專利名稱：地榆皂苷Ⅰ的含量測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種中藥地榆藥材及其提取物和制劑中地榆皂苷I的含量測定方法，屬于中藥技術領域。

背景技術：
中藥地榆為薔薇科植物地榆Sanguisorba officinalis L.或長葉地榆Sanguisorba officinalis L.var.longifolia(Bert.)Yüet Li的干燥根。
中國藥典2005版收載該品種，其中記載了鞣質(zhì)的含量測定方法，具體含量測定項下內(nèi)容為“取本品粉末(過四號篩)約0.4g，精密稱定，照鞣質(zhì)含量測定法(附錄XB)測定，即得。按干燥品計算，不得少于10.0％?！薄?br> 中華人民共和國國家藥品監(jiān)督管理局WS-11020(ZD-1020)-2002地榆升白片標準(試行)記載了地榆升白片中的沒食子酸的含量的測定方法“照高效液相色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VID)測定。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相；甲醇-乙腈-0.05mol/L磷酸溶液(5∶6∶89)為流動相；檢測波長為270nm。理論塔板數(shù)按沒食子酸峰計算應不低于6000。對照品溶液的制備精密稱取沒食子酸對照品適量，加50％甲醇制成每1ml含20μg的溶液，即得。供試品溶液的制備取本品20片，除去包衣，精密稱定，研細，取適量(約相當于10片的重量)，精密稱定，精密加入50％甲醇25ml，稱定重量，加熱回流1小時，放冷至室溫，再稱定重量，用50％甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各5μl～10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。本品每片含地榆以沒食子酸(C7H5O5)計，不得少于24μg?！币陨蠘藴史謩e公開了地榆藥材及地榆制劑——地榆升白片中鞣質(zhì)和沒食子酸的含量測定。
而地榆藥材應用廣泛、適應癥較多，而不同的適應癥其所發(fā)揮作用的有效成分也是不同的，特別是針對地榆在升高白細胞水平的適應癥方面，僅通過檢測地榆制劑中的鞣質(zhì)或沒食子酸來判定制劑的是否合格是不適宜的，原因為現(xiàn)有研究已證明地榆皂苷是地榆發(fā)揮升高白細胞作用的活性成分，特別是地榆皂苷I，而鞣質(zhì)和沒食子酸并不起升高白細胞水平的主要作用高小平等，地榆促造血作用的有效部位篩選.中國天然藥物，2006(2)137-140；成都地奧制藥集團有限公司.地榆總皂苷提取物及其制備方法和用途[P].中國專利200310119248.1，2004-11-25；成都地奧制藥集團有限公司.烏索烷型三萜皂苷在制備升高白細胞和/或血小板藥物中的應用[P].中國專利03135776.8，20030908ZL03135776.8，因此，通過檢測地榆制劑中地榆皂苷I的含量則更為合理，也更能反應產(chǎn)品的質(zhì)量。然而實踐中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有的鞣質(zhì)和/或沒食子酸含量的檢測方法并不適于地榆皂苷I的檢測。
鄒盛勤等公開了地榆中的烏索酸和齊墩果酸含量的高效液相色譜測定法鄒盛勤，陳武.地榆中烏索酸和齊墩果酸含量的高效液相色譜測定，時珍國醫(yī)國藥，2006，17(8)1373～1374；解軍波等公開了用HPLC-ELSD法四季青中3種三萜及其皂苷，包括地榆皂苷I的含量測定方法解軍波，畢志明，李萍.HPLC-ELSD法測定四季青中三萜及其皂苷的含量，雖然四季青中也含有地榆皂苷I，但是由于四季青與地榆為不同的植物，除地榆皂苷I外，二者含有的其他化學成分不同，因此適用于四季青中地榆皂苷I的含量測定方法并不適用于地榆藥材、地榆提取物或地榆制劑中地榆皂苷I的含量測定；沙明等公開了地榆皂苷類成分、黃酮類成分的HPLC指紋圖譜，其中地榆皂苷類成分的HPLC色譜條件為色譜柱Shim-pack CLC ODS柱(6.0mm×150mm，5μm)，流動相乙腈-水(30∶70)檢測波長206nm，流速1.0ml/min，柱溫25℃。沙明，張東方，孟憲生等.DNA指紋譜與HPLC指紋譜對中藥地榆質(zhì)量評價研究，中國藥學雜志，2002，37(11)815～818，但使用該方法出峰時間過長(20min)，分析效率較低，且不能將地榆皂苷I與其結構相近的皂苷類成分有效的分離。以上報道的分析方法均存在出峰時間長達20min，分析效率較低，且不能將地榆皂苷I與其結構相近的皂苷類成分有效分離的技術缺陷 因此，到目前為止，國內(nèi)外尚無能夠快速、準確測定地榆藥材及其提取物或制劑中地榆皂苷I含量的方法。


發(fā)明內(nèi)容
針對以上技術缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠快速、準確測定地榆藥材、其提取物或制劑中地榆皂苷I的含量的方法，具體地提供一種用高效液相色譜法測定地榆藥材、其提取物或制劑中地榆皂苷I的含量的方法。
本發(fā)明所述方法包括 1)分別取地榆皂苷I的標準品和含有地榆皂苷I的供試品溶于乙醇水溶液中，分別制成標準溶液和供試品溶液； 2)分別取等體積的標準溶液和供試品溶液注入高效液相色譜儀中，然后測量標準品溶液和供試品溶液的峰面積并進行計算，即得供試品中的地榆皂苷I的含量； 其中，所述高效液相色譜儀的固定相為碳十八烷基鍵合硅膠；流動相為甲醇-水溶液。
本發(fā)明方法中，作為優(yōu)選的實施方案，所述碳十八烷基鍵合硅膠的粒徑為≤5μm；進一步優(yōu)選所述碳十八烷基鍵合硅膠的粒徑為5μm、4μm或3.5μm。
本發(fā)明所述流動相為甲醇-水的溶液，優(yōu)選為以體積百分比計，60％～80％甲醇的水溶液的梯度溶液、或為50％～80％甲醇的水溶液的等度溶液。
本發(fā)明方法中，當所述流動相采用60％～80％甲醇的水溶液的梯度溶液時；優(yōu)選所述梯度溶液組成為以體積百分比計，0～17min 60％→70％甲醇的水溶液、17～25min 70％→80％甲醇的水溶液、25～35min 80％甲醇的水溶液；或 0～7min 60％→64％甲醇的水溶液、7～12min 64％→66％甲醇的水溶液、12～17min 66％→80％甲醇的水溶液，17～25min 80％甲醇的水溶液；或0～7min 60％→64％甲醇的水溶液、7～15min 64％甲醇的水溶液、15～20min64％→80％甲醇的水溶液、20～25min 80％甲醇的水溶液；或 0～7min 60％→64％甲醇的水溶液，7～12min 64％甲醇的水溶液，12～20min64％→80％甲醇的水溶液，20～27min 80％甲醇的水溶液；或 0～7min 60％→64％甲醇的水溶液，7～13min 64％甲醇的水溶液。
作為優(yōu)選的實施方案，所述等度溶液為以體積百分比計，64％甲醇的水溶液。
作為優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明所述乙醇水溶液的濃度為以體積計50％-60％乙醇的水溶液。
本發(fā)明所述地榆皂苷I的測定方法可以用于醫(yī)藥領域的各個方面，本發(fā)明包括但不限于地榆藥材中、地榆皂苷提取物中，以及各種藥物制劑，如片劑、膠囊、顆粒劑、注射劑等各種胃腸道或非胃腸道途徑給藥的制劑中的地榆皂苷I的含量及純度的測定。
地榆皂苷I標準品可參考現(xiàn)有技術中的方法制備地榆皂苷I曹愛民，張東方，沙明等，地榆中皂苷類化合物分離、鑒定及其含量測定.中草藥，2003，5(34)397～399進行制備。
作為優(yōu)選的實施方案，所述地榆藥材中地榆皂苷I的含量測定方法包括 1)供試品溶液的制備取地榆藥材，粉碎，過四號篩，約0.4g，精密稱定，置100ml量瓶中，加入60％乙醇的水溶液80ml，搖勻，超聲15min，放至室溫，定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液進樣分析或離心取上清液即得； 對照品溶液的制備取地榆皂苷I對照品約50mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加60％乙醇的水溶液溶解并定容至刻度，搖勻；分別精密量取5.00ml和25.00ml至50ml量瓶中，加60％乙醇的水溶液稀釋定容至刻度，搖勻，即制成每1ml含0.1mg和0.5mg的對照品溶液； 2)含量測定分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液10μl，注入高效液相色譜儀，測定對照品溶液及供試品溶液的峰面積，將峰面積積分值及濃度分別取常用對數(shù)后，按外標兩點法計算地榆皂苷I的含量； 其中，高效液相色譜以碳十八烷基鍵合硅膠為固定相粒徑小于或等于5μm，流動相為甲醇與水體積為64％∶36％的等度洗脫液或為甲醇體積濃度為60-64％的甲醇-水溶液的梯度洗脫液，洗脫程序為0～7min 60％→64％甲醇的水溶液，7～13min 64％甲醇的水溶液流速0.8ml/min，柱溫25℃，ELSD漂移管溫度為80℃，氣體流速2.5L/min，不分流模式，理論塔板數(shù)按地榆皂苷I計算應不低于4×103。
作為優(yōu)選的實施方案，所述地榆皂苷提取物中地榆皂苷I的含量測定方法包括 1)供試品溶液的制備取地榆總皂苷粉末50mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加入60％乙醇的水溶液60ml，搖勻，超聲5min，放至室溫，定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液或離心取上清液進樣分析； 對照品溶液的制備取地榆皂苷I對照品約50mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加60％乙醇的水溶液溶解并定容至刻度，搖勻；分別精密量取5.00ml和25.00ml至50ml量瓶中，加60％乙醇的水溶液稀釋定容至刻度，搖勻即制成每1ml含0.1mg和0.5mg的對照品溶液； 2)含量測定分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液10μl，注入高效液相色譜儀，測定對照品溶液及供試品溶液的峰面積，將峰面積積分值及濃度分別取常用對數(shù)后，按外標兩點法計算地榆皂苷I的含量； 其中，高效液相色譜儀用碳十八烷基鍵合硅膠為固定相粒徑小于或等于5μm，以甲醇體積濃度為60-64％的甲醇-水混合溶劑梯度洗脫，洗脫程序為0～7min 60％→64％甲醇的水溶液，7～13min 64％甲醇的水溶液，流速1.2ml/min，柱溫25℃，ELSD(Alltech 2000 ES)漂移管溫度為100℃，氣體流速3.5L/min，不分流模式，理論塔板數(shù)按地榆皂苷I計算應不低于4×103。
作為優(yōu)選的實施方案，所述地榆片劑中地榆皂苷I的含量測定方法包括 1)供試品溶液的制備取地榆升白片20片，精密稱定，研細，精密稱取相當于2mg地榆皂苷I的量，置150ml具塞錐形瓶中，準確加入50％乙醇20ml，搖勻，稱重，超聲10min，放至室溫，用50％乙醇的水溶液補足減失的重量，搖勻，離心取上清液即得； 對照品溶液的制備取在105℃干燥至恒重的地榆皂苷I對照品適量，加50％乙醇的水溶液溶解并定容制成每1ml含0.05mg和0.2mg的對照品溶液； 2)含量測定分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，測定對照品溶液及供試品溶液的峰面積，將峰面積積分值及濃度分別取常用對數(shù)后，按外標兩點法計算地榆皂苷I的含量； 其中，高效液相色譜儀，用粒徑小于或等于5μm的碳十八烷基鍵合硅膠為固定相，以甲醇-水體積比為64∶36的混合溶液為等度洗脫液，或以甲醇體積濃度為60-64％的甲醇-水混合溶劑梯度洗脫，洗脫程序為0～7min 60％→64％甲醇的水溶液，7～13min 64％甲醇的水溶液，流速1.0ml/min，柱溫25℃，ELSD漂移管溫度為85℃，氣體流速2.8L/min，不分流模式，理論塔板數(shù)按地榆皂苷I計算應不低于4×103。
作為優(yōu)選的實施方案，所述地榆皂苷I的純度測定方法包括 1)樣品溶液的制備取地榆皂苷I適量，加甲醇溶解并稀釋成每1ml含0.5mg的溶液，即得； 2)純度測量精密吸取樣品溶液10μl，注入液相色譜儀，測定，按峰面積歸一化法計算地榆皂苷I的純度； 其中，所述高效液相色譜儀用碳十八烷基鍵合硅膠為固定相，粒徑小于或等于5μm，以甲醇體積濃度為60-64％的甲醇-水混合溶劑梯度洗脫，洗脫程序為0～7min 60％→64％甲醇的水溶液，7～12min 64％甲醇的水溶液，12～20min 64％→80％甲醇的水溶液，20～27min 80％甲醇的水溶液，流速1.0ml/min，柱溫25℃，ELSD(Alltech 2000ES)漂移管溫度為85℃，氣體(空氣)流速2.8L/min，不分流模式，理論塔板數(shù)按地榆皂苷I計算應不低于4×103； 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明為地榆藥材及其提取物或制劑中地榆皂苷I含量的測定提供了快速、準確的方法，能夠?qū)⒌赜茉碥誌與其前面緊鄰的一色譜峰(結構非常相近的同分異構體3β-0-α-L-吡喃阿拉伯糖-28-β-D吡喃葡萄糖酯-19α-羥基-齊墩果酸)實現(xiàn)基線分離；且出峰時間短，僅為10min。
根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領域的普通技術知識和慣用技術手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術思想的前提下，還可以做出其他多種形式的修改、替換和變更。



圖1a實施例1等度洗脫，(Synergi Hydro-RP C18柱(150×4.6mm，4μm)，乙腈-水(30∶70)，流速1.0ml/min，柱溫25℃，檢測波長210nm，分析時間30min)； 圖1b實施例1梯度洗脫，(Synergi Hydro-RP C18柱(150×4.6mm，4μm)，乙腈-水梯度洗脫(洗脫程序0～20min，30％乙腈→50％乙腈；20～25min，50％乙腈→80％乙腈)，流速1.0ml/min，柱溫25℃，檢測波長210nm，分析時間30min)； 圖2-1實施例2色譜柱選擇(YMC-Pack proC18柱(150×4.6mm，3.5μm)； 圖2-2實施例2色譜柱選擇Synergi Hydro-RP C18柱(150×4.6mm，4μm)； 圖3-1實施例3地榆藥材62％甲醇水溶液等度洗脫； 圖3-2實施例3地榆總苷62％甲醇水溶液等度洗脫； 圖3-3實施例3地榆藥材80％甲醇水溶液等度洗脫； 圖3-4實施例3地榆總苷80％甲醇水溶液等度洗脫； 圖3-5實施例3地榆總苷50％甲醇水溶液等度洗脫； 圖3-6實施例3地榆藥材50％甲醇水溶液等度洗脫； 圖4-1實施例4乙腈-水系統(tǒng)分離地榆藥材中地榆皂苷I； 圖4-2實施例4甲醇-水系統(tǒng)分離地榆藥材中地榆皂苷I； 圖5-1實施例5藥材專屬性考察(溶劑)； 圖5-2實施例5藥材專屬性考察(地榆皂苷I對照溶液)； 圖5-3實施例5藥材專屬性考察(藥材提取液)； 圖6-1實施例6地榆升白片專屬性考察(空白輔料)； 圖6-2實施例6地榆升白片專屬性考察(地榆皂苷I對照溶液)； 圖6-3實施例6地榆升白片專屬性考察(地榆升白片樣品液)； 圖7實施例7地榆升白片中地榆皂苷I的含量均勻度測定； 圖8實施例8地榆總苷提取物中地榆皂苷I的含量測定； 圖9實施例9地榆皂苷I對照品純度測定。

具體實施例方式 以下通過實施例對本發(fā)明再做進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發(fā)明僅限于以下實例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。
實施例1高效液相色譜色譜柱、流動相和洗脫程序的選擇 地榆皂苷屬于三萜皂苷，極性較大，實驗表明其在C18色譜柱上有保留，因此選用C18分析柱。
流動相的選擇地榆皂苷I系中性化合物，流動相中無需添加酸堿附加劑或離子對試劑。因此選擇甲醇-水、乙腈-水等流動相系統(tǒng)對比篩選，在紫外檢測中乙腈-水系統(tǒng)較甲醇-水系統(tǒng)基線平直，峰形尖銳，但經(jīng)多次調(diào)整分離色譜峰仍然較甲醇-水系統(tǒng)少，且無論采用等度洗脫還是梯度洗脫地榆皂苷I前面緊鄰的雜質(zhì)峰完全無法檢出(見圖1a和1b)，而地榆皂苷I峰面積較甲醇-水系統(tǒng)明顯增加，而在甲醇-水系統(tǒng)中兩者能得到一定的分離(R＝1.2)，因此選擇甲醇-水系統(tǒng)。根據(jù)分離度變化趨勢，將流動相調(diào)整為梯度洗脫，詳見表1。
表1流動相梯度洗脫程序 結果表明，在洗脫程序B、C、D中，地榆皂苷I與前面緊鄰的雜質(zhì)峰分離效果基本一致(R＝1.2)，地榆皂苷I在等度洗脫的7～12min(64％甲醇的水溶液)出峰，保留時間10min，因此洗脫條件優(yōu)化調(diào)整為0～7min60％→64％甲醇的水溶液，7～12min 64％甲醇的水溶液，12～20min 64％→80％甲醇的水溶液，20～27min 80％甲醇的水溶液。而對于含量測定而言，待測主峰洗脫出來即可，因此在對樣品中的地榆皂苷I進行含量測定時，洗脫條件可簡化為0～7min 60％→64％甲醇的水溶液，7～13min 64％甲醇的水溶液。
地榆皂苷I分析條件選擇的關鍵在于將其與前面緊鄰的一色譜峰實現(xiàn)基線分離，而不同來源的樣品分離難易程度不一，藥材樣品較好、地榆總苷及制劑次之、地榆皂苷I對照品最難；在前面流動相的選擇中都是以C18柱(4.6×150mm，5μm)為基礎，在選定的洗脫條件下又分別考察了常規(guī)分析柱ZORBAX XDB-C18柱(4.6×150mm，5μm)、Luna C18柱(4.6×150mm，5μm)、和小粒徑柱YMC-Pack proC18柱(4.6×150mm，3.5μm)、Synergi Hydro-RP C18柱(4.6×150mm，4μm)對地榆皂苷I的分離效果。結果表明，在粒徑較小的3.5μm和4μm C18分析柱上對照品中地榆皂苷I與該雜質(zhì)峰均能達到基線分離(R＞1.5)。在上述研究確定的條件下，地榆皂苷I色譜峰保留時間約10min；地榆樣品中各成分可在27min內(nèi)全部流出色譜柱(純度檢查)，地榆皂苷I色譜峰拖尾因子1.1，理論塔板數(shù)大于1×104，峰分離度大于1.5，符合HPLC測定方法要求。
在用于含量測定時，常規(guī)分析柱(直徑4.6mm×150mm/250mm，5μm)和50～80％甲醇等度洗脫，通過改變色譜柱長度、流速或柱溫，都可滿足分離要求。
實施例2色譜柱粒徑對地榆皂苷I對照品的分離效果的影響 (1)樣品溶液制備取地榆皂苷I粗品適量，加甲醇溶解并稀釋成每1ml含0.5mg的溶液，即得； (2)色譜條件以甲醇-水系統(tǒng)為流動相梯度洗脫，洗脫程序為0～7min 60％→64％甲醇的水溶液，7～12min 64％甲醇的水溶液，12～20min 64％→80％甲醇的水溶液，20～27min 80％甲醇的水溶液，流速1.0ml/min，柱溫25℃，檢測波長210nm，ELSD85℃，2.8L/min，gainl；考察了YMC-Pack proC18柱(150×4.6mm，3.5μm)(紫外檢測)和SynergiHydro-RP C18柱(150×4.6mm，4μm)(ELSD檢測)對地榆皂苷I的分離效果，結果見圖2。
圖2結果表明，在粒徑小于或等于5μm的色譜柱上地榆皂苷I主峰與前面緊鄰雜質(zhì)峰峰能得到完全分離。
實施例3甲醇-水系統(tǒng)等度洗脫對地榆藥材和地榆總苷中地榆皂苷I的分離 (1)藥材樣品溶液制備取地榆藥材粉末(過四號篩)約0.4g，精密稱定，置100ml量瓶中，加入60％乙醇的水溶液80ml，搖勻，超聲15min，放至室溫，定容至刻度，搖勻，濾過取續(xù)濾液進樣分析或離心取上清液即得。
(2)地榆總苷樣品溶液的制備取地榆藥材粗粉適量，加10倍體積水煎煮，每次1h，共煮三次，過濾，合并濾液，上大孔吸附樹脂，蒸餾水充分洗滌，后用體積濃度70％乙醇的水溶液洗脫，合并洗脫液并濃縮，干燥即得地榆總皂苷粉末。取地榆總苷粉末約50mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加入60％乙醇60ml，搖勻，超聲5min，放至室溫，定容至刻度，搖勻，濾過取續(xù)濾液進樣分析或離心取上清液即得； (3)色譜條件以甲醇-水系統(tǒng)為流動相等度洗脫，流速0.8～1.5ml/min，柱溫25℃～40℃，ELSD85℃，2.8L/min，gain1；分別考察了Synergi Hydro-RP C18柱(150×4.6mm，4μm)、Gemini C18柱(150×4.6mm，5μm)和luna C18柱(250×4.6mm，5μm)對地榆皂苷I與其前面緊鄰雜質(zhì)峰的分離效果，結果見圖3。
結果表明，對于地榆藥材和地榆總皂苷提取物等樣品，在粒徑小于5μm的色譜柱上50％～80％甲醇的水溶液等度洗脫能將地榆皂苷I與前面緊鄰的雜質(zhì)峰實現(xiàn)基線分離，常規(guī)的5μm的色譜柱上甲醇-水等度洗脫也同樣可以實現(xiàn)基線分離。
實施例4地榆藥材中地榆皂苷I的分離 (1)樣品溶液制備取地榆藥材，粉碎，過四號篩，約0.4g，精密稱定，置100ml量瓶中，加入60％乙醇的水溶液80ml，搖勻，超聲15min，放至室溫，定容至刻度，搖勻，濾過取續(xù)濾液進樣分析或離心取上清液即得。
(2)色譜條件ZORBAX XDB-C18柱(4.6×150mm，5μm)上，流速1.0ml/min，柱溫25℃，檢測波長210nm，分別用甲醇-水系統(tǒng)梯度洗脫(洗脫程序為0～7min 60％→64％甲醇的水溶液，7～12min 64％甲醇的水溶液，12～20min 64％→80％甲醇的水溶液，20～27min 80％甲醇的水溶液)和乙腈-水系統(tǒng)對藥材中地榆皂苷I進行分離，結果見圖4。
圖4結果表明，甲醇-水系統(tǒng)能夠?qū)⒌赜芩幉闹械赜茉碥誌與其緊鄰的雜峰完全分離開，而乙腈-水則不能將二者分開。
實施例5地榆藥材中地榆皂苷I的含量測定及方法驗證 含量測定方法 (1)色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗用碳十八烷基鍵合硅膠為固定相(4.6×150mm，粒徑4μm)，甲醇-水混合溶劑梯度洗脫，洗脫程序為(0～7min 60％→64％甲醇的水溶液，7～13min 64％甲醇的水溶液)，流速0.8ml/min，柱溫25℃，ELSD漂移管溫度為80℃，氣體(空氣)流速2.5L/min，不分流模式，理論塔板數(shù)按地榆皂苷I計算應不低于4×103； (2)供試品溶液的制備取地榆藥材粉末(過四號篩)約0.4g，精密稱定，置100ml量瓶中，加入60％乙醇的水溶液80ml，搖勻，超聲15min，放至室溫，定容至刻度，搖勻，濾過取續(xù)濾液進樣分析或離心取上清液即得。
(3)對照品溶液的制備取地榆皂苷I對照品約50mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加60％乙醇的水溶液溶解并定容至刻度，搖勻；分別精密量取5.00ml和25.00ml至50ml量瓶中，加60％乙醇的水溶液稀釋定容至刻度，搖勻即制成每1ml含0.1mg和0.5mg的對照品溶液； (4)含量測定方法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，測定對照品溶液及供試品溶液的峰面積，將峰面積積分值及濃度分別取常用對數(shù)后，按外標兩點法計算地榆皂苷I的含量為(以干燥品計)3.340％。
方法驗證 (1)在選定的色譜條件下，地榆藥材中地榆皂苷I有較強的色譜峰和較好的分離度，溶劑不干擾測定，見圖5。結果表明，本方法具有較高的專屬性。
(2)線性 精密配制濃度為0.0998mg/ml、0.1996mg/ml、0.2

mg/ml、0.3992mg/ml、0.4990mg/ml的地榆皂苷I對照品溶液各10ml，準確吸取10μl注入液相色譜儀，按上述條件進行測定，以峰面積積分值的常用對數(shù)為縱坐標，地榆皂苷I溶液濃度的常用對數(shù)為橫坐標進行直線回歸，線性方程為logA＝1.5846logC+7.1419(r＝0.9998)，表明地榆皂苷I在0.998μg～4.990μg范圍內(nèi)具有良好線性關系。
表2線性關系測定結果

(3)精密度 重復性 分別取地榆藥材粉末(過四號篩)0.4g，精密稱定，按供試品制備方法配制6份，精密吸取續(xù)濾液10μl進樣，測定地榆皂苷I的峰面積，將峰面積積分值和濃度取常用對數(shù)后以外標兩點法計算含量，結果見表3。
表3重復性測定結果
結果表明，本法重復性良好。
日內(nèi)精密度 取地榆皂苷I對照溶液A(0.0998mg/ml)、B(0.499mg/ml)和地榆藥材供試品溶液，按0，2，4，6，8小時時間間隔，分別測定地榆皂苷I峰面積，將峰面積積分值和濃度取常用對數(shù)后以外標兩點法計算含量，結果見表4。
表4日內(nèi)精密度測定結果

結果表明，本法日內(nèi)精密度良好。
日間精密度 取日內(nèi)精密度的對照液和供試液分別在第0、1、2、3天(d)進樣，測定地榆皂苷I峰面積，將峰面積積分值和濃度取常用對數(shù)后以外標兩點法計算含量，結果見表5。
表5日間精密度測定結果
結果表明，本法的日間精密度良好。
(4)加樣回收試驗 取已知含量的地榆藥材粉末(過四號篩)0.2g，精密稱定，置100ml的量瓶中，分別精密加入5.020mg/ml的地榆皂苷I對照品溶液1、2、3ml，再用60％乙醇的水溶液補足到80ml，按3.7項下供試品溶液制備方法制備，即得。精密量取續(xù)濾液10μl進樣，記錄峰面積，將峰面積積分值和濃度取常用對數(shù)后以外標兩點法計算含量，結果見表6。
表6回收率測定結果

結果表明本法加樣回收率符合要求，準確度較高。
實施例6地榆升白片中地榆皂苷I的含量測定 含量測定方法 (1)色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗用碳十八烷基鍵合硅膠為固定相(4.6×150mm，粒徑小于5μm)，甲醇-水(64∶36)等度洗脫，流速1.0ml/min，柱溫25℃，ELSD(Alltech 2000)漂移管溫度為85℃，氣體(空氣)流速2.8L/min，不分流模式，理論塔板數(shù)按地榆皂苷I計算應不低于4×103； (2)供試品溶液的制備取地榆升白片(成都地奧制藥集團天府藥業(yè)生產(chǎn)，批號070301)20片，精密稱定，研細，精密稱取適量(約相當于地榆皂苷I 2mg)，置150ml具塞錐形瓶中，準確加入50％乙醇20.00ml，搖勻，稱重，超聲10min，放至室溫，用50％乙醇補足減失的重量，搖勻，離心取上清液即得； (3)對照品溶液的制備取地榆皂苷I對照品約25mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加50％乙醇的水溶液溶解并定容至刻度，搖勻；分別精密量取5.00ml和20.00ml至50ml量瓶中，加50％乙醇的水溶液稀釋定容至刻度，搖勻即制成每1ml含0.05mg和0.2mg的對照品溶液； (4)含量測定方法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，測定對照品溶液及供試品溶液的峰面積，將峰面積積分值及濃度分別取常用對數(shù)后，按外標兩點法計算地榆皂苷I的含量為0.18mg/片。
方法驗證 (1)專屬性在選定的色譜條件下，地榆升白片中地榆皂苷I有較強的色譜峰和較好的分離度，溶劑和輔料不干擾測定，見圖6。結果表明，本方法具有較高的專屬性。
(2)線性 精密配制濃度為0.05014mg/ml、0.1003mg/ml、0.2006mg/ml、0.4011mg/ml、0.5014mg/ml的地榆皂苷I對照品溶液各10ml，準確吸取20μl注入液相色譜儀，按上述條件進行測定，以峰面積積分值的常用對數(shù)為縱坐標，地榆皂苷I溶液濃度的常用對數(shù)為橫坐標進行直線回歸，線性方程為logA＝1.6549logC+7.0118(r＝1)，表明地榆皂苷I在1.003μg～10.03μg范圍內(nèi)具有良好線性關系。
表7線性關系測定結果
(3)重復性 分別取地榆藥材升白片粉末(批號070301，約相當于地榆皂苷I2mg)約1g，精密稱定，按供試品制備方法配制5份，精密吸取續(xù)濾液20μl進樣，測定地榆皂苷I的峰面積，將峰面積積分值和濃度取常用對數(shù)后以外標兩點法計算含量，結果見表8。
表8重復性測定結果

結果表明，本法重復性良好。
(4)加樣回收試驗 取已知含量(地榆皂苷I 0.18％)的地榆升白片粉末(批號070301，約相當于地榆皂苷I 1mg)0.5g，精密稱定，置150ml的錐形瓶瓶中，分別精密加入0.3008mg/ml的地榆皂苷I對照品溶液1、3、10ml，再用50％乙醇補足到20ml，按供試品溶液制備方法制備，即得。精密量取續(xù)濾液20μl進樣，記錄峰面積，將峰面積積分值和濃度取常用對數(shù)后以外標兩點法計算含量，結果見表9。
表9回收率測定結果
結果表明本法加樣回收率符合要求，準確度較高。
實施例7地榆升白片中地榆皂苷I的含量均勻度測定 (1)色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗用碳十八烷基鍵合硅膠為固定相(4.6×150mm，粒徑小于5μm)，甲醇-水(64∶36)等度洗脫，流速1.0ml/min，柱溫25℃，ELSD(Alltech 2000)漂移管溫度為85℃，氣體(空氣)流速2.8L/min，不分流模式，理論塔板數(shù)按地榆皂苷I計算應不低于4×103； (2)供試品溶液的制備取地榆升白片(成都地奧制藥集團天府藥業(yè)生產(chǎn)，批號070301)10片，分別精密稱定，置5ml離心管中，準確加入50％乙醇2.00ml，搖勻，稱重，超聲10min，放至室溫，用50％乙醇補足減失的重量，搖勻，離心取上清液即得； (3)對照品溶液的制備取地榆皂苷I對照品約25mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加50％乙醇溶解并定容至刻度，搖勻；分別精密量取5.00ml和20.00ml至50ml量瓶中，加50％乙醇稀釋定容至刻度，搖勻即制成每1ml含0.05mg和0.2mg的對照品溶液； (4)含量測定方法分別精密吸取對照品溶液20μl和供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，測定對照品溶液及供試品溶液的峰面積，將峰面積積分值及濃度分別取常用對數(shù)后，按外標兩點法分別計算10片中地榆皂苷I的含量，其RSD值應不超過7.0％(表10，圖7)。
表10含量均勻度測定結果
實施例8地榆總皂苷提取物中地榆皂苷I的含量測定 (1)色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗用碳十八烷基鍵合硅膠為固定相(4.6×150mm，粒徑小于3.5μm)，甲醇-水混合溶劑梯度洗脫，洗脫程序為0～7min 60％→64％甲醇的水溶液，7～13min 64％甲醇的水溶液，流速1.2ml/min，柱溫25℃，ELSD(Alltech 2000ES)漂移管溫度為100℃，氣體(空氣)流速3.5L/min，不分流模式，理論塔板數(shù)按地榆皂苷I計算應不低于4×103； (2)供試品溶液的制備取地榆藥材粗粉適量，加10倍體積水煎煮，每次1h，共煮三次，過濾，合并濾液，上大孔吸附樹脂，蒸餾水充分洗滌，后用70％乙醇洗脫，合并洗脫液并濃縮，干燥即得地榆總皂苷粉末(080604)。取地榆總苷粉末約50mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加入60％乙醇60ml，搖勻，超聲5min，放至室溫，定容至刻度，搖勻，濾過取續(xù)濾液進樣分析或離心取上清液即得； (3)對照品溶液的制備取地榆皂苷I對照品約50mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加60％乙醇的水溶液溶解并定容至刻度，搖勻；分別精密量取5.00ml和25.00ml至50ml量瓶中，加60％乙醇的水溶液稀釋定容至刻度，搖勻即制成每1ml含0.1mg和0.5mg的對照品溶液； (4)含量測定方法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，測定對照品溶液及供試品溶液的峰面積，將峰面積積分值及濃度分別取常用對數(shù)后，按外標兩點法計算地榆皂苷I的含量為50％(圖8)。
實施例9地榆皂苷I對照品的純度測定 (1)色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗用碳十八烷基鍵合硅膠為固定相(4.6×150mm，粒徑小于5μm)，甲醇-水混合溶劑梯度洗脫，洗脫程序為0～7min 60％→64％甲醇的水溶液，7～12min 64％甲醇的水溶液，12～20min64％→80％甲醇的水溶液，20～27min 80％甲醇的水溶液，流速1.0ml/min，柱溫25℃，ELSD(Alltech 2000ES)漂移管溫度為85℃，氣體(空氣)流速2.8L/min，不分流模式，理論塔板數(shù)按地榆皂苷I計算應不低于9000； (2)樣品溶液的制備取地榆皂苷I適量，加甲醇溶解并稀釋成每1ml含0.5mg的溶液，即得； (3)純度檢查方法精密吸取樣品溶液10μl，注入液相色譜儀，測定，按峰面積歸一化法計算地榆皂苷I的純度大于99.0％(圖9)。
實施例10地榆皂苷I對照品的制備 取地榆藥材粗粉適量，加10倍體積水煎煮，每次1h，共煮三次，過濾，合并濾液，上大孔吸附樹脂，蒸餾水充分洗滌，后用70％乙醇洗脫，合并洗脫液并濃縮，干燥即得地榆總皂苷粉末。用甲醇(1g∶5ml)加熱回流10min，趁熱過濾，待濾液冷至室溫，攪拌下滴加水，至出現(xiàn)渾濁，且不消失，停止，靜置12h，抽濾，用30％乙醇洗滌沉淀，收集，真空干燥，粉碎，得第一次重結晶產(chǎn)物。再反復重結晶一至兩次，得地榆皂苷I。
權利要求
1.一種地榆皂苷I的含量測定方法，其特征在于，所述方法包括
1)分別取地榆皂苷I的標準品和含有地榆皂苷I的供試品溶于乙醇水溶液中，分別制成標準溶液和供試品溶液；
2)分別取等體積的標準溶液和供試品溶液注入高效液相色譜儀中，然后測量標準品溶液和供試品溶液的峰面積并進行計算，即得供試品中的地榆皂苷I的含量；
其中，所述高效液相色譜儀的固定相為碳十八烷基鍵合硅膠；流動相為甲醇-水溶液。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述碳十八烷基鍵合硅膠的粒徑為≤5μm。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的碳十八烷基鍵合硅膠的粒徑為5μm、4μm或3.5μm。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，所述流動相為甲醇-水的溶液；優(yōu)選為以體積百分比計，60％～80％甲醇的水溶液的梯度溶液、或50％～80％甲醇的水溶液的等度溶液。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，所述梯度溶液為以體積百分比計，0～17min 60％→70％甲醇的水溶液、17～25min 70％→80％甲醇的水溶液、25～35min 80％甲醇的水溶液；或
0～7min 60％→64％甲醇的水溶液、7～12min 64％→66％甲醇的水溶液、12～17min 66％→80％甲醇的水溶液，17～25min 80％甲醇的水溶液；或
0～7min 60％→64％甲醇的水溶液、7～15min 64％甲醇的水溶液、15～20min64％→80％甲醇的水溶液、20～25min 80％甲醇的水溶液；或
0～7min 60％→64％甲醇的水溶液，7～12min 64％甲醇的水溶液，12～20min64％→80％甲醇的水溶液，20～27min 80％甲醇的水溶液；或
0～7min 60％→64％甲醇的水溶液，7～13min 64％甲醇的水溶液。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述等度溶液為以體積百分比計，64％甲醇的水溶液。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于，所述乙醇的水溶液為以體積計50％-60％乙醇的水溶液。
8.一種利用權利要求1-7任一所述的方法測量地榆藥材中地榆皂苷I的含量的方法，其特征在于，所述方法包括
1)供試品溶液的制備取地榆藥材，粉碎，過四號篩，約0.4g，精密稱定，置100ml量瓶中，加入60％乙醇的水溶液80ml，搖勻，超聲15min，放至室溫，定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液進樣分析或離心取上清液即得；
對照品溶液的制備取地榆皂苷I對照品約50mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加60％乙醇的水溶解并定容至刻度，搖勻；分別精密量取5.00ml和25.00ml至50ml量瓶中，加60％乙醇的水溶液稀釋定容至刻度，搖勻即制成每1ml含0.1mg和0.5mg的對照品溶液；
2)含量測定分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液10μl，注入高效液相色譜儀，測定對照品溶液及供試品溶液的峰面積，將峰面積積分值及濃度分別取常用對數(shù)后，按外標兩點法計算地榆皂苷I的含量；
其中，高效液相色譜以碳十八烷基鍵合硅膠為固定相，粒徑小于或等于5μm，流動相為甲醇與水體積為64％∶36％的等度洗脫液或甲醇體積濃度為60-64％的甲醇水混合溶液的梯度洗脫液，洗脫程序為0～7min 60％→64％甲醇的水溶液，7～13min 64％甲醇的水溶液，流速0.8ml/min，柱溫25℃，ELSD漂移管溫度為80℃，氣體流速2.5L/min，不分流模式，理論塔板數(shù)按地榆皂苷I計算應不低于4×103。
9.一種利用權利要求1-7任一所述的方法測量地榆皂苷提取物中地榆皂苷I的含量的方法，其特征在于，所述方法包括
1)供試品溶液的制備取地榆總皂苷粉末50mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加入60％乙醇60ml，搖勻，超聲5min，放至室溫，定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液或離心取上清液進樣分析；
對照品溶液的制備取地榆皂苷I對照品約50mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加60％乙醇的水溶液溶解并定容至刻度，搖勻；分別精密量取5.00ml和25.00ml至50ml量瓶中，加60％乙醇的水溶液稀釋定容至刻度，搖勻即制成每1ml含0.1mg和0.5mg的對照品溶液；
2)含量測定分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液10μl，注入高效液相色譜儀，測定對照品溶液及供試品溶液的峰面積，將峰面積積分值及濃度分別取常用對數(shù)后，按外標兩點法計算地榆皂苷I的含量；
其中，高效液相色譜儀用碳十八烷基鍵合硅膠為固定相，粒徑小于或等于5μm，以甲醇體積濃度為60-64％的甲醇-水混合溶劑梯度洗脫，洗脫程序為0～7min 60％→64％甲醇的水溶液，7～13min 64％甲醇的水溶液，流速1.2ml/min，柱溫25℃，ELSD漂移管溫度為100℃，氣體流速3.5L/min，不分流模式，理論塔板數(shù)按地榆皂苷I計算應不低于4×103。
10.一種利用權利要求1-7任一所述的方法測量地榆片劑中地榆皂苷I的含量的方法，其特征在于，所述方法包括
1)供試品溶液的制備取地榆升白片20片，精密稱定，研細，精密稱取相當于2mg地榆皂苷I的量，置150ml具塞錐形瓶中，準確加入50％乙醇的水溶液20ml，搖勻，稱重，超聲10min，放至室溫，用50％乙醇的水溶液補足減失的重量，搖勻，離心取上清液即得；
對照品溶液的制備取在105℃干燥至恒重的地榆皂苷I對照品適量，加50％乙醇的水溶液溶解并定容制成每1ml含0.05mg和0.2mg的對照品溶液；
2)含量測定分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液20μl，注入高校液相色譜儀，測定對照品溶液及供試品溶液的峰面積，將峰面積積分值及濃度分別取常用對數(shù)后，按外標兩點法計算地榆皂苷I的含量；
其中，高效液相色譜儀，用粒徑小于或等于5μm的碳十八烷基鍵合硅膠為固定相，以甲醇-水體積比為64∶36的混合溶液為等度洗脫液，或以甲醇體積濃度為60-64％的甲醇-水混合溶劑梯度洗脫，洗脫程序為0～7min 60％→64％甲醇的水溶液，7～13min 64％甲醇的水溶液，流速1.0ml/min，柱溫25℃，ELSD漂移管溫度為85℃，空氣流速2.8L/min，不分流模式，理論塔板數(shù)按地榆皂苷I計算應不低于4×103。
11.一種地榆皂苷I的純度測定方法，其特征在于，所述方法包括
1)樣品溶液的制備取地榆皂苷I適量，加甲醇溶解并稀釋成每1ml含0.5mg的溶液，即得；
2)純度測量精密吸取樣品溶液10μl，注入液相色譜儀，測定，按峰面積歸一化法計算地榆皂苷I的純度；
其中，所述高效液相色譜儀用碳十八烷基鍵合硅膠為固定相，粒徑小于或等于5μm，甲醇體積濃度為60-64％的甲醇-水混合溶劑梯度洗脫，洗脫程序為0～7min 60％→64％甲醇的水溶液，7～12min 64％甲醇的水溶液，12～20min 64％→80％甲醇的水溶液，20～27min 80％甲醇的水溶液，流速1.0ml/min，柱溫25℃，ELSD漂移管溫度為85℃，氣體(空氣)流速2.8L/min，不分流模式，理論塔板數(shù)按地榆皂苷I計算應不低于4×103。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種地榆皂苷I的含量測定方法，所述方法包括1)分別取地榆皂苷I的標準品和含有地榆皂苷I的供試品溶于乙醇水溶液中，分別制成標準溶液和供試品溶液；2)分別取等體積的標準溶液和供試品溶液注入高效液相色譜儀中，然后測量標準品溶液和供試品溶液的峰面積并進行計算，即得供試品中的地榆皂苷I的含量。本發(fā)明為地榆藥材及其提取物或制劑中地榆皂苷I含量的測定提供了快速、準確的方法。
文檔編號A61P7/00GK101810705SQ201010170728
公開日2010年8月25日 申請日期2010年4月30日 優(yōu)先權日2009年5月26日
發(fā)明者姬建新, 黎秀麗, 劉志勇, 白紅艷, 鄒文俊, 王軍, 姚華 申請人:成都地奧集團天府藥業(yè)股份有限公司