專利名稱：表達pcv-2免疫原基因的重組桿狀病毒及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達PCV-2免疫原基因的重組桿狀病毒及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒(PCV)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是圓環(huán)病毒屬的代表種，它是一 種小而無囊膜、二十面體對稱、共價閉合、環(huán)狀、單股DNA病毒，病毒粒子直徑平均為17nm， 是目前獸醫(yī)學(xué)上發(fā)現(xiàn)的最小的動物病毒。 PCV可分為兩個血清型，即PCV-1和PCV-2。 PCV-1對豬無致病性，為非致病性PCV， PCV-2對豬有致病性，可引起P麗S (斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征)，又稱P麗S相關(guān)PCV。 1991 年加拿大首次爆發(fā)該病，隨后世界上許多國家和地區(qū)都有該病的報道，目前我國的很多豬 場均有該病存在，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。 Hamel等通過對PCV基因組分析，發(fā)現(xiàn)PCV-1和PCV-2均可能含有11個開放閱讀框 (ORF) 。 PCV各閱讀框中，0RF1和0RF2為主要閱讀框，現(xiàn)已證實0RF1編碼是與病毒復(fù)制相 關(guān)的R印蛋白，而PCV-2的0RF2基因編碼病毒核衣殼蛋白(Cap)，也是病毒的保護性抗原。 Liu等將0RF2基因連接到MBP-His (8) -tag基因3'端，在細菌中表達0RF2融合蛋白，發(fā)現(xiàn) 該融合蛋白可被抗PCV-2多克隆抗體和PCV-2感染豬血清識別，表明0RF2蛋白與PCV-2的 免疫反應(yīng)性有關(guān)。Truong等用從實驗性感染豬制備的PCV-2抗血清，建立ELISA方法，發(fā) 現(xiàn)PCV2-0RF2編碼蛋白具有與抗原性相關(guān)的線性表位，其中從69-83和117-131殘基的兩 個抗原表位對PCV-2來說具型有特異性，0RF2抗原表位可以作為PCV-2感染的血清學(xué)標志 以檢測PCV-2抗體效價。 PCV-2是目前嚴重威脅養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一種重要的病毒。目前對PCV-2的控制目前 尚無疫苗。因此發(fā)展新型疫苗來控制PCV-2已是當務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種重組桿狀病毒及可作為預(yù)防PCV-2感染的亞 單位疫苗。 本發(fā)明提供的一種表達PCV-2免疫原基因的重組桿狀病毒，帶有SEQ IDNO. 1所示
的序列。所述重組桿狀病毒表面展示PCV-2結(jié)構(gòu)蛋白0RF2。 本發(fā)明提供一種上述的重組桿狀病毒的制備方法，步驟包括 a、制備0RF2基因。制備方法為用PCR方法擴增了 PCV_2陜西株0RF2基因，并將
其克隆到pMD18-T載體，構(gòu)建了 pMD18T-0RF2質(zhì)粒； b、將PCV-2的0RF2基因，插入到桿狀病毒表面展示轉(zhuǎn)座載體pBacSC的p10啟動
子下游，構(gòu)建含PCV-2的0RF2基因的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBacSC-0RF2 ; c、將上述重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBacSC-0RF2轉(zhuǎn)入大腸桿菌內(nèi)進行同源重組，獲
得重組桿狀病毒基因組DNA。作為優(yōu)選，所述大腸桿菌為感受態(tài)大腸桿菌DH10Bac。 d、將步驟c得到的重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，得到重組桿狀病毒。優(yōu)選地，將重組桿狀病毒DNA通過脂質(zhì)體介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)入昆蟲細胞Sf9中，包裝出重組桿狀病毒。 本發(fā)明提供一種上述的重組桿狀病毒在制備豬圓環(huán)病毒疫苗中的應(yīng)用。 本發(fā)明提供一種制備豬圓環(huán)病毒疫苗的方法所述重組病毒接種昆蟲細胞，培養(yǎng)
48 72h，收取感染細胞，-40°C /37t:凍融，離心，取上清測定病毒PFU，調(diào)整病毒的滴度使
其達到109PFU/ml。上述昆蟲細胞優(yōu)選Sf9昆蟲細胞。 本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果為 1、本發(fā)明得到的重組桿狀病毒BacSC-0RF2可表面展示PCV-2結(jié)構(gòu)蛋白0RF2，直 接經(jīng)過超速離心得到桿狀病毒的同時也就得到了目的蛋白，可以避免現(xiàn)有技術(shù)中表達系統(tǒng) (包括傳統(tǒng)的桿狀病毒表達系統(tǒng))表達目的蛋白分離純化的繁瑣過程。而，現(xiàn)有技術(shù)的表達 系統(tǒng)中表達的目的蛋白是分泌到Sf9細胞的培養(yǎng)基中，需要通過蛋白純化系統(tǒng)來純化目的 蛋白，這樣費時費力，代價昂貴，不能大規(guī)模應(yīng)用于目的蛋白的規(guī)模化生產(chǎn)，這也是目前蛋 白表達最令人頭疼的地方。 2、轉(zhuǎn)座載體中添加eGFP基因，可以通過熒光顯微鏡直接觀察熒光的有無來檢測 重組病毒的產(chǎn)生情況，大大簡化病毒滴度的測定。 3、該重組桿狀病毒表面展示的蛋白可與PCV-2抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。 4、本發(fā)明得到的一株重組桿狀病毒BacSC-0RF2可剌激小鼠產(chǎn)生有效的體液免疫
和細胞免疫。 5、本發(fā)明得到的一株重組桿狀病毒BacSC-0RF2對實驗動物是安全的，無任何病 理現(xiàn)象出現(xiàn)。 6、本發(fā)明得到的一株重組桿狀病毒具有很好的遺傳穩(wěn)定性，經(jīng)多次傳代后外源基 因不丟失。 7、本發(fā)明所使用的目的基因為PCV-2(自陜西分離)國內(nèi)分離株，從而構(gòu)建的重組 桿狀病毒可作為我國預(yù)防豬圓環(huán)病毒病的亞單位疫苗。


圖1是重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBacSC-0RF2構(gòu)建流程圖。 圖2是重組桿狀病毒BacSC-0RF2感染Sf9細胞綠色熒光蛋白的表達。 圖3是共軛聚焦顯微鏡分析重組桿狀病毒BacSC-0RF2的0RF2蛋白在Sf9細胞膜
上的展示。 圖4是重組桿狀病毒BacSC-0RF2的0RF2蛋白的Western blot分析。 圖5是免疫電鏡分析0RF2蛋白在重組桿狀病毒囊膜上的展示。 圖5中標號說明A.重組桿狀病毒BacSC-0RF2 ;B.陰性對照組，重組桿狀病毒
BacSC。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以
更好的理解本發(fā)明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。 本發(fā)明用PCR方法擴增了 PCV-2陜西株0RF2基因(具體見序列SEQ IDNO. 1)，并將
其克隆到pMD18-T載體，構(gòu)建了 pMD18T-0RF2質(zhì)粒。酶切pMD18T-0RF2質(zhì)粒，回收0RF2基因。
4將回收0RF2插入到桿狀病毒表面展示轉(zhuǎn)座載體pBacSC的plO啟動子下游，構(gòu)建含PCV-2 的0RF2的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBacSC-0RF2 ;將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入桿狀病毒/昆蟲表 達系統(tǒng)感受態(tài)大腸桿菌DH10Bac內(nèi)，使其進行同源重組，并用卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素 進行抗性篩選。重組病毒分別經(jīng)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)、免疫蛋白印記(westernblot)、激 光共聚焦顯微鏡和免疫電子顯微鏡試驗進行檢測，篩選獲得陽性重組桿狀病毒；將篩選的 陽性重組桿狀病毒分別免疫BALB/c小鼠和豬并進行了免疫學(xué)指標的檢測。
pBacSC載體的構(gòu)建過程
1. 1引物的設(shè)計 根據(jù)發(fā)表的桿狀病毒AcMNPV(GenBank :AY542374)的gp64基因組序列和綠色熒光 蛋白(eGFP)基因(GenBank :EU048697)基因組序列，設(shè)計3對特異性引物(Pl/P2、 P3/P4、 P5/P6)。
CACAAGCAAGATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTG-3' ，5'端加上Smal酶切位點；下游引
CGCGCCCATGGGCTAGCGCATGCGCATGC-3'。上游引物P3 5' -GCGCGCCCATCGCATGCTTCAGGGCT AGTGTTTGGTCATGTA-3';下游引物P45' -CCC GGTACCTTAATATTGTCTATTAC-3' ，5'端加上 Kpn I酶切位點。預(yù)期擴增片斷為267bp，含有GP64信號肽(SP)序列，6個組氨酸(His6) 標簽，4個多克隆位點(Bsshl、 Ncol、 Nhel、 Sphl) ， GP64跨膜區(qū)(TM)和GP64胞質(zhì)區(qū)(CTD)基因。 上游引物P5 5' -GCTGGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT-3 ' ，5'端加上 BamHI酶切位點。下游引物P6 5' -AAGCTTCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA-3' ，5'端加上 HindIII酶切位點。預(yù)期擴增片斷為717bp，含有完整的綠色熒光蛋白基因(eGFP)基因。
1. 2SP-His6-四個酶切位點-TM-CTD序列(具體序列見SEQ IDNO. 2)的擴增
PCR反應(yīng)體系如下10XPCR Buffer 5 ii L、 dNTPs 4 ii L、 Pl/P2， P3/P4各1 ii L、 Taq DNA多聚酶1 ii L、加水至50ii L。反應(yīng)程序95 。C變性5min ;94。C lmin， 56 。C lmin， 72°C 30sec，共30個循環(huán)；最后72"延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后取10 y L PCR產(chǎn)物加入1 y L 6XLoading Buffer于0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，分析擴增產(chǎn)物。
1. 2eGFP基因的擴增 PCR反應(yīng)體系如下10 X PCR Buffer 5 ii L、 dNTPs 4 ii L、 P5/P6各1 ii L、 TaqDNA多 聚酶1 y L、pEGFP-Cl質(zhì)粒(BD Biosciences Clontech) 1 ii L、加水至50 ii L。反應(yīng)程序95。C 變性5min ;94。C lmin，56。C lmin，72。C 2min，共30個循環(huán);最后72"C延伸10min。反應(yīng)結(jié)束 后取10 ii L PCR產(chǎn)物加入1 y L 6 X Loading Buffer于0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，分析擴增產(chǎn) 物。 1. 3PCR產(chǎn)物與pFastBacTM Dual載體的連接 參照上海生工UNIQ-10膠回收試劑盒說明書回收目的基因。將eGFP基因插入載 體pFastBacTM Dual (Life Technologies)的Polyhedrin啟動子下游的多克隆位點(MCS) 的BamHI和HindIII酶切位點處。同樣方法將SP_His6-四個酶切位點-TM-CTD基因插入 到已經(jīng)插入了 eGFP基因的pFastBacTM Du al載體的另外一個plO啟動子下游多克隆位點 (MCS)的Smal和Kpnl酶切位點處，從而構(gòu)建成功pBacSC載體。具體的操作方法、參數(shù)都是按照分子生物學(xué)常規(guī)方法進行。
下面敘述本發(fā)明的具體實施方法
1. PCV-2陜西株0RF2基因的克隆
1. 1引物的設(shè)計根據(jù)發(fā)表的P CV-2GX株(GenBank :EF675237)的基因組序列，設(shè)計1對特異性引 物(P1/P2)。上游引物P1 5' -GCTCTCGAG ATGAATGGCATCTTC-3' ，5'端加上Xhol酶切位 點。下游引物P2 5' -CTGCAGAAGTGGGGGGTCTTTAAG-3' ，5'端加上PstI酶切位點。預(yù)期 擴增片斷為570bp，含有去掉N端核定位區(qū)基因的完整的0RF2基因。
1. 2病毒基因組的擴增 取出-S(TC保存的PCV-2細胞毒，按照寶生物工程(大連)有限公司的病毒DNA提 取試劑盒說明書提取病毒DNA。 PCR反應(yīng)體系如下IOXPCR Buffer 5iiL、dNTPs 4 ii L、P1/P2各1 ii L、rTaql ii L、 病毒DNA 3ii L、加水至50ii L。反應(yīng)程序95。C變性5min ;94。C lmin，56。C 45s，72。C 1. 5min， 共30個循環(huán)；最后72t:延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后取10 y LPCR產(chǎn)物加入適量6XLoading Buffer于0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，分析擴增產(chǎn)物。
1. 3PCR產(chǎn)物的純化與回收 參照上海生工UNIQ-IO膠回收試劑盒說明書回收目的基因。
2.大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備(氯化鈣法) 以無菌接種環(huán)刮取凍存于-7(TC冰箱的大腸桿菌菌種，劃線接種于不含氨芐青霉 素(Amp)的LB瓊脂平板，37t:培養(yǎng)16h左右。挑取單一菌落，接種到100mlLB培養(yǎng)基中， 37°C 、250r/min振搖培養(yǎng)到0D600 = 0. 4 0. 6，在無菌條件下將細菌培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到兩個無 菌并以冰預(yù)冷的聚丙烯離心管中(以下操作均需無菌)，冰浴10min，使培養(yǎng)物冷卻到0°C ; 4。C、2000r/min離心10min，棄上清，以10ml用冰預(yù)冷的75mmol/L CaCl2、 10mmol/L(p朋.5) 溶液重懸沉淀，冰浴10min，4°C，2000r/min離心10min，棄上清，以2ml用冰預(yù)冷的，含15% v/v、)甘油的75mmol/L CaCl2、 10mmol/L Tris *C1 (p朋.5)溶液重懸每管沉淀，用無菌吸頭 將感受態(tài)細胞分裝于無菌微量離心管中，每管200 ii 1 ;標明菌株、體積和日期，置-7(rc冰 箱凍存?zhèn)溆谩?3. 0RF2基因片段與pMD18-T載體的連接反應(yīng)取0. 5 ii g pMD18-T載體，力n 3 5倍摩爾量的0RF2DNA片段，2 yl 5 X連接緩沖 液加水定容至10iil，最后加入1Weiss單位T4DNA連接酶，混勻并離心，16。C連接1 4h， 取7 iil連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化上述E co. li感受態(tài)細胞。
4.轉(zhuǎn)化 將適量連接產(chǎn)物DNA(體積質(zhì)粒< 1 y 1，連接產(chǎn)物< lOiU， DNA < 50ng)加入 200 iil上述感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30min ;42。C水浴熱沖擊90s，冰浴冷卻2min ; 加入200ii1 37t:預(yù)熱的LB培養(yǎng)基，37t: 150r/min振搖培養(yǎng)50min ;取培養(yǎng)液涂布于含 Amp (50 ii g/ml)的LB瓊脂平板，37。C培養(yǎng)14h 16h后，得到轉(zhuǎn)化菌落。
5.質(zhì)粒的提取(堿裂解法) 挑取單個上述轉(zhuǎn)化菌落，接種到2ml含50 ii g/ml Amp的LB培養(yǎng)液(下同)中， 37°C 250r/min振搖培養(yǎng)12 16h ;將1. 5ml轉(zhuǎn)入微量離心管中，12000r/min離心30s，棄上清。以200 ii 1冰預(yù)冷的溶液I (50rnmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris Cl， pH8. 0 ;10mmo1/ L EDTA，pH8. 0)重懸沉淀，加入200 新配制的溶液II (0. 2mol/LNaOH， 1 % SDS)，顛倒數(shù)次 混勻，加入200 ii 1用冰預(yù)冷的溶液III (3mol KAc， 5mol/L冰乙酸)，顛倒混勻，4°C 12000r/ min離心10min，取上清，分別用等量飽和酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1)，氯仿/異戊醇 (24 : 1)各抽提一次；加2倍體積冷無水乙醇，混合均勻，置-2(TC 30min，4°C 12000r/min 離心10min，棄上清，沉淀用70%冷乙醇洗滌抽干。以20 含終濃度20 y g/ml RNA酶(無 DNA酶)的TE(10mmol/L Tri s HCl， pH8. 0， lmmol/LEDTA， pH8.0，下同)溶解沉淀，并于 37t:水浴中作用30min，瓊脂糖凝膠電泳檢查或-2(TC保存。
6.重組質(zhì)粒pMD18T-0RF2的酶切鑒定 將1. 0 ii g質(zhì)粒DNA與適量水混勻，使其總體積為18 iil ，分別加入2 3單位Pst I和Xho I限制性內(nèi)切酶及l(fā)iU相應(yīng)的10X限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，輕彈管壁混勻并離 心，置最適反應(yīng)溫度水浴2 3h，瓊脂糖凝膠電泳檢查。酶切結(jié)果均與預(yù)計完全相同者，即 為目的重組質(zhì)粒。完全酶切后，_201:保存，以備進一步鑒定或回收片段之用。
7.攜帶0RF2基因重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體質(zhì)粒的構(gòu)建 用Xhol和Pstl雙酶切pMD18T-0RF2質(zhì)粒，回收0RF2基因，將其插入到同樣經(jīng)過 Xhol和Pstl雙酶切的桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體pBacSC，進行連接反應(yīng)，構(gòu)建含有0RF2基因的桿 狀病毒轉(zhuǎn)座載體pBacSC-0RF2。具體試驗操作過程與pMD18T-0RF2重組質(zhì)粒構(gòu)建相同。
8.同源重組
8. 1制備"三抗"LB平板 將高壓蒸汽滅菌后的LB液體培養(yǎng)基(含1.5%瓊脂粉)置超凈臺內(nèi)，待其溫度 冷卻至5(TC左右時加入以下三種抗生素至終濃度為卡那霉素(Kan)50iig/mL、慶大霉素 (Gm) 7 ii g/ml和四環(huán)素(Tet) 10 y g/ml，并加入X-gal (終濃度為150 y g/mL和IPTG(終濃 度為40ii g/mL)混勻后立即鋪制平板。
8. 2轉(zhuǎn)化過程 取重組質(zhì)粒pBacSC-0RF2 10 ii L(4 ii g)加入100mL制備好的感受態(tài)大腸桿菌 DH10Bac管內(nèi)，輕輕混勻，將離心管放入冰水混合物中冰浴30min，將離心管放入42。C熱休 克2min，再迅速移至冰水中放置5min。加入滅菌的LB液體培養(yǎng)基900mL， 37。C搖床200rpm/ min振蕩培養(yǎng)lh，加入卡那霉素(終濃度為50 ii g/mL)、慶大霉素(終濃度為7 y g/ml)后 繼續(xù)搖床200rpm/min振蕩培養(yǎng)4h。 6000rpm/min離心10min，保留細菌沉淀及LB液體 約300iiL，用新鮮的LB液體培養(yǎng)基將其以10—、10—2和10—3不同的稀釋度稀釋。然后各取 100 ii L分別均勻涂布于"三抗"LB平板，將平皿于37t:倒置培養(yǎng)24 48h，觀察藍白菌落 的生長情況。
8. 3白斑鑒定 用滅菌的牙簽挑取5 10個分隔良好的白色菌落，再次接種于含"三抗"的平 板上，37t:倒置培養(yǎng)24h，觀察菌落表型的變化，進一步證實為白色菌落。再用滅菌牙簽挑 取6個白色菌落和2個藍色菌落，分別放入裝有6ml LB培養(yǎng)基的試管中，再加入卡那霉素 (Kan)50ii g/mL、慶大霉素(Gm) 7 y g/ml和四環(huán)素(Tet) 10 y g/ml，三種抗生素，37。C搖床 200rpm/min振蕩培養(yǎng)過夜。
8. 4重組桿狀病毒DNA的提取與制備
將上述培養(yǎng)菌液分裝至1. 5mL的Eppendorf管中，12000rpm/min離心lmin。棄凈 上清，加入300ii L溶液I(50mmol/L Tris-HCL pH8. 0， 10mmol/L EDTA，滅菌備用)，重懸沉 淀。加入300iiL溶液II(0.2mol/L NaOH，l% SDS)，溫和顛倒混勻，置冰水浴中5min，使細 菌裂解。緩慢逐滴加入300ii L溶液III(5mol/L乙酸鉀60ml，冰乙酸11. 5ml，水28. 5ml， pH5. 5)，加入過程中輕微搖動，置于冰上10min。 12000r/min離心10min，同時標好另一干 凈的E卯endorf管，加入800 y L異丙醇。輕輕將上清轉(zhuǎn)移至已加好異丙醇的新管中，注意 不要吸入蛋白沉淀，將離心管顛倒數(shù)次混勻，置于室溫15min， 12000r/min離心lOmin，棄上 清。分別用75%和100X的乙醇各洗滌一次，14000r/min離心5min，棄上清，風(fēng)干(無菌條 件下)lh，溶于40 ii L TE緩沖液。
9.重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染Sf9細胞 在6孔板中每個孔中加入Sf9昆蟲細胞9X105 cells,培養(yǎng)基用2mL Sf900IISFM， 含有雙抗?jié)舛葹?.5X終濃度(50units/ml penicillin, 50 u g/ml str印tomycin)。細胞 來自培養(yǎng)3 4天的處于對數(shù)生長期的，活力大于97X細胞，并置于27t:培養(yǎng)箱中l(wèi)h;在 這lh中準備下列實驗。取2支1. 5ml E卯endorf管標為A、 B，分別加入100 y L無抗生素 的Sf90011 SFM培養(yǎng)液，A管中加入5iiL的上述重組桿狀病毒DNA，混勻。B管中加入6iiL 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin，混勻(注意脂質(zhì)體是一個油脂的懸浮物，可能會沉淀，使用前 顛倒管子5 10次，將其混均勻)。混合A管和B管，輕輕混勻，置室溫45min，使其形成 Cellfectin-DNA混合物。取已經(jīng)貼壁生長良好的Sf 9單層細胞，棄舊培養(yǎng)液，用無抗生素 的Sf90011 SFM培養(yǎng)液洗滌1遍。取上述Cellfectin-DNA混合物，加入O. 8ml不含抗生素 的Sf90011 SFM混合均勻。從細胞中吸棄清洗用的培養(yǎng)基，將混合均勻的脂質(zhì)體和重組DNA 混合物鋪到細胞上，覆蓋細胞，放置28t:培養(yǎng)6h后。吸棄混合物，加入含抗生素的Sf90011 SFM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細胞形態(tài)表現(xiàn)。收集細胞用于表達蛋白的分析，同時收集培 養(yǎng)上清作為原毒種，分小管貯存于-201:，用于重新感染Sf9細胞。
10.重組桿狀病毒BacSC-0RF2的PCR鑒定 取病毒的細胞培養(yǎng)物2mL，反復(fù)凍融3次，12000r/min離心15min，取上清 437. 5ii L，加入12. 5ii L蛋白酶K(20mg/mL)和50 ii L SDS液(10% ) ，37。C水浴30min ;等 體積酚/氯仿抽提一次，取上清；等體積氯仿復(fù)提，取上清；加入l/10體積NaAc(2mol/L)和 2倍體積無水乙醇，-20。C放置2h ;4。C 15000r/min離心15min，取沉淀；70%乙醇洗滌一次， 沉淀用30iiL TE溶液溶解，即為提取的DNA，-70。C保存?zhèn)溆?。PCR時取5yL即可。PCR反 應(yīng)條件為95。C預(yù)變性5min后，按95。C變性lmin，54。C退火lmin，72。C延伸2min共30個循 環(huán)，最后72t:延伸10min。
11.重組桿狀病毒量的放大與濃縮 懸浮培養(yǎng)昆蟲細胞待細胞濃度達lX106cell/ml，以MOI = 1 (Multiplicity ofinfection，MOI)的重組桿狀病毒量感染昆蟲細胞，利用病毒會在宿主昆蟲細胞中復(fù)制達 到病毒量放大的目的。感染3 4天后離心除去細胞及細胞碎片，收集上清液即完成病毒 量的放大。 12.重組病毒表達產(chǎn)物的檢測
12. 1熒光顯微鏡觀察鑒定重組病毒 重組pBacSC-0RF2轉(zhuǎn)座載體上帶有eGFP基因，可以表達綠色熒光蛋白，可以通過熒光顯微鏡觀察發(fā)出熒光的細胞數(shù)量來確認轉(zhuǎn)染陽性細胞。轉(zhuǎn)染后48h后細胞呈現(xiàn) 明顯的CPE變化，轉(zhuǎn)染細胞出現(xiàn)熒光(見附圖2)，產(chǎn)生了具有感染活性的重組桿狀病毒 BacSC-0RF2。 12.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 將擴增后的純化重組病毒BacSC-0RF2，以10M0I分別接種于10ml培養(yǎng)瓶1 X 106個 /ml Sf9細胞中，同時設(shè)桿狀病毒陰性對照組和細胞對照，至75%細胞出現(xiàn)明顯病變時，棄 培養(yǎng)液，用lml的TEN(40mmol/L Tris *C1 pH7. 5， lmmol/L EDTA， 150,1/L NaCl)洗脫細 胞，收集于E卯endorf管中，3000r/min離心5min，棄上清，細胞沉淀用PBS洗3次，加60 yl 裂解緩沖液(1Ommol/L Tris Cl， pH7. 4， lmmol/L MgCl2， 0. 5% NP40， 20 ii g/ml DNase I) 裂解，冰浴30min，煮沸3min， 5000r/min離心5min， -20。C凍存。 取30iil細胞裂解液與等量2X樣品緩沖液(100mmol/L Tris Cl，p朋.8，4% SDS， 0. 2 %溴酚藍，20 %甘油，使用前加入2. 5 % 13 -巰基乙醇)混勻，于10 %凝膠進行SDS-PAGE 電泳。 12. 3免疫印跡(Western blot) 經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白后，將其電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂乳或3%牛血 清白蛋白緩沖液(1Ommol/L Tri s Cl， pH7. 5， 150mmol/L NaCl，0. 05% Tween20) 37。C封 閉2h，洗滌緩沖液(10mmol/L Tris Cl pH7. 5， 150mmol/L NaCl，0. 05 % Tween20)洗滌 3次，每次5 10min，將豬抗PCV-2陽性血清用封閉緩沖液稀釋(1 : 300)覆蓋膜上，室 溫感作2h，洗滌3 5次，辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG(1 : 4000)室溫感作2h，洗 滌3 5次后，每次5 10min，最后用蒸餾水清洗一次，夾出硝酸纖維素膜稍晾干，配制 ECL(enhancedchemiluminescence)工作液，在可見光下室溫孵育膜數(shù)分鐘，將印跡膜用保 鮮膜包被粘貼固定于X光片曝光暗盒。然后轉(zhuǎn)入暗室將X光膠片壓在膜上曝光數(shù)秒到數(shù)分 鐘，顯影定影后蛋白質(zhì)條帶可清晰顯示在X光膠片上。
12. 4激光共軛聚焦顯微鏡分析 在6孔培養(yǎng)板中放入無菌載玻片，Sf9細胞先接種于無菌之載玻片上，細胞接入量 為每孔加入1X106。細胞吸附lh后，吸棄培養(yǎng)基，加入重組桿狀病毒BacSC-0RF2在M01 = IO下感染。2天后吸棄培養(yǎng)基，再添加lml甲醇丙酮(1 : 1)混合液于-2(TC冰箱下固定 5分鐘，之后再加入lml PBS(phosphate-bufferedsaline)搖床轉(zhuǎn)速50r/min清洗2次，每 次5min。接著以lml的2% BSA(bovinese進26 albumin)在37。C下反應(yīng)30min。之后再 加入lmlPBS (phosphate-buffered saline)搖床轉(zhuǎn)速50r/min清洗2次，每次5min。接下 來分別加入豬抗PCV-2陽性血清(1 : 100)在37t:下反應(yīng)lh。以lml的PBS清洗3次后， 再加入FITC標記的羊抗豬IgG(l : 100)37"下反應(yīng)lh。最后再以lml的PBS清洗3次。 在激光共軛焦顯微鏡(confocal microscope,TCS SP2，Leica，Germany)下觀察，帶有0RF2 重組蛋白質(zhì)細胞膜會被FITC染色而呈現(xiàn)綠色熒光。
12. 5免疫電子顯微鏡檢測 取15iU純化的昆蟲桿狀病毒液滴于蠟板上，將封有炭膜的銅網(wǎng)有炭膜的一面向 下懸浮在昆蟲桿狀病毒液面上，吸附30min。滴入含有1 % BSA的PBS液1滴于蠟板上，將 銅網(wǎng)有炭膜的一面輕浮于液滴上室溫封阻20min，然后用PBS液洗滌3次，每次5min。洗滌 的方法和封阻的方法相同，用濾紙在網(wǎng)緣將水吸干。將銅網(wǎng)分別浮于豬抗PCV-2陽性血清(1 : 50)液滴上(大約15 ill)，室溫30 60min。同時設(shè)立陰性對照組，不加第一抗體，用 PBS代替。PBS漂洗洗3次，每次5min，濾紙吸干。將銅網(wǎng)懸浮于膠體金標記的羊抗豬IgG 第二抗體液滴上(1 : 50倍稀釋)，室溫孵育30 60min。 PBS漂洗洗3次，每次5min，濾 紙吸干。將銅網(wǎng)懸浮在2%的磷鴇酸液滴上負染2min，在室溫干燥，電鏡觀察。
13.重組病毒BacSC-0RF2表達產(chǎn)物的檢測結(jié)果 篩選獲得的重組桿狀病毒BacSC-0RF2接種Sf9昆蟲細胞后，在感染細胞的細胞膜 處，可觀察到特異的一圈黃綠色熒光，說明表達產(chǎn)物是特異的而且表達產(chǎn)物展示在Sf9昆 蟲細胞的細胞膜上(見附圖3)。經(jīng)Western blot分析，重組毒接種的細胞培養(yǎng)物出現(xiàn)了與 豬抗PCV-2陽性血清結(jié)合的大小為27kD的特異帶(見附圖4)，證明了 0RF2蛋白在Sf9昆 蟲細胞中得到了表達。重組毒BacSC-0RF2免疫電子顯微鏡檢測到與豬抗PCV-2陽性血清 結(jié)合的金粒子，并且金粒子位置在重組病毒膨大的囊膜蛋白處，表明0RF2蛋白被展示在桿 狀病毒的囊膜上(見附圖5)。 14.重組桿狀病毒BacSC-0RF2的免疫原性研究
14. 1重組桿狀病毒BacSC-0RF2免疫小鼠 重組病毒接種Sf9昆蟲細胞，培養(yǎng)48 72h，收取感染細胞。_40°C /37。C反復(fù)凍 融3次，3000r/min離心10min，取上清測定病毒PFU，調(diào)整病毒的滴度使其達到109PFU/ml。
BALB/c雌性小鼠12只，體重18 20g，隨機分2組，采取腹腔注射方式，分別注射 重組桿狀病毒BacSC-0RF2和不含0RF2基因的桿狀病毒BacSC0. 5ml 。上述2組均免疫二次， 間隔14天，最后一次免疫后的第14天摘眼球取血，頸椎脫臼處死，凝血分離血清供ELISA 檢測抗PCV-2抗原的IgG抗體以及進行中和試驗檢測免疫小鼠的血清中和抗體滴度。無菌 取其脾臟分別進行T淋巴細胞增值試驗和用流式細胞儀分析檢測T淋巴細胞亞類的數(shù)量。
14. 2脾臟免疫學(xué)指標的檢測
14. 2. 1脾臟單淋巴細胞懸液制備 頸椎脫臼處死小鼠，無菌條件下取出脾臟，置于盛有RPMI 1640培養(yǎng)基的平皿中， 用玻片研磨，200目尼龍網(wǎng)過濾制成單細胞懸液，1500r/min，離心5min，棄上清。用Hanks 液離心洗細胞兩次，重懸于含10 % NBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，計數(shù)，調(diào)至2 X 107個/ml備用。 1 4. 2. 2脾T淋巴細胞亞類數(shù)量的檢測 取脾細胞懸液0. lml，加5ml PBS， 1500r/min，離心10min，洗細胞兩次，在0. 5ml PBS細胞懸浮液中分別加熒光標記大鼠抗小鼠CD4+和CD8+單克隆抗體(此抗體用PBS按 1 : 10稀釋)室溫避光放置30min，再加5ml PBS洗一次，1500r/min離心10min，將管底細 胞用200 iil PBS懸浮，待上流式細胞儀檢測。FACS檢測10000個細胞，所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計 學(xué)處理。 14. 2. 3T淋巴細胞增值試驗 (1)脾細胞的制備將小鼠捕殺、采血、取脾、研磨、過濾，最后一次用Hank' s液洗 滌，棄上清，再用含有10%犢牛血清的1640培養(yǎng)液lml重懸脾細胞，調(diào)整細胞濃度至2 X 106 個/ml。 (2)在96孔板中每孔加入淋巴細胞懸液100 ii 1，對應(yīng)孔中分別加入特異性剌激原 ConA(lO ii g/ml) 100 y 1作為陽性對照組、20 y g/ml重組桿狀病毒特異性剌激原100 yl為試驗組以及1640培養(yǎng)基100 1為非剌激抗原孔，不同剌激原重復(fù)3個孔；以只加200 1 1640培養(yǎng)基無淋巴細胞的孔作為本底。 (3)68h后，每孔加入MTT(5mg/ml)20iil，避光培養(yǎng)4h ;每孔吸棄100 培養(yǎng)液， 再加入匿SO 100iil，10min內(nèi)用酶聯(lián)免疫檢測儀630nm測定個孔OD值。
(4)結(jié)果計算SI =(特異剌激原的平均OD值-本底值)/(非剌激原的平均OD 值_本底值) 14. 3ELISA測定免疫小鼠血清中抗PCV-2抗體 ELISA試劑盒中的包被抗原為滅活的全病毒，二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗 鼠IgG抗體。在酶聯(lián)免疫儀450nm測量各孔OD值。
14. 4重組病毒在本體動物豬的免疫學(xué)研究
同小鼠的免疫學(xué)和檢測方法。 [ono] 檢測結(jié)果 獲得的重組桿狀病毒BacSC-0RF2提取基因組后進行PCR擴增，得預(yù)期大小的目的 片段。激光共聚焦顯微鏡觀察試驗、免疫金電子顯微鏡觀察和Western blot檢測均為陽性 結(jié)果，說明構(gòu)建的重組桿狀病毒BacSC-0RF2可分別表達PCV-2 0RF2衣殼蛋白。重組桿狀 病毒BacSC-0RF2可在昆蟲細胞中表達，且重組病毒具有良好的遺傳穩(wěn)定性。將重組桿狀病 毒大量擴增后進行小鼠免疫實驗，可在免疫小鼠血清中檢測到抗PCV-2的抗體，表明重組 病毒剌激小鼠機體產(chǎn)生了特異性體液免疫。免疫小鼠脾T細胞亞類數(shù)量的檢測及淋巴細胞 增殖試驗結(jié)果均顯示小鼠產(chǎn)生了特異性細胞免疫。 研究結(jié)果表明，本發(fā)明所構(gòu)建的重組桿狀病毒是一種安全、有效的基因工程亞單 位疫苗，具有開發(fā)成為用于預(yù)防豬圓環(huán)病毒病的疫苗的良好前景。 以上所述實施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實施例，本發(fā)明的保護范 圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明 的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護范圍以權(quán)利要求書為準。
權(quán)利要求
一種表達PCV-2免疫原基因的重組桿狀病毒，其特征在于，所述重組桿狀病毒帶有SEQ ID NO.1所示的序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組桿狀病毒，其特征在于，所述重組桿狀病毒表面展示 PCV-2結(jié)構(gòu)蛋白0RF2。
3. —種權(quán)利要求1或2所述重組桿狀病毒的制備方法，其特征在于，步驟包括a、 制備0RF2基因；b、 將上述的0RF2基因，插入到桿狀病毒表面展示轉(zhuǎn)座載體pBacSC的p10啟動子下游， 構(gòu)建含PCV-2的0RF2基因的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBacSC-0RF2 ;c、 將上述重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBacSC-0RF2轉(zhuǎn)入大腸桿菌內(nèi)進行同源重組，得重組 桿狀病毒DNA ;d、 將步驟c得到的重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，得到重組桿狀病毒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組桿狀病毒的制備方法，其特征在于，所述0RF2基因的制 備方法為用PCR方法擴增了PCV-2陜西株0RF2基因，并將其克隆到pMD18-T載體，構(gòu)建了 pMD18T-0RF2質(zhì)粒，酶切pMD18T-0RF2質(zhì)粒，回收0RF2基因。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組桿狀病毒的制備方法，其特征在于，步驟d所述重組桿狀 病毒DNA轉(zhuǎn)染昆蟲細胞的方法為將重組桿狀病毒DNA通過脂質(zhì)體介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)入昆蟲細胞 中。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組桿狀病毒的制備方法，其特征在于，步驟c所述大腸桿菌 為感受態(tài)大腸桿菌DH10Bac。
7. 如權(quán)利要求1或2所述的重組桿狀病毒在制備豬圓環(huán)病毒疫苗中的應(yīng)用。
8. —種制備豬圓環(huán)病毒亞單位疫苗的方法，其特征在于，所述重組病毒接種昆蟲細胞， 培養(yǎng)48 72h，收取感染細胞，-4(TC /37t:凍融，離心，取上清測定病毒PFU，調(diào)整病毒的滴 度使其達到109PFU/ml。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述昆蟲細胞為Sf9昆蟲細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表達PCV-2免疫原基因的重組桿狀病毒及其制備方法和應(yīng)用。具體地說涉及一種重組桿狀病毒，所述重組桿狀病毒帶有SEQ ID NO.1所示的序列，其表面展示PCV-2結(jié)構(gòu)蛋白基因ORF2。利用所述重組病毒接種昆蟲細胞，培養(yǎng)48～72h，收取感染細胞，-40℃/37℃凍融，離心，取上清測定病毒PFU，調(diào)整病毒的滴度使其達到109PFU/ml，制得一種安全、有效的基因工程亞單位疫苗，用于預(yù)防PCV-2。
文檔編號A61K39/12GK101792743SQ20101014080
公開日2010年8月4日 申請日期2010年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月7日
發(fā)明者張琪, 童德文, 許信剛 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)