專利名稱：表達(dá)jev免疫原基因的重組桿狀病毒及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)JEV免疫原基因的重組桿狀病毒及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
JE(乙型腦炎)也稱日本腦炎(J即anese enc印halitis)，是由JEV(日本腦炎病 毒)引起的人和動物共患的一種蟲媒病毒性疾病。主要引起母豬出現(xiàn)繁殖障礙如流產(chǎn)、早 產(chǎn)、死胎、木乃伊胎)，也可引起公豬的睪丸急性炎癥反應(yīng)或不育，從而給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了 巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 JEV屬于黃病毒科，黃病毒屬，是不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒。基因組長約llKb， 有單一開放的閱讀框，能編碼、翻釋、加工成3種結(jié)構(gòu)蛋白(囊膜蛋白E、膜蛋白M以及衣殼 蛋白C)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白。E糖蛋白是JEV主要的免疫原，可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和血 凝抑制抗體，保護(hù)機(jī)體免受病毒攻擊，是乙腦病毒的基因工程疫苗研究首選蛋白。
JEV是目前嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一種重要的病毒，目前對這JE疾病的控制尚無 切實(shí)有效的方法，防制JE的疫苗主要有滅活苗和弱毒苗，但由于免疫原性和安全性等方面 的問題受到限制。因此發(fā)展新型疫苗來控制JE已是當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種重組桿狀病毒及可作為預(yù)防JE感染的亞單 位疫苗。 本發(fā)明提供的一種表達(dá)JEV免疫原基因的重組桿狀病毒，帶有SEQ IDNO. 1所示的
序列。所述重組桿狀病毒表面展示JEV結(jié)構(gòu)蛋白E。 本發(fā)明提供一種上述的重組桿狀病毒的制備方法，步驟包括 a、制備E基因。制備方法為用PCR方法擴(kuò)增了 JEV陜西株E基因，并將其克隆到
pMD18-T載體，構(gòu)建了 pMD18T-E質(zhì)粒； b、將JEV的E基因，插入到桿狀病毒表面展示轉(zhuǎn)座載體pBacSC的p10啟動子下游， 構(gòu)建含JEV的E基因的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBacSC-E ; c、將上述重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBacSC-E轉(zhuǎn)入大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行同源重組，獲得 重組桿狀病毒基因組DNA。作為優(yōu)選，所述大腸桿菌為感受態(tài)大腸桿菌DH10Bac。
d、將步驟c得到的重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，得到重組桿狀病毒。優(yōu)選地， 將重組桿狀病毒DNA通過脂質(zhì)體介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)入昆蟲細(xì)胞Sf9中，包裝出重組桿狀病毒。
本發(fā)明提供一種上述的重組桿狀病毒在制備預(yù)防豬乙型腦炎的疫苗中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供一種制備預(yù)防豬乙型腦炎的亞單位疫苗的方法重組病毒接種昆蟲細(xì) 胞，培養(yǎng)48 72h，收取感染細(xì)胞，-40°C /37t:凍融，離心，取上清測定病毒PFU，調(diào)整病毒 的滴度使其達(dá)到109PFU/ml。上述昆蟲細(xì)胞優(yōu)選Sf9昆蟲細(xì)胞。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果為 1 、本發(fā)明得到的重組桿狀病毒BacSC-E可表面展示JEV結(jié)構(gòu)蛋白E，直接經(jīng)過超速
3離心得到桿狀病毒的同時也就得到了目的蛋白，可以避免現(xiàn)有技術(shù)中表達(dá)系統(tǒng)(包括傳統(tǒng) 的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng))表達(dá)目的蛋白分離純化的繁瑣過程。而，現(xiàn)有技術(shù)的表達(dá)系統(tǒng)中表 達(dá)的目的蛋白是分泌到Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)基中，需要通過蛋白純化系統(tǒng)來純化目的蛋白，這
樣費(fèi)時費(fèi)力，代價昂貴，不能大規(guī)模應(yīng)用于目的蛋白的規(guī)?；a(chǎn)，這也是目前蛋白表達(dá)最 令人頭疼的地方。 2、轉(zhuǎn)座載體中添加eGFP基因，可以通過熒光顯微鏡直接觀察熒光的有無來檢測 重組病毒的產(chǎn)生情況，大大簡化病毒滴度的測定。 3、該重組桿狀病毒表面展示的蛋白可與JEV抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。 4、本發(fā)明得到的一株重組桿狀病毒BacSC-E可剌激小鼠產(chǎn)生有效的體液免疫和
細(xì)胞免疫。 5、本發(fā)明得到的一株重組桿狀病毒BacSC-E對實(shí)驗(yàn)動物是安全的，無任何病理現(xiàn) 象出現(xiàn)。 6、本發(fā)明得到的一株重組桿狀病毒具有很好的遺傳穩(wěn)定性，經(jīng)多次傳代后外源基 因不丟失。 7、本發(fā)明所使用的目的基因?yàn)镴EV(自陜西分離)國內(nèi)分離株，從而構(gòu)建的重組桿 狀病毒可作為我國預(yù)防JE的亞單位疫苗。


圖1是重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBacSC-E構(gòu)建流程圖。 圖2是重組病毒BacSC-E感染Sf9細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá)。 圖3是共軛聚焦顯微鏡分析重組桿狀病毒BacSC-E的E蛋白在Sf9細(xì)胞膜上的展示。 圖4是重組桿狀病毒BacSC-E的E蛋白的Western blot分析。 圖5是免疫電鏡分析E蛋白在重組桿狀病毒BacSC-E囊膜上的展示。 圖5中標(biāo)號說明A.重組桿狀病毒BacSC-E ;B.陰性對照組，重組桿狀病毒BacSC。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以 更好的理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對本發(fā)明的限定。
本發(fā)明用PCR方法擴(kuò)增了 JEV陜西株E基因(具體序列見SEQ ID NO. 1)，并將其 克隆到pMD18-T載體，構(gòu)建了 pMD18T-E質(zhì)粒。酶切pMD18T-E質(zhì)粒，回收E基因。將回收的 結(jié)構(gòu)蛋白基因E插入到桿狀病毒表面展示轉(zhuǎn)座載體pBacSC的p10啟動子下游，構(gòu)建含JEV 的E的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBacSC-E ;將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入桿狀病毒/昆蟲表達(dá)系統(tǒng) 感受態(tài)大腸桿菌DH10Bac內(nèi)，使其進(jìn)行同源重組，并用卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素進(jìn)行抗 性篩選。重組病毒分別經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、免疫蛋白印記(western blot)、激光共聚 焦顯微鏡和免疫電子顯微鏡試驗(yàn)進(jìn)行檢測，篩選獲得陽性重組桿狀病毒；將篩選的陽性重 組桿狀病毒分別免疫BALB/c小鼠和豬并進(jìn)行了免疫學(xué)指標(biāo)的檢測。
pBacSC載體的構(gòu)建過程
1. 1引物的設(shè)計
根據(jù)發(fā)表的桿狀病毒AcMNPV(GenBank :AY542374)的gp64基因組序列和綠色熒光 蛋白(eGFP)基因(GenBank :EU048697)基因組序列，設(shè)計3對特異性引物(Pl/P2、 P3/P4、 P5/P6)。
CACAAGCAAGATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTG-3' ，5'端加上Smal酶切位點(diǎn)；下游引
CGCGCCCATGGGCTAGCGCATGCGCATGC-3'。上游引物P3 5' -GCGCGCCCATCGCATGCTTCAGGGCTA GTGTTTGGTCATGTA-3';下游引物P4 5' -CCCGGTACCTTAATATTGTCTATTAC-3' ，5'端加上 Kpn I酶切位點(diǎn)。預(yù)期擴(kuò)增片斷為267bp，含有GP64信號肽(SP)序列，6個組氨酸(His6) 標(biāo)簽，4個多克隆位點(diǎn)(Bsshl、 Ncol、 Nhel、 Sphl) ， GP64跨膜區(qū)(TM)和GP64胞質(zhì)區(qū)(CTD)基因。 上游引物P55' -GCTGGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT-3 ' ，5'端加上 BamHI酶切位點(diǎn)。下游引物P6 5' -AAGCTTCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA-3' ，5'端加上 HindIII酶切位點(diǎn)。預(yù)期擴(kuò)增片斷為717bp，含有完整的綠色熒光蛋白基因(eGFP)基因。
1. 2SP-His6-四個酶切位點(diǎn)-TM-CTD序列(具體序列見SEQ IDNO. 2)的擴(kuò)增
PCR反應(yīng)體系如下10XPCR Buffer 5 ii L、 dNTPs 4 ii L、 Pl/P2， P3/P4各1 ii L、 Taq DNA多聚酶1 ii L、加水至50ii L。反應(yīng)程序95 。C變性5min ;94。C lmin， 56 。C lmin， 72°C 30sec，共30個循環(huán)；最后72"延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后取10 y L PCR產(chǎn)物加入lyL 6XLoading Buffer于0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，分析擴(kuò)增產(chǎn)物。
1. 3eGFP基因的擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系如下10 X PCR Buffer 5 ii L、 dNTPs 4 ii L、 P5/P6各1 ii L、 TaqDNA多 聚酶1 y L、pEGFP-Cl質(zhì)粒(BD Biosciences Clontech) 1 ii L、加水至50 ii L。反應(yīng)程序95。C 變性5min ;94。C lmin，56。C lmin，72。C 2min，共30個循環(huán);最后72"C延伸10min。反應(yīng)結(jié)束 后取10 ii L PCR產(chǎn)物加入1 y L 6 X Loading Buffer于0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，分析擴(kuò)增產(chǎn) 物。 1. 4PCR產(chǎn)物與pFastBacTM Dual載體的連接 參照上海生工UNIQ-10膠回收試劑盒說明書回收目的基因。將eGFP基因插入載
體pFastBacTM Dual (Life Technologies)的Polyhedrin啟動子下游的多克隆位點(diǎn)(MCS)
的BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)處。同樣方法將SP_His6_四個酶切位點(diǎn)-TM-CTD基因插入
到已經(jīng)插入了 eGFP基因的pFastBacTM Du al載體的另外一個p10啟動子下游多克隆位點(diǎn)
(MCS)的Smal和Kpnl酶切位點(diǎn)處，從而構(gòu)建成功pBacSC載體。具體的操作方法、參數(shù)都是
按照分子生物學(xué)常規(guī)方法進(jìn)行。 下面敘述本發(fā)明的具體實(shí)施方法 1. JEV陜西株E基因的克隆 1. 1引物的設(shè)計 根據(jù)發(fā)表的JEV SA14標(biāo)準(zhǔn)株(GenBank :U14163)的基因組序列，設(shè)計1對特異性 引物(P1/P2)。上游引物P1 5' -GCTTCTAGAATGGGGAATCGGGATTTCATAGA AG-3' ，5'端加 上X ba I酶切位點(diǎn)。下游引物P2 5' -GGG GAATTCGGCATGCACATTGGTCGCTAAAAAC-3' ， 5' 端加上EcoR I酶切位點(diǎn)。預(yù)期擴(kuò)增片斷為1500bp，含有完整E基因。
1. 2病毒基因組的提取 取出-S(TC保存的JEV陜西分離株細(xì)胞毒，按照Trizol提取試劑盒提取病毒RNA。 取RNA作模板3ii L，加入E下游引物P21 ii L、 dNTP 4ii L、 RNase-InhibitorO. 5 ii L、 AMV 0. 5iiL、5XAMV Buffer 4iiL，力口DEPC H20至20 ii L， 42°C lh，即得cDNA模板；
PCR反應(yīng)體系如下IOXPCR Buffer 5 ii L、 dNTPs 4 ii L、 Pl/P2各1 ii L、 TaqDNA 多聚酶1 y L、 cDNA 6 ii L、加水至50 ii L。反應(yīng)程序95。C變性5min ;94。C lmin， 56°C lmin， 72°C 2. 5min，共30個循環(huán)；最后72t:延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后取10 y L PCR產(chǎn)物加入lyL 6XLoading Buffer于0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，分析擴(kuò)增產(chǎn)物。
1. 3PCR產(chǎn)物的純化與回收 參照上海生工UNIQ-IO膠回收試劑盒說明書回收目的基因。
2.大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(氯化鈣法) 以無菌接種環(huán)刮取凍存于-7(TC冰箱的大腸桿菌菌種，劃線接種于不含氨芐青霉 素(Amp)的LB瓊脂平板，37t:培養(yǎng)16h左右。挑取單一菌落，接種到100mlLB培養(yǎng)基中， 37°C 、250r/min振搖培養(yǎng)到0D600 = 0. 4 0. 6，在無菌條件下將細(xì)菌培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到兩個無 菌并以冰預(yù)冷的聚丙烯離心管中(以下操作均需無菌)，冰浴10min，使培養(yǎng)物冷卻到0°C ; 4°C 、2000r/min離心10min，棄上清，以10ml用冰預(yù)冷的75,1/L CaCl2、 10mmol/L (p朋.5) 溶液重懸沉淀，冰浴10min，4°C，2000r/min離心10min，棄上清，以2ml用冰預(yù)冷的，含15% v/v、)甘油的75mmol/L CaCl2、 10mmol/L Tris *C1 (p朋.5)溶液重懸每管沉淀，用無菌吸頭 將感受態(tài)細(xì)胞分裝于無菌微量離心管中，每管200 1 ;標(biāo)明菌株、體積和日期，置-7(rc冰 箱凍存?zhèn)溆谩?3. E基因片段與pMD18-T載體的連接反應(yīng)取0. 5 ii g pMD18-T載體，力n 3 5倍摩爾量的E DNA片段，2 yl 5 X連接緩沖液 加水定容至10iil，最后加入1Weiss單位T4DNA連接酶，混勻并離心，16。C連接1 4h，取 7 y 1連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化上述E co. li感受態(tài)細(xì)胞。
4.轉(zhuǎn)<七 將適量連接產(chǎn)物DNA(體積質(zhì)粒< 1 y 1，連接產(chǎn)物< lOiil， DNA < 50ng)加入 200 iil上述感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min ;42。C水浴熱沖擊90s，冰浴冷卻2min ; 加入200ii1 37t:預(yù)熱的LB培養(yǎng)基，37t: 150r/min振搖培養(yǎng)50min ;取培養(yǎng)液涂布于含 Amp (50 ii g/ml)的LB瓊脂平板，37。C培養(yǎng)14h 16h后，得到轉(zhuǎn)化菌落。
5.質(zhì)粒的提取(堿裂解法) 挑取單個上述轉(zhuǎn)化菌落，接種到2ml含50 ii g/ml Amp的LB培養(yǎng)液(下同)中， 37°C 250r/min振搖培養(yǎng)12 16h ;將1. 5ml轉(zhuǎn)入微量離心管中，12000r/min離心30s，棄上 清。以200 ii 1冰預(yù)冷的溶液I (50rnmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris Cl， pH8. 0 ;10mmol/L EDTA，pH8. 0)重懸沉淀，加入200 y 1新配制的溶液II (0. 2mol/L NaOH， 1% SDS)，顛倒數(shù)次 混勻，加入200 ii 1用冰預(yù)冷的溶液III (3mo1 KAc， 5mol/L冰乙酸)，顛倒混勻，4°C 12000r/ min離心10min，取上清，分別用等量飽和酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1)，氯仿/異戊醇 (24 : 1)各抽提一次；加2倍體積冷無水乙醇，混合均勻，置-2(TC 30min，4°C 12000r/min 離心10min，棄上清，沉淀用70%冷乙醇洗滌抽干。以20 yl含終濃度20 y g/ml RNA酶(無 DNA酶)的TE(10mmol/L Tri s HC1， pH8. 0， lmmol/LEDTA， pH8. O，下同)溶解沉淀，并于37t:水浴中作用30min，瓊脂糖凝膠電泳檢查或-2(TC保存。
6.重組質(zhì)粒pMD18T-E的酶切鑒定 將1. 0 ii g質(zhì)粒DNA與適量水混勻，使其總體積為18 iil ，分別加入2 3單位EcoR I和Xba I限制性內(nèi)切酶及l(fā)iU相應(yīng)的10X限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，輕彈管壁混勻并離 心，置最適反應(yīng)溫度水浴2 3h，瓊脂糖凝膠電泳檢查。酶切結(jié)果均與預(yù)計完全相同者，即 為目的重組質(zhì)粒。完全酶切后，_201:保存，以備進(jìn)一步鑒定或回收片段之用。
7.攜帶JEV E基因重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體質(zhì)粒的構(gòu)建 用Xba和EcoRI雙酶切pMD18T-E質(zhì)粒，回收E基因，將其插入到同樣經(jīng)過Xba I
和EcoRI雙酶切的桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體pBacSC，進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建含有E基因的桿狀病毒轉(zhuǎn)
座載體pBacSC-E。具體試驗(yàn)操作過程與pMD18T-E重組質(zhì)粒構(gòu)建相同。 8.同源重組 8. 1制備"三抗"LB平板 將高壓蒸汽滅菌后的LB液體培養(yǎng)基(含1.5%瓊脂粉)置超凈臺內(nèi)，待其溫度 冷卻至5(TC左右時加入以下三種抗生素至終濃度為卡那霉素(Kan)50iig/mL、慶大霉素 (Gm) 7 ii g/ml和四環(huán)素(Tet) 10 y g/ml，并加入X-gal (終濃度為150 y g/mL和IPTG(終濃 度為40ii g/mL)混勻后立即鋪制平板。
8. 2轉(zhuǎn)化過程 取重組質(zhì)粒pBacSC-E 10ii L(4ii g)加入100mL制備好的感受態(tài)大腸桿菌DH10Bac 管內(nèi)，輕輕混勻，將離心管放入冰水混合物中冰浴30min，將離心管放入42t:熱休克2min， 再迅速移至冰水中放置5min。加入滅菌的LB液體培養(yǎng)基900mL， 37。C搖床200rpm/min振 蕩培養(yǎng)lh，加入卡那霉素(終濃度為50 ii g/mL)、慶大霉素(終濃度為7 ii g/ml)后繼續(xù)搖 床200rpm/min振蕩培養(yǎng)4h。 6000rpm/min離心10min，保留細(xì)菌沉淀及LB液體約300 y L， 用新鮮的LB液體培養(yǎng)基將其以10—、 10—2和10—3不同的稀釋度稀釋。然后各取100 ii L分別 均勻涂布于"三抗"LB平板，將平皿于37t:倒置培養(yǎng)24 48h，觀察藍(lán)白菌落的生長情況。
8. 3白斑鑒定 用滅菌的牙簽挑取5 10個分隔良好的白色菌落，再次接種于含"三抗"的平 板上，37t:倒置培養(yǎng)24h，觀察菌落表型的變化，進(jìn)一步證實(shí)為白色菌落。再用滅菌牙簽挑 取6個白色菌落和2個藍(lán)色菌落，分別放入裝有6ml LB培養(yǎng)基的試管中，再加入卡那霉素 (Kan)50ii g/mL、慶大霉素(Gm) 7 y g/ml和四環(huán)素(Tet) 10 y g/ml，三種抗生素，37。C搖床 200rpm/min振蕩培養(yǎng)過夜。
8. 4重組桿狀病毒DNA的提取與制備 將上述培養(yǎng)菌液分裝至1. 5mL的Eppendorf管中，12000rpm/min離心lmin。棄凈 上清，加入300ii L溶液I(50mmol/L Tris-HCL pH8. 0， 1Ommol/L EDTA，滅菌備用)，重懸沉 淀。加入300iiL溶液I1(0. 2mol/L NaOH，l% SDS)，溫和顛倒混勻，置冰水浴中5min，使細(xì) 菌裂解。緩慢逐滴加入300ii L溶液III(5mol/L乙酸鉀60ml，冰乙酸11. 5ml，水28. 5ml， pH5. 5)，加入過程中輕微搖動，置于冰上10min。 12000r/min離心10min，同時標(biāo)好另一干 凈的E卯endorf管，加入800 y L異丙醇。輕輕將上清轉(zhuǎn)移至已加好異丙醇的新管中，注意 不要吸入蛋白沉淀，將離心管顛倒數(shù)次混勻，置于室溫15min， 12000r/min離心10min，棄上 清。分別用75%和100X的乙醇各洗滌一次，14000r/min離心5min，棄上清，風(fēng)干(無菌條件下)lh，溶于40 ii L TE緩沖液。 9.重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞 在6孔板中每個孔中加入Sf9昆蟲細(xì)胞9X105 cells,培養(yǎng)基用2mL Sf900IISFM， 含有雙抗?jié)舛葹?.5X終濃度(50units/ml penicillin, 50 u g/ml str印tomycin)。細(xì)胞 來自培養(yǎng)3 4天的處于對數(shù)生長期的，活力大于97X細(xì)胞，并置于27t:培養(yǎng)箱中l(wèi)h;在 這lh中準(zhǔn)備下列實(shí)驗(yàn)。取2支1. 5ml E卯endorf管標(biāo)為A、 B，分別加入100 y L無抗生素 的Sf90011 SFM培養(yǎng)液，A管中加入5iiL的上述重組桿狀病毒DNA，混勻。B管中加入6iiL 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin，混勻(注意脂質(zhì)體是一個油脂的懸浮物，可能會沉淀，使用前 顛倒管子5 10次，將其混均勻)?；旌螦管和B管，輕輕混勻，置室溫45min，使其形成 Cellfectin-DNA混合物。取已經(jīng)貼壁生長良好的Sf9單層細(xì)胞，棄舊培養(yǎng)液，用無抗生素 的Sf90011 SFM培養(yǎng)液洗滌1遍。取上述Cellfectin-DNA混合物，加入O. 8ml不含抗生素 的Sf90011 SFM混合均勻。從細(xì)胞中吸棄清洗用的培養(yǎng)基，將混合均勻的脂質(zhì)體和重組DNA 混合物鋪到細(xì)胞上，覆蓋細(xì)胞，放置28t:培養(yǎng)6h后。吸棄混合物，加入含抗生素的Sf90011 SFM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)。收集細(xì)胞用于表達(dá)蛋白的分析，同時收集培 養(yǎng)上清作為原毒種，分小管貯存于-201:，用于重新感染Sf9細(xì)胞。
10重組桿狀病毒BacSC-E的PCR鑒定 取病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物2mL，反復(fù)凍融3次，12000r/min離心15min，取上清 437. 5ii L，加入12. 5ii L蛋白酶K(20mg/mL)和50 ii L SDS液(10% ) ，37。C水浴30min ;等 體積酚/氯仿抽提一次，取上清；等體積氯仿復(fù)提，取上清；加入l/10體積NaAc(2mol/L)和 2倍體積無水乙醇，-20。C放置2h ;4。C 15000r/min離心15min，取沉淀；70%乙醇洗滌一次， 沉淀用30iiL TE溶液溶解，即為提取的DNA，-70。C保存?zhèn)溆?。PCR時取5yL即可。PCR反 應(yīng)條件為95。C預(yù)變性5min后，按95。C變性lmin，54。C退火lmin，72。C延伸2min共30個循 環(huán)，最后72t:延伸10min。
11.重組桿狀病毒量的放大與濃縮 懸浮培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞待細(xì)胞濃度達(dá)lX106cell/ml，以MOI = 1 (Multiplicity ofinfection，MOI)的重組桿狀病毒量感染昆蟲細(xì)胞，利用病毒會在宿主昆蟲細(xì)胞中復(fù)制達(dá) 到病毒量放大的目的。感染3 4天后離心除去細(xì)胞及細(xì)胞碎片，收集上清液即完成病毒 量的放大。 12.重組病毒表達(dá)產(chǎn)物的檢測
12. 1熒光顯微鏡觀察鑒定重組病毒 重組pBacSC-E轉(zhuǎn)座載體上帶有eGFP基因，可以表達(dá)綠色熒光蛋白，可以通過熒光 顯微鏡觀察發(fā)出熒光的細(xì)胞數(shù)量來確認(rèn)轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48h后細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的CPE 變化，轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)熒光(見附圖2)，產(chǎn)生了具有感染活性的重組桿狀病毒BacSC-E。
12. 2SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 將擴(kuò)增后的純化重組病毒BacSC-E，以10M0I分別接種于10ml培養(yǎng)瓶1 X 106個/ ml Sf9細(xì)胞中，同時設(shè)桿狀病毒陰性對照組和細(xì)胞對照，至75X細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時，棄培 養(yǎng)液，用lml的TEN(40mmol/L Tris *C1 pH7. 5， lmmol/L EDTA， 150mmol/L NaCl)洗脫細(xì)胞， 收集于E卯endorf管中，3000r/min離心5min，棄上清，細(xì)胞沉淀用PBS洗3次，加60 yl裂 解緩沖液(10mmol/LTris Cl， pH7. 4， lmmol/L MgC12，0. 5% NP40， 20 ii g/ml DNase I)裂解，冰浴30min，煮沸3min， 5000r/min離心5min， -20。C凍存。 取30iil細(xì)胞裂解液與等量2X樣品緩沖液(100mmol/L Tris Cl，p朋.8，4% SDS， 0. 2 %溴酚藍(lán)，20 %甘油，使用前加入2. 5 % 13 -巰基乙醇)混勻，于10 %凝膠進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。 12. 3免疫印跡(Western blot) 經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白后，將其電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂乳或3%牛 血清白蛋白緩沖液(10mmol/L Tri s Cl， pH7. 5， 150,1/L NaCl， 0. 05% Tween20) 37°C 封閉2h，洗滌緩沖液(1Ommol/L Tris Cl pH7. 5， 150mmol/LNaCl，0. 05 % Tween20)洗 滌3次，每次5 10min，將豬抗JEV陽性血清用封閉緩沖液稀釋(1 : 300)覆蓋膜上，室 溫感作2h，洗滌3 5次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬IgG(1 : 4000)室溫感作2h，洗 滌3 5次后，每次5 10min，最后用蒸餾水清洗一次，夾出硝酸纖維素膜稍晾干，配制 ECL(enhancedchemiluminescence)工作液，在可見光下室溫孵育膜數(shù)分鐘，將印跡膜用保 鮮膜包被粘貼固定于X光片曝光暗盒。然后轉(zhuǎn)入暗室將X光膠片壓在膜上曝光數(shù)秒到數(shù)分 鐘，顯影定影后蛋白質(zhì)條帶可清晰顯示在X光膠片上。
12. 4激光共軛聚焦顯微鏡分析 在6孔培養(yǎng)板中放入無菌載玻片，Sf9細(xì)胞先接種于無菌之載玻片上，細(xì)胞接入量 為每孔加入1X106。細(xì)胞吸附lh后，吸棄培養(yǎng)基，加入重組桿狀病毒BacSC-E在MOI = 10 下感染。2天后吸棄培養(yǎng)基，再添加lml甲醇丙酮(1 : 1)混合液于-2(TC冰箱下固定5 分鐘，之后再加入lml PBS(phosphate-bufferedsaline)搖床轉(zhuǎn)速50r/min清洗2次，每次 5min。接著以lml的2% BSA(bovinese進(jìn)26 albumin)在37。C下反應(yīng)30min。之后再加 入lmlPBS(phosphate-buffered saline)搖床轉(zhuǎn)速50r/min清洗2次，每次5min。接下來 分別加入豬抗JEV陽性血清(1 : 100)在37t:下反應(yīng)lh。以lml的PBS清洗3次后，再加 入FITC標(biāo)記的羊抗豬IgG(l : 100)37t:下反應(yīng)lh。最后再以lml的PBS清洗3次。在激 光共軛焦顯微鏡(confocal microscope, TCS SP2， Leica， Germany)下觀察，帶有E重組蛋 白質(zhì)細(xì)胞膜會被FITC染色而呈現(xiàn)綠色熒光。
12. 5免疫電子顯微鏡檢測 取15iU純化的昆蟲桿狀病毒液滴于蠟板上，將封有炭膜的銅網(wǎng)有炭膜的一面向 下懸浮在昆蟲桿狀病毒液面上，吸附30min。滴入含有1% BSA的PBS液1滴于蠟板上，將 銅網(wǎng)有炭膜的一面輕浮于液滴上室溫封阻20min，然后用PBS液洗滌3次，每次5min。洗 滌的方法和封阻的方法相同，用濾紙在網(wǎng)緣將水吸干。將銅網(wǎng)分別浮于豬抗JEV陽性血清 (1 : 50)液滴上(大約15iU)，室溫30 60min.同時設(shè)立陰性對照組，不加第一抗體，用 PBS代替。PBS漂洗洗3次，每次5min，濾紙吸干。將銅網(wǎng)懸浮于膠體金標(biāo)記的羊抗豬IgG 第二抗體液滴上(1 : 50倍稀釋)，室溫孵育30 60min。 PBS漂洗洗3次，每次5min，濾 紙吸干。將銅網(wǎng)懸浮在2%的磷鴇酸液滴上負(fù)染2min，在室溫干燥，電鏡觀察。
13.重組病毒BacSC-E表達(dá)產(chǎn)物的檢測結(jié)果 篩選獲得的重組桿狀病毒BacSC-E接種Sf9昆蟲細(xì)胞后，在感染細(xì)胞的細(xì)胞膜處， 可觀察到特異的一圈黃綠色熒光，說明表達(dá)產(chǎn)物是特異的而且表達(dá)產(chǎn)物展示在Sf-9昆蟲 細(xì)胞的細(xì)胞膜上(見附圖3)。經(jīng)Western blot分析，重組毒接種的細(xì)胞培養(yǎng)物出現(xiàn)了與豬 抗JEV陽性血清結(jié)合的大小為53kD的特異帶(見附圖4)，證明了 E蛋白在Sf9昆蟲細(xì)胞中得到了表達(dá)。重組毒pBacSC-E免疫電子顯微鏡檢測到與豬抗JEV陽性血清結(jié)合的金粒子，并且金粒子位置在重組病毒膨大的囊膜蛋白處，表明E蛋白被展示在桿狀病毒的囊膜上(見附圖5)。 14.重組病毒的免疫原性研究
14. 1重組病毒免疫小鼠 重組病毒接種Sf9昆蟲細(xì)胞，培養(yǎng)48 72h，收取感染細(xì)胞。_40°C /37。C反復(fù)凍融3次，3000r/min離心10min，取上清測定病毒PFU，調(diào)整病毒的滴度使其達(dá)到109PFU/ml。
BALB/c雌性小鼠12只，體重18 20g，隨機(jī)分2組，采取腹腔注射方式，分別注射重組桿狀病毒BacSC-E和不含E基因的桿狀病毒BacSC 0. 5ml。上述2組均免疫二次，間隔14天，最后一次免疫后的第14天摘眼球取血，頸椎脫臼處死，凝血分離血清供ELISA檢測抗JEV抗原的IgG抗體以及進(jìn)行中和試驗(yàn)檢測免疫小鼠的血清中和抗體滴度。無菌取其脾臟分別進(jìn)行T淋巴細(xì)胞增值試驗(yàn)和用流式細(xì)胞儀分析檢測T淋巴細(xì)胞亞類的數(shù)量。
14. 2脾臟免疫學(xué)指標(biāo)的檢測
14. 2. 1脾臟單淋巴細(xì)胞懸液制備 頸椎脫臼處死小鼠，無菌條件下取出脾臟，置于盛有RPMI 1640培養(yǎng)基的平皿中，用玻片研磨，200目尼龍網(wǎng)過濾制成單細(xì)胞懸液，1500r/min，離心5min，棄上清。用Hanks液離心洗細(xì)胞兩次，重懸于含10% NBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，計數(shù)，調(diào)至2 X 107個/ml備用。 14. 2. 2脾T淋巴細(xì)胞亞類數(shù)量的檢測 取脾細(xì)胞懸液0. lml，加5ml PBS， 1500r/min，離心10min，洗細(xì)胞兩次，在0. 5mlPBS細(xì)胞懸浮液中分別加熒光標(biāo)記大鼠抗小鼠CD4+和CD8+單克隆抗體(此抗體用PBS按1 : 10稀釋)室溫避光放置30min，再加5ml PBS洗一次，1500r/min離心10min，將管底細(xì)胞用200 iil PBS懸浮，待上流式細(xì)胞儀檢測。FACS檢測10000個細(xì)胞，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。 14. 2. 3T淋巴細(xì)胞增值試驗(yàn) (1)脾細(xì)胞的制備將小鼠捕殺、采血、取脾、研磨、過濾，最后一次用Hank' s液洗滌，棄上清，再用含有10%犢牛血清的1640培養(yǎng)液lml重懸脾細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2 X 106個/ml。 (2)在96孔板中每孔加入淋巴細(xì)胞懸液100 ii 1，對應(yīng)孔中分別加入特異性剌激原ConA(lO ii g/ml) 100 y 1作為陽性對照組、20 y g/ml重組桿狀病毒特異性剌激原100 yl為試驗(yàn)組以及1640培養(yǎng)基100 ii 1為非剌激抗原孔，不同剌激原重復(fù)3個孔；以只加200 ii 11640培養(yǎng)基無淋巴細(xì)胞的孔作為本底。 (3)68h后，每孔加入MTT(5mg/ml)20iil，避光培養(yǎng)4h ;每孔吸棄100 yl培養(yǎng)液，再加入匿SO 100iil，10min內(nèi)用酶聯(lián)免疫檢測儀630nm測定個孔0D值。
(4)結(jié)果計算SI =(特異剌激原的平均OD值-本底值)/(非剌激原的平均OD值_本底值) 14. 3ELISA測定免疫小鼠血清中抗JEV抗體 ELISA試劑盒中的包被抗原為滅活的全病毒，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體。在酶聯(lián)免疫儀450nm測量各孔OD值。
14. 4重組病毒在本體動物豬的免疫學(xué)研究
同小鼠的免疫學(xué)和檢測方法。
檢測結(jié)果 獲得的重組桿狀病毒BacSC-E提取基因組后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得預(yù)期大小的目的片段。激光共聚焦顯微鏡觀察試驗(yàn)、免疫金電子顯微鏡觀察和Westernblot檢測均為陽性結(jié)果，說明構(gòu)建的重組桿狀病毒BacSC-E可分別表達(dá)JEV糖蛋白E囊膜蛋白。重組桿狀病毒BacSC-E可在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，且重組病毒具有良好的遺傳穩(wěn)定性。將重組桿狀病毒BacSC-E大量擴(kuò)增后進(jìn)行小鼠免疫實(shí)驗(yàn)，可在免疫小鼠血清中檢測到抗JEV的抗體，表明重組病毒BacSC-E剌激小鼠機(jī)體產(chǎn)生了特異性體液免疫。免疫小鼠脾T細(xì)胞亞類數(shù)量的檢測及淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果均顯示小鼠產(chǎn)生了特異性細(xì)胞免疫。 研究結(jié)果表明，本發(fā)明所構(gòu)建的重組桿狀病毒是一種安全、有效的基因工程亞單位疫苗，具有開發(fā)成為用于預(yù)防JE的疫苗的良好前景。 以上所述實(shí)施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實(shí)施例，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
一種表達(dá)JEV免疫原基因的重組桿狀病毒，其特征在于，所述重組桿狀病毒帶有SEQ ID NO.1所示的序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的重組桿狀病毒，其特征在于，所述重組桿狀病毒表面展示JEV 結(jié)構(gòu)蛋白E。
3. —種權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟包括a、 制備E基因；b、 將上述的E基因，插入到桿狀病毒表面展示轉(zhuǎn)座載體pBacSC的p10啟動子下游，構(gòu) 建含JEV的E基因的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBacSC-E ;c、 將上述重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBacSC-E轉(zhuǎn)入大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行同源重組，得重組桿 狀病毒DNA ; d、 將步驟c得到的重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，得到重組桿狀病毒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組桿狀病毒的制備方法，其特征在于，所述E基因的制備方 法為用PCR方法擴(kuò)增了 JEV陜西株E基因，并將其克隆到pMD18-T載體，構(gòu)建了 pMD18T-E 質(zhì)粒，酶切pMD18T-E質(zhì)粒，回收E基因。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組桿狀病毒的制備方法，其特征在于，步驟d所述重組桿狀 病毒DNA轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞的方法為將重組桿狀病毒DNA通過脂質(zhì)體介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)入昆蟲細(xì)胞 中。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組桿狀病毒的制備方法，其特征在于，步驟c所述大腸桿菌 為感受態(tài)大腸桿菌DH10Bac。
7. 如權(quán)利要求1或2所述的重組桿狀病毒在制備預(yù)防豬乙型腦炎的疫苗中的應(yīng)用。
8. —種制備預(yù)防豬乙型腦炎的亞單位疫苗的方法，其特征在于，重組病毒接種昆蟲細(xì) 胞，培養(yǎng)48 72h，收取感染細(xì)胞，-40°C /37t:凍融，離心，取上清測定病毒PFU，調(diào)整病毒 的滴度使其達(dá)到109PFU/ml。
9. 根據(jù)權(quán)利要 8所述的方法，其特征在于，所述昆蟲細(xì)胞為Sf9昆蟲細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表達(dá)JEV免疫原基因的重組桿狀病毒及其制備方法和應(yīng)用。具體地說涉及一種重組桿狀病毒，所述重組桿狀病毒帶有SEQ ID NO.1所示的序列，其表面展示JEV結(jié)構(gòu)蛋白E。利用所述重組病毒接種Sf9昆蟲細(xì)胞，培養(yǎng)48～72h，收取感染細(xì)胞，-40℃/37℃凍融，離心，取上清測定病毒PFU，調(diào)整病毒的滴度使其達(dá)到109PFU/ml，制得一種安全、有效的基因工程亞單位疫苗，用于預(yù)防豬日本乙型腦炎。
文檔編號A61P25/00GK101792741SQ20101014079
公開日2010年8月4日 申請日期2010年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月7日
發(fā)明者張琪, 童德文, 許信剛 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)