本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)病理領(lǐng)域，尤其涉及一種玻璃化冷凍保存軟骨的方法。

背景技術(shù)：

近年來，隨著我國人們生活水平的提高以及體育運動的全面普及，關(guān)節(jié)軟骨損傷患者顯著增多。軟骨移植是目前治療軟骨病變的十分有前景的修復(fù)方法之一。因為異體軟骨移植材料獲得相對較容易且可預(yù)制成任意形狀和大小,便于將正常功能的關(guān)節(jié)軟骨制成各種形狀植于骨缺損處，恢復(fù)軟骨的外形。

近年來，同種異體骨軟骨移植技術(shù)受到臨床學(xué)者的關(guān)注。在實施關(guān)節(jié)軟骨移植治療過程中，軟骨取材后的儲藏、保存是保證手術(shù)實施的重要一環(huán)。傳統(tǒng)低溫冷凍法盡管能夠保存軟骨組織一定的活性，但會造成軟骨基質(zhì)的斷裂。

傳統(tǒng)的低溫方法有很多局限性，無法避免冷凍過程中細胞內(nèi)冰晶的形成，操作過程繁瑣，需要昂貴的程序降溫儀等。近年發(fā)展起來的玻璃化冷凍法以一種液態(tài)和固態(tài)之間的非晶體透明的玻璃樣高粘度物質(zhì)，并以這種狀態(tài)在低溫下長期保存，避免了冰凍過程中細胞內(nèi)冰晶的形成，極大的減慢了反應(yīng)速度，顯著降低了細胞損傷的概率，使細胞長期維持相對穩(wěn)定狀態(tài)。

但是，玻璃化冷凍法在軟骨保存的應(yīng)用，并不完善，還存在著很多需要改善和提升的地方。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種玻璃化冷凍保存軟骨的方法，降低冰凍液對軟骨的毒性損傷，提高軟骨細胞的成活率和生物活性。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種玻璃化冷凍保存軟骨的方法，包括以下步驟：

1)配置玻璃化冷凍液在Hanks平衡鹽溶液加入DMSO、乙酰胺、丙二醇、半乳糖、青霉素和聚乙二醇，用2mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.3-7.5。

2)細胞培養(yǎng)將收集的軟骨以滅菌PBS充分漂洗，并進行細胞培養(yǎng)和細胞傳代，得細胞懸液。

3)冷凍保存將細胞懸液和玻璃化冷凍液分別預(yù)冷至4℃2h，緩慢向細胞懸液滴加玻璃化冷凍溶液得到細胞冷凍懸液，將細胞冷凍懸液分裝于冷凍管管中，將凍存管兩端以火焰封口，將冷凍管快速投入液氦中保存。

作為一種優(yōu)選的方案，步驟1)中，所述玻璃化冰凍液中，每1000ml的Hanks平衡鹽溶液中還包括：DMSO 18-22mmol，乙酰胺14-16mmol、丙二醇8-10mmol、半乳糖2-5g、聚乙二醇5-6mmol和青霉素70-90U。

作為一種優(yōu)選的方案，每1000ml的Hanks平衡鹽溶液中還包括：DMSO20.5mmol、乙酰胺15.5mmol、丙二醇10mmol、半乳糖3g、青霉素90U和聚乙二醇6mmol，用2mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.4。用2mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.4。

作為一種優(yōu)選的方案，步驟3)中，向細胞懸液滴加玻璃化冷凍溶液的滴加過程為：前3min以0.3ml/min滴加，后5min以0.6ml/min滴加，余下的凍存液以0.75ml/min滴加。

作為一種優(yōu)選的方案，還包括復(fù)溫過程，將冷凍管放入37℃水浴復(fù)溫，不斷攪拌直到完全融化后，收集細胞懸液備用。

作為一種優(yōu)選的方案，收集的細胞懸液放入PBS緩沖液中備用。

由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明涉及的玻璃化冷凍保存軟骨的方法選用的玻璃化冷凍液，低濃度滲透液降低了對軟骨細胞的毒性損傷。用Hanks平衡鹽溶液加入DMSO、乙酰胺、丙二醇、半乳糖、青霉素和聚乙二醇的冷凍液，延長了細胞的保存時間。

使用溫度更低的液氦(﹣269℃)為冷源冷凍保存皮膚間充質(zhì)干細胞，取得的結(jié)果是液氦冷凍的效果優(yōu)于液氮冷凍。液氦是唯一在常壓下和沸點以下直至趨近絕對零度仍保持液態(tài)的物質(zhì)，是目前可被利用的、溫度最低的液體。

選用液氦液氦(﹣269℃)取代液氮(﹣196℃左右)作為冷源，在相同操作條件下，降溫速率提高，進一步降低了軟骨細胞的損傷概率，提高了軟骨細胞的成活率和生物活性。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實施例1

一種玻璃化冷凍保存軟骨的方法，包括以下步驟：

1)配置玻璃化冷凍液每1000ml的Hanks平衡鹽溶液中還包括：DMSO20.5mmol、乙酰胺15.5mmol、丙二醇10mmol、半乳糖3g、青霉素90U和聚乙二醇6mmol，用2mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.4。用2mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.4。

2)細胞培養(yǎng)將收集的軟骨以滅菌PBS充分漂洗，并進行細胞培養(yǎng)和細胞傳代，得細胞懸液。

3)冷凍保存將細胞懸液和玻璃化冷凍液分別預(yù)冷至4℃2h，緩慢向細胞懸液滴加玻璃化冷凍溶液得到細胞冷凍懸液，滴加過程為：前3min以0.3ml/min滴加，后5min以0.6ml/min滴加，余下的凍存液以0.75ml/min滴加。將細胞冷凍懸液分裝于冷凍管中，將凍存管兩端以火焰封口，將冷凍管快速投入液氦中保存。

4)復(fù)溫將冷凍管放入37℃水浴復(fù)溫，不斷攪拌直到完全融化后，收集細胞懸液，用磷酸鹽緩沖液液沖洗3遍，然后用熒光標記法測定細胞存活率為86％。

同樣條件下，分別采用程序性降溫法、梯度降溫法、采用氮氣降溫的玻璃化冷卻法保存軟骨細胞相同時間，測定細胞存活率為79％、62％和82％?？梢钥闯霰景l(fā)明涉及的冷凍保存方法提高了細胞的成活率。

實施例2

一種玻璃化冷凍保存軟骨的方法，包括以下步驟：

1)配置玻璃化冷凍液每1000ml的Hanks平衡鹽溶液中加入：DMSO 20mmol，乙酰胺16mmol、丙二醇8mmol、半乳糖4g和聚乙二醇5mmol以及青霉素70U，用2mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.4。

2)細胞培養(yǎng)將收集的軟骨以滅菌PBS充分漂洗，并進行細胞培養(yǎng)和細胞傳代，得細胞懸液。

3)冷凍保存將細胞懸液和玻璃化冷凍液分別預(yù)冷至4℃2h，緩慢向細胞懸液滴加玻璃化冷凍溶液得到細胞冷凍懸液，滴加過程為：前3min以0.3ml/min滴加，后5min以0.6ml/min滴加，余下的凍存液以0.75ml/min滴加。將細胞冷凍懸液分裝于冷凍管中，將凍存管兩端以火焰封口，將冷凍管快速投入液氦中保存。

4)復(fù)溫將冷凍管放入37℃水浴復(fù)溫，不斷攪拌直到完全融化后，收集細胞懸液備用。然后用熒光標記法測定細胞存活率為84％。

實施例3

一種玻璃化冷凍保存軟骨的方法，包括以下步驟：

1)配置玻璃化冷凍液每1000ml的Hanks平衡鹽溶液中加入：DMSO18mmol，乙酰胺14mmol、丙二醇8mmol、半乳糖2g和聚乙二醇5mmol以及青霉素75U，用2mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.4。

2)細胞培養(yǎng)將收集的軟骨以滅菌PBS充分漂洗，并進行細胞培養(yǎng)和細胞傳代，得細胞懸液。

3)冷凍保存將細胞懸液和玻璃化冷凍液分別預(yù)冷至4℃2h，緩慢向細胞懸液滴加玻璃化冷凍溶液得到細胞冷凍懸液，滴加過程為：前3min以0.3ml/min滴加，后5min以0.6ml/min滴加，余下的凍存液以0.75ml/min滴加。將細胞冷凍懸液分裝于冷凍管中，將凍存管兩端以火焰封口，將冷凍管快速投入液氦中保存。

4)復(fù)溫將冷凍管放入37℃水浴復(fù)溫，不斷攪拌直到完全融化后，收集細胞懸液備用。然后用熒光標記法測定細胞存活率為85％。