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一種乙酰膽堿受體介導(dǎo)腦靶向多肽及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號:1182688閱讀:341來源:國知局
專利名稱:一種乙酰膽堿受體介導(dǎo)腦靶向多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬藥學(xué)領(lǐng)域,涉及乙酰膽堿受體介導(dǎo)腦靶向多肽,尤其是一種可以跨過血腦屏障的乙酰膽堿受體介導(dǎo)腦靶向多肽,還涉及此乙酰膽堿受體介導(dǎo)腦靶向多肽形成的復(fù)合物在腦部疾病診斷與治療中的用途。
背景技術(shù)
煙堿型乙酰膽堿受體(nAChRs)是一種門控型離子通道受體,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)高度表達(dá),在腦組織,包括組成血腦屏障的腦毛細(xì)內(nèi)皮細(xì)胞均廣泛表達(dá)。血腦屏障是阻礙藥物進(jìn)入腦部組織的主要障礙,研究和開發(fā)可以穿透血腦屏障的靶向頭基,協(xié)助藥物或者藥物載體穿過血腦屏障,從而達(dá)到藥物的腦內(nèi)傳輸,具有現(xiàn)實(shí)意義。蛇神經(jīng)毒素主要分為短神經(jīng)毒素和長神經(jīng)毒素,前者主要是指含有60-62個(gè)氨基酸、形成4對二硫鍵的蛋白分子;后者指含有71-74個(gè)氨基酸、形成5對二硫鍵的蛋白分子。 前人研究表明,一些毒蛇,例如眼鏡蛇、蝮蛇和金環(huán)蛇等,其分泌毒液中的神經(jīng)毒素可以與乙酰膽堿受體特異性結(jié)合(KD = I(T9-KTkiM)。蛇神經(jīng)毒素屬于三手指形結(jié)構(gòu)(如圖7所示),蛇神經(jīng)毒素形成的三個(gè)環(huán)中(loop I、loop II和loopIII),loop II是與nAChRs結(jié)合的主要區(qū)域,分子水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,神經(jīng)毒素loop II氨基酸序列與nAChRs具有高親和力。設(shè)計(jì)具有短神經(jīng)毒素Candoxin的Loop II區(qū)域氨基酸序列的多肽,使其與nAChRs 具有高親和力,并能作為穿透血腦屏障的靶分子具有十分巨大的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種乙酰膽堿受體介導(dǎo)腦靶向多肽(CDX)。本發(fā)明的另一目的是將所述乙酰膽堿受體介導(dǎo)腦靶向多肽(CDX)用于腦部疾病診斷與治療中。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種乙酰膽堿受體介導(dǎo)腦靶向多肽,其特征在于,具有由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列,也即氨基酸序列為FKESWREARGTRIERG,是短神經(jīng)毒素Candoxin的LoopII區(qū)域氨基酸序列,包含16個(gè)氨基酸。所述多肽CDX可與其它分子復(fù)合,形成具有介導(dǎo)腦靶向功能的CDX衍生物。所述具有介導(dǎo)腦靶向功能的⑶X衍生物,通過N端生物素化得到生物素化⑶X,與親和素衍生物耦合得到一種⑶X-Avidin-X復(fù)合物。所述的⑶X-Avidin-X復(fù)合物,其特征在于,復(fù)合物中的X是熒光物質(zhì)FITC或近紅外染料IR820中的一種。所述的CDX-Avidin-X復(fù)合物可以進(jìn)行體內(nèi)外示蹤,細(xì)胞特異性攝取和腦部分布結(jié)果表明,這種多肽-蛋白復(fù)合物具有腦靶向特征 所述多肽CDX的N端連接上半胱氨酸,得到巰基化的多肽,利用巰基與馬來酰亞胺的加成反應(yīng),與含馬來酰亞胺-聚乙二醇的兩親性高分子連接,修飾到PEG-PLA膠束材料上,得到CDX-PEG-Y復(fù)合物,該膠束可將包載熒光染料或者藥物的膠束攜帶入腦,表明CDX
3可以通過乙酰膽堿受體介導(dǎo)將納米遞藥系統(tǒng)輸送入腦。所述的⑶X-PEG-Y復(fù)合物,復(fù)合物中的Y是聚乳酸(PLA)、聚乳酸-聚羥基乙酸 (PLGA)、聚己內(nèi)酯(PCL)或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)中的一種。所述的CDX-PEG-Y復(fù)合物具有在形成微粒遞藥系統(tǒng),包載難溶性藥物中的用途。所述的CDX-PEG-Y復(fù)合物,所述的微粒遞藥系統(tǒng)包載的難溶性藥物,還包括紫杉醇、阿霉素、伊曲康唑或銀杏內(nèi)酯之中的一種。CDX修飾的具有腦靶向特征的的遞藥系統(tǒng)不僅限于包載紫杉醇、阿霉素和伊曲康唑等抗腫瘤藥物,還可以包載治療神經(jīng)退行性疾病的藥物如銀杏內(nèi)酯腦內(nèi)遞藥。所述的CDX-PEG-Y復(fù)合物具有腦靶向特征,具有在腦部疾病診斷與治療中的用途。本發(fā)明根據(jù)神經(jīng)毒素Candoxin的Loop II區(qū)域,設(shè)計(jì)了與nAChRs具有高親和力的多肽⑶X,氨基酸序列為FKESWREARGTRIERG,將其作為穿透血腦屏障的靶分子。⑶X與乙酰膽堿受體具有高親和力,同時(shí)可以被組成血腦屏障的腦毛細(xì)內(nèi)皮細(xì)胞特異性攝取,動(dòng)物體內(nèi)分布表明CDX自身或者攜帶膠束遞送系統(tǒng)可跨越血腦屏障。


圖 1 是 CDX 的 HPLC 和 ESI-MS 圖譜色譜方法色譜柱(YMC,C18) :150Χ4·6_;流動(dòng)相Α:水(含0. 三氟乙酸),流動(dòng)相B 乙腈(含0. 三氟乙酸);洗脫程序0-45分鐘5% B-65% B ;流速0. 7ml/分鐘; 柱溫:40°C ;檢測:UV280nm, TCDX :12. 72 分鐘,CDX 純度為 98%。ESI-MS :CDX :1979。圖2是⑶X對α -Bungarotoxin與乙酰膽堿受體結(jié)合的競爭抑制曲線CDX的濃度為10-5 10-12Μ時(shí),對α -Bungarotoxin與乙酰膽堿受體結(jié)合競爭抑制效果,IC50值為301. 99ηΜ。圖3是⑶X體內(nèi)生物分布結(jié)果A、B分別為陰性對照FITC-Avidin臟器成像和熒光半定量結(jié)果,C、D分別為 FITC-Avidin-CDX臟器成像和熒光半定量結(jié)果。臟器從左至右分別為0. 5h,lh, 2h和4h。圖4是載coumarin-6的⑶X_PEG_PLA膠束體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)和腦分布結(jié)果A、B分別為載Coumarin-6的CDX-PEG-PLA和PEG-PLA膠束體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)和腦部分布曲線,表格為相關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(a,P < 0. 05)。圖5是包載OTR染料Dir的⑶X_PEG_PLA膠束在膠質(zhì)瘤原位腫瘤模型上的活體成
像A為腫瘤種植5天后注射載Dir的⑶X-PEG-PLA (右)和PEG-PLA (左)膠束的活體成像分布結(jié)果;B為腫瘤種植15天后注射載Dir的⑶X-PEG-PLA膠束的活體和離體成像結(jié)果。圖6是膠質(zhì)瘤原位腫瘤模型裸鼠的生存曲線生理鹽水組、Taxol組、載紫杉醇PEG-PLA和⑶X_PEG_PLA膠束組平均生存時(shí)間為 34,38. 5,41. 5 和 48 天。圖7是三手指形蛇神經(jīng)毒素結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明,而不是限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1⑶X的制備與表征采用固相合成法,制備了氨基酸序列為FKESWREARGTRIERG的多肽(⑶X)。將 PAM-Gly-Boc樹脂用三氟乙酸(TFA)脫保護(hù)1分鐘,兩次,將Boc保護(hù)氨基酸溶解在0. 5M的 HBTU (溶劑為DMF)中,室溫反應(yīng)15min,DMF洗滌,TFA脫除Boc保護(hù),按照氨基酸序列依次反應(yīng),反應(yīng)完成后,用20%的哌啶DMF溶液脫除CHO保護(hù)基15分鐘,兩次。三氟乙酸脫Boc 保護(hù)后,用氫氟酸將多肽從樹脂上切割下來,乙腈/水(含0. TFA)體系分離純化。HPLC 和ESI-MS結(jié)果如附圖1所示,CDX的純度為98%,分子量為1979。實(shí)施例2⑶X競爭抑制α -Bungarotoxin對乙酰膽堿受體結(jié)合活性試驗(yàn)Wister大鼠Q20 260克)斷頭處死后迅速分離出海馬,稱量后加入10倍體積的Tris-HCl 緩沖液(50mM Tris-HCl,5mM MgCl2 ·6Η20,ImM EDTA,0. 5% (ff/V)BSA, ImMPMSF, 3 μ g/ml蛋白酶抑制劑,0. 1% NaN3,0. 32M sucrose,pH7. 4),用勻漿器15000轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行勻漿,每次30秒,共5次。勻漿液經(jīng)1000 Xg離心10分鐘,取上清液再用39000 Xg離心10 分鐘,收集沉淀,用原重量的10倍體積Tris-HCl緩沖液pH7. 4重新懸液,再用39000 X g離心10分鐘,沉淀再用相同緩沖液洗滌,39000 X g離心10分鐘,最后得神經(jīng)源性乙酰膽堿受體蛋白,用以上緩沖液懸浮后分裝,在-80°C保存?zhèn)溆?。用Fotin法測定蛋白質(zhì)含量。在所有試管中加入50μ g乙酰膽堿受體(nAChRs)蛋白量。測試管中依次加入 20 μ 1 一定濃度的CDX,非特異結(jié)合管中加入50 μ 1非標(biāo)記配體α -Bungarotoxin ( α -Bgt, 終濃度 ο μ Μ),預(yù)先反應(yīng)50分鐘。全部試管依次加入30 μ 1 125I-α -Bgt,終濃度為2ηΜ。 用Tris-HCl緩沖液ρΗ7. 4補(bǔ)足所有反應(yīng)管體積至200 μ 1。在37°C反應(yīng)條件下反應(yīng)2小時(shí)。點(diǎn)樣于49型玻璃纖維濾膜上,負(fù)壓抽濾,再用冰冷的緩沖液洗滌10次,每次anl,抽干濾膜,烘干后放在閃爍瓶中,加Iml閃爍液,用LS6500型液閃計(jì)數(shù)器測定放射性強(qiáng)度。CDX 在不同濃度時(shí)對nAChRs與125I-Ci-Bgt結(jié)合競爭性抑制作用結(jié)果如附圖2所示。CDX具有競爭抑制α -Bgt對乙酰膽堿受體結(jié)合活性,其IC5tl為301. 99ηΜ。實(shí)施例3⑶X的體內(nèi)生物分布試驗(yàn)昆明種小鼠( 25克)尾靜脈分別注射FITC-Avidin和FITC-Avidin-CDX復(fù)合物溶液100 μ 1 (⑶X濃度為2. 5 μ Μ),分別在0. 5、1、2和4小時(shí)用乙醚麻醉,生理鹽水心臟灌流,分別取心、肝、脾、肺、腎和腦等主要器官,活體成像儀(in-vivo Imaging System, FX Pro, Kodak, USA)檢測各個(gè)臟器的熒光分布,同時(shí)根據(jù)熒光強(qiáng)度進(jìn)行半定量計(jì)算,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖3所示。結(jié)果表明,尾靜脈注射FITC-Avidin-⑶X復(fù)合物,在0. 5-4小時(shí)內(nèi)主要分布在腦和腎臟,其中腎臟是其主要代謝途徑,而陰性對照FITC-Avidin在腦內(nèi)沒有分布,說明 CDX具有腦靶向特性。實(shí)施例4⑶X-聚乙二醇-聚乳酸(⑶X-PEG-PLA)膠束體內(nèi)生物分布試驗(yàn)在⑶X上連接半胱氨酸,得到巰基化的⑶X (⑶X-Cys)。⑶X-Cys在pH8. 0的PBS 中與馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚乳酸(Maleimide-PEG-PLA)反應(yīng),反應(yīng)完成后凝膠柱純化除去小分子,凍干備用。制備的CDX-PEG-PLA(Img)與PEG-PLA(19mg)溶解在3ml乙腈中, 加入15 μ g 6-香豆素(Coumarin-6),減壓成膜2h,水化,CL-4B柱除去游離Coumarin_6,制備得到包載Coumarin-6的⑶X修飾膠束,同法制備PEG-PLA載Coumarin_6普通膠束。在 KM鼠( 25克)尾靜脈分別注射包載Coumarin-6的⑶X-PEG-PLA膠束、PEG-PLA膠束各 100μ 1,分別在5分鐘 12小時(shí)用乙醚麻醉,取血后,生理鹽水心臟灌流,取腦組織,生物樣品通過HPLC分析coumarin-6含量,制備血藥-時(shí)間曲線和腦分布-時(shí)間曲線(如表1、圖 4所示),計(jì)算各藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。腦分布中,載Coumarin-6的⑶X-PEG-PLA膠束AUC值顯著大于PEG-PLA膠束,說明⑶X-PEG-PLA可以介導(dǎo)膠束遞藥系統(tǒng)穿透血腦屏障。
權(quán)利要求
1.一種乙酰膽堿受體介導(dǎo)腦靶向多肽,其特征在于,其具有由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽,其特征在于,所述多肽可與其它分子復(fù)合,形成具有介導(dǎo)腦靶向功能的CDX衍生物。
3.—種CDX-Avidin-X復(fù)合物,其特征在于,由權(quán)利要求2所述具有介導(dǎo)腦靶向功能的 ⑶X衍生物,通過N端生物素化得到生物素化⑶X,與親和素衍生物耦合得到。
4.如權(quán)利要求3所述的CDX-Avidin-X復(fù)合物,其特征在于,復(fù)合物中的X是熒光物質(zhì) FITC或近紅外染料IR820中的一種。
5.權(quán)利要求4所述的CDX-Avidin-X復(fù)合物在制備腦部疾病的診斷和示蹤分子制劑中的用途。
6.一種CDX-PEG-Y復(fù)合物,其特征在于,由權(quán)利要求1所述的多肽的N端連接半胱氨酸后,得到巰基化多肽,與含馬來酰亞胺-聚乙二醇的兩親性高分子連接制得。
7.如權(quán)利要求6所述的CDX-PEG-Y復(fù)合物,其特征在于,復(fù)合物中的Y是聚乳酸、聚乳酸-聚羥基乙酸、聚己內(nèi)酯或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一種。
8.權(quán)利要求7所述的CDX-PEG-Y復(fù)合物在制備微粒遞藥系統(tǒng)中的用途。
9.如權(quán)利要求8所述的用途,CDX-PEG-Y復(fù)合物,其特征在于,所述的微粒遞藥系統(tǒng)包載難溶性藥物,包括紫杉醇、阿霉素、伊曲康唑或銀杏內(nèi)酯中的一種。
10.權(quán)利要求7所述的CDX-PEG-Y復(fù)合物在制備診斷與治療腦部疾病的腦靶向制劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬藥學(xué)領(lǐng)域,涉及一種可以跨過血腦屏障的乙酰膽堿受體介導(dǎo)腦靶向多肽CDX,及該乙酰膽堿受體介導(dǎo)腦靶向多肽形成的復(fù)合物在腦部疾病診斷與治療中的用途。熒光素標(biāo)記物的細(xì)胞特異性攝取和腦部分布結(jié)果表明,本發(fā)明的CDX具有介導(dǎo)復(fù)合物跨越血腦屏障的特征;將CDX修飾到聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)等聚合物材料上,并構(gòu)建成包載熒光素或者藥物等分子的聚合物膠束,可以介導(dǎo)跨越血腦屏障,將所載物質(zhì)傳遞到腦組織;包載紫杉醇的PEG-PLA膠束經(jīng)CDX修飾后,可以顯著延長膠質(zhì)瘤原位腫瘤模型動(dòng)物的生存期。本發(fā)明的CDX可以介導(dǎo)藥物或者遞藥系統(tǒng)用于腦部疾病的診斷與治療。
文檔編號A61K31/496GK102212116SQ201010141218
公開日2011年10月12日 申請日期2010年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月2日
發(fā)明者占昌友, 孟慶剛, 謝操, 陸偉躍, 顧炳 申請人:復(fù)旦大學(xué)
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