專利名稱：含有葛根提取物或發(fā)酵葛根提取物/乳酸菌復合物作為有效成分的用于預防或治療肝中 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及乳酸菌發(fā)酵葛根湯(Galgeuntang)，以及一種含有葛根湯或乳酸菌發(fā)酵葛根湯的用于預防或治療肝中毒(liver toxicity)的組合物。
背景技術：
葛根湯是一種中藥處方,該處方通過葛根(puerariae radix)、麻黃、姜、率、甘草、芍藥、桂枝等熬制而成，可用于治療頸腰僵直、畏寒、冷而無汗畏風寒的感冒癥狀；發(fā)寒顫(shivering with chills)、發(fā)燒、充血、冷而無汗身背僵直的感冒；以及眼耳鼻部發(fā)炎或者皮疹、哮喘等疾病。 現(xiàn)有技術中有如下的一些通過在草藥中加入微生物進行發(fā)酵而制備對人體有益的藥材的方法。例如，有一種在緩解腸功能紊亂方面能夠產生協(xié)同效應的方法，該方法包括以下步驟在草藥提取物中聯(lián)合培養(yǎng)(co-culturing)具有良好的生長率和香味的乳酸菌，然后對所述混合物進行發(fā)酵(韓國專利號185619)。還有一種在保持每味藥材具備原有療效(characteristics)的同時加倍其效果的方法,該方法包括以下步驟用選定的谷物和草藥發(fā)酵的黃豆，通過低溫發(fā)酵工藝來發(fā)酵全部原材料(韓國專利公開號2004-0078030)。但是，還沒有報道涉及葛根湯的發(fā)酵。因此，發(fā)明人通過如下實驗，首先通過注射四氯化碳誘導大鼠肝中毒，然后證實施用乳酸菌發(fā)酵的葛根湯或葛根湯本身后肝中毒能夠被治愈，從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供乳酸菌發(fā)酵葛根湯，以及一種含有葛根湯或乳酸菌發(fā)酵葛根湯作為活性成分的用于預防或治療肝中毒的組合物。本發(fā)明提供通過下列步驟制備的乳酸菌發(fā)酵葛根湯首先混合含有葛根、麻黃、姜、率、甘草、茍藥、桂枝(Cinnamomi ramulus)的草藥,再用熱水提取,得到葛根湯,然后接種乳酸菌至上述葛根湯提取物后進行發(fā)酵。所述葛根湯通過將2-10重量份的麻黃、2-10重量份的姜、2-10重量份的棗、1_7重量份的甘草、1-7重量份的芍藥以及1-7重量份的桂枝與12重量份的葛根混合制備而成。所述乳酸菌優(yōu)選選自由雙歧桿菌(Bifidobacterium)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、鏈球菌(Streptococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、小球菌(Pediococcus)、乳球菌(Lactococcus)菌屬微生物組成的組中，進一步優(yōu)選為雙歧桿菌菌屬微生物。本發(fā)明還提供一種制備所述乳酸菌發(fā)酵葛根湯的方法，該方法包括下列步驟通過熱水提取含有葛根、麻黃、姜、棗、甘草、芍藥和桂枝的草藥混合物制備葛根湯；將乳酸菌菌絲體培養(yǎng)液接種到所制備的上述葛根湯中；以及
通過對上述得到的葛根湯培養(yǎng)液進行無氧培養(yǎng)以誘導深層發(fā)酵。上述制備方法優(yōu)選包括附加步驟在制備出葛根湯后，接種乳酸菌菌絲體培養(yǎng)液前，調節(jié)所述葛根湯的PH至6-8。
本發(fā)明還提供一種用于預防或治療肝中毒的組合物，該組合物含有葛根湯和/或乳酸菌發(fā)酵葛根湯作為活性成分。如上所述，葛根湯通過用熱水提取含有葛根、麻黃、姜、棗、甘草、芍藥以及桂枝的草藥混合物制備而成，并且所述乳酸菌發(fā)酵葛根湯也是通過如上文描述的方法制備而成的乳酸菌發(fā)酵組合物。所述組合物能夠降低選自AST (谷草轉氨酶)、ALT (谷丙轉氨酶)和LDH (乳酸脫氫酶)組成的組中的一種或多種酶的活性。本發(fā)明進一步提供一種用于恢復肝功能的保健食品，該食品含有上述葛根湯和乳酸菌發(fā)酵葛根湯中的至少一種作為活性成分。根據本發(fā)明優(yōu)選實施方式，通過注射四氯化碳誘導大鼠肝中毒，然后分別對大鼠施用本發(fā)明提供的普通葛根湯和乳酸菌發(fā)酵葛根湯。觀察小鼠的狀態(tài)。結果，觀察到在施用所述葛根湯或所述葛根湯發(fā)酵乳酸菌后沒有觀察到中毒癥狀。本發(fā)明的發(fā)明人在通過上述操作方法用四氯化碳進行處理后，分別測量了 AST、ALT和LDH的活性。結果，本發(fā)明的發(fā)明人證實了由于注射四氯化碳而活性上升的所述三種酶，在施用所述乳酸菌發(fā)酵葛根湯后，三種酶活性都下降了。上述結果表明本發(fā)明提供的乳酸菌發(fā)酵葛根湯對肝中毒有療效。本發(fā)明提供的組合物含有乳酸菌發(fā)酵葛根湯作為活性成分。所述乳酸菌發(fā)酵葛根湯能夠通過口服施用，也可以用于一般形式的藥物制劑?？捎糜诳诜墓腆w制劑有片劑、硬/軟膠囊、溶液、懸浮液等等。所述藥物制劑可以使用常用的藥劑學載體，如輔料、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、助溶劑、懸浮劑、保護劑或者增充劑。所述乳酸菌發(fā)酵葛根湯的有效劑量可以通過病人的狀態(tài)、年齡、性別、病癥情況等條件確定。一般來說，成人的劑量為l_40mL每Ikg/天,優(yōu)選,10_30mL每Ikg/天。優(yōu)選情況下，優(yōu)選每個單獨制劑含有所述乳酸菌發(fā)酵葛根湯I天、1/2天、1/3天或1/4天的劑量。施用頻率優(yōu)選一天1-6次。如果需要長期施用，所述劑量可以低于上述劑量，但是更高的劑量也可以接受，因為所述乳酸菌發(fā)酵葛根湯被證明是非常安全的。另外，本發(fā)明提供一種用于恢復肝功能的保健食品，該食品含有所述組合物。本發(fā)明提供的乳酸菌發(fā)酵葛根湯可用作食品添加劑。這種情況下，所述乳酸菌發(fā)酵葛根湯可以按照常規(guī)方法單獨添加，也可以與其他食物組分混合添加?；钚猿煞值幕旌媳壤梢愿鶕褂媚康?預防、保健或治療)來調整。一般來說，用于生產保健食品或保健飲品，乳酸菌發(fā)酵葛根湯優(yōu)選添加比例為5-30wt%，進一步優(yōu)選為10-20wt%。但是，假如為了衛(wèi)生保健或者調節(jié)健康狀況而需要長期施用，所述添加比例可以低于上述比例，但是更高的比例也可以接受，也是因為所述乳酸菌發(fā)酵葛根湯被證明是非常安全的。同時，此處所述的食品種類沒有特別限制。本發(fā)明提供的組合物對肝中毒有療效，所以它可被有效的用作一種肝功能恢復劑或肝功能恢復保健食品。


圖I (A)是葛根湯的色譜圖，以及圖I⑶是乳酸菌發(fā)酵葛根湯的色譜圖。圖2是顯示實施例1-7中血液生化檢測結果的一組圖。圖3是顯示實施例1-8中肝臟重量檢測結果的一組圖。圖4-9是顯示實施例2中肝臟病理組織檢測結果的照片。附圖標記說明CV:中央靜脈N :小葉中心壞死 —(左箭頭)空泡變性▲(實心三角):炎癥細胞侵潤
具體實施例方式本發(fā)明優(yōu)選的實施方式通過下列實施例來說明。但是，本領域技術人員應當理解，在不偏離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，各種修改和補充都是可能的。預備例I :葛根湯的制備通過熱水提取120g葛根、60g麻黃、60g姜、60g棗、40g甘草、40g芍藥，以及40g桂
枝來制備葛根湯。實施例I :乳酸菌發(fā)酵葛根湯的制備<1-1> 乳酸菌 下列實驗所用短雙歧桿菌(KFRI 744，ATCC 15700)均來自韓國食品研究所(Korea Food Research Institute)?！?-2>乳酸菌的菌種培養(yǎng)菌株分別在斜面培養(yǎng)基(slant medium)和液體培養(yǎng)基中進行次代培養(yǎng)。首先，把所述乳酸菌接種到斜面培養(yǎng)基，在37°C恒溫箱中培養(yǎng)24小時。當菌落出現(xiàn)時，用石蠟層密封以切斷供氧，并保存在冰箱中。為了避免所述培養(yǎng)的細菌失活或者被其他微生物污染，所述培養(yǎng)基需要每2-3周更換為新鮮的斜面瓊脂培養(yǎng)基。把所述菌落接種到液體培養(yǎng)基，然后在37°C恒溫箱中培養(yǎng)24小時。所述菌種培養(yǎng)使用RCM (強化梭菌培養(yǎng)基,Reinforced Clostridial Medium 10g/L細菌用胰蛋白(Bacto-tryptose)、10g/L細菌用牛肉膏、3g/L細菌用酵母提取物、5g/L細菌用葡萄糖、5g/L氯化鈉、lg/L可溶淀粉、0. 5g/L左旋半胱氨酸鹽酸鹽、3g/L醋酸鈉、0. 5g/L細菌用瓊脂、pH 7. 6)或者肉湯培養(yǎng)基(Gam broth medium)。<1-3>使用乳酸菌的葛根湯深層發(fā)酵用IM的NaOH將實施例I中制備的葛根湯的pH調節(jié)到7. 0，然后在121°C、1. 5atm下，高壓滅菌15分鐘。冷卻到室溫后，將乳酸菌接種到所述葛根湯中。將所述葛根湯在37°C恒溫箱中無氧培養(yǎng)48小時，以使其深層發(fā)酵。此時，接種物所占體積為1% (V/V)。在發(fā)酵48小時后，檢測pH的變化。當用雙歧桿菌發(fā)酵蔬菜和谷物后，常常能觀察到細菌的增殖被抑制，由于pH低，此種現(xiàn)象在番茄發(fā)酵后特別明顯。但是，當PH調節(jié)到7. 2時，所述細菌的數量增加了。在這個實施例中，當葛根湯的PH低至4. 9時，它的現(xiàn)象就不規(guī)律了。所以，為了正常發(fā)酵，本發(fā)明的發(fā)明人用IM的NaOH溶液將pH進行調高。在滅菌前將葛根湯的pH調節(jié)為7. O時，發(fā)酵之前的對照組的PH降低到了 5. 9-7. O之間。這大概歸因于葛根湯是經過高溫高壓(121°C，
I.5atm, 15分鐘)滅菌的，所以一些葛根湯里的膳食纖維分解為有機酸同時伴隨pH的降低。把KFRI 744(短雙歧桿菌)接種到所述調節(jié)過pH的葛根湯中，再培養(yǎng)48小時。然后，觀察PH的變化。結果表明，通過發(fā)酵葛根湯的pH降至4. 3，這也說明了活性有機酸的產生。<1-4>分析發(fā)酵產物I)為HPLC制備樣品
離心分離出所述發(fā)酵葛根湯的殘渣，再用O. 45 μ m的過濾器過濾。然后，用HPLC進行檢測。2)用HPLC分析代謝產物用HPLC檢測葛根湯在乳酸菌作用下發(fā)酵前后的代謝產物的變化情況，并對比分析發(fā)酵前后的成份情況。根據下列條件使用HPLC來檢測并分析發(fā)酵葛根湯的代謝產物。分析葛根湯發(fā)酵產物的HPCL系統(tǒng)的操作條件為柱反相柱(C18,250X4. 6mm, 5 μ m)檢測器UV254nm溶劑A水；B乙腈運行時間70分鐘進樣量20μ L流速1·OmT ,/mi η柱溫30°C表I列出了濃度梯度。表I
時間(分鐘)A/B O85/15
~1085/15
5065/35
5520/80
5820/80
6380/20
7085/15
結果如圖I所示，通過對比乳酸菌發(fā)酵葛根湯(圖1(B))與未發(fā)酵葛根湯(圖I (A))的結果，可以確定經過發(fā)酵38. 2分鐘出現(xiàn)的峰值增長了 6. 4倍。黃豆苷(24. 3分鐘)葛根湯的代表性的指標材料(index materials)在每個樣品中都能檢測到。實驗實施例I :對肝中毒的療效<1-1>實驗動物八周大的雄性大鼠從東方有限公司(Orient Co. Ltd. ) (459-24，首爾衿川區(qū)爾加山洞)購得，然后送入KIOM(韓國中藥研究所)動物實驗室進行檢疫并馴化二周。然后選擇其中健康的小鼠進行實驗?！?-2>劑量的確定為研究由傳統(tǒng)中藥配方制備的葛根湯和本發(fā)明提供的乳酸菌發(fā)酵葛根湯對肝臟的保護作用，大鼠用四氯化碳(CCl4)處理24小時，然后檢測肝臟損傷狀況?；谌詹墒沉?daily intake) (3次,3包)，葛根湯的施用劑量確定為15mL/kg,同時發(fā)酵葛根湯的劑量確定為 7. 5mL/kg、15mL/kg 和 30mL/kg?！?-3>動物分組及識別動物分組如下進行。首先，對馴化期間選出的健康大鼠進行稱重。以5g為間隔進行區(qū)分，選擇接近各個平均體重的大鼠各60只。然后，將上述60只大鼠根據重量范圍和隨機數每組分配均等體重的10只(見表2)。通過對皮毛染色和使用個體識別卡對每只小鼠進行區(qū)分。表權利要求
1.一種乳酸菌發(fā)酵葛根湯，該乳酸菌發(fā)酵葛根湯是通過下述步驟制備的 混合含有葛根、麻黃、姜、棗、甘草、芍藥以及桂枝的草藥，然后進行熱水提取；接種乳酸菌至葛根湯提取物；以及發(fā)酵制得的所述葛根湯。
2.根據權利要求I所述的乳酸菌發(fā)酵葛根湯，其中，所述葛根湯通過將2-10重量份的麻黃、2-10重量份的姜、2-10重量份的棗、1-7重量份的甘草、1-7重量份的芍藥以及1_7重量份的桂枝與12重量份的葛根混合而制備。
3.根據權利要求I所述的乳酸菌發(fā)酵葛根湯，其中，所述乳酸菌選自由雙歧桿菌、乳酸桿菌、鏈球菌、明串珠菌、小球菌和乳球菌菌屬微生物組成的組中。
4.根據權利要求I所述的乳酸菌發(fā)酵葛根湯，其中，所述乳酸菌為雙歧桿菌菌屬微生物。
5.一種制備權利要求I所述的乳酸菌發(fā)酵葛根湯的方法，該方法包括下列步驟 通過熱水提取含有葛根、麻黃、姜、棗、甘草、芍藥、桂枝的草藥混合物制備葛根湯； 將乳酸菌菌絲體培養(yǎng)液接種到上述葛根湯中；以及 通過對上述得到的葛根湯培養(yǎng)液進行無氧培養(yǎng)以誘導深層發(fā)酵。
6.根據權利要求5所述的制備乳酸菌發(fā)酵葛根湯的方法，其中，該方法進一步包括以下步驟在制備出葛根湯后，且接種乳酸菌菌絲體培養(yǎng)液前，調節(jié)所述葛根湯的pH至6-8。
7.一種用于預防或治療肝中毒的組合物，其特征在于，該組合物含有葛根湯和/或乳酸菌發(fā)酵葛根湯作為活性成分。
8.根據權利要求7所述的組合物，其中，所述葛根湯通過用熱水提取含有葛根、麻黃、姜、棗、甘草、芍藥以及桂枝的草藥混合物制備而成。
9.根據權利要求7所述的組合物，其中，所述乳酸菌發(fā)酵葛根湯是權利要求I所述的乳酸菌發(fā)酵葛根湯。
10.根據權利要求7所述的組合物，其中，所述組合物能夠降低選自由谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶和乳酸脫氫酶組成的組中的一種或多種酶的活性。
11.一種恢復肝功能的保健食品，其特征在于，該食品含有上述葛根湯和乳酸菌發(fā)酵葛根湯中的至少一種作為活性成分。
12.根據權利要求11所述的組合物，其中，所述葛根湯通過用熱水提取含有葛根、麻黃、姜、棗、甘草、芍藥以及桂枝的草藥混合物制備而成。
13.根據權利要求12所述的組合物，其中，所述乳酸菌發(fā)酵葛根湯是權利要求I所述的乳酸菌發(fā)酵葛根湯。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵葛根提取物/乳酸復合物，以及一種含有所述發(fā)酵復合物或葛根提取物作為活性成分的組合物，尤其是涉及通過接種乳酸菌至葛根湯再培養(yǎng)然后發(fā)酵制備的發(fā)酵葛根提取物/乳酸菌復合物，以及一種含有所述發(fā)酵復合物或葛根提取物的用于預防或治療肝中毒的組合物。本發(fā)明的組合物對肝中毒有療效，所以它可被有效地用作一種肝功能恢復劑或肝功能恢復保健食品。
文檔編號A61K36/725GK102639138SQ200980161522
公開日2012年8月15日 申請日期2009年9月25日 優(yōu)先權日2009年9月18日
發(fā)明者嚴永蘭, 李智慧, 李載勛, 馬珍烈 申請人:韓國東方醫(yī)藥研究所