫瘤細(xì)胞抑制腫瘤生長的作用。由于這種新型高效樹突狀細(xì)胞腫瘤治療性疫苗，攜帶有腫瘤抗原，又有幾乎所有目前研制的高效腫瘤疫苗所必須的共刺激信號的特性，未經(jīng)基因修飾和外源基因?qū)耄虼藢C(jī)體潛在危害作用小，沒有倫理的難題，無個體限制性，且制備簡單易行，因而可成為一種極有臨床應(yīng)用前景的新型生物制劑和疫苗，具有重要的應(yīng)用價值和良好的市場前景， 對有效控制腫瘤的發(fā)生發(fā)展、改善惡性腫瘤治療現(xiàn)狀具有重要意義，將有極大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種含腫瘤抗原的上清液，其特征在于，所述的上清液是由腫瘤細(xì)胞經(jīng)化療藥物 5-氟尿嘧啶(5-FU)誘導(dǎo)培養(yǎng)后的，經(jīng)離心去除腫瘤細(xì)胞和固態(tài)雜質(zhì)后獲得的上清液，并且所述的上清液具有以下特征(a)包含以下免疫刺激分子HMGB1；(b)含有選自下組的免疫分子腫瘤抗原、MHC分子、粘附分子或共刺激分子；和(c)含有熱休克蛋白分子。
2.如權(quán)利要求1所述的含腫瘤抗原的上清液，其特征在于，所述的上清液還具有以下特性(d)可以刺激樹突狀細(xì)胞分泌選自下組的細(xì)胞因子和趨化因子IL-li3、IL-12、 TNF- α 和 MIP-I α (CCL3)、ΜΙΡ-3 β (CCL19)和 IP-IO (CXCLlO)；(e)所述的含腫瘤抗原的上清液在體外可以趨化和激活樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞，誘導(dǎo)抗原特異性和非特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
3.如權(quán)利要求1所述的含腫瘤抗原的上清液，其特征在于，是用如下方法制備的(a)將所述的腫瘤細(xì)胞在37士3°C下用化療藥物5-FU誘導(dǎo)培養(yǎng)0.5_48小時，獲得培養(yǎng)液；禾口(b)對步驟(a)的培養(yǎng)液進(jìn)行離心，從而獲得培養(yǎng)上清。
4.如權(quán)利要求1所述的含腫瘤抗原的上清液，其特征在于，所述的腫瘤細(xì)胞是選自下組腫瘤的細(xì)胞肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、黑色素瘤、腎癌、前列腺癌、惡性淋巴瘤、白血病、宮頸癌、卵巢癌、鼻咽癌、口腔癌、骨肉瘤、腦膠質(zhì)瘤、膀胱癌、多發(fā)性骨髓瘤。
5.一種致敏的樹突狀細(xì)胞，其特征在于，所述的樹突狀細(xì)胞是用權(quán)利要求1所述的含腫瘤抗原的上清液致敏的。
6.如權(quán)利要求5所述的致敏的樹突狀細(xì)胞，其特征在于，所述的致敏的樹突狀細(xì)胞具有以下特性(i)分泌選自下組的細(xì)胞因子和趨化因子IL-1β、IL-12、TNF-α和MIP-I α (CCL3)、 ΜΙΡ-3 β (CCL19)和 IP-IO (CXCLlO)；(ii)分泌MHC II 分子 HLA-DR ；(iii)分泌共刺激分子⑶80，⑶86；(iv)刺激同種異體的T細(xì)胞增殖。
7.—種藥物組合物，其特征在于，含有有效量的權(quán)利要求5所述的致敏的樹突狀細(xì)胞， 和藥學(xué)上可接受的載體。
8.一種制備含腫瘤抗原的上清液的方法，其特征在于，包括以下步驟(a)將所述的腫瘤細(xì)胞在37士3°C下用化療藥物5-FU誘導(dǎo)培養(yǎng)0.5_48小時，獲得培養(yǎng)液；禾口(b)對步驟(a)的培養(yǎng)液進(jìn)行離心，從而獲得培養(yǎng)上清。
9.一種制備權(quán)利要求5所述的致敏的樹突狀細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟用權(quán)利要求1所述的含腫瘤抗原的上清液，按50 μ g/ml (建議改為50 μ g/106個細(xì)胞)樹突狀細(xì)胞的劑量致敏樹突狀細(xì)胞，從而獲得致敏的樹突狀細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求1所述的含腫瘤抗原的上清液或權(quán)利要求5所述的致敏的樹突狀細(xì)胞的用途，其特征在于，用于制備預(yù)防或治療腫瘤藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新的腫瘤的樹突狀細(xì)胞治療性疫苗的制備方法及其用途。該類疫苗為化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原，負(fù)載并活化樹突狀細(xì)胞，制備成腫瘤治療性疫苗。本發(fā)明的化療藥物誘導(dǎo)性腫瘤抗原，包含多種免疫刺激分子和腫瘤相關(guān)及特異性抗原，可以顯著趨化和激活樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞等免疫細(xì)胞，刺激樹突狀細(xì)胞成熟并表達(dá)多種細(xì)胞因子和趨化因子，有效誘導(dǎo)抗原特異性和非特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。本發(fā)明的疫苗可用于腫瘤的預(yù)防及治療，具有制備簡便、成本低、特異性強(qiáng)、療效顯著等特點(diǎn)。
文檔編號A61K39/00GK102258772SQ20101018160
公開日2011年11月30日 申請日期2010年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月25日
發(fā)明者萬濤, 昂冰, 曹雪濤, 黃曉輝 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)