專(zhuān)利名稱(chēng)：一種組織工程化軟骨的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組織工程化軟骨的制造方法，包括所需的可降解多孔生物陶瓷支架材料，屬于組織工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)軟骨創(chuàng)傷修復(fù)目前仍是臨床醫(yī)學(xué)的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)?，F(xiàn)有的治療方案包括軟骨組織或骨-軟骨組織移植和人工關(guān)節(jié)。自體軟骨是最好的移植材料，但因工體有限，而且通常需要在第二個(gè)部位手術(shù)以獲取足夠的用于移植的軟骨組織，因此就應(yīng)用而言并不理想。而人工關(guān)節(jié)替代性修復(fù)迄今為止上難以達(dá)到功能性修復(fù)效果，并且常會(huì)伴有各種并發(fā)癥的產(chǎn)生。盡管人們?cè)谶@一領(lǐng)域進(jìn)行了多年不懈的努力，但仍需尋找一種關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的有效治療方法，提供適當(dāng)?shù)纳硇孕迯?fù)，從而避免再?gòu)幕颊呱砩鲜占罅孔泽w軟骨組織，以一種創(chuàng)傷修復(fù)另外一種創(chuàng)傷。
組織工程技術(shù)的興起為軟骨組織的生理性修復(fù)帶來(lái)了希望。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)相繼報(bào)道有采用該技術(shù)構(gòu)建軟骨，在裸鼠和具有免疫力的小鼠、大鼠、兔、豬等動(dòng)物體內(nèi)取得成功的例子。但這些研究所采用的支架材料均是聚合物或膠原等有機(jī)大分子。而聚合物在體內(nèi)降解時(shí)會(huì)造成酸性產(chǎn)物堆積，給軟骨組織新生帶來(lái)不利的影響；膠原或凝膠類(lèi)材料則遇水后容易形變，不足以對(duì)軟骨細(xì)胞的新生提供持續(xù)有力的支撐。以上兩種不足嚴(yán)重限制了軟骨組織工程產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。
磷酸三鈣多孔生物陶瓷是一種無(wú)機(jī)的可降解的生物材料，該材料除生物相容性和機(jī)械力學(xué)強(qiáng)度上的優(yōu)點(diǎn)外，還由于優(yōu)異的加工工藝具有特殊的微結(jié)構(gòu)，孔型規(guī)則，孔隙率高，孔與孔之間連接徑合理。該結(jié)構(gòu)不僅可提高組織和細(xì)胞的長(zhǎng)入性，還可以借此調(diào)節(jié)在體內(nèi)的降解速率，以使其與組織的新生速度相協(xié)調(diào)。材料的大小和形狀與新生組織的大小和形狀一致，有利于對(duì)結(jié)果的控制。另外，材料的大小和形狀也可預(yù)制，因此不受缺損大小和形狀的限制。該材料在骨組織工程中得到了廣泛而深入的研究和應(yīng)用，并且表現(xiàn)出了卓越的骨再生潛能，究中完成，并且已獲準(zhǔn)進(jìn)入臨床。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服上述軟骨組織工程研究中的不足，提供一種以生物可降解多孔陶瓷為支架的組織工程化軟骨的制造方法。該多孔陶瓷作為支架材料可以是α-TCP(圖1)，也可以是β-TCP。本發(fā)明以生物可降解多孔陶瓷為支架制造組織工程化軟骨，其方法如下1)軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增局部麻醉下無(wú)菌切取關(guān)節(jié)面非負(fù)重區(qū)軟骨組織(為減少手術(shù)取材創(chuàng)傷，對(duì)患者而言，損傷關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)作為軟骨工區(qū)首選)，放入裝有含抗生素的培養(yǎng)基的小瓶中帶回實(shí)驗(yàn)室，用剪刀剪碎成1mm3的小塊，置于0.5~1.5％的II型膠原酶溶液中，4℃消化6~10小時(shí)，或37℃消化1~4小時(shí)，獲得的單細(xì)胞用含10~15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成懸液，以2~4×106的密度接種到培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中，在37℃，5％CO2，飽和濕度的CO2孵箱中培養(yǎng)擴(kuò)增3代。
2)支架材料預(yù)處理可降解多孔生物陶瓷材料預(yù)制成各種規(guī)格的圓片狀，或根據(jù)需要預(yù)制成其它形狀，60gray60Co照射，也可以是75％酒精浸泡10分鐘～1小時(shí)消毒。用前用95％酒精浸泡以提高親水性，然后用無(wú)血清培養(yǎng)基或PBS緩沖液將酒精置換出來(lái)，滅菌干紗布吸干液體。
3)組織工程化軟骨的構(gòu)建將第3代軟骨細(xì)胞制成1～2×107/ml的軟骨細(xì)胞懸液，輕輕滴加在支架材料上，并輕輕翻轉(zhuǎn)材料，使細(xì)胞分布盡量均勻。將軟骨細(xì)胞一多孔陶瓷復(fù)合體放入孵箱中，37℃，5％CO2，飽和濕度下靜置6～10小時(shí)，使細(xì)胞貼附在材料的孔洞內(nèi)和表面。然后轉(zhuǎn)移入旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行三維立體培養(yǎng)。旋轉(zhuǎn)速度15~50rpm。
4)體內(nèi)植入手術(shù)暴露損傷關(guān)節(jié)面，修整創(chuàng)面使之與構(gòu)建的復(fù)合物大小和形狀一致，小心將復(fù)合物嵌入缺損區(qū)，并使之與周?chē)M織密合，關(guān)閉關(guān)節(jié)囊，縫合傷口。術(shù)后4周內(nèi)關(guān)節(jié)制動(dòng)。
有益效果本發(fā)明組織工程化軟骨的制造方法使用的可降解多孔生物陶瓷支架材料生物相容性好，機(jī)械強(qiáng)度高，微結(jié)構(gòu)合理，適于軟骨細(xì)胞的長(zhǎng)入和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，其降解速率可以也軟骨組織的新生速度相協(xié)調(diào)，最終在體內(nèi)形成正常的有功能的軟骨組織，實(shí)現(xiàn)功能性軟骨的再生，再生的軟骨組織可以與周?chē)M織自然整合，且具有更大的最終強(qiáng)度和穩(wěn)定性，對(duì)損傷或缺損實(shí)現(xiàn)生理性修復(fù)。由于可降解多孔生物陶瓷加工工藝成熟，可批量生產(chǎn)，自體軟骨取材容易、不會(huì)有免疫排斥，因此本發(fā)明制造的組織工程化軟骨具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例羊自體關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)1)組織工程化軟骨的構(gòu)建所有步驟均參照3DA相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。將28只中國(guó)美麗奴綿羊(6月齡，雌雄不拘)隨機(jī)分成三組實(shí)驗(yàn)組(10只)、材料對(duì)照組(10只)、空白對(duì)照組(4只)，實(shí)驗(yàn)組在前肢肱骨遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)面非負(fù)重區(qū)片取軟骨組織，約3～5g。在0.5％的II型膠原酶中4℃過(guò)夜消化，收集細(xì)胞，置75ml塑料培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM+10％胎牛血清(FCS)，0.25％胰酶。收集第3代細(xì)胞，制備成1.5～2×107/ml的細(xì)胞懸液，接種到圓柱狀(直徑10mm，厚4mm)α-TCP支架上，盡量使細(xì)胞分布均勻。α-TCP多孔生物陶瓷材料由上海貝奧路公司專(zhuān)利的方法和工藝生產(chǎn)，材料經(jīng)60gray60Co照射消毒后用于組織工程化關(guān)節(jié)軟骨構(gòu)建，在一個(gè)優(yōu)選的方案中，其微結(jié)構(gòu)為孔徑-100～300μm，孔隙率-52％，孔間連接徑-30～100μm。靜置6小時(shí)后，將復(fù)合物移入RCCS(旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器，Synthecom公司)，在含10％FCS的DMEM中培養(yǎng)48小時(shí)，轉(zhuǎn)速為30rpm。
2)組織工程化軟骨在羊關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用在各組動(dòng)物的前肢肱骨遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)面制備一個(gè)10mm直徑，4mm深的圓形缺損，將上述構(gòu)建的復(fù)合物植入對(duì)應(yīng)的對(duì)照組動(dòng)物缺損區(qū)；將未接種細(xì)胞的支架材料植入材料對(duì)照組動(dòng)物缺損區(qū)；空白對(duì)照不做修復(fù)。關(guān)閉關(guān)節(jié)腔，縫合切口，通過(guò)組織學(xué)和組織化學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)估移植物和周?chē)M織。T檢驗(yàn)評(píng)估結(jié)果。
3)結(jié)果術(shù)后24周取材，可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組術(shù)區(qū)關(guān)節(jié)表面呈乳白色，有連續(xù)的新生軟骨組織形成，與周?chē)浌墙M織無(wú)明顯分界；單純材料組可見(jiàn)材料周?chē)熊浌菢咏M織長(zhǎng)入，中心略有萎陷，植入的多孔支架材料大部分已經(jīng)吸收(圖2)；空白對(duì)照組缺損區(qū)仍然為凹陷，未見(jiàn)有軟骨樣組織充填。組織學(xué)和免疫組織化學(xué)染色顯示實(shí)驗(yàn)組在植入?yún)^(qū)內(nèi)新生軟骨組織逐漸融合成片，番紅“0”、甲苯胺蘭及II型膠原染色陽(yáng)性，關(guān)節(jié)軟骨缺損得到完整修復(fù)，多孔陶瓷支架材料基本吸收完全(圖3)；單純材料組在植入?yún)^(qū)內(nèi)亦可見(jiàn)部分新生軟骨組織從材料周邊區(qū)域向中心區(qū)域生長(zhǎng)，支架材料基本吸收完全，關(guān)節(jié)軟骨缺損未得到完全修復(fù)；空白對(duì)照組在缺損區(qū)邊緣和底部可見(jiàn)少量軟骨向中心部位生長(zhǎng)，缺損未得到修復(fù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組(P＜0.001)和材料組(P＜0.01)之間均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。


圖1為α-TCP材料的掃描電鏡照片。顯示材料孔型規(guī)則、孔隙率高、孔的內(nèi)表面光滑一致、孔與孔之間連接同暢。
圖2為羊關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)24周的大體照片。顯示缺損關(guān)節(jié)表面已經(jīng)完全被新生軟骨組織取代，新生軟骨與周?chē)M織過(guò)渡自然連續(xù)。
圖3為羊關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)24周的組織學(xué)(番紅O染色×40)照片。顯示材料孔洞內(nèi)和孔洞間被新生的番紅O染色陽(yáng)性的軟骨細(xì)胞所充滿(mǎn)，細(xì)胞外基質(zhì)豐富。
權(quán)利要求
1.一種組織工程化軟骨的制造方法。取自體軟骨組織分離軟骨細(xì)胞，體外培養(yǎng)擴(kuò)增后與可降解多孔生物陶瓷支架材料復(fù)合構(gòu)建組織工程化軟骨。
2.權(quán)利要求1中所述的多孔生物陶瓷支架材料，其特征是可以是α-磷酸三鈣(α-TCP)，也可以是β-磷酸三鈣(β-TCP)。其組成成分磷酸三鈣與機(jī)體骨骼的無(wú)機(jī)成分相同，因而具有良好的生物相容性和機(jī)械力學(xué)特性，可以為組織新生提供適宜的環(huán)境和有力的支撐。
3.權(quán)利要求1中所述的多孔陶瓷生物材料，其特征是具有可控的特殊微結(jié)構(gòu)，孔型規(guī)則，孔隙率高，孔與孔之間有管狀連接。該特殊微結(jié)構(gòu)的特征是孔徑可以在100～300μm之間，孔隙率可以在45％～52％之間，孔間連接徑可以在30～100μm之間。該結(jié)構(gòu)不僅可提高組織和細(xì)胞的長(zhǎng)入性，還可以借此調(diào)節(jié)在體內(nèi)的降解速率，以使其與軟骨組織的新生速度相協(xié)調(diào)。
4.權(quán)利要求1中所述多孔陶瓷材料的消毒可以是60gray60Co照射，也可以是75％酒精浸泡10分鐘～1小時(shí)。用前用95％酒精浸泡以提高親水性，然后用無(wú)血清培養(yǎng)基或PBS緩沖液將酒精置換出來(lái)，滅菌干紗布吸干液體。
5.權(quán)利要求1中所述的制造方法其特征是采用組織工程技術(shù)。即將軟骨細(xì)胞與多孔陶瓷支架材料復(fù)合，先靜置使細(xì)胞爬入材料內(nèi)部貼附在材料孔洞內(nèi)表面，再在生物反應(yīng)器內(nèi)孵育。
6.權(quán)利要求8中所述的軟骨細(xì)胞與多孔陶瓷支架材料復(fù)合，其方法是將1～2×107/ml的軟骨細(xì)胞懸液輕輕滴加在支架材料上，并輕輕翻轉(zhuǎn)材料，使細(xì)胞分布盡量均勻。
7.權(quán)利要求8中所述的孵育，其條件是在37℃，5％CO2，飽和濕度的生物反應(yīng)器內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)24~72小時(shí)，轉(zhuǎn)動(dòng)速度為15~50rpm。
8.權(quán)利要求8中所述的生物反應(yīng)器，其特征是可以是旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器，也可以是其它類(lèi)似的動(dòng)態(tài)立體培養(yǎng)裝置，有利于軟骨細(xì)胞在材料內(nèi)的生長(zhǎng)和分泌細(xì)胞外基質(zhì)。
9.權(quán)利要求9中所述的軟骨細(xì)胞，其特征是可以是患者自體軟骨細(xì)胞，也可以是動(dòng)物的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。可以是取自關(guān)節(jié)面非負(fù)重區(qū)軟骨組織，也可以取自肋軟骨等非關(guān)節(jié)部位的軟骨組織。將獲得的軟骨組織剪碎后，用0.5～1.5％的II型膠原酶4℃消化6~10小時(shí)，或37℃消化1~4小時(shí)，獲得的單細(xì)胞用含10~15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成懸液，以2~4×106的密度接種到培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中，在37℃，5％CO2，飽和濕度的CO2孵箱中培養(yǎng)擴(kuò)增3代。
10.權(quán)利要求1所述的組織工程化軟骨，其特征是可以用于創(chuàng)傷、炎癥、腫瘤等原因造成的各種關(guān)節(jié)軟骨損傷的生理性修復(fù)，也可以用于美容、整形外科等需要軟骨組織提供組織替代或制成的治療。
全文摘要
本發(fā)明是一種組織工程化軟骨的制造方法，包括所需的可降解多孔生物陶瓷材料，屬組織工程領(lǐng)域。本發(fā)明采用一種無(wú)機(jī)生物支架材料(α－磷酸三鈣多孔生物陶瓷)與組織細(xì)胞(軟骨細(xì)胞)復(fù)合構(gòu)建軟骨組織，用于關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨損傷的功能性修復(fù)，具有明顯的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1565647SQ03147950
公開(kāi)日2005年1月19日 申請(qǐng)日期2003年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月30日
發(fā)明者郭希民, 王常勇, 段翠密, 趙強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所