專利名稱：用于與軟骨損傷有關(guān)的應(yīng)用的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥組合物以及所述組合物在治療、緩解和預(yù)防與軟骨損傷相關(guān)的疾 病和與它相關(guān)的疼痛、或者預(yù)防關(guān)節(jié)病(artrose)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和與它相關(guān)的疼痛中 的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在工業(yè)世界中三個(gè)成年人中多達(dá)一個(gè)可能目前患有慢性關(guān)節(jié)癥狀或關(guān)節(jié)炎。最常 見的癥狀，持續(xù)的關(guān)節(jié)疼痛，可以表現(xiàn)為髖痛、膝痛、手痛或腕痛、以及在身體的其它區(qū)域中的 關(guān)節(jié)疼痛。所述癥狀造成痛苦并在人們被迫停止工作或削減工作時(shí)間時(shí)造成經(jīng)濟(jì)損失。醫(yī)療 護(hù)理也花費(fèi)不菲。顯然，需要用于緩解或治療關(guān)節(jié)癥狀和關(guān)節(jié)炎的經(jīng)濟(jì)有效的解決方案。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的具體實(shí)施方式
包括包含選自由下列物質(zhì)組成的組中的至少一個(gè)成員的 物質(zhì)在制備用于治療或預(yù)防軟骨的炎性或非炎性損傷的疾病和與上述相關(guān)的疼痛的藥物 制劑中的應(yīng)用α-酮戊二酸、谷氨酰胺、谷氨酸和這些酸的藥用鹽、α-酮戊二酸和氨基酸 或二肽或三肽的酰胺、谷氨酰胺和其它氨基酸的二肽、谷氨酰胺和其它氨基酸的三肽、谷氨 酸(glutamine acid)和其它氨基酸的二肽、谷氨酸和其它氨基酸的三肽和所述二肽和三肽 的藥用鹽、α-酮戊二酸或其藥用鹽與至少一種氨基酸的藥物學(xué)上可接受的物理狀態(tài)混合 物(physical mixture)。另外的具體實(shí)施方式
包括如上所述在用于治療或預(yù)防關(guān)節(jié)病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 以及與上述相關(guān)的疼痛中的應(yīng)用。另外的具體實(shí)施方式
包括如上所述在用于治療或預(yù)防在涉及重量減輕和/或受 損的營(yíng)養(yǎng)、或胃切除術(shù)、部分(局部)胃切除術(shù)或胃囊?guī)g(shù)(胃束帶，gastric banding)的 情況下的軟骨損傷中的應(yīng)用。另外的具體實(shí)施方式
包括如上所述在用于治療或預(yù)防在涉及營(yíng)養(yǎng)不良的情況下 的軟骨損傷中的應(yīng)用。另外的具體實(shí)施方式
包括如上所述用于在上述條件下減輕與軟骨損傷相關(guān)的疼 痛中的應(yīng)用。另外的具體實(shí)施方式
包括如上所述在用于治療或預(yù)防與胃切除術(shù)相關(guān)的骨質(zhì)疏 松癥中的應(yīng)用。


通過下面的借助優(yōu)選的具體實(shí)施方式
、實(shí)施例研究和附圖的描述將進(jìn)一步解釋本發(fā)明，附圖中圖1是描述了飲食α-酮戊二酸鹽和胃切除術(shù)對(duì)大鼠體重的影響的圖；圖2示出了實(shí)驗(yàn)大鼠的顱骨(顱蓋)的上部的四張透視照片；圖3是示出了實(shí)驗(yàn)大鼠的顱蓋的透視照片上發(fā)現(xiàn)的陷窩面積(區(qū)域，范圍，area)的圖。
具體實(shí)施例方式因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了選自由下列物質(zhì)組成的組中的至少一個(gè)成 員在制備用于治療或預(yù)防關(guān)節(jié)病(artrose)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和軟骨破壞的疾病和與上述 疾病相關(guān)的疼痛的藥物制劑中的新應(yīng)用，所述物質(zhì)為α-酮戊二酸、谷氨酰胺、谷氨酸和 這些酸的藥用鹽、α -酮戊二酸和氨基酸或者二肽或三肽的酰胺、谷氨酰胺和其它氨基酸的 二肽、谷氨酰胺和其它氨基酸的三肽、谷氨酸和其它氨基酸的二肽、谷氨酸和其它氨基酸的 三肽和所述二肽和三肽的藥用鹽、α“酮戊二酸或其藥用鹽與至少一種氨基酸的藥物學(xué)上 可接受的物理狀態(tài)混合物。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方式
，使用α-酮戊二酸或其堿金屬或堿土金屬鹽或 者它們的組合。優(yōu)選地，使用α-酮戊二酸鈉。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物(包括人)中選自 包括關(guān)節(jié)病的組的至少一個(gè)成員的增加的疼痛的疾病的方法，該方法包括給予需要這樣的 治療或預(yù)防的受治療者有效疼痛量的選自由下列物質(zhì)組成的組中的至少一種成員，所述物 質(zhì)為α -酮戊二酸、谷氨酰胺、谷氨酸和這些酸的藥用鹽、α -酮戊二酸和氨基酸或者二肽 或三肽的酰胺、谷氨酰胺和其它氨基酸的二肽、谷氨酰胺和其它氨基酸的三肽、谷氨酸和其 它氨基酸的二肽、谷氨酸和其它氨基酸的三肽和所述二肽和三肽的藥用鹽、α -酮戊二酸或 其藥用鹽與至少一種氨基酸的藥物學(xué)上可接受的物理狀態(tài)混合物。根據(jù)這些方面的優(yōu)選具體實(shí)施方式
，給予α -酮戊二酸或其堿金屬或堿土金屬鹽 或者它們的組合。最優(yōu)選地，給予α-酮戊二酸鈉。根據(jù)本發(fā)明所用的活性成分(有效成分，active principle)或組分(成分)的 藥物制劑可以給予脊椎動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物和鳥類，如嚙齒動(dòng)物，如小鼠、大鼠、豚鼠、或兔； 鳥，如火雞、母雞或小雞和其它雛雞以及自由行走的動(dòng)物；牛、馬、豬或小豬以及其它農(nóng)場(chǎng)動(dòng) 物、狗、貓和其它寵物，尤其是人。可以以不同的方式進(jìn)行給藥，取決于要治療的脊椎動(dòng)物是什么種類、需要所述方 法的脊椎動(dòng)物的疾病、以及要治療的特異性適應(yīng)癥(specific indication) 0在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，給藥作為食物或飼料添加劑進(jìn)行，如飲食添加劑和/或 固體食物形式的成分和/或飲料。另外的具體實(shí)施方式
可以在懸浮液或溶液中，如下面進(jìn) 一步描述的飲料。此外，形式可以為膠囊或片劑，如可咀嚼或可溶的，如泡騰片劑，以及粉劑 和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它干燥形式，如丸劑，如小丸、和顆粒。給藥可以作為腸胃外、直腸或經(jīng)口食物或飼料添加劑，如上所揭示的。腸道外載體包括氯化鈉溶液、林格(Ringer's)右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格(Ringer's)或固定 油(不揮發(fā)性油)。食物和飼料添加劑還可以被乳化。一種或多種活性治療成分隨后可以與賦形劑混合，賦形劑是藥物學(xué)上可接受的并且與活性成分是相容的。合適的賦形劑是，例如，水、鹽、 右旋糖、甘油、乙醇等以及它們的組合。此外，如果需要，該組合物可以包含少量的輔助物 質(zhì)，如濕潤(rùn)劑或乳化劑、PH、緩沖劑，其提高了活性成分的效能。 可以供應(yīng)不同形式的親本(parental)食物或飼料添加劑，如固體食物、液體或凍 干或以其他方式干燥的制劑。它可以包括各種緩沖劑(如，Tris-HCl、乙酸鹽、磷酸鹽)、pH 和離子強(qiáng)度的稀釋劑、添加劑如白蛋白或凝膠(明膠)以防止吸收到表面、去垢劑(如吐溫 20、吐溫80、PluroniC F68 (聚丙二醇與環(huán)氧乙烷的加聚物F68)、膽汁酸鹽)、增溶劑(如甘 油、聚乙二醇)、抗氧化劑(如抗壞血酸、焦亞硫酸鈉)、防腐劑(如硫柳汞(工汞硫代水楊酸 鈉，Thimerosal)、苯甲醇、對(duì)羥基苯甲酸酯類(parabens))、膨脹物質(zhì)(bulkingsubstance) 或張性改性劑(如乳糖、甘露醇)、聚合物如聚乙二醇到組合物的共價(jià)連接、與金屬離子絡(luò) 合、或物質(zhì)進(jìn)入或到達(dá)聚合化合物(如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝膠等)的微粒制劑的并入、或 物質(zhì)到達(dá)脂質(zhì)體、微乳、膠束、單層或多層泡囊、紅細(xì)胞影(erythrocyteghost)、或球形體。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，根據(jù)本發(fā)明的方法的任何一個(gè)中，食物或飼料添加劑以 飲料或它們的干燥組合物的形式給予。飲料包括有效量的活性成分或其成分，以及營(yíng)養(yǎng)上可接受的水溶性載體，如礦物、 維生素、碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)。如果飲料以干燥形式提供，則所有這些組分以干燥形 式供應(yīng)。所提供的準(zhǔn)備用于消費(fèi)的飲料還包括水。最終的飲料溶液還可以具有受控的張性 (tonicity)和酸度，如根據(jù)上面段落中的一般建議作為緩沖溶液。pH優(yōu)選在約2-5的范圍內(nèi)，尤其是約2-4，以防止細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)。也可以使用無(wú) 菌飲料，其中PH為約6-8。飲料可以單獨(dú)供應(yīng)或與一種或多種治療有效的組合物結(jié)合供應(yīng)。根據(jù)另外的具體實(shí)施方式
，作為用于口服和直腸應(yīng)用的藥物的藥物制劑可以為片 齊 、錠劑、膠囊、粉劑、水或油狀混懸劑、糖漿、酏劑、水溶液等的形式，包括活性成分或多種 成分，混合有藥用載體和/或添加劑，如稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體， 在本發(fā)明披露的方法和應(yīng)用中是有用的。此外，本文所用的“藥用載體”是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且可以包括，但不限 于，0.01-0. 05Μ磷酸鹽緩沖液或0.8%鹽水。此外，這樣的藥用載體可以為含水或非水溶 液、懸浮液、以及乳濁液。非水溶劑的實(shí)例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、以及可注 射的有機(jī)酯如油酸乙酯。含水載體包括水、醇/水溶液、乳濁液或懸浮液、包括鹽水和緩沖 介質(zhì)。腸胃外載體包括氯化鈉溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格或固定油。防 腐劑和其它添加劑也可以存在，如，例如，抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等。形成具有α -酮戊二酸的酰胺或具有谷氨酰胺或谷氨酸的二肽或具有谷氨酰胺 和/或谷氨酸的三肽的部分的氨基酸可以為自然界中作為肽中成分存在的任何氨基酸。同 樣的應(yīng)用于α-酮戊二酸或其鹽與至少一個(gè)氨基酸的藥學(xué)上可接受的物理狀態(tài)混合物。優(yōu) 選地，所述氨基酸或酸選自由精氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和賴氨酸組成的組。所述氨基酸優(yōu)選以它們的L-構(gòu)型使用。α -酮戊二酸與氨基酸或二肽或三肽的酰胺的實(shí)例包括，但不限于，α -酮戊二酸 與選自由下列物質(zhì)組成的組中的氨基酸的酰胺谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、鳥氨酸、賴氨 酸、脯氨酸、異亮氨酸和亮氨酸以及α-酮戊二酸與二肽的酰胺，其中所述二肽為谷氨酰胺與谷氨酸、精氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、脯氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的任何一個(gè)的二肽，以及谷氨酸與精氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、脯氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的任何一個(gè)的二肽。谷氨酰胺和谷氨酸與其它氨基酸的二肽和肽的實(shí)例包括上述那些，與α -酮戊二 酸與二肽或三肽的酰胺有關(guān)。α -酮戊二酸或其鹽與至少一種氨基酸的物理狀態(tài)混合物的實(shí)例包括，但不限于， 選自由α-酮戊二酸和其鈉、鉀、鈣和鎂鹽組成的組中的至少一個(gè)成員與谷氨酰胺、谷氨 酸、精氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸和脯氨酸以及所述氨基酸的任何組合中的任 何一個(gè)的物理狀態(tài)混合物。α-酮戊二酸或其鹽與所述物理狀態(tài)混合物的氨基酸或多個(gè)氨基酸的摩爾比一 般在1 0.01至1 2的限度內(nèi)，優(yōu)選為1 0. 1至1 1.5，并且最優(yōu)選為1 0. 2至 1 1.0。待給予的劑量將根據(jù)待所用的活性成分或成分、待治療的疾病、待治療的患者的 年齡、性別、體重等而變化，但一般在1至1000mg/kg體重/天的范圍內(nèi)，或從10至400mg/ kg體重/天，優(yōu)選從10至100mg/kg體重/天。現(xiàn)在，將通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步示出本發(fā)明，該實(shí)施例不應(yīng)被視為限制本發(fā)明 的范圍。實(shí)施例背景手術(shù)去除胃(胃切除術(shù)，Gx)導(dǎo)致動(dòng)物和人類中骨質(zhì)疏松癥。胃切除術(shù)主要 影響小梁骨的結(jié)構(gòu)。不清楚Gx是否也不利地影響骺板。飲食α-酮戊二酸(AKG)是羥脯 氨酸(羥基脯氨酸)的前體-骨和軟骨前膠原中最豐富的氨基酸。研究的目的是突出AKG 對(duì)胃切除術(shù)依賴性骨/軟骨損失的作用。方法利用40只雌性Sprague-Dawley大鼠。將20只大鼠胃切除并分成2組 Gx+AKG和Gx+安慰劑。對(duì)另外20只大鼠進(jìn)行假手術(shù)(sham-operate)并分成另外的2組 Sham (假手術(shù))+AKG和Sham (假手術(shù))+安慰劑。在8周后，處死動(dòng)物，收集顱蓋、股骨和脛 骨。估計(jì)右股骨和脛骨中的骨質(zhì)量密度(BMD)和骨礦物濃度(BMC)，并估計(jì)來(lái)自左骨的組織 形態(tài)計(jì)量學(xué)(組織形態(tài)測(cè)量學(xué)，histomorphometry)。還進(jìn)行了顱蓋的透視法測(cè)量。結(jié)果飲食α _酮戊二酸揭示了對(duì)胃切除的大鼠的顱蓋骨損失的強(qiáng)保護(hù)作用。AKG 表現(xiàn)了對(duì)胃切除大鼠的骺板細(xì)胞、小梁骨體積和小梁形狀的強(qiáng)抗破壞作用。結(jié)論:AKG最小化大鼠胃切除術(shù)后發(fā)展的骨和軟骨破壞。手術(shù)去除胃導(dǎo)致人類、大鼠和其它實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中骨質(zhì)減少和關(guān)節(jié)炎。胃切除術(shù)與人 類中的骨質(zhì)減少有關(guān)。胃功能障礙也有助于老年人中骨質(zhì)減少的發(fā)展。因此，大多數(shù)研究 涉及在胃切除后對(duì)患者的骨疾病處理。胃切除術(shù)主要影響小梁骨、有時(shí)也影響皮質(zhì)骨(骨皮質(zhì))、引起顱蓋骨破壞的顯著 作用。胃切除術(shù)后皮質(zhì)和小梁骨質(zhì)量的減少已經(jīng)在兩種人類性別中報(bào)道。在胃切除術(shù)16 周后脛骨和股骨中的小梁骨體積減少60%。骨損失增加了胃切除術(shù)患者中髖、椎骨和其它 部位的骨折風(fēng)險(xiǎn)，其是當(dāng)今嚴(yán)重的問題。假定胃切除患者中的骨損失不是飲食不足(如鈣)或缺乏胃酸或維生素D的結(jié) 果。胃切除術(shù)后引發(fā)的骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制仍是未知的。然而，假定，骨質(zhì)疏松癥的主要原因 是骨膠原在被破骨細(xì)胞大量破壞后不能重新合成。骨前膠原的主要成分是脯氨酸-在胃腸道中經(jīng)由谷氨酸鹽(谷氨酸)并經(jīng)由脯氨酸從AKG合成的氨基酸，其又在AKG、維生素C和 Fe2+的存在下在骨前膠原中轉(zhuǎn)化為羥(基)脯氨酸。最近顯示AKG可以有效防止卵巢切除 的大鼠和火雞中切除神經(jīng)的骨中的骨損失?？紤]到上述全部，所述研究的主要目的是研究 飲食AKG是否可以防止胃切除的大鼠中的骨和軟骨損失。動(dòng)物和手術(shù)過程將40 只雌性 Sprague-Dawley 大鼠，10 周大(220_230g)，容納在 Macrolon 籠中 (每個(gè)籠中2只大鼠)，并給予標(biāo)準(zhǔn)大鼠食物顆粒的飲食(Lactamin，Vadstena, Sweden)和 隨意溶解在水中的載體或AKG(表1)。該研究持續(xù)8周。對(duì)大鼠每周進(jìn)行稱重。大鼠每天飲水25至50毫升。原則上，可以認(rèn)為大鼠飲水在體重的10至20%之 間。AKG組大鼠每天飲用約25ml的AKG飲品(drink)。在25ml的飲品中，存在0. 36g 的AKG，其給了約1至1.4g的AKG/kg大鼠體重/天。安慰劑(對(duì)照)組大鼠每天飲用約 50ml的安慰劑飲品。手術(shù)20只大鼠被胃切除并分成2組Gx+AKG和Gx+安慰劑(每組10只大鼠)。胃的 腺部分(即，產(chǎn)酸部分、胃底和幽門竇)被切除，之后非腺體部分(前胃)與十二指腸首 尾相連的連接。20只大鼠被假手術(shù)并分成2組Sham(假手術(shù))+AKG和Sham(假手術(shù))+ 安慰劑(每組10只大鼠)。假手術(shù)涉及中線剖腹術(shù)、胃處理和切口閉合。通過皮下注射 Ketalar (50mg/kg ；Parke-Davis, MorrisPlains, NJ, U.S. A)禾口 Stresnil (40mg/kg ； Janssen-Cilag Pharma, Vienna, Austria)實(shí)現(xiàn)麻醉。通過皮下注身寸 Temgesic (0. 18mg/ kg ；Schering-Plough, Kenilworth, NJ, U. S. A)實(shí)現(xiàn)鎮(zhèn)痛。處理開始于用載體處理Sham(假 手術(shù))+安慰劑和Gx+安慰劑組，同時(shí)用AKG處理Sham (假手術(shù))+AKG和Gx+AKG。通過肌肉內(nèi)途徑每隔一周(開始于術(shù)后第一周)給Gx大鼠注射0. 4mg/kg的維生 素 B12(Betolvex lmg/ml, Dumex, Copenhagen, Denmark)以補(bǔ)充內(nèi)因子的損失，其對(duì)于S 氧化鐵聚麥芽糖復(fù)合體(Ferrum 50mgFe3+/ml，Vifor (International) Inc.，St. Gallen/ Switzerland)(作為用于由于胃酸損失的預(yù)期的鐵的不良吸收的補(bǔ)充)的維生素B12和 20mgFe37kg的吸收是重要的。這些補(bǔ)充對(duì)于沒有經(jīng)歷手術(shù)過程的大鼠的體重發(fā)展沒有影 響。在實(shí)驗(yàn)過程中8只動(dòng)物死亡。動(dòng)物的最終數(shù)量(n)在Sham(假手術(shù))+安慰劑中 為7只，在Sham (假手術(shù))+AKG中為10只，在Gx+安慰劑中為8只，以及在Gx+AKG組中為 7 O
‘Z、O在如上所述麻醉下通過從腹主動(dòng)脈放血處死全部大鼠。研究通過了瑞典蘭德當(dāng)?shù)貏?dòng)物福利委員會(huì)(Animal WelfareCommittee, Lund, Sweden)的批準(zhǔn)。組織收集和分析從每個(gè)大鼠切下顱蓋并通過仔細(xì)去除骨膜清除軟組織。通過用浸透鹽水的紗布覆 蓋每個(gè)顱蓋避免干燥，并將它們存儲(chǔ)在+4°C的密封容器中直到檢查。每個(gè)顱蓋被置于光源 頂端的玻璃板上(商業(yè)熒光管)，發(fā)出恒定強(qiáng)度的光。通過利用連接于操作顯微鏡(放大 率X16)的相機(jī)，為所獲得的透視圖像照相。將圖像進(jìn)行由Imagejv. 1.33a實(shí)施的組織形態(tài)計(jì)量學(xué)(histomor phometric)計(jì)算機(jī)分析。估計(jì)骨損失(作為觀察的陷窩面積)的百 分比。收集股骨和脛骨并儲(chǔ)存在70%的乙醇中直到進(jìn)一步分析。對(duì)右股骨和脛骨進(jìn)行PIXIMUS 分析，其給出了 BMD (以g/cm2表示)和BMC (以 g/cm3 表示)。將乙醇固定的左股骨和脛骨在7%的硝酸(nitrogen acid)中脫鈣48小時(shí)。遠(yuǎn) 端股骨和近端脛骨樣品(包括具有8mm的干骺端部分的骺)用于進(jìn)一步組織學(xué)處理。將該 樣品浸入到石蠟中。股骨和脛骨樣品的縱切片(6iim厚)通過自動(dòng)切片機(jī)Microm HM 360 切割。從1個(gè)個(gè)體的每1塊骨切割20張切片(每5張后具有20 y m的間隔)。在標(biāo)準(zhǔn)條件 下用蘇木精/伊紅(曙紅)將切片染色。從每個(gè)染色的切片獲取顯微鏡圖像。用于評(píng)估小 梁骨的圖片利用NikonEclipse E800-光學(xué)顯微鏡(放大率X40)和Nikon D70-數(shù)字照相 機(jī)采集。對(duì)股骨和脛骨的切片的顯微鏡圖像進(jìn)行組織形態(tài)計(jì)量學(xué)計(jì)算機(jī)分析。利用ImageJ v. 1. 33a分析小梁。用于評(píng)估骺板的圖片通過Nomarski對(duì)比技術(shù)制作并通過AXI0VERT 200M(裝備有LSM5 Pascal激光掃描頭，Zeiss，放大率X 100，具有514nm氬激光波長(zhǎng))收 集。利用Analysis v. 3.0分析骺板。利用AXIOVERT 200M(裝備有LSM 5 Pascal激光掃描 頭，Zeiss，放大率X 100，具有514nm氬激光波長(zhǎng))的熒光模式捕獲關(guān)節(jié)軟骨圖像。關(guān)節(jié)軟 骨的圖片通過Zeiss LSM圖像檢查儀v.3. 1. 0. 99評(píng)估。與骺板下面的小梁相關(guān)的考慮參數(shù) 為測(cè)量的小梁骨體積(BV/TV%)以獲得網(wǎng)狀骨的特征、以及小梁分形維數(shù)(Box Counting Method)。關(guān)于骺板的參數(shù)為在包括靜止區(qū)、增殖區(qū)和肥厚性軟骨區(qū)的R0I (感興趣區(qū)域) 內(nèi)的軟骨細(xì)胞的數(shù)量。借助LSM 5 Pascal激光掃描頭檢測(cè)器12位(bit)灰度級(jí)作為測(cè)量 規(guī)模，通過在隨機(jī)選擇R0I (對(duì)于每個(gè)切片相同的面積-6個(gè)圓圈，每個(gè)直徑為83 y m，沿著關(guān) 節(jié)軟骨)中的伊紅染色的膠原熒光強(qiáng)度測(cè)量進(jìn)行關(guān)節(jié)軟骨的相對(duì)膠原含量的估計(jì)。對(duì)于每 個(gè)切片在嚴(yán)格相同的標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行測(cè)量。統(tǒng)計(jì)將數(shù)據(jù)與單因素方差分析(AN0VA)、學(xué)生(student’ s) t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，并且p <0. 05被認(rèn)為統(tǒng)計(jì)上顯著。結(jié)果在實(shí)驗(yàn)的最后，手術(shù)處理的動(dòng)物的身體質(zhì)量(body mass)比假-手術(shù)的動(dòng)物少 8%。在組之間沒有統(tǒng)計(jì)上的顯著性差異(圖1)。顱蓋的透視顱蓋的透視表明與Sham(假手術(shù))+安慰劑和Sham(假手術(shù))+AKG大鼠相比，Gx+ 安慰劑和Gx+AKG大鼠中骨陷窩的百分?jǐn)?shù)的顯著增長(zhǎng)(圖2)。與Gx+安慰劑組相比，Gx+AKG 大鼠也表現(xiàn)出陷窩的顯著較低的百分?jǐn)?shù)fp = 0.031)(圖3)。Sham(假手術(shù))+安慰劑和 Sham(假手術(shù))+AKG之間的差異在統(tǒng)計(jì)上不顯著。股骨和脛骨中的骨礦物密度(BMD)和骨礦物含量(BMC)與Sham (假手術(shù))+安慰劑和Sham (假手術(shù))+AKG大鼠相比，Gx+安慰劑和Gx+AKG 大鼠中BMD和BMC較低(數(shù)據(jù)未示出)。然而，Gx+AKG中的BMD傾向于比Gx+安慰劑組大 (p = 0. 19)。組織形態(tài)計(jì)量學(xué)關(guān)節(jié)軟骨分析Gx+AKG組中的軟骨膠原的量類似于對(duì)照(假手術(shù))組中的量并且與Gx+安慰劑組 相比明顯較高(表2)。骺板分析骺生長(zhǎng)板細(xì)胞的定量分析表明與Gx+安慰劑相比，Gx+AKG組(均在股骨和脛骨 中)中的細(xì)胞數(shù)量增加。此外，Gx+AKG組中的軟骨細(xì)胞的數(shù)量顯著大于兩個(gè)Sham (假手術(shù)) 組(表3、4)。小梁骨分析與Sham (假手術(shù))+安慰劑和Sham (假手術(shù))+AKG大鼠相比，Gx+安慰劑和Gx+AKG 大鼠中的小梁骨體積減少。然而，Gx+AKG中小梁的面積減少小于Gx+安慰劑組(表5、6)。骨小梁的分形維數(shù)Gx+AKG中的分形維數(shù)類似于對(duì)照組并且高于Gx+安慰劑(表7、8)。碰實(shí)驗(yàn)的目的是評(píng)估飲食a-酮戊二酸對(duì)由胃切除術(shù)引起的骨損失的影響。獲得的 數(shù)據(jù)證明假設(shè)。確實(shí)，飲食AKG防止胃切除的大鼠中的骨和軟骨損失。我們的結(jié)果與最近 的實(shí)驗(yàn)一致，表明AKG防止卵巢切除的大鼠和絕經(jīng)期后的婦女中骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展。胃切除術(shù)在Gx+安慰劑中引起軟骨膠原和軟骨細(xì)胞損失，但是在Gx+AKG大鼠中 沒有引起。證明在Gx+AKG中的軟骨細(xì)胞比Gx+安慰劑中多22%。這表明AKG在防止胃切 除后的大鼠中的軟骨細(xì)胞的損失中是有效的。分析表明AKG對(duì)骨和軟骨膠原的保護(hù)作用。 Gx+AKG組中膠原的量在用于實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組的范圍內(nèi)，并且比Gx+安慰劑大鼠中高約18%。觀察到AKG對(duì)胃切除的大鼠中顱蓋骨的保護(hù)性作用。來(lái)自Gx+AKG大鼠的顱蓋表 現(xiàn)出比來(lái)自Gx+安慰劑大鼠的顱蓋的損傷少20%。BMD和BMC值表明胃切除術(shù)引起Gx+ 安慰劑和Gx+AKG大鼠中的骨質(zhì)減少，這與其它實(shí)驗(yàn)一致。然而，利用更敏感的組織形態(tài)計(jì) 量學(xué)方法，我們表明AKG在防止GX大鼠中的骨質(zhì)減少方面可能有效。此外，表明與Gx+安慰劑動(dòng)物相比，檢查的小梁骨體積在Gx+AKG大鼠中減少小 于38%。此外，Gx+AKG組中小梁的分形維數(shù)表現(xiàn)出與假手術(shù)組中幾乎相同的水平。因此， a-酮戊二酸確實(shí)對(duì)骨小梁的結(jié)構(gòu)的重新構(gòu)建具有很大影響。胃切除術(shù)對(duì)骨骼具有強(qiáng)大的破壞作用，引起骨質(zhì)減少和關(guān)節(jié)病。AKG不能完全停止 這些損傷，但是它的確限制骨和軟骨中較大的破壞性胃切除術(shù)相關(guān)的變化并可能改善骨骼 系統(tǒng)的重新構(gòu)建。這些觀察結(jié)果的含義對(duì)于人類中的臨床考慮可能是重要的，例如，其中部 分胃切除術(shù)被推薦用于肥胖患者中的體重減輕。所有這些患者發(fā)展了骨質(zhì)減少和關(guān)節(jié)病。 因此，技術(shù)人員可以推測(cè)對(duì)于這些患者飲食的AKG可以停止或限制這些破壞性骨變化。表1. AKG和安慰劑飲品的組成 為實(shí)現(xiàn)每種溶液中pH相同的水平，安慰劑飲品用0. 1M HC1滴定到pH4. 6 (AKG 飲品的pH水平)。
表2. AKG和胃切除術(shù)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨膠原相對(duì)含量的作用
處理熒光標(biāo)準(zhǔn)差(SD)
Gx+AKG2363a623
Gx+安慰劑1928'3 647
Sham+AKG2475a457
Sham+安慰劑2171'3 374
伴隨欄中的結(jié)果給出的不同字母描述了當(dāng)P < 0. 05時(shí)的顯著性差異。
在 Gx+AKG 中 n =:7，在Gx+安慰劑中n = 8，在Sham(假手術(shù))+AKG中n = 10，在Sham (假手術(shù))+安慰劑中n = 7o
表3. AKG和胃切除術(shù)對(duì)股骨骺板軟骨細(xì)朐,的數(shù)量的作用
處理細(xì)胞的數(shù)量/mm2 SD
Gx+AKG2220a 490
Gx+安慰劑1760b 360
Sham+AKG1890b 330
Sham+安慰劑1850b 220
伴隨欄中的結(jié)果給出的不同字母描述了當(dāng)P < 0. 05時(shí)的顯著性差異。
在 Gx+AKG 中 n =7，在Gx+安慰劑中n = 8，在Sham+AKG中n = 10，在Sham+安慰劑中n=7。
表4. AKG和胃切除術(shù)對(duì)脛骨骺板軟骨細(xì)胞的數(shù)量的作用
處理細(xì)胞的數(shù)量/mm2 SD
Gx+AKG2470a470
Gx+安慰劑1950b330
Sham+AKG1840b410
Sham+安慰劑2110b340
伴隨欄中的結(jié)果給出的不同字母描述了當(dāng)P<0. 05時(shí)的顯著性差異。
在 Gx+AKG 中 n=7，在Gx+安慰劑中n = 8，在 Sham+AKG 中 n = 10，在 Sham+ 安慰劑中n=7。
表5. a -酮戊二二酸和胃切除術(shù)對(duì)股骨小梁骨體積的作用
處理小梁的面積(％ )SD
Gx+AKG18. 8a3. 7
Gx+安慰劑11. 2b2. 1
Sham+AKG25. 5C7. 8
Sham+安慰劑24. 5C5. 9
伴隨欄中的結(jié)果給出的不同字母描述了當(dāng)P<0. 05時(shí)的顯著性差異。
在 Gx+AKG 中 n=7，在Gx+安慰劑中n = 8，在 Sham+AKG 中 n = 10，在 Sham+ 安慰劑中n=7。
表6. a -酮戊二二酸和胃切除術(shù)對(duì)脛骨小粱骨體積的作用
處理小梁的面積(％ )SD
Gx+AKG16. T3. 4
Gx+安慰劑10. 5b2. 5
Sham+AKG24. 9C5. 3
Sham+安慰劑21. lc5. 7
伴隨欄中的結(jié)果給出的不同字母描述了當(dāng)P<0. 05時(shí)的顯著性差異。
在 Gx+AKG 中 n=7，在Gx+安慰劑中n = 8，在 Sham+AKG 中 n = 10，在 Sham+ 安慰劑中n=7。
表7. a-酮戊二二酸和胃切除術(shù)對(duì)股骨小梁的分形維數(shù)的作用
處理分形維數(shù)[D]SD
Gx+AKG1. 22b0. 02
Gx+安慰劑1. 19a0. 03
Sham+AKG1. 24b0. 04
Sham+安慰劑1. 25b0. 03
伴隨欄中的結(jié)果給出的不同字母描述了當(dāng)P<0. 05時(shí)的顯著性差異。
在 Gx+AKG 中 n=7，在Gx+安慰劑中n = 8，在 Sham+AKG 中 n = 10，在 Sham+ 安慰劑中n=7。
表8. a-酮戊二二酸和胃切除術(shù)對(duì)脛骨小梁的分形維數(shù)的作用
處理分形維數(shù)[D]SD
Gx+AKG1. 22b 0. 02
Gx+安慰劑1. 17a0. 02
Sham+AKG1. 22b 0. 03
11
Sham+安慰劑 1. 21b0.04伴隨欄中的結(jié)果給出的不同字母描述了當(dāng)ρ < 0. 05時(shí)的顯著性差異。在Gx+AKG 中 η = 7，在 Gx+ 安慰劑中 η = 8，在 Sham+AKG 中 η = 10，在 Sham+ 安慰 劑中η = 7。圖的圖灃圖1.飲食α -酮戊二酸和胃切除術(shù)對(duì)大鼠體重的作用。對(duì)照組SHAM+PLAC、GX+PLAC實(shí)驗(yàn)組SHAM+AKG、GX+AKG (SHAM-假手術(shù)的大鼠、GX-胃切除的大鼠)。圖2.測(cè)試的動(dòng)物的顱蓋的選擇的照片。對(duì)照組SHAM+PLAC、GX+PLAC實(shí)驗(yàn)組 SHAM+AKG、GX+AKG(SHAM-假手術(shù)的大鼠、GX-胃切除的大鼠)。圖3.飲食α -酮戊二酸和胃切除術(shù)對(duì)顱蓋的透視的作用。對(duì)照組SHAM+PLAC、 GX+PLAC實(shí)驗(yàn)組SHAM+AKG、GX+AKG (SHAM-假手術(shù)的大鼠、GX-胃切除的大鼠)。*p = 0. 0288
權(quán)利要求
α-酮戊二酸或α-酮戊二酸的藥用鹽在制備用于治療或預(yù)防軟骨損傷的藥物制劑中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述α-酮戊二酸或所述α-酮戊二酸的藥用鹽 是與至少一種氨基酸的藥物學(xué)上可接受的物理狀態(tài)混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中，所述氨基酸選自谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、鳥 氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸以及它們的組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的應(yīng)用，其中，所述α-酮戊二酸的藥用鹽是堿金屬鹽或堿 土金屬鹽或它們的組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4所述的應(yīng)用，其中，所述α-酮戊二酸的藥用鹽是α-酮戊二酸鈉。
6.α -酮戊二酸和氨基酸、二肽或三肽的酰胺在制備用于治療或預(yù)防軟骨損傷的藥物 制劑中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中，所述與α-酮戊二酸形成酰胺的氨基酸選自谷 氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、脯氨酸、異亮氨酸以及亮氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中，所述與α-酮戊二酸形成酰胺的二肽是谷氨酰胺 與谷氨酸、精氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、脯氨酸、異亮氨酸和亮氨酸中的任何一個(gè)的二肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8所述的應(yīng)用，其中，所述軟骨損傷是在涉及重量減輕和/或受損的 營(yíng)養(yǎng)、營(yíng)養(yǎng)不良、胃切除術(shù)、部分胃切除術(shù)或胃囊?guī)g(shù)的情況下引起的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9所述的應(yīng)用，其中，給予患者的劑量在所述物質(zhì)的1至IOOOmg/ kg體重/天的間隔內(nèi)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-9所述的應(yīng)用，其中，給予患者的劑量在所述物質(zhì)的10至400mg/ kg體重/天的間隔內(nèi)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-9所述的應(yīng)用，其中，給予患者的劑量在所述物質(zhì)的10至IOOmg/ kg體重/天的間隔內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于與軟骨損傷有關(guān)的應(yīng)用的藥物。本發(fā)明還涉及用于治療醫(yī)學(xué)關(guān)節(jié)疾病如關(guān)節(jié)病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及軟骨損傷的物質(zhì)的應(yīng)用。該應(yīng)用包括α-酮戊二酸、谷氨酰胺或谷氨酸、以及所述物質(zhì)的鹽、酰胺、二肽或三肽的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K31/194GK101843609SQ20101017090
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2006年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月15日
發(fā)明者斯特凡·皮爾齊諾斯基 申請(qǐng)人:安特瑞斯公司