專利名稱：用銅氧還蛋白預(yù)防癌癥的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含銅氧還蛋白、和銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物的組合物，所述銅氧還蛋白和銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、組織和動(dòng)物中抑制癌前病變的發(fā)展。本發(fā)明還涉及銅氧還蛋白、和銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物作為化學(xué)預(yù)防劑在哺乳動(dòng)物中抑制癌前病變的發(fā)展并最終抑制癌癥的應(yīng)用。背景癌癥化學(xué)預(yù)防是使用天然的、合成的或生物的化學(xué)劑來(lái)逆轉(zhuǎn)、抑制或預(yù)防浸潤(rùn)性癌癥的致癌進(jìn)展。最近在高風(fēng)險(xiǎn)群體中進(jìn)行的預(yù)防癌癥的臨床試驗(yàn)表明，化學(xué)預(yù)防性治療對(duì)于高風(fēng)險(xiǎn)患者來(lái)說(shuō)是一種實(shí)際可行的治療。化學(xué)預(yù)防性治療基于多病灶區(qū)域致癌作用和多級(jí)致癌的概念。在區(qū)域性致癌中，組織區(qū)域的全身性致癌物暴露導(dǎo)致組織中的彌漫性上皮損傷和突變細(xì)胞的克隆性增殖。區(qū)域內(nèi)的這些遺傳突變?cè)黾恿嗽搮^(qū)域中一種或多種癌前病變或惡性病變發(fā)生的可能。多級(jí)致癌在這些基因和表型改變的逐步累積中。阻遏多級(jí)致癌中的一個(gè)或多個(gè)步驟可阻止或預(yù)防癌癥的發(fā)展。一般參見Tsao等人，CA Cancer J Clin 54 150-180(2004)?？捎眯∈笕橄倨鞴倥囵B(yǎng)(MMOC)分析來(lái)評(píng)估潛在的化學(xué)預(yù)防劑對(duì)激素誘導(dǎo)的乳腺結(jié)構(gòu)分化和DMBA誘導(dǎo)的腺內(nèi)腫瘤發(fā)生前增生腺泡節(jié)樣病變的抑制作用。來(lái)自年輕的未交配的動(dòng)物的乳腺在胰島素(I) +催乳素(P) +醛固酮㈧存在下孵育6天后可分化成完全成熟的腺體。這些腺體在形態(tài)學(xué)上類似于來(lái)自妊娠小鼠的腺體。醛固酮可以用雌激素(E) + 孕酮(Pg)來(lái)代替。向培養(yǎng)基中加入氫化可的松(H)刺激了乳腺的功能性分化:Mehta和 Banerjee,Acta Endocrinol. 80 501 (1975) ；Mehta禾口Moon，Breast Cancer :Treatment and Prognosis 300，300 (Basil A Stoll 編輯·，Blackwell Press 1986)。這樣，在該培養(yǎng)系統(tǒng)中觀察到的激素誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)性和功能性分化模擬了動(dòng)物的不同生理階段過(guò)程中對(duì)激素的反應(yīng)。在MMOC中，小鼠在癌癥形成前表現(xiàn)出獨(dú)特的腫瘤前階段。C3H小鼠中的這種腫瘤前病變由小鼠乳腺腫瘤病毒誘導(dǎo)，或在BALB/c小鼠中由DMBA來(lái)誘導(dǎo)。在生長(zhǎng)期的第3天和第4天之間將腺體暴露在2 μ g/mlDMBA下，隨后使所述腺體在僅含胰島素的培養(yǎng)基中復(fù)原2-3周，導(dǎo)致了乳房腺泡病變(MAL)的形成。Hawthorne等人，Pharmaceutical Biology 40:70-74(2002) ；Mehta 等人，Methods in Cell Science 19:19-24(1997)。并且，將從含有DMBA誘導(dǎo)的乳腺病變的腺體中制備的上皮細(xì)胞移植到同源宿主中導(dǎo)致了乳腺癌的形成。Telang等人，PNAS 76:5886-5890(1979)。這些腫瘤在病理學(xué)上類似于當(dāng)同系小鼠被施用DMBA時(shí)體內(nèi)觀察到的那些。同前。MMOC中DMBA誘導(dǎo)的乳房病變形成可通過(guò)多種化學(xué)預(yù)防劑諸如類視黃醇來(lái)抑制。這些劑包含來(lái)源于諸如蕓薹寧(brassinin)、白藜蘆醇(resveretrol)、硫醇類、抗氧化劑、鳥氨酸脫羧酶抑制劑諸如0FM0和魚藤素、前列腺素合成抑制劑、Ca調(diào)節(jié)劑等的天然產(chǎn)物的化學(xué)預(yù)防劑。Jang 等人，Science 275:218-220(1997) ；Mehta，Eur. J. Cancer 36: 1275-1282(2000) ；Metha 等人，J. Natl. Cancer Inst. 89 :212_219 (1997)。這些研究清楚地表明該器官培養(yǎng)系統(tǒng)提供了測(cè)定針對(duì)乳房致癌作用化合物的有效性的獨(dú)特模型。其結(jié)果與體內(nèi)施用所述化合物獲得的抑制密切相關(guān)。MMOC也可經(jīng)誘導(dǎo)形成乳房導(dǎo)管病變(MDL)。如果用雌激素和孕酮代替醛固酮，并在培養(yǎng)基中加入氫化可的松，即可誘導(dǎo)MDL。卵巢留類存在下腺泡結(jié)構(gòu)非常小，但在組織病理學(xué)切片中可觀察到導(dǎo)管內(nèi)病變。Mehta等人，J. Natl. Cancer Inst. 93 :1103_1106 (2001)。 選擇性作用于卵巢激素依賴的ER+乳腺癌的抗雌激素諸如他莫昔芬，抑制了 MDL形成而非 MAL形成。這樣，該經(jīng)過(guò)改良的培養(yǎng)物模型除了常規(guī)MAL誘導(dǎo)方案外現(xiàn)可用于評(píng)價(jià)化學(xué)治療劑對(duì)MAL和MOL的作用。蛋白質(zhì)進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞通常由蛋白質(zhì)的小片段所指揮，其常被稱作“蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”或PTD?？蓪⒃撈斡米髋c外部蛋白連接的信號(hào)以協(xié)助該蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。例如，在人類成纖維細(xì)胞HS68中或小鼠淋巴細(xì)胞白血病L1210細(xì)胞中，兩親性肽被用來(lái)協(xié)助DNA裂解金屬卟啉的攝取而作為潛在的抗腫瘤藥物(Chal0in，L.等人Bioconjugate Chem. 12 :691_700，(2001))。稱作細(xì)胞滲透肽(CPP)或細(xì)胞遞送載體(⑶V)的肽，諸如穿膜肽、轉(zhuǎn)運(yùn)肽、 Tat (氨基酸第47-57位或第48-60位)和模型兩親性肽MAP是短的、兩親性的和陽(yáng)離子的肽和肽衍生物，通常含有多個(gè)賴氨酸和精氨酸殘基。Fischer，P.M.，Med Res Rev, 27 755-795(2007)。它們作為多種物質(zhì)的潛在的轉(zhuǎn)運(yùn)劑或遞送載體，形成一類受到重點(diǎn)關(guān)注的小分子，所述多種物質(zhì)包括基因治療中的細(xì)胞毒性藥物、反義寡聚核苷酸、蛋白和肽，并作為誘餌肽。Hallbrink,M.等人· Biochim. Biophys. Acta 1515:101-109(2001) ；Lindgren, M·，等人.Trends Pharmacol. Sci. 21 :99_103 (2000) ；Gusarova，等人，J Clin Invest, 117 99-111(2007) ；Melnick, A.，Biochem Soc Trans,35 :802_806(2007) ；Astriab-Fisher 等人，Pharm Res, 19 744-754 (2002) ；El-Andaloussi 等人，J Gene Med, 8 1262-1273 (2006)； Cashman 等人，MolTher，6 :813_823 (2002)。實(shí)施方案的概述
本發(fā)明涉及包含可為銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物的肽的組合物和方法，所述銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物優(yōu)先進(jìn)入細(xì)胞并還在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、組織和動(dòng)物中抑制癌前病變的發(fā)展。本發(fā)明還涉及方法，所述方法包括通過(guò)將癌細(xì)胞與細(xì)胞毒性銅氧還蛋白相接觸而殺死癌細(xì)胞，其中所述細(xì)胞毒性的銅氧還蛋白通過(guò)一種或多種胞吞途徑優(yōu)先進(jìn)入癌細(xì)胞， 并且其中所述細(xì)胞毒性的銅氧還蛋白是天青蛋白的截短體，并且其中所述天青蛋白的截短體包含來(lái)自SEQ ID NO :2的C-末端的氨基酸的一個(gè)或多個(gè)。在一些實(shí)施方案中，天青蛋白的截短體來(lái)自銅綠假單胞菌O^seudomonas aeruginosa) 0在另一些實(shí)施方案中，天青蛋白的截短體包含SEQ ID NO :2。在又一些其它的實(shí)施方案中，天青蛋白的截短體由SEQ ID NO 2組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性的銅氧還蛋白通過(guò)胞膜窖介導(dǎo)的胞吞作用優(yōu)先進(jìn)入癌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性的銅氧還蛋白進(jìn)入癌細(xì)胞是通過(guò)高爾基體介導(dǎo)的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性的銅氧還蛋白包含無(wú)論癌細(xì)胞的狀態(tài)如何能夠與癌細(xì)胞的細(xì)胞膜接觸的氨基酸。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性的銅氧還蛋白與細(xì)胞膜上的氨基酸、細(xì)胞表面肽、和/或受體接觸。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性的銅氧還蛋白可包含位于SEQ ID NO :1的第69、70、75、76和85位的氨基酸中的每一個(gè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 細(xì)胞毒性的銅氧還蛋白包含位于SEQ ID NO 1的第69、70、75、76和85位的氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)。在這些實(shí)施方案的任何一個(gè)中，這些氨基酸可位于與SEQ ID NO :1的那些相似或同源的細(xì)胞毒性銅氧還蛋白內(nèi)的位置。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性銅氧還蛋白包含選自由SEQ ID NO 35, SEQ ID N0:36和SEQ ID NO :37組成的組的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性銅氧還蛋白由選自由SEQ ID NO 35, SEQ ID NO 36和SEQ ID NO :37組成的組的氨基酸序列組成。本發(fā)明還涉及能夠與癌細(xì)胞的細(xì)胞膜接觸、通過(guò)胞膜窖介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入癌細(xì)胞并殺死癌細(xì)胞的分離的肽，其中所述分離的肽包含SEQ IDNO :2的C-末端氨基酸。在一些實(shí)施方案中，分離的肽與細(xì)胞膜上的氨基酸、細(xì)胞表面肽、和/或受體接觸。在一些實(shí)施方案中，分離的肽進(jìn)入癌細(xì)胞是由高爾基體介導(dǎo)的。在另一些實(shí)施方案中，分離的肽來(lái)自銅綠假單胞菌。在另一些實(shí)施方案中，分離的肽包含SEQ ID NO :2。在另一些實(shí)施方案中，分離的肽由SEQ ID N0:2組成。在又一些其它的實(shí)施方案中，分離的肽由SEQ ID N0:2的C-末端氨基酸組成。例如，分離的肽可包含選自由SEQ ID NO 35, SEQ ID N0:36和SEQ ID NO: 37SEQ ID NO :36組成的組的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，分離的肽由選自由SEQ ID NO :35、SEQ ID NO 36和SEQ ID NO :37SEQ ID NO :36組成的組的氨基酸序列組成。本發(fā)明還涉及能夠與癌細(xì)胞的細(xì)胞膜接觸、通過(guò)胞膜窖介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入癌細(xì)胞并殺死癌細(xì)胞的分離的肽，其中所述分離的肽包含位于SEQ ID N0:1的第69、70、75、76 和85位的氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)。在另一些實(shí)施方案中，分離的肽包含位于SEQ ID NO 1 的第69、70、75、76和85位的氨基酸中的每一個(gè)。在這些實(shí)施方案中，這些氨基酸可位于與 SEQID NO :1的那些相似或同源的分離的肽內(nèi)的位置。在一些實(shí)施方案中，分離的肽與細(xì)胞膜上的氨基酸、細(xì)胞表面肽、和/或受體接觸。本發(fā)明還涉及包含以上所描述的分離的肽中的一個(gè)或多個(gè)的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物還包含藥學(xué)上可接受的載體。在另一些實(shí)施方案中，其中的藥學(xué)上可接受的載體適宜于靜脈內(nèi)施用。本發(fā)明還涉及通過(guò)向患者施用治療有效量的本發(fā)明的藥物組合物中的一個(gè)或多個(gè)而治療哺乳動(dòng)物患者的方法。在一些實(shí)施方案中，患者是人。在另一些實(shí)施方案中，患者處于高于一般群體發(fā)生癌癥的較高風(fēng)險(xiǎn)。在又一些實(shí)施方案中，癌癥選自黑素瘤、乳腺癌、 胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、肺癌、結(jié)腸直腸癌、頭頸癌、膀胱癌、前列腺癌、皮膚癌和宮頸癌。在另一些實(shí)施方案中，患者具有至少一種高風(fēng)險(xiǎn)特征。在另一個(gè)實(shí)施方案中，患者具有癌前病變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，患者已被治愈癌癥或癌前病變。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物通過(guò)選自由靜脈注射、肌內(nèi)注射、皮下注射、吸入法、局部施用、透皮貼劑、栓劑、玻璃體注射和口腔組成的組的方式來(lái)施用。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，施用方式為通過(guò)靜脈注射。本發(fā)明還涉及包含在小管中的本發(fā)明的藥物組合物中的一個(gè)或多個(gè)的藥盒。在一些實(shí)施方案中，藥盒還包括向患者施用活性組合物的裝置。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的分離的肽中的一個(gè)或多個(gè)和貨物化合物(cargo compound)的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，分離的肽與貨物化合物連接。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，貨物化合物是他莫昔芬(Tamoxifen)。在另一些實(shí)施方案中，貨物化合物選自由蛋白、脂蛋白、多肽、肽、多糖、核酸、染料、微粒、納米微粒、毒素和藥組成的組。在另一個(gè)實(shí)施方案中，貨物化合物是可檢測(cè)的物質(zhì)。例如，貨物化合物可以是通過(guò)X-射線CT可檢測(cè)的X-射線造影劑、通過(guò)MRI可檢測(cè)的磁共振成像造影劑，或超聲造影劑且是通過(guò)超聲可檢測(cè)的。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物還包含藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明還涉及包括通過(guò)將細(xì)胞與藥物組合物相接觸而遞送貨物化合物的方法，所述藥物組合物包括如上所述的分離的肽中的一個(gè)或多個(gè)和如以上所描述的貨物化合物。本發(fā)明的這些和其它方面、優(yōu)勢(shì)和特征將從以下的圖和具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述中變得明顯。序列簡(jiǎn)述SEQ ID NO :1.來(lái)自銅綠假單胞菌的天青蛋白的氨基酸序列(Ala Glu Cys Ser Val Asp lie Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn Thr Asn Ala lie Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val lie Ala His Thr Lys Leu lie Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys)。SEQ ID NO :2. p^的氨基酸序列，銅綠假單胞菌天青蛋白第50-77位殘基 (Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO 3.來(lái)自層理席藻(Phormidium laminosum)的質(zhì)體藍(lán)素的氨基酸序列 (Glu Thr Phe Thr Val Lys Met Gly Ala Asp Ser Gly Leu Leu Gln Phe Glu Pro Ala Asn Val Thr Val His Pro Gly Asp Thr Val Lys Trp Val Asn Asn Lys Leu Pro Pro His Asn lie Leu Phe Asp Asp Lys Gln Val Pro Gly Ala Ser Lys Glu Leu Ala Asp Lys Leu SerHis Ser Gln Leu Met Phe Ser Pro Gly Glu Ser Tyr Glu lie Thr Phe Ser Ser Asp Phe Pro Ala Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Cys Ala Pro His Arg Gly Ala Gly Met Val Gly Lys lie Thr Val Glu Gly)。SEQ ID NO :4.來(lái)自氧化亞鐵硫桿菌(Thiobacillus ferrooxidans)
的鐵硫菌藍(lán)蛋白的氨基酸序列(GlyThrLeuAspThrThrTrpLysGluAlaThrLeu ProGlnValLysAlaMetLeuGluLysAspThrGlyLysValSerGlyAspThrValThr TyrSerGlyLysThrValHisValValAlaAlaAlaValLeuProGlyPheProPhePro SerPheGluValHisAspLysLysAsnProThrLeuGlulieProAlaGlyAlaThrVal AspValThrPhelieAsnThrAsnLysGlyPheGlyHisSerPheAsplieThrLysLys GlyProProTyrAlaValMetProVallieAspProlieValAlaGlyThrGlyPheSer ProValProLysAspGlyLysPheGlyTyrThrAspPheThrTrpHisProThrAlaGly ThrTyrTyrTyrValCysGlnlieProGlyHisAlaAlaThrGlyMetPheGlyLyslie Val
Val Lys)。SEQ ID NO :5.來(lái)自裂環(huán)無(wú)色桿菌(Achromobacter cycloclastes)的假天青蛋白的氨基酸序列(Ala Asp Phe Glu Val His Met Leu Asn Lys Gly Lys Asp Gly Ala Met Val Phe Glu Pro Ala Ser Leu Lys Val Ala Pro Gly Asp Thr Val Thr Phe lie Pro Thr Asp Lys Gly His Asn Val Glu Thr lie Lys Gly Met lie Pro Asp Gly Ala Glu Ala Phe Lys Ser Lys lie Asn Glu Asn Tyr Lys Val Thr Phe Thr Ala Pro Gly Val Tyr Gly Val Lys Cys Thr Pro His Tyr Gly Met Gly Met Val Gly Val Val Gln Val Gly Asp Ala Pro Ala Asn Leu Glu Ala Val Lys Gly Ala Lys Asn Pro Lys Lys Ala Gln Glu Arg Leu Asp Ala Ala Leu Ala Ala Leu Gly Asn)。SEQ ID NO 6.來(lái)自糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)的天青蛋白的氨基酸序列
(Ala Cys Asp Val Ser lie Glu GlyAsnAspSerMetGlnPheAsnThrLysSerlie ValVal AspLysThrCysLys Glu Phe Thr lieAsnLeuLysHisThrGlyLysLeuPro LysAla AlaMetGlyHisAsn Val Val Val SerLysLysSerAspGluSerAlaValAla ThrAsp GlyMetLysAlaGly Leu Asn Asn AspTyrValLysAlaGlyAspGluArgVal lieAla HisThrSerVallie Gly Gly Gly GluThrAspSerValThrPheAspValSer LysLeu LysGluGlyGluAsp Tyr Ala Phe PheCysSerPheProGlyHisTrpSerlie MetLys GlyThrlieGluLeu Gly Ser)。
SEQIDNO '7.來(lái)自木糖氧化無(wú)色桿菌反硝化亞種I(Achromobacter
xylosoxidans ssp. denitrificans I)S WMSSIji^J (Ala Gln Cys Glu Ala
Thr lie Glu Ser Asn Asp Ala Met Gln Tyr Asn Leu Lys Glu Met Val Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val His Leu Lys His Val Gly Lys Met Ala Lys Val Ala Met Gly His Asn Trp Val Leu Thr Lys Glu Ala Asp Lys Gln Gly Val Ala Thr Asp Gly Met Asn Ala Gly Leu Ala Gln Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val lie Ala His Thr Lys Val lie Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Pro Gly Glu Ala Tyr Ala Tyr Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Met Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Ser Asn)。 SEQ ID NO :8.來(lái)自支氣管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)的天青蛋白的氨基酸序列(Ala Glu Cys Ser Val Asp lie Ala Gly Thr Asp Gln Met Gln Phe AspLys LysAlaIleGluVal Ser Lys Ser Cys Lys Gln PheThrValAsnLeuLysHis ThrGly LysLeuProArgAsn Val Met Gly His Asn Trp ValLeuThrLysThrAlaAsp MetGln AlaValGluLysAsp Gly lie Ala Ala Gly Leu AspAsnGlnTyrLeuLysAla GlyAsp ThrArg ValLeuAla His Thr Lys Val Leu Gly GlyGlyGluSerAspSerVal ThrPhe AspValAlaLysLeu Ala Ala Gly Asp Asp Tyr ThrPhePheCysSerPhePro GlyHis GlyAlaLeuMetLys Gly Thr Leu Lys Leu ValAsp)1 O
SEQIDNO :9.來(lái)自甲基單胞菌(Methylomonas sp.) J的天青蛋白的氨基酸序列
(Ala Ser Cys Glu Thr Thr Val Thr Ser Gly Asp Thr Met Thr Tyr Ser Thr Arg Ser
lie SerValProAlaSerCysAlaGluPheThrValAsnPheGluHisLysGlyHis MetPro LysThrGlyMetGlyHisAsnTrpValLeuAlaLysSerAlaAspValGlyAsp ValAla LysGluGlyAlaHisAlaGlyAlaAspAsnAsnPheValThrProGlyAspLys ArgVal lieAlaPheThrProlielieGlyGlyGlyGluLysThrSerValLysPheLys ValSer AlaLeuSerLysAspGluAlaTyrThrTyrPheCysSerTyrProGlyHisPhe SerMet MetArgGly Thr Leu LysLeuGluGlu)。 SEQ ID NO :10.來(lái)自腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)Z2491 的天青蛋
白的氨基酸序列(CysSerGlnGluProAlaAlaProAlaAlaGluAlaThrProAla AlaGlu AlaProAla SerGluAlaProAlaAlaGluAlaAlaProAlaAspAlaAlaGlu AlaPro AlaAlaGly AsnCysAlaAlaThrValGluSerAsnAspAsnMetGlnPheAsn ThrLys AsplieGln ValSerLysAlaCysLysGluPheThrlieThrLeuLysHisThr GlyThr GlnProLys ThrSerMetGlyHisAsnlieVallieGlyLysThrGluAspMet AspGly liePheLys AspGlyValGlyAlaAlaAspThrAspTyrValLysProAspAsp AlaArg ValValAla HisThrLysLeulieGlyGlyGlyGluGluSerSerLeuThrLeu AspPro AlaLysLeu AlaAspGlyGluTyrLysPheAlaCysThrPheProGlyHisGly AlaLeu MetAsnGly Lys ValThrLeuValAsp) ο SEQ ID NO :11.來(lái)自熒光假單胞菌(I^seudomonas fluorescen)的天青蛋白的氨基
酸序列(AlaGlu CysLysThrThrlieAsp Ser ThrAsp GlnMetSerPheAsnThr LysAla lieGlulie AspLysAlaCysLysThr PheThrVal GluLeuThrHisSerGly SerLeu ProLysAsn ValMetGlyHisAsnLeu VallieSer LysGlnAlaAspMetGln Prolie AlaThrAsp GlyLeuSerAlaGlylie AspLysAsn TyrLeuLysGluGlyAsp ThrArg VallieAla HisThrLysVallieGly AlaGlyGlu LysAspSerLeuThrlie AspVal SerLysLeu AsnAlaAlaGluLysTyr GlyPhePhe CysSerPheProGlyHis lieSer MetMetLys Gly Thr ValThrLeuLys) ο SEQ ID NO :12.來(lái)自綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)的天青蛋白的
氨基酸序列(Ala Glu Cys Lys Val Asp Val AspSerThrAspGlnMetSerPheAsn ThrLys GlulieThr lieAspLysSerCysLysThrPheThrValAsnLeuThrHisSer GlySer LeuProLys AsnValMetGlyHisAsnTrpValLeuSerLysSerAlaAspMet AlaGly lieAlaThr AspGlyMetAlaAlaGlylieAspLysAspTyrLeuLysProGly AspSer ArgVallie AlaHisThrLyslielieGlySerGlyGluLysAspSerValThr PheAsp ValSerLys LeuThrAlaGlyGluSerTyrGluPhePheCysSerPheProGly HisAsn SerMetMetLys Gly Ala Val Val Leu Lys)。
SEQIDNO 13.來(lái)自苛養(yǎng)木桿菌(Xylella fastidiosa)9a5c的天1f蛋白的氨基酸序列(LysThrCysAlaValThrIleSer Ala Asn Asp Gln Met LysPheAspGln AsnThr IleLyslieAlaAlaGluCysThrHisValAsnLeu ThrLeuThrHisThrGly LysLys SerAlaArgValMetGlyHisAsnTrpValLeuThr LysThrThrAspMetGln AlaVal AlaLeuAlaGlyLeuHisAlaThrLeuAlaAspAsn TyrValProLysAlaAsp ProArg VallieAlaHisThrAlalielieGlyGlyGlyGlu ArgThrSerlieThrPhe ProThr AsnThrLeuSerLysAsnValSerTyrThrPhePhe CysSerPheProGlyHis TrpAla LeuMetLysGly Thr Leu AsnPhe GlyGly)。
SEQIDNO 14.來(lái)自] 瓜(cucumis；sativus)的漆樹花 f苷的氨基酸序列(MetGln SerThrValHislieVal GlyAspAsnThrGlyTrp SerValProSerSerPro AsnPhe TyrSerGlnTrpAlaAla GlyLysThrPheArgVal GlyAspSerLeuGlnPhe AsnPhe ProAlaAsnAlaHisAsnValHisGluMetGluThr LysGlnSerPheAspAla CysAsn PheValAsnSerAspAsn AspValGluArgThrSer ProVallieGluArgLeu AspGlu LeuGlyMetHisTyrPheValCysThrValGlyThr HisCysSerAsnGlyGln LysLeu SerlieAsnValValAla AlaAsnAlaThrValSer MetProProProSerSer SerPro ProSerSerValMetProProPre)Val Met Pro Pro Pro Ser Pro Ser)。
SEQIDNO 15.來(lái)自 §色綠屈:( (Chloroflexus aurantiacus) ^ ^tiffi^
的氨基畫!序列(Met Lys lie Thr Leu Arg Met Met Val LeuAlaValLeuThrAlaMetAla MetValLeuAlaAlaCysGlyGlyGlyGlySerSerGlyGlySerThrGlyGlyGlySer GlySerGlyProValThrlieGlulieGlySerLysGlyGluGluLeuAlaPheAspLys ThrGluLeuThrValSerAlaGlyGlnThrValThrlieArgPheLysAsnAsnSerAla ValGlnGlnHisAsnTrplieLeuValLysGlyGlyGluAlaGluAlaAlaAsnlieAla AsnAlaGlyLeuSerAlaGlyProAlaAlaAsnTyrLeuProAlaAspLysSerAsnlie lieAlaGluSerProLeuAlaAsnGlyAsnGluThrValGluValThrPheThrAlaPro AlaAlaGlyThrTyrLeuTyrlieCysThrValProGlyHisTyrProLeuMetGlnGly LysLeuValValAsn) ο
SEQIDNO 16.來(lái)自4登色綠屈:_的橙綠屈撓素B的氨基酸序列(AlaAlaAsnAla ProGlyGlySerAsnValValAsnGluThrProAlaGlnThrValGluValArgAlaAla ProAspAlaLeuAlaPheAlaGlnThrSerLeuSerLeuProAlaAsnThrValValArg LeuAspPheValAsnGlnAsnAsnLeuGly ValGlnHisAsnTrpValLeuValAsnGly GlyAspAspValAlaAlaAlaValAsnThr AlaAlaGlnAsnAsnAlaAspAlaLeuPhe ValProProProAspThrProAsnAlaLeu AlaTrpThrAlaMetLeuAsnAlaGlyGlu SerGlySerValThrPheArgThrProAla ProGlyThrTyrLeuTyrlieCysThrPhe ProGlyHis Tyr LeuAla Gly MetLys Gly Thr Leu Thr Val Thr Pro)。
SEQIDNO 17.來(lái)自j乾瓜的黃瓜堿性蛋白的氨基I酸序列(Ala 1ValTyrValValGly GlySerGlyGlyTrpThrPheAsnThrGluSer Trp ProLysGlyLysArgPheArgAla GlyAsplieLeuLeuPheAsnTyr Asn ProSerMetHisAsnValValValValAsnGln GlyGlyPheSerThrCys AsnThrProAlaGly Ala LysValTyrThrSerGlyArgAsp Gln lie Lys Leu Pro Lys Gly Gln Ser Tyr Phe lie Cys Asn Phe Pro Gly His Cys Gln Ser Gly Met Lys lie Ala Val Asn Ala Leu)。SEQ ID NO :18.來(lái)自淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)F62 的 Laz 的氨基酸序列(Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Gly Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp lie Gln Val Ser Lys Ala Cys Lys Glu Phe Thr lie Thr Leu Lys His Thr Gly Thr Gln Pro Lys Ala Ser Met Gly His Asn Leu Val lie Ala Lys Ala Glu Asp Met Asp Gly Val Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala His Thr Lys Leu lie Gly Gly Gly Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly Asp Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly Lys Val Thr Leu Val Asp)。SEQ ID NO :19.來(lái)自副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的天青蛋白的氨
基酸序列(Met Ser Leu Arg lie Leu Ala Ala Thr Leu Ala Leu Ala GlyLeuSer PheGly AlaGlnAlaSerAlaGluCysGluValSerlieAspAlaAsnAspMetMetGln PheSer ThrLysThrLeuSerValProAlaThrCysLysGluValThrLeuThrLeuAsn HisThr GlyLysMetProAlaGlnSerMetGlyHisAsnValVallieAlaAspThrAla Asnlie GlnAlaValGlyThrAspGlyMetSerAlaGlyAlaAspAsnSerTyrValLys ProAsp AspGluArgValTyrAlaHisThrLysValValGlyGlyGlyGluSerThrSer lieThr PheSerThrGluLysMetThrAlaGlyGlyAspTyrSerPhePheCysSerPhe Pro
Gly His Trp Ala lie Met Gln Gly Lys Phe Glu Phe Lys)。SEQ ID NO :20.來(lái)自橙色綠屈撓菌的橙綠屈撓素B的第57_89位氨基酸的氨基酸序列(His Asn Trp Val Leu Val Asn Gly Gly Asp Asp Val Ala Ala Ala Val Asn Thr Ala Ala Gln Asn Asn Ala Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro Asp)。SEQ ID NO :21.來(lái)自丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)天青蛋白的第 51-77 位氨基酸的氨基酸序列(Ser Lys Lys Ala Asp Ala Ser Ala lie Thr Thr Asp Gly Met Ser Val Gly lie Asp Lys Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :22.來(lái)自腦膜炎奈瑟球菌Laz的第89-115位氨基酸的氨基酸序列(lie Gly Lys Thr Glu Asp Met Asp Gly lie Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :23.來(lái)自副溶血性弧菌天青蛋白的第52_78位氨基酸的氨基酸序列 (Ala Asp Thr Ala Asn lie Gln Ala Val Gly Thr Asp Gly Met Ser Ala Gly Ala Asp Asn Ser Tyr Val Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :24.來(lái)自支氣管炎博德特菌天青蛋白的第51_77位氨基酸的氨基酸序列(Thr Lys Thr AlaAsp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly lie Ala Ala Gly LeuAspAsn Gln Tyr Leu Lys Ala GlyAsp)。SEQ ID NO :25.來(lái)自pl8的氨基酸序列，銅綠假單胞菌天青蛋白第50-67位殘基 (Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val ThrAsp Gly Met Ala Ser Gly)。SEQ ID NO :26.來(lái)自銅綠假單胞菌天青蛋白第36-88位氨基酸的氨基酸序列(ProGly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val lie Ala His Thr Lys Leu lie Gly)。SEQ ID NO :27.來(lái)自銅綠假單胞菌天青蛋白第36-77位氨基酸的氨基酸序列(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp) οSEQ ID NO :28.來(lái)自銅綠假單胞菌天青蛋白第36_89位氨基酸的氨基酸序列(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val lie Ala His Thr Lys Leu lie Gly Ser)。SEQ ID NO :29.來(lái)自銅綠假單胞菌天青蛋白第36-1 位氨基酸的氨基酸序列 (Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val lie Ala His Thr Lys Leu lie Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys)。SEQ ID NO :30.來(lái)自銅綠假單胞菌天青蛋白第53-70位氨基酸的氨基酸序列(Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys)。SEQ ID NO :31.來(lái)自銅綠假單胞菌天青蛋白第53-64位氨基酸的氨基酸序列 (AlaAlaAsp Met Gln Gly Val Val ThrAsp Gly Met)。SEQ ID NO :32.氨基酸序列 DGXXXXXDXXYXKXXD。SEQ ID NO :33.氨基酸序列 DGXXX)(DXX^(KX)(D。SEQ ID NO :34. ρ 18b的氨基酸序列，銅綠假單胞菌天青蛋白第60_77位殘基(Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :35. p28的C-末端12個(gè)氨基酸的序列，銅綠假單胞菌天青蛋白第66-77 位殘基(ρ 12) (Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :36p28的C-末端10個(gè)氨基酸的序列，銅綠假單胞菌天青蛋白第68_77 位殘基(Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :37p28的C-末端11個(gè)氨基酸的序列，銅綠假單胞菌天青蛋白第67-77 位殘基(Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :38.是天青蛋白截短體p28的變體的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Ala Val Val Thr Asp Thr Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :39.是天青蛋白截短體p28的變體的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Leu Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Leu Ala Ser Gly Leu AspLys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :40.是天青蛋白截短體p28的變體的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Val Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Val Ala Ser Gly Leu Asp LysAsp Tyr LeuLys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :41.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(Asp Asp Pro Lys Leu Tyr Asp Lys Asp Leu Gly Ser Ala Met Gly Asp Thr Val Val Gly Gln Met Asp Ala Ala Thr Ser Leu)。SEQ ID NO :42.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(乙酰化-Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp-酰胺化)。SEQ ID NO :43.是六肽的氨基酸序列(Val Ser Pro Pro Ala Arg)。SEQ ID NO :44.是六肽的氨基酸序列(Tyr Thr Pro Pro Ala Leu)。SEQ ID NO :45.是六肽的氨基酸序列(Phe Ser Phe Phe Ala Phe)。SEQ ID NO :46.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Thr Pro Gly Cys)。SEQ ID NO :47.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Aia Asp Cys Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Aspノ。SEQ ID NO :48.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Cys Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :49.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Cys Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :50.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Thr Met Gln Cys Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :51.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Thr Met Gln Gly Cys Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :52.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Aia Asn Thr Gln Gly Cys Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp;。SEQ ID NO :53.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Aia Asn Thr Gln Gly Val Cys Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp;。SEQ ID NO :54.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Aia Asp Met Thr Ala Val Cys Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :55.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Thr Ala Val Val Cys Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr LeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :56.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(LeuSerThrAlaAla AspMetGln Thr Val Val Cys Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp LysAspTyrLeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :57.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(LeuSerThrAlaAla AspMetGln Thr Val Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp LysAspTyrLeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :58.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(LeuSerThrAlaAla AspMetGln Ala Thr Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp LysAspTyrLeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :59.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(LeuSerThrAlaAla AspMetGln Ala Thr Val Thr Asp Cys Met Ala Ser Gly Leu Asp LysAspTyrLeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :60.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(LeuSerThrAlaAla AspMetGln Gly Val Thr Ala Asp Cys Met Ala Ser Gly Leu Asp LysAspTyrLeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :61.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(LeuSerThrAlaAla AspMetGln Gly Val Thr Ala Asp Gly Cys Ala Ser Gly Leu Asp LysAspTyrLeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :62.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(LeuSerThrAlaAla AspMetGln Gly Val Val Thr Asn Gly Cys Ala Ser Gly Leu Asp LysAspTyrLeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :63.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(LeuSerThrAlaAla AspMetGln Gly Val Val Thr Ala Thr Met Gly Ser Gly LeuCys LysAspTyrLeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :64.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(LeuSerThrAlaAla AspMetGln Gly Val Val Thr Asp Leu Thr Ala Ser Gly Leu Cys LysAspTyrLeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :65.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(LeuSerTrpAlaAla AspMetGln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp LysAspTyrLeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :66.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(LeuSerThrAlaAla AspMetTrp Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp LysAspTyrLeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :67.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(LeuSerThrAlaAla AspMetGln Gly Val Val Trp Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp LysAspTyrLeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :68.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(LeuSerThrAlaAla AspMetGln Gly Val Val Thr Asp Trp Met Ala Ser Gly Leu Asp LysAspTyrLeuLys Pro Ala Asp Lys Pro Ala Asp Lys Pro Ala Asp Lys Pro Ala Asp Lys Pro Ala Asp Lys Pro Ala Asp Lys Pro Ala Asp Lys Pro Ala Asp Asp X9),
Leu Tyr Ser X9)。SEQ ID NO :78.是pUC19_azu 的引物(5，-CGGGATCCCC GGCA ACCTGC CGA AGA ACGT CATGGGC-3')。SEQ ID NO :79.是 pUC19_azu 的弓| 物(5' -CGGAATTCGCATCACTTCAGG GTCAGGG-3，)。SEQ ID NO :80.是 AACCGCCGCC GACATGCAG-3，)。SEQ ID NO :81.是 ACAGTACCCA GTTGTGGCC-3')。SEQ ID NO :82.是 GTGTCATCGC CCACACC-3，)。SEQ ID NO :83.是
Asp SEQ Met Asp SEQ Met Asp SEQ Met Asp SEQ Met Asp SEQ Met Asp SEQ Met Asp SEQ Met Asp SEQ
Asp) ο
ID NO :69.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(Leu Trp Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp) ο
ID NO :70.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(Leu Gln Gly Val Val Trp Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp) ο
ID NO :71.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(Leu Gln Gly Val Val Thr Asp Trp Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp) ο
ID NO :72.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(Leu Trp Gly Val Val Trp Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp) ο
ID NO :73.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(Leu Trp Gly Val Val Thr Asp Trp Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp) ο
ID NO :74.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(Leu Gln Gly Val Val Trp Asp Trp Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp) ο
ID NO :75.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(Leu Trp Gly Val Val Trp Asp Trp Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp) ο
ID NO :76.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(X1
Ser Trp Ala Asp Tyr Leu
Ser Trp Ala Asp Tyr Leu
Ser Trp Ala Asp Tyr Leu
Ser Thr Ala Asp Tyr Leu
Ser Thr Ala Asp Tyr Leu
Ser Thr Ala Asp Tyr Leu
Ser Trp Ala Asp Tyr Leu
Ser X2 Ala
X3 X4 X5 Val Val X6 Asp X7 X8 Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro
SEQ ID NO :77.是經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的氨基酸序列(X1 Asp Pro Lys Asp Lys Asp Leu Gly Ser Ala X2 X3 Asp X4 Val Val X5 X6X7 Asp Ala Ala X8
pGST-azu36-50的弓丨物(5， -GGCCACAACTGGGTACTGTG
pGST-azu36-50的弓丨物(5， -CTGCATGTCGGCGGCGGTTC
pGST-azu36-77的弓丨物(5， -CCTGAAGCCCGACGACTGAC
pGST-azu36-77的弓丨物(5， -GGTGTGGGCGATGACACGTCAGTCGTCGGG CTTCAGG-3，)。SEQ ID NO :84.是 pGST-azu GAGAAGGACT CGGTGACC-3’ )。SEQ ID NO :85.是 pGST-azu ACGAGCCGAT CAGCTTGG-3，)。SEQ ID NO :86.是 azu50_77 的引物(5，-CGGGATCCTGAGCACCGCCG CCGACATGCA GGG-3，)。SEQ ID NO :87.是 azu 67-77 的引物(5，-CGGGATCCCC GGCCTGGACA AGGATTACCT GAAGCCCG-3，)。SEQ ID NO :88.是反向引物(5，-CGGAATTCGC ATCACTTCAG GGTCAGGG-3，)。SEQ ID NO :89.是 pGST-azu-50-66 的弓丨物(5，-GACGGCATGG CTTCCTGACT GGACAAGGAT TACC-3')。SEQ ID NO :90.是 pGST-azu-50-66 的弓丨物(5，-GGTAATCCTT GTCCAGTCAG GAAGCCATGC CGTC-3，)。SEQ ID NO :91.是正向引物(5，-CGGGATCCCC ATGGTGAGCA AGGGCG-3，)。SEQ ID NO :92.是反向引物(5，-CGGAATTCCT TGTACAGCTC GTCCATGCCG-3，)。SEQ ID NO :93.是 pGST-azu-50-77 的弓丨物(5，-CCGCTCGAGC CTGAGCACCG CCGCCATGCA GGG-3')。SEQ ID NO :94.是 pGST-azu-50-77 的弓丨物(5，-TTTTCCTTTT GCGGCCGCTC AGTCGTCGGG CTTCAGGTAA TCC-3’ )。SEQ ID NO :95.是多聚精氨酸或Arg8的氨基酸序列(ArgArgArgArg ArgArgArgArg)。SEQ ID NO :96.是 pl8 的片段的氨基酸序列(Ser Gly Leu Asp Lys Asp)。附圖簡(jiǎn)述

圖1.圖1描繪了對(duì)所有腺體進(jìn)行!^8和天青蛋白的效力的評(píng)價(jià)的照片。圖IA顯示了 DMBA處理的腺體中腺泡病變的代表性照片，和其與利用DMBA聯(lián)合化學(xué)預(yù)防劑處理的腺體進(jìn)行的對(duì)比。圖1B-1F顯示了 M8對(duì)腺泡病變的發(fā)展的作用的代表性照片。圖2.圖2描繪了顯示p^針對(duì)DMBA誘導(dǎo)的乳房泡病變的效力的圖。圖3.圖3描繪了導(dǎo)管病變的代表性切片和P^的作用的照片。圖4.圖4描繪了顯示出針對(duì)DMBA誘導(dǎo)的導(dǎo)管病變的M8的效力的圖。圖5.顯示α-螺旋在wt-天青蛋白中以及在wt-天青蛋白第50-77位蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域中定位的圖。指出了天青蛋白50-77結(jié)構(gòu)域中的三個(gè)氨基酸被脯氨酸殘基所替代。圖6(A)、(B)和(C). (A)圖顯示了 GST-GFP-azu 50-77 融合蛋白的構(gòu)建。將 gfp 基因?qū)氲絞st基因的3'端(用于GST-GFP)并將azu 50-77片段連接到gfp基因的3' 端框內(nèi)以產(chǎn)生GST-GFP-azu 50-77融合蛋白。將GST-GFP-azu 50-77作為單一融合蛋白從細(xì)胞裂解物中純化。將純化的蛋白在SDS-PAGE上進(jìn)行電泳并通過(guò)考馬斯藍(lán)染色進(jìn)行檢測(cè) (6(B)和還通過(guò)利用抗天青蛋白抗體的蛋白質(zhì)印跡來(lái)檢測(cè)(6(C))。圖7 (A)、(B)和(C).顯示GST-綠色熒光蛋白(GFP)和GST-GFP-天青蛋白融合蛋白的內(nèi)化的動(dòng)力學(xué)研究的圖。在利用不同濃度的GST-GFP (10 (a))或GST-GFP-azu
36-89 的弓丨物(5，-CCAAGCTGATCGGCTCGTGA 36-89 的弓丨物(5，-GGTCACCGAGTCCTTCTCTC50-77 (10(b))在37°C下處理1小時(shí)的J774細(xì)胞中分析綠色熒光。利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì) 10，000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析。(c)GST-GFP-azu 50-77的內(nèi)化的時(shí)間依賴。在37°C下將J774細(xì)胞與200 μ g/ml的GST-GFP-azu 50-77孵育指定的時(shí)間并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。圖8(A)、(B)和(C). (A)圖顯示了如前關(guān)于GST-GFP融合所描述的， 與GST(GST-PEDIII)融合的外毒素A結(jié)構(gòu)域III (第405-613位氨基酸)，以及結(jié)構(gòu)域Ib(第381-404位氨基酸)的部分。然后利用PCIUfazu 50-77片段連接到 GST-PEDIIKGST-PEDIII-azu 50-77)的羧基末端。(B)通過(guò)谷胱甘肽瓊脂糖4B柱凝膠過(guò)濾柱層析純化融合蛋白，并在SDS-PAGE上電泳以測(cè)定大小。(C)圖顯示了如PEDIII介導(dǎo)的細(xì)胞毒性所測(cè)定的，GST-PEDII I-azu 50-77融合蛋白在UIS0_Mel_2癌細(xì)胞中和正常成纖維(FBT)細(xì)胞中的作用。如所指出的，不同濃度的GST-PEDIII和GST-PEDIII-azu 50-77 與UISO-Mel-2細(xì)胞和FBT細(xì)胞孵育M小時(shí)，之后通過(guò)MTT分析測(cè)定細(xì)胞存活率。圖9.顯示GST-PEDIII-鐵硫菌藍(lán)蛋白融合蛋白對(duì)UIS0-Mel-2癌細(xì)胞和FBT 細(xì)胞的PEDIII-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的圖。如所指出的，將不同濃度的GST-PEDIII和 GST-PEDIII-azu 50-77與UIS0-Mel-2細(xì)胞和FBT細(xì)胞孵育M小時(shí)，其后通過(guò)MTT分析來(lái)測(cè)定細(xì)胞存活率。圖10，(A)、⑶和(C).描繪了顯示天青蛋白來(lái)源的肽，pl8和p^滲透到不同組織發(fā)生的癌細(xì)胞系中以及它們的正常對(duì)應(yīng)物的照片。(A)顯示37°C下2小時(shí)后Alexafluor 568標(biāo)記的!^8或？18的穿透的照片。使用陽(yáng)離子Arg8(SEQ ID NO :95)作為對(duì)照。(B)描繪37°C下2小時(shí)后Alexafluor 568標(biāo)記的p^或pl8穿透到同樣細(xì)胞系中的流式細(xì)胞術(shù)分析的圖。(C)描繪比來(lái)自正常細(xì)胞的熒光成倍增加的圖。？觀或？18進(jìn)入到4個(gè)黑素瘤細(xì)胞系中的相似的觀察顯示了比來(lái)自正常細(xì)胞的熒光的幾倍增加。圖 11，(A)和(B).描繪了顯示 azu 60-77 (pl8b)和 azu 66-77 (pl2)進(jìn)入到癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中的照片。利用alexafluor 568標(biāo)記的pl8b (A)或pl2 (B)在37°C下孵育細(xì)胞2小時(shí)，并通過(guò)共聚焦顯微術(shù)來(lái)記錄圖像。圖12，(A)和(B).描繪了天青蛋白和它的肽的細(xì)胞膜毒性的圖。㈧在37°C下暴露于不同濃度的P28、pl8和天青蛋白10分鐘的UISOMel-2細(xì)胞的LDH泄漏分析。包括作為陽(yáng)性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)裂解緩沖液(cytotox-one試劑)。在λ ex 560nm和λ em 590nm處測(cè)量暴露后的熒光的改變。將裂解緩沖液定義為100% LDH釋放。數(shù)據(jù)代表對(duì)照的陽(yáng)性熒光的百分比。數(shù)據(jù)顯示為平均值士SEM。(B)從與p28、pl8和天青蛋白共同孵育的人紅細(xì)胞中的血紅蛋白泄露。在37°C下利用肽孵育人紅細(xì)胞30分鐘，并測(cè)定了 540nm處的吸光度。 0. 1% Triton X_100后的血紅蛋白釋放定義為100%血紅蛋白釋放。數(shù)據(jù)代表了三份重復(fù)測(cè)定的平均值士SEM。圖13，(A)、(B)、(C)和(D).描繪了顯示 p28 和 pl8 進(jìn)入 UISO-Mel-2 細(xì)胞的溫度依賴和競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)化的照片。在不同的溫度下通過(guò)共聚焦顯微術(shù)來(lái)評(píng)價(jià)Alexafluor 568 標(biāo)記的P^ (A)或pl8⑶在201IM時(shí)的滲透。(C)和⑶在未標(biāo)記的肽的存在/不存在下 (200倍過(guò)量)，在37°C下30分鐘后Alexafluor 568標(biāo)記的p28 (C)或pl8 (D)以5μΜ進(jìn)入 UIS0-Mel-2細(xì)胞的共聚焦分析。圖14，(A)、(B)、(C)和(D). (A)描繪了顯示在硫酸肝素的存在/不存在下 (100 μ g/ml)，在 37 °C 下 1 小時(shí)后 ρ28、ρ18(20μΜ)和 Arg8 (SEQ ID NO :95) (10 μ Μ)進(jìn)入U(xiǎn)ISO-Mel-2細(xì)胞的共聚焦分析的照片。(B)顯示在抑制物存在下M8或pl8進(jìn)入的流式細(xì)胞術(shù)分析的圖。認(rèn)為抑制物不存在下的細(xì)胞熒光強(qiáng)度(對(duì)照)為100%。(C)描繪在抑制物存在下M8和P18進(jìn)入成纖維細(xì)胞的FRCS分析的圖。(D)描繪了顯示pl8和M8與窖蛋白1(套組1)的共定位的照片。在37°C下利用Alexafluor 568標(biāo)記的pl8或p28 (20 μ M) 或培養(yǎng)基孵育UISO-Mel-2細(xì)胞2小時(shí)。固定細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行抗窖蛋白1免疫染色處理。 在37°C下2小時(shí)后Alexafluor568標(biāo)記的pl8或p^ (20 μ Μ)進(jìn)入U(xiǎn)IS0-Mel-2細(xì)胞，隨后進(jìn)行抗高爾基體蛋白97抗體處理的共聚焦分析(套組幻。Alexafluor 568標(biāo)記的天青蛋白、P^和pl8(紅色)與線粒體示蹤物(mitotracker)染料(綠色)(套組幻和溶酶體示蹤物(Lysotracker)(綠色)染料(套組4)在UISO-Mel-2細(xì)胞中的共定位。在37°C下利用20 μ M的天青蛋白、ρ^、ρ18或僅培養(yǎng)基來(lái)孵育細(xì)胞。90分鐘孵育后，加入線粒體示蹤物 /溶酶體示蹤物探針并孵育細(xì)胞30分鐘。用DAPI (藍(lán)色)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)染色。天青蛋白、 Ρ28或ρ18的共定位表現(xiàn)為黃色熒光。圖15，(A)和(B).描繪在37°C下與漸增濃度的天青蛋白、？觀或？18共同孵育72 小時(shí)的UISO-Mel-2細(xì)胞的圖。MTT(A)；直接細(xì)胞計(jì)數(shù)(B)。認(rèn)為對(duì)照孔中的細(xì)胞存活率 (MTT)或細(xì)胞數(shù)目為100%。數(shù)據(jù)代表平均值士 SEM。圖16，(A)至(H).描繪了用蛋白和/或緩沖液處理細(xì)胞之后利用共聚焦顯微鏡拍攝的顯示細(xì)胞攝取化合物的照片。(A)用20 μ M未標(biāo)記的蛋白或PBS緩沖液預(yù)處理人類腦腫瘤LN-2^細(xì)胞2小時(shí)，然后用PBS緩沖液洗滌三次。棄去所有緩沖液且然后加入20 μ M 的Alex568-Paz，在37°C下持續(xù)30分鐘。(B)然后在37°C下用20 μ M未標(biāo)記的蛋白或PBS 緩沖液和20 μ M的Alex568-Paz處理細(xì)胞30分鐘。(C)用10 μ M未標(biāo)記的蛋白或 PBS緩沖液預(yù)處理另一組人類腦腫瘤LN-2^細(xì)胞2小時(shí)，然后用PBS緩沖液洗滌三次。棄去所有緩沖液，然后加入10 μ M的Alex568-Paz，在37°C下持續(xù)30分鐘。(D)然后在37°C下用10 μ M未標(biāo)記的蛋白或PBS緩沖液和10 μ M的Alex568-Paz處理細(xì)胞30分鐘。 (E)在37°C下用20 μ M的未標(biāo)記的蛋白或PBS緩沖液和20 μ M的Alex568_Paz處理人類腦腫瘤LN-2^細(xì)胞30分鐘。(F)在37°C下用20 μ M的Alex568_H. 8處理人類腦腫瘤
細(xì)胞30分鐘。(G)在37°C下用20 μ M的Alex568_蛋白處理人類腦腫瘤細(xì)胞30分鐘。(H)在37°C下用20 μ M的Alex568-蛋白處理人類乳腺癌MCF-7細(xì)胞30分鐘。圖17，(A)至(C).描繪肽結(jié)合和進(jìn)入細(xì)胞的曲線和圖表。(A)將UISO-Mel-2細(xì)胞或成纖維細(xì)胞(3xl05個(gè)細(xì)胞)懸浮在不含酚紅的MEME培養(yǎng)基中。通過(guò)加入10、50、100、 150、250、300 和 400 μ M 的 Alexaf luor568_ 軛合的 p^ 在冰上持續(xù) 30、60、90 和 120 秒來(lái)起始反應(yīng)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)分析細(xì)胞。(B)通過(guò)將肽濃度(PM)對(duì)比速率(MFI/秒)繪制曲線而計(jì)算K1^nvmaxt5 (C)利用Mel2全細(xì)胞(50，000細(xì)胞/ml)來(lái)測(cè)定肽結(jié)合和進(jìn)入，在存在/不存在1000倍過(guò)量的未標(biāo)記的p28，或天青蛋白的情況下，在37°C下將細(xì)胞與漸增濃度(0-175nM)的放射性標(biāo)記的天青蛋白孵育30分鐘，利用γ計(jì)數(shù)器計(jì)算保留在細(xì)胞沉淀中的放射性。認(rèn)為與單獨(dú)的125I天青蛋白孵育的細(xì)胞中的放射性為總結(jié)合；認(rèn)為未標(biāo)記的天青蛋白或M8存在下的放射性為非特異性結(jié)合。通過(guò)從總結(jié)合中減去非特異性結(jié)合而測(cè)定特異性結(jié)合，并生成斯卡恰特圖(katchard plots)。圖18，(A)至(C).描繪了對(duì)患有黑素瘤MEL-23腫瘤的小鼠注射250yL掃描中的 60 μ M濃度的P^染料復(fù)合物后和注射對(duì)照PBS后(A) 24小時(shí)和(B) 48小時(shí)拍攝的小鼠側(cè)面和背面照片。(C)描繪了對(duì)患有黑素瘤MEL-23腫瘤的小鼠注射200μΜ濃度的？觀后對(duì)小時(shí)和48小時(shí)拍攝的小鼠的側(cè)面和背面照片。圖19，(A)至(C).描繪了對(duì)患有黑素瘤MEL-23腫瘤的小鼠注射601^濃度的？18 后(A) 17小時(shí)、(B)M小時(shí)和(C)46小時(shí)拍攝的小鼠側(cè)面和背面照片。(C)還描繪了注射 ρ18后46小時(shí)所拍攝的小鼠器官的照片，包括心臟、肺、肝、腎、脾和腦。圖20，(A)和(B). (A)描繪了對(duì)患有腫瘤的小鼠注射60 μ M濃度的ρ18、ρ^和 arg-8 (SEQ ID NO. 95)后12小時(shí)拍攝的小鼠的側(cè)面和背面照片。(B)描繪了注射pl8、p28 和arg-8(SEQ ID NO. 95)后12小時(shí)所拍攝的小鼠器官的照片，包括小鼠腦。圖21，(A)和(B). (A)描繪了對(duì)患有黑素瘤MEL-6腫瘤的小鼠注射600 μ M濃度的 ρ18和arg-8 (SEQ ID NO. 95)到尾靜脈后40小時(shí)后所拍攝的小鼠的側(cè)面和背面照片。pl8 處理的動(dòng)物接受了 500，000個(gè)細(xì)胞，arg-8 (SEQ ID NO. 95)處理的動(dòng)物接受了 1，000, 000個(gè)細(xì)胞。(B)描繪了注射600 μ M濃度的ρ18和arg-8 (SEQ ID NO. 95)后40小時(shí)所拍攝的小鼠器官的照片。圖22，(A)和⑶.㈧描繪了對(duì)患有黑素瘤MEL-23腫瘤的小鼠注射60 μ M濃度的 p^、pl8*arg-8(SEQ ID NO. 95)后16小時(shí)所拍攝的小鼠的側(cè)面和背面照片。(B)描繪了對(duì)患有黑素瘤MEL-23腫瘤的小鼠注射60 μ M濃度的ρ28、ρ18和arg-8 (SEQ ID NO. 95)后 24小時(shí)所拍攝的小鼠的側(cè)面和背面照片。圖23.描繪了將60 μ M濃度的!^8和ρ 18染料肽復(fù)合物注射到具有黑素瘤MEL-23 的小鼠后48小時(shí)所拍攝的小鼠器官的照片。圖24.描繪了將60 μ M濃度的ρ^注射到具有MEL-23腫瘤的小鼠和器官后M小時(shí)所拍攝的小鼠器官的照片。圖25.描繪了對(duì)患有黑素瘤MEL-23腫瘤的小鼠注射60 μ M濃度的ρ^和 arg-8 (SEQ ID NO. 95)后16小時(shí)所拍攝的小鼠的側(cè)面和背面照片。圖26.描繪了對(duì)患有黑素瘤MEL-23腫瘤的小鼠注射60 μ M濃度的ρ18后16小時(shí)所拍攝的小鼠的側(cè)面和背面照片。圖27.描繪了利用240 μ M濃度的ρ18、ρ28和arg-8 (SEQ ID NO. 95)對(duì)具有腫瘤的小鼠進(jìn)行高劑量處理之后10小時(shí)和M小時(shí)所拍攝的小鼠的側(cè)面照片。圖 28.描繪了利用 240 μ M 濃度的口18、口沘和 arg-8 (SEQ ID NO. 95)對(duì)患有 MCF-7 腫瘤的小鼠和器官進(jìn)行高劑量處理后觀小時(shí)所拍攝的小鼠和器官的側(cè)面和背面照片。還描繪了利用240 μ M濃度的ρ18、ρ28和arg-8 (SEQ ID NO. 95)對(duì)具有MCF-7的小鼠器官進(jìn)行高劑量處理后觀小時(shí)所拍攝的小鼠器官的照片。圖29.描繪了利用240 μ M濃度的ρ18、ρ28和arg-8 (SEQ ID NO. 95)對(duì)具有腫瘤的小鼠進(jìn)行高劑量處理之后50小時(shí)所拍攝的小鼠的側(cè)面和背面照片。圖30.描繪了將120 μ M濃度的pl8、p^和arg-8 (SEQ ID NO. 95)注射到具有 HCT-116腫瘤的小鼠的尾靜脈和器官中后M小時(shí)所拍攝的小鼠器官的照片。圖 31，(A)和(B). (A)描繪了將 120 μ M 濃度的 pl8、p^ 和 arg_8 (SEQ ID NO. 95) 注射到具有HCT-116腫瘤的小鼠的尾靜脈和器官中后M小時(shí)所拍攝的小鼠器官的照片。 (B)將120 μ M濃度的ρ18、ρ28和arg-8 (SEQ ID NO. 95)注射到具有HCT-116腫瘤的小鼠的尾靜脈中后21小時(shí)所拍攝的小鼠的側(cè)面照片。
圖32，㈧和(B). (A)描繪了將1，000，000個(gè)細(xì)胞注射到尾靜脈后47天，用120 μ M 濃度的Μ8注射具有HCT-116腫瘤的小鼠后M小時(shí)，小鼠的側(cè)面和背面照片。(B)描繪了將1，000，000個(gè)細(xì)胞注射到尾靜脈后47天，將120 μ M濃度的ρ^注射到具有HCT-116的小鼠后4小時(shí)，所拍攝的小鼠器官的照片。圖33.描繪了利用120μM濃度的pl8、p 和arg-8(SEQ ID NO. 95)處理后M小時(shí)所拍攝的取自MEL-6小鼠的器官的照片。圖34，(A)和(B). (A)描繪了注射 120 μ M 濃度的 ρ18、ρ28 和 arg_8 (SEQ ID NO. 95)，和6060 μ M濃度的arg-8 (SEQ ID NO. 95)后22小時(shí)所拍攝的MEL-6小鼠的側(cè)面和背面照片。(B)描繪了利用120 μ M濃度的pl8、p^和arg-8 (SEQ ID NO. 95)，和60 μ M濃度的arg-8 (SEQ IDN0. 95)處理后MEL-6小鼠器官的照片。圖 35，(A)和(B). (A)描繪了利用 60 禾口 120 μ M 濃度的 pl8、p^ 和 arg_8 (SEQ ID NO. 95)處理后22小時(shí)所拍攝的取自HT-1080小鼠的器官的照片。(B)描繪了利用60和 120 μ M濃度的ρ18、ρ28和arg-8 (SEQID NO. 95)處理后22小時(shí)所拍攝的取自HT-1080小鼠的腦的并列照片，表明將攝取P18和p^到腦中的差異。圖36.描繪了在阿霉素(Doxorubicin)對(duì)比口8的研究過(guò)程中，在利用60和 120 μ M濃度的ρ18、ρ28和arg-8 (SEQ ID NO. 95)處理后16小時(shí)拍攝的HT-1080小鼠的側(cè)面和背面照片。圖 37，(A)禾口(B). (A)描繪了利用 60 和 120 μ M 濃度的 M8 和 arg_8 (SEQ ID NO. 95) 處理后22小時(shí)所拍攝的取自HT-1080小鼠的器官的照片。⑶描繪了利用60和120μΜ濃度的ρ28和arg-8 (SEQ ID NO. 95)處理后22小時(shí)所拍攝的取自HT-1080小鼠的腦的并列照片。圖 38，(A)和(B). (A)描繪了利用 60 和 120 μ M 濃度的 ρ 18 和 arg_8 (SEQ ID NO. 95) 處理后22小時(shí)所拍攝的取自HT-1080小鼠的器官的照片。⑶描繪了利用60和120 μ M濃度的ρ18和arg-8 (SEQ ID NO. 95)處理后22小時(shí)所拍攝的取自HT-1080小鼠的腦的并列照片。圖39，(A)至(E).描繪了以㈧腹膜內(nèi)施用:3mg/kg阿霉素，3次處理⑶每天腹膜內(nèi)施用5mg/kg p28 ； (C)PBS對(duì)照，每天腹膜內(nèi)施用PBS ； (D)每天腹膜內(nèi)施用10mg/kg P28 ； (E)每天腹膜內(nèi)施用20mg/kg，通過(guò)其尾靜脈進(jìn)行處理的具有肺轉(zhuǎn)移的HT-1080小鼠的照片。圖40，(A)和(B). (A)描繪了動(dòng)物研究中取自HT-1080小鼠的器官的照片，其中通過(guò)將IxlO6個(gè)細(xì)胞注射到尾靜脈中(43天)，且所有處理的小鼠均具有肺轉(zhuǎn)移，拍攝自將 60 μ M濃度的M8注射到尾靜脈中后M小時(shí)和沈小時(shí)。拍攝時(shí)動(dòng)物6982是死亡的。(B) 描繪了動(dòng)物研究中ΗΤ-1080小鼠的側(cè)面和背面的照片，其中通過(guò)將IxlO6個(gè)細(xì)胞注射到尾靜脈中(43天)，拍攝自將60 μ M濃度的ρ^注射到尾靜脈中后22小時(shí)。拍攝時(shí)動(dòng)物6982 是死亡的。圖41.描繪了動(dòng)物研究中ΗΤ-1080小鼠的側(cè)面和背面的照片，其中通過(guò)將IxlO6個(gè)細(xì)胞注射到尾靜脈中(43天)，拍攝自將60 μ M濃度的ρ^注射到尾靜脈中后沈小時(shí)。圖42，(A)和(B).描繪了 Balb-C肽研究中㈧取自小鼠的器官和⑶小鼠的后視圖的照片，拍攝自利用60和120 μ M濃度的？18、？觀和arg-8 (SEQ ID NO. 95)處理后12小時(shí)。圖43，(A)和(B).描繪了 Balb-C肽研究中(A)取自小鼠的器官和(B)小鼠的側(cè)視圖的照片，拍攝自利用60和120 μ M濃度的ρ18、ρ28和arg-8 (SEQ ID NO. 95)處理后24 小時(shí)。圖44.描繪了尾靜脈注射60 μ M濃度的ρ 18和arg_8 (SEQ ID NO. 95)后16小時(shí) MEL-6小鼠(通過(guò)尾靜脈注射500，000個(gè)細(xì)胞)的側(cè)面和背面照片。圖45，(A)至(D).描繪了用pl8和M8處理后，小鼠器官特別是小鼠腦的照片。圖 46.描繪了用 ρ28、ρ 18 和 arg-8 (SEQ ID NO. 95)處理后 24 小時(shí)取自 MEL-6 小鼠的器官的照片。圖47，(A)至(C). (A)描繪了注射 60 μ M 濃度的 pl8、p^ 和 arg_8 (SEQ ID NO. 95) 后3小時(shí)MEL-6小鼠的側(cè)面和背面照片。(B)描繪了注射60 μ M濃度的ρ 18、ρ28和arg-8 (SEQ ID NO. 95)后22小時(shí)所拍攝的，MEL-6小鼠的側(cè)面和背面照片，和取自MEL-6小鼠的器官的照片。(C)描繪了注射60 μ M濃度的P18、ρ28和arg-8 (SEQ ID NO. 95)后M小時(shí)取自 MEL-6小鼠的器官的照片。圖48，(A)和(B).描繪了將pl8和p28攝取到(A)小鼠腦中和(B)小鼠器官中。圖49.描繪了研究中MEL-6小鼠的側(cè)面和背面照片，其通過(guò)將500，000個(gè)細(xì)胞靜脈注射到尾靜脈中(44天后)，拍攝自將M μ M濃度的pl8和arg-8 (SEQ ID NO. 95)注射到尾靜脈后120小時(shí)。圖50.描繪了利用ρ 18處理后168小時(shí)取自MEL-6小鼠的器官的照片。圖51.描繪了在注射細(xì)胞41天后，arg-8 (SEQ ID NO. 95)和pl8注射后72小時(shí)所拍攝的MEL-6小鼠的側(cè)面和背面照片。圖52.描繪了注射arg-8 (SEQ ID NO. 95)和pl8后所拍攝的小鼠的照片。圖53.描繪了注射arg-8和pl8后3小時(shí)、M小時(shí)和48小時(shí)所拍攝的小鼠的側(cè)面和正面照片。圖54.描繪M8對(duì)人類乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的圖。在37°C下將MCF-7細(xì)胞與 p28 (0-200 μ Μ)孵育24、48和72小時(shí)。細(xì)胞計(jì)數(shù)(A)和MTT分析(B)。使用阿霉素(10 μ Μ)作為陽(yáng)性對(duì)照。認(rèn)為對(duì)照孔的細(xì)胞數(shù)目或存活率為100%。數(shù)據(jù)代表對(duì)照的平均值％ 士SEM。 *，ρ < 0. 05。(C)p^對(duì)MCF-7異種移植生長(zhǎng)的抑制。對(duì)每組的最少10只小鼠，在10天、 14天、21天和25天利用15 μ mol/kg的紫杉醇腹腔內(nèi)進(jìn)行處理，或每天用5或10mg/kg的 P28腹腔內(nèi)處理，持續(xù)30天。柱形代表平均值士SEM。*，ρ < 0. 05。圖55. (A)和(B)是描繪細(xì)胞周期的FACS分析和p^穿透乳腺癌細(xì)胞的圖。利用p28 (50 μ Μ)對(duì)MCF-7細(xì)胞(A)和MDD2細(xì)胞(B)處理48小時(shí)和72小時(shí)。如Yamada,等人·，Proc Natl Acad Sci USA, 101 :4770-4775(2004)中所描述的，用碘化丙啶染色細(xì)胞并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。指出了 G1期、S期、G2/M期和亞-G1期(凋亡)中的細(xì)胞的百分比。(C)包括的圖像描繪了在無(wú)酚紅的MEM中在蓋玻片上過(guò)夜培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞和MDD2 細(xì)胞，用20 μ M p28或10 μ M的陽(yáng)離子(陽(yáng)性對(duì)照)肽、八精氨酸(Arg8)，(SEQ ID N0. 95) 在37°C下對(duì)其處理2小時(shí)。紅色-Alexa fluor 568標(biāo)記的p28，藍(lán)色-DAPI (核)。圖56. p28與p53的相互作用。(A)-(D)是描繪細(xì)胞中p53水平和p^水平的照片。(A)與!^8孵育后隨時(shí)間推移MCF-7細(xì)胞中的p53水平。相對(duì)于緊接處理前p53水平的(% )增高(0小時(shí)作為100% )0 (B)GSTpu 11-down分析表明GST_p28和p53之間復(fù)合物的形成。從左到右為GST-p28 (10和20 μ g/反應(yīng))、GST_MDM2和單獨(dú)的GST。利用抗p53 抗體通過(guò)免疫印跡(IB)檢測(cè)p53。(C)在摩爾過(guò)量的p^存在下(上方)，p53被GST-MDM2 拉下。在M8存在下，三種不同的抗P53抗體，Pab 1801(第32-79位氨基酸)、ab 2433 (第 277-296位氨基酸)和Pab 1802 (第306-393位氨基酸)與GST_p53固定化珠子反應(yīng)。利用抗P^抗體(下方)通過(guò)IB檢測(cè)p28。(D)摩爾過(guò)量的p^片段pl2、pl8和pl8b與p^ 競(jìng)爭(zhēng)對(duì)GST-p53的結(jié)合。結(jié)合的相對(duì)量(單獨(dú)的P^表示為100% )。M :p28標(biāo)記物。(E) 是描繪暴露于P^或天青蛋白后MCF-7核提取物中p53DNA結(jié)合的圖。H2A處理的MCF-7細(xì)胞的核提取物作為內(nèi)對(duì)照。利用抗P53的單克隆抗體對(duì)p53-寡聚核苷酸復(fù)合物定量。數(shù)據(jù)表示為三個(gè)重復(fù)的平均值士SEM。圖57.描繪M8誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白(CDK和CDKI)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的照片。MCF-7細(xì)胞 (A)和MDD2細(xì)胞(B)暴露于p28 (50 μ Μ) 24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，并通過(guò)免疫印跡測(cè)定蛋白質(zhì)水平。將MCF-7細(xì)胞在蓋玻片上與Μ8培養(yǎng)72小時(shí)，p21(C)和細(xì)胞周期蛋白Bl (D) 的胞內(nèi)定位和相對(duì)水平。利用相應(yīng)的特異性抗體染色P21和細(xì)胞周期蛋白B。(E)利用抗 p-cdc2抗體(Santa Cruz Biotechnology, CA)評(píng)價(jià)磷酸化的cdc2。所有結(jié)果通過(guò)作為內(nèi)部對(duì)照的肌動(dòng)蛋白來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化。圖58.描繪蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的圖。A)具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的天青蛋白截短體；B)70ns模擬的結(jié)果；C)模擬結(jié)構(gòu)中基于Ca原子之間的距離對(duì)硫醚橋位置的測(cè)量。發(fā)明詳述定義如本文所用的，除非特別描述為“單個(gè)細(xì)胞”，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”包括該術(shù)語(yǔ)的單數(shù)或復(fù)數(shù)形式。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)，，可交替使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語(yǔ)應(yīng)用于氨基酸聚合物，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物。該術(shù)語(yǔ)還應(yīng)用于天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”也包括修飾，所述修飾包括但不局限于糖基化、脂質(zhì)連接、硫酸化、谷氨酸殘基的Y羧化、羥基化和ADP核糖基化。應(yīng)理解地是，多肽并不總是全部是直鏈的。例如，作為泛素化的結(jié)果，多肽可以是支鏈的，并且一般作為翻譯后事件(包括天然處理事件和非天然的人工操作引起的事件)的結(jié)果，多肽可以是環(huán)形的(具有或沒有支鏈)。環(huán)狀、支鏈和支鏈環(huán)狀的多肽可通過(guò)非翻譯天然方法來(lái)合成，以及通過(guò)完全合成的方法來(lái)合成。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“藥理學(xué)活性”表示藥物或其它化學(xué)物質(zhì)對(duì)生物系統(tǒng)的作用。 化學(xué)物質(zhì)的作用可以是有利的(治療性的)或有害的(毒性的)。純的化學(xué)物質(zhì)或混合物可以是天然來(lái)源的(植物、動(dòng)物或礦物)，或可以是合成的化合物。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“癌前”意為癌變前的，或不受控制的異常細(xì)胞分裂前。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“病變”意為異常組織的區(qū)域。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“病理狀況”包括解剖上和生理上偏離正常，其構(gòu)成活體動(dòng)物或其部分之一的正常狀態(tài)的損害、干擾或改變身體機(jī)能的表現(xiàn)，并且是對(duì)各種因素(如營(yíng)養(yǎng)不良、工業(yè)危害或氣候)、對(duì)特定的傳染物(如蠕蟲、寄生原生動(dòng)物、細(xì)菌或病毒)、對(duì)生物體內(nèi)在缺陷(如遺傳異常)、或?qū)@些因素的組合的反應(yīng)。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“病癥”包括解剖上和生理上偏離正常，其構(gòu)成活體動(dòng)物或其部分之一的正常狀態(tài)的損害，干擾或改變身體機(jī)能的表現(xiàn)。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“患有”包括，目前表現(xiàn)出病理狀況的癥狀，盡管沒有可觀察到的癥狀但具有病理狀況，處于病理狀況的恢復(fù)中或已從病理狀況中恢復(fù)。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“化學(xué)預(yù)防”是指藥物、維生素或其它天然的或合成的生物的或化學(xué)的劑的使用，以試圖降低癌癥的發(fā)展或復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)、預(yù)防、抑制、逆轉(zhuǎn)或延遲癌癥的發(fā)展或復(fù)發(fā)。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒性”指對(duì)細(xì)胞具有毒性的性質(zhì)。例如，“細(xì)胞毒性銅氧還蛋白”是對(duì)包括癌細(xì)胞的細(xì)胞具有毒性的銅氧還蛋白或其變體、衍生物、截短體或結(jié)構(gòu)等價(jià)物。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“治療”包括預(yù)防、降低、停止或逆轉(zhuǎn)與正在治療的病癥相關(guān)的病癥或癥狀的進(jìn)展或嚴(yán)重度。因此，術(shù)語(yǔ)“治療”視情況包括藥物施用、治療性和/或預(yù)防性治療。治療還可包括防止或減輕病癥諸如癌癥的發(fā)展。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“抑制細(xì)胞生長(zhǎng)”意為減緩或停止細(xì)胞分裂和/或細(xì)胞擴(kuò)增。 該術(shù)語(yǔ)還包括抑制細(xì)胞發(fā)育或增加細(xì)胞死亡?！爸委熡行Я俊笔怯行Х乐?、降低、停止或逆轉(zhuǎn)正在治療對(duì)象的特定疾病的發(fā)展、或部分地或整體地減輕特定疾病的現(xiàn)有癥狀的量。治療有效量的測(cè)定在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍之內(nèi)。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“基本上純的”，當(dāng)用于修飾本發(fā)明的蛋白或其它細(xì)胞產(chǎn)物時(shí)， 指的是例如從生長(zhǎng)培養(yǎng)基或細(xì)胞內(nèi)容物分離的蛋白形式為基本上沒有或基本上未摻雜其它蛋白和/或其它化合物。術(shù)語(yǔ)“基本上純的”指因子的量以干重計(jì)是分離組分的至少約 75%，或至少“75%基本上純的”。更具體地，術(shù)語(yǔ)“基本上純的”是指化合物以干重計(jì)是分離組分的至少約85%，或至少“85%基本上純的”。最具體地，術(shù)語(yǔ)“基本上純的”是指化合物以干重計(jì)是分離組分的至少約95%，或至少“95%基本上純的”。術(shù)語(yǔ)“基本上純的”也可用于修飾本發(fā)明的合成的蛋白或化合物，其中，例如，合成的蛋白從合成反應(yīng)的試劑和副產(chǎn)物中分離。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“藥物級(jí)，，當(dāng)指本發(fā)明的肽或化合物時(shí)，是基本上或?qū)嵸|(zhì)上從組分分離的肽或化合物，該組分通常伴隨在天然狀態(tài)發(fā)現(xiàn)的該物質(zhì)，包括合成試劑和副產(chǎn)物，以及基本上或?qū)嵸|(zhì)上從可能損壞其藥用的成分分離。例如，“藥物級(jí)”肽可與任何致癌物分離。在某些情況下，“藥物級(jí)”可以通過(guò)想要施用的方法來(lái)修飾，例如“靜脈藥物級(jí)”，來(lái)指定基本上或?qū)嵸|(zhì)上從任何可能使組合物不適于向患者施用的物質(zhì)中分離的肽或化合物。例如“靜脈藥物級(jí)”肽可從去垢劑諸如SDS和抗菌劑諸如疊氮化物中分離。術(shù)語(yǔ)“分離的”、“純化的”或“生物上純的”指的是物質(zhì)基本上沒有或?qū)嵸|(zhì)上沒有通常在該物質(zhì)的天然狀態(tài)中伴隨該物質(zhì)的組分。因此，根據(jù)本發(fā)明的分離的肽優(yōu)選地不含有在肽的原位環(huán)境中通常與肽有關(guān)的物質(zhì)。多肽的“分離的”區(qū)域是指不包括該區(qū)域所來(lái)源的多肽的整個(gè)序列的區(qū)域?！胺蛛x的”核酸、蛋白或其相應(yīng)的片段已基本上從其體內(nèi)環(huán)境中移出，從而其可由有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員來(lái)操作，諸如但不限于，核苷酸測(cè)序、限制性消化、定點(diǎn)誘變和亞克隆到用于核酸片段的表達(dá)載體中以及獲得基本上純的量的蛋白或蛋白片段。本文中關(guān)于肽所用的術(shù)語(yǔ)“變體”，是指與野生型的多肽相比，具有氨基酸替代、缺失或插入的氨基酸序列變體。變體可以是野生型肽的截短體?！叭笔А笔菑亩嚯膬?nèi)部去除一個(gè)或多個(gè)氨基酸，而“截短體”是從多肽的一端或兩端去除一個(gè)或多個(gè)氨基酸。因此，可通過(guò)操作編碼多肽的基因來(lái)生成變體肽。變體可通過(guò)改變多肽的基本組成或特征，但不改變其至少某些藥理學(xué)活性而生成。例如，天青蛋白的“變體”可以是保留其抑制哺乳動(dòng)物癌前細(xì)胞生長(zhǎng)的能力的突變的天青蛋白。在一些情況下，變體肽是利用非天然氨基酸(例如 ε -(3，5-二硝基苯甲?；?-Lys 殘基)來(lái)合成的。Ghadiri & Fernholz，J. Am. Chem. Soc.， 112 :9633-9635 (1990)。在一些實(shí)施方案中，與野生型肽或其部分相比，變體具有的替代、 缺失或插入的氨基酸不超過(guò)20個(gè)。在一些實(shí)施方案中，與野生型肽或其部分相比，變體具有的替代、缺失或插入的氨基酸不超過(guò)15個(gè)。在一些實(shí)施方案中，與野生型肽或其部分相比，變體具有的替代、缺失或插入的氨基酸不超過(guò)10個(gè)。在一些實(shí)施方案中，與野生型肽或其部分相比，變體具有的替代、缺失或插入的氨基酸不超過(guò)6個(gè)。在一些實(shí)施方案中，與野生型肽或其部分相比，變體具有的替代、缺失或插入的氨基酸不超過(guò)5個(gè)。在一些實(shí)施方案中，與野生型肽或其部分相比，變體具有的替代、缺失或插入的氨基酸不超過(guò)3個(gè)。在另一些實(shí)施方案中，變體是利用本文所公開的方法和技術(shù)來(lái)構(gòu)建的。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”是指包含任何天然存在的或非天然存在的或合成的氨基酸殘基的氨基酸部分，即，包含至少一個(gè)羧基和與一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)碳原子，通常為一個(gè)(α)碳原子直接連接的至少一個(gè)氨基的任何部分。本文中關(guān)于肽所用的術(shù)語(yǔ)“衍生物”是指衍生自目標(biāo)肽的肽。衍生包括肽的化學(xué)修飾而使肽仍保留其某些基本功能。例如，天青蛋白的“衍生物”可以，例如是化學(xué)修飾的天青蛋白，其仍保留了天青蛋白抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中血管生成的能力。感興趣的化學(xué)修飾包括但不局限于，肽的酰胺化、乙?；⒘蛩峄?、聚乙二醇(PEG)修飾、磷酸化或糖基化，或本文所公開的其它方法和技術(shù)。此外，衍生肽可以是多肽或其片段與化學(xué)化合物的的融合， 所述化學(xué)化合物諸如但不局限于，另一肽、藥物分子或其它治療劑或藥劑或可檢測(cè)探針。術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定義為當(dāng)比對(duì)兩個(gè)序列時(shí)，多肽中與候選序列中氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。為了測(cè)定氨基酸同一性％，比對(duì)序列， 并且如果需要，引入空位來(lái)實(shí)現(xiàn)最大的序列同一性％ ；保守性替代不被認(rèn)為是序列同一性的部分。測(cè)定百分比同一性的氨基酸序列比對(duì)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。通常，使用公眾可獲得的計(jì)算機(jī)軟件，例如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)軟件來(lái)比對(duì)肽序列。在具體的實(shí)施方案中，使用長(zhǎng)復(fù)雜性過(guò)濾器(long complexity filter)、預(yù)期 (expect) 10、字大小(word size)3、存在性(existence) 11 和延伸(extension) 1 的缺省參數(shù)來(lái)使用Blastp (可從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心，Bethesda MD獲得)。當(dāng)進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)時(shí)，給定的氨基酸序列A同、與或相對(duì)給定的氨基酸序列B 的氨基酸序列同一性％ (其可選地可表達(dá)為給定氨基酸序列A具有或包含同、與或相對(duì)給定氨基酸序列B的一定的％氨基酸序列同一性)可按如下來(lái)計(jì)算%氨基酸序列同一性=X/Y*100，其中X是氨基酸殘基的數(shù)目，其通過(guò)A和B的序列比對(duì)程序或算法的比對(duì)評(píng)分為相同匹配，和Y是B中氨基酸殘基的總數(shù)目。
如果氨基酸序列A的長(zhǎng)度不等于氨基酸序列B的長(zhǎng)度，A對(duì)B的％氨基酸序列同一性不等于B對(duì)A的％氨基酸序列同一性。當(dāng)對(duì)比較長(zhǎng)的序列與較短的序列時(shí)，較短序列將為“B”序列。例如，當(dāng)對(duì)比截短的肽與相應(yīng)的野生型多肽時(shí)，截短的肽將是“B”序列。MM在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含銅氧還蛋白、銅氧還蛋白的變體、衍生物、 截短體和結(jié)構(gòu)等價(jià)物的組合物，以及在哺乳動(dòng)物中預(yù)防癌癥發(fā)展的方法。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含優(yōu)先進(jìn)入包括癌細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的銅氧還蛋白，和銅氧還蛋白的變體、衍生物、截短體和結(jié)構(gòu)等價(jià)物的組合物。另一些實(shí)施方案提供了在哺乳動(dòng)物中保持預(yù)防癌癥的發(fā)展或癌癥的復(fù)發(fā)的能力的銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物。特定的實(shí)施方案提供了包含銅綠假單胞菌天青蛋白、天青蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物的組合物，和它們用來(lái)治療患者、特別是處于比一般群體高的發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)的患者的用途。本發(fā)明的另一些實(shí)施方案包括直接和/或優(yōu)先滲透癌細(xì)胞的方法。本發(fā)明的又一些實(shí)施方案包括直接和/或優(yōu)先滲透癌細(xì)胞和正常細(xì)胞并在那里具有化學(xué)預(yù)防作用的方法。另一些實(shí)施方案提供了將治療性化合物優(yōu)先遞送到癌細(xì)胞的方法。最后，本發(fā)明提供了通過(guò)在誘導(dǎo)癌前病變之前或之后將細(xì)胞與銅氧還蛋白，或其變體、衍生物、截短體或結(jié)構(gòu)等價(jià)物相接觸，并觀察癌前細(xì)胞和/或癌細(xì)胞的發(fā)展，從而研究哺乳動(dòng)物細(xì)胞、組織和動(dòng)物中癌癥的發(fā)展的方法。又一些其它實(shí)施方案將從本文公開內(nèi)容中變得明顯。優(yōu)先進(jìn)入細(xì)胞先前已知由銅綠假單胞菌加工的氧化還原蛋白，銅氧還蛋白天青蛋白，選擇性地進(jìn)入J774肺癌細(xì)胞而非進(jìn)入正常細(xì)胞中，并誘導(dǎo)凋亡。Zaborina等人，Microbiology 146 2521-2530(2000)。天青蛋白還可選擇性地進(jìn)入并殺死人黑素瘤UIS0_Mel_2細(xì)胞或人乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞。Yamada 等人·，PNAS 99 :14098-14103(2002) ；Punj 等人，Oncogene 23 2367-2378(2004)。來(lái)自銅綠假單胞菌的天青蛋白優(yōu)先進(jìn)入J774小鼠網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤細(xì)胞中，與腫瘤抑制蛋白P53形成復(fù)合物并使其穩(wěn)定，提高了 p53的細(xì)胞內(nèi)濃度，并誘導(dǎo)了凋亡。 Yamada 等人，hfection and Immunity 70 :7054-7062(2002) 對(duì)天青蛋白分子的不同結(jié)構(gòu)域的詳細(xì)研究顯示氨基酸50-77 (p28) (SEQ ID NO :2)代表蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)，其對(duì)于內(nèi)化和隨之的凋亡活性很重要。Yamada等人.，Cell. Microbial. 7 1418-1431 (2005)?，F(xiàn)已知天青蛋白，和來(lái)源于天青蛋白的肽，諸如P^和ρ 18，具有化學(xué)預(yù)防性質(zhì)?，F(xiàn)已知天青蛋白和其衍生物M8在小鼠乳腺器官培養(yǎng)中預(yù)防癌前腫瘤前病變的形成。在小鼠乳腺器官培養(yǎng)模型中，發(fā)現(xiàn)50 μ g/ml的天青蛋白將腺泡病變的形成抑制了 67%。同樣地， 發(fā)現(xiàn)25 μ g/ml的p^將腺泡病變的形成抑制了 67%。參見實(shí)施例1。并且，發(fā)現(xiàn)50 μ g/ ml的天青蛋白將導(dǎo)管病變的形成抑制了 79%，和25 μ g/ml的p^將導(dǎo)管病變的形成抑制了 71%。參見實(shí)施例1。共聚焦顯微術(shù)和FAC顯示了天青蛋白和M8進(jìn)入正常小鼠乳腺上皮細(xì)胞(MM3MG)和乳房癌細(xì)胞GTl)。P^還以溫度、時(shí)間和濃度依賴的方式進(jìn)入了人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)并以劑量依賴的方式抑制了培養(yǎng)在Matrigel 上的HUVEC的毛細(xì)管形成。共聚焦顯微術(shù)和FAC也顯示pl8選擇性地進(jìn)入人類黑素瘤細(xì)胞系(Mel-2、7、29)、 乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7)、卵巢癌細(xì)胞系(SK-0V3)、胰腺癌細(xì)胞系(CAPAN-2)、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系(LN-2^)、星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系(CCF-STTG1)、前列腺癌細(xì)胞系(LN-CAP)和腎癌細(xì)胞系(ACHN-CRL1611)。此外，在具有異種移植的黑素瘤腫瘤的無(wú)胸腺小鼠中，標(biāo)記紅外線染料(Aeffl 800nm)的pl8的成像明顯地表明了原發(fā)皮下腫瘤和遠(yuǎn)位器官轉(zhuǎn)移中的選擇性攝取， 而不在正常器官和組織中累積。因此現(xiàn)已知天青蛋白和天青蛋白的變體可用來(lái)在哺乳動(dòng)物患者中抑制癌前腫瘤前病變的形成，并從而抑制癌癥且尤其是乳腺癌的發(fā)展。標(biāo)準(zhǔn)癌癥治療方法，包括放射療法和化學(xué)療法，涉及損傷癌細(xì)胞的DNA。正常DNA 損傷的細(xì)胞反應(yīng)包括DNA修復(fù)的激活、細(xì)胞周期停滯和致死(Hall，Radiobiology for the Radiologist (用于放射學(xué)家的放射學(xué))，Harper和Row，1988)。例如DNA雙鏈斷裂的誘導(dǎo)導(dǎo)致致死性染色體畸變，包括缺失、雙中心粒、環(huán)和分裂后期橋(Hall，Radiobiology for the Radiologist (用于放射學(xué)家的放射學(xué))，Harper和Row，1994)。由于腫瘤細(xì)胞和多種癌細(xì)胞對(duì)本發(fā)明的肽的選擇性攝取，這些肽，包括一個(gè)實(shí)施方案中的P18，可用作將物質(zhì)導(dǎo)入到腫瘤細(xì)胞和癌細(xì)胞中的非病毒載體。例如，本發(fā)明的肽可用來(lái)將DNA或RNA片段導(dǎo)入到癌細(xì)胞中，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞提供治療性的DNA或RNA片段治療。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)基于其結(jié)構(gòu)特性、陽(yáng)離子殘基或兩親性α-螺旋而分為兩組，但有些同時(shí)屬于兩個(gè)種類。通常，陽(yáng)離子肽通過(guò)與帶負(fù)電的表面糖蛋白結(jié)合而起始與原核物種和真核物種的細(xì)胞膜相互作用，協(xié)助有效進(jìn)入到寬泛范圍的正常細(xì)胞系和惡性腫瘤細(xì)胞系中。Kondejewski，L. H.，等人，J Biol Chem 277 :67-74(2002) ；Fuchs, S. M.和 Raines, R. Τ.，Biochemistry, 43 :2438-2444(2004)。陽(yáng)離子肽與 HS 的結(jié)合與它們對(duì)于 HS 的高度親和性(Kd-109nM)相符，該值遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)以下關(guān)于天青蛋白、pl8和p^的例子中所報(bào)道的。Tran，D.等人，Proc Natl Acad Sci USA 84:7957-7961(1987)。天青蛋白和來(lái)源于其的肽(例如，P^和pl8)具有優(yōu)先進(jìn)入癌細(xì)胞并通過(guò)細(xì)胞抑制機(jī)制和細(xì)胞毒性機(jī)制抑制癌細(xì)胞增殖的獨(dú)特性質(zhì)。氧化還原蛋白通常不歸為細(xì)胞滲透肽(CPP)或抗增殖劑。認(rèn)為天青蛋白、？觀和？18的進(jìn)入與陽(yáng)離子CPP的進(jìn)入不同。兩親性的天青蛋白片段P18和p^含有天青蛋白的第M-67位氨基酸的α -螺旋結(jié)構(gòu)以及部分片層結(jié)構(gòu)。一些細(xì)胞表面受體，包括整合素和粘附蛋白，其上異常的N-糖基化與多種組織發(fā)生的癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的變化相關(guān)，表明仍未知的N糖基化的細(xì)胞表面蛋白在天青蛋白、Ρ18和!^8滲透的起始步驟中具有作用。Partridge，Ε.Α.，等人，Science 306 120-124(2004) Jeales，E. C.，等人，Cancer Res65 :4645-4652(2005) 支持胞吞組分的細(xì)胞滲透的陽(yáng)離子CPP的溫度依賴的進(jìn)入反映在天青蛋白和天青蛋白的第50-77位氨基酸片段(p28)的進(jìn)入上。Yamada, T.，等人，Cell Microbiol 7 1418-1431(2005)。天青蛋白的第50-67位氨基酸(pl8)進(jìn)入正常細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞相對(duì)于P^表現(xiàn)得加速。P18的較低Km和較高Vmax表明天青蛋白的50-67位氨基酸當(dāng)與磷脂膜結(jié)合時(shí)限定了兩親性結(jié)構(gòu)，所述兩親性結(jié)構(gòu)更加貼近地代表了天青蛋白的實(shí)際PTD。然而，能量依賴的胞吞過(guò)程或孔相關(guān)的過(guò)程似乎并不是這些肽唯一可獲得的進(jìn)入方式。例如， 代謝和膜潛在抑制物疊氮化鈉和烏本苷(Na+Κ+ΑΤΡ酶抑制物)，其抑制了陽(yáng)離子肽的進(jìn)入， 并不削弱P18或p^進(jìn)入到UISO-Mel-2細(xì)胞或成纖維細(xì)胞(圖14B、C)，表明每個(gè)肽可直接滲透細(xì)胞膜。與其它陽(yáng)離子肽的細(xì)胞滲透的推測(cè)的途徑(即大胞飲)相比，天青蛋白來(lái)源的肽一般利用不同的滲透途徑，沿肌動(dòng)蛋白纖絲或微管分布至次級(jí)內(nèi)體或溶酶體，并在特定的細(xì)胞周期階段進(jìn)行滲透，這是因?yàn)檫@些途徑中的每一個(gè)的抑制物非常無(wú)效的(圖14B、C)。 Pl8,p28和天青蛋白以描述為不依賴發(fā)動(dòng)蛋白的網(wǎng)格蛋白依賴的載體介導(dǎo)的方式透過(guò)質(zhì)膜并到達(dá)與胞膜窖結(jié)合的次級(jí)內(nèi)體、溶酶體和高爾基體。KirWiam，M.和Part0n，R. G. ,Biochem Biophys Acta 1746 :349-363 ^00 。諾可唑?qū)B透的顯著抑制和破壞肌動(dòng)蛋白絲的細(xì)胞松弛素-D對(duì)抑制的相對(duì)減弱，顯示了胞膜窖介導(dǎo)的進(jìn)入。同前。已關(guān)于整體細(xì)胞表面組分和看似不同的分子描述了這種進(jìn)入方式，所述看似不同的分子即，葡聚糖，和同樣利用胞膜窖來(lái)繞開經(jīng)典胞吞途徑的廣泛的病原體或其產(chǎn)物。利用甲基環(huán)糊精、菲律賓菌素或制霉菌素從質(zhì)膜去除膽固醇以破壞脂筏，其為提供液體平臺(tái)以分離膜組分并將膜區(qū)域化的質(zhì)膜結(jié)構(gòu)域，顯著抑制了 Pl8(50% )和ρ28( 60% )滲透到UISO-Mel-2細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中(分別為35%和42%)，表明？18和!^8通過(guò)胞膜窖滲透到質(zhì)膜中的顯著的百分比( 60%)。胞膜窖是質(zhì)膜的脂筏內(nèi)陷的50至IOOnm的Ω形亞群，由起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)子的作用的窖蛋白特異蛋白(窖蛋白-1、-2或- 所界定。布雷菲德菌素A破壞了高爾基體并抑制了 pl8累積。因此，該通路，和高爾基體也用于P18和p^進(jìn)入和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。pl8和p^通過(guò)胞膜窖進(jìn)行的細(xì)胞滲透與證據(jù)一致 N-糖基化的抑制物在UISO-Mel-2細(xì)胞中使細(xì)胞進(jìn)入減少了 60 %，且在成纖維細(xì)胞中使細(xì)胞進(jìn)入分別減少了 25%和35%。進(jìn)入之間的百分比差異與癌細(xì)胞對(duì)比正常細(xì)胞中的N-糖基化膜結(jié)構(gòu)的數(shù)目相關(guān)，并且!^8和？18的進(jìn)入的相關(guān)途徑經(jīng)由該機(jī)制。圖 14B、C。相對(duì)于許多其它潛在的抗癌肽，天青蛋白、p^和pl8均以高親和性和高容量與癌細(xì)胞結(jié)合。結(jié)合后，該蛋白/受體復(fù)合物定位在胞膜窖中并被內(nèi)化，最終移向(通過(guò)小窩體(caveosome))高爾基體、ER和核。除胞膜窖介導(dǎo)的進(jìn)入外，動(dòng)力學(xué)分析還表明M8和 P18通過(guò)非網(wǎng)格蛋白胞膜窖介導(dǎo)的過(guò)程滲透質(zhì)膜。非網(wǎng)格蛋白依賴的通路和非窖蛋白依賴的通路作為組成型內(nèi)化機(jī)制而存在，比如用于白細(xì)胞介素2受體和用于某些糖基-磷脂酰肌醇(GPI)錨定的蛋白。Lamaze，C，等人，Mol Cell 7 :661-671(2001) ；Sabharanjak, S.，等人，Dev Cell，2 :411-423 0002)。不依賴網(wǎng)格蛋白和窖蛋白的胞吞作用也可被病原體用來(lái)侵入細(xì)胞，對(duì)于鼠多瘤病毒是唯一途徑，或?qū)τ诹鞲胁《镜那闆r與常規(guī)途徑相組合。 Ewers，H.，等人，Proc Natl Acad Sci USA 102 :15110-15115(2005) ；Sieczkarski, S. B.和 ffhittaker, G. R. ,JVirol, 76 =10455-10464(2002)。癌細(xì)胞中窖蛋白_1表達(dá)高于正常細(xì)胞不太可能為天青蛋白、P^和P18優(yōu)先進(jìn)入癌細(xì)胞的唯一依據(jù)。成纖維細(xì)胞和許多其它正常細(xì)胞在其表面也具有大量胞膜窖。 實(shí)施例18- 顯示了 pl8 (天青蛋白的第50-67位氨基酸)和p^ (天青蛋白的第50-77位氨基酸)通過(guò)胞吞介導(dǎo)的途徑、小窩體介導(dǎo)的途徑和不依賴小窩體的途徑優(yōu)先滲透癌細(xì)胞。因?yàn)閷?duì)于癌細(xì)胞的優(yōu)先性，P18和？觀的細(xì)胞滲透與所有目前CPP相比是獨(dú)特的。令人驚奇地，p28 (SEQ ID NOS :35、36和37)的C-末端第10-12位氨基酸包括主要負(fù)責(zé)細(xì)胞周期抑制和凋亡活性/細(xì)胞毒性的結(jié)構(gòu)域。并且，該相同結(jié)構(gòu)域極可能與細(xì)胞膜上的特定殘基接觸，而無(wú)論細(xì)胞狀況如何，并從而協(xié)助進(jìn)入；具體地，天青蛋白的第69、70、 75、76和85位氨基酸提供了對(duì)細(xì)胞膜的接觸。具有相同的氨基酸或相似結(jié)構(gòu)的氨基酸的肽應(yīng)該具有接觸特定細(xì)胞膜殘基并進(jìn)入細(xì)胞的相同或相似能力，所述相似結(jié)構(gòu)的氨基酸位于肽鏈中的相同位置，或肽鏈中與天青蛋白的第69、70、75、76和85位氨基酸的位置相似或等價(jià)的位置。經(jīng)內(nèi)化后，P^通過(guò)細(xì)胞抑制機(jī)制初步抑制癌細(xì)胞增殖。這樣，負(fù)責(zé)天青蛋白優(yōu)先進(jìn)入人類癌細(xì)胞并分別是天青蛋白對(duì)人類癌細(xì)胞的大部分抗增殖活性和細(xì)胞毒性活性的原因。除進(jìn)入癌細(xì)胞之外，如圖16至53所示，ρ 18和!^8能夠進(jìn)入腫瘤和哺乳動(dòng)物器官， 所述腫瘤和哺乳動(dòng)物器官是利用實(shí)施例31中所公開的方法獲得的。令人驚奇地是，pl8和 P^還能夠滲透血腦屏障并進(jìn)入哺乳動(dòng)物腦中，如通過(guò)諸如以下中所證實(shí)的圖20A、20B、 21B、23、24、28、30、31A、32B、33、34B、35A-B、37A-C、38A-C、40A、42A、43A、45A-D、46、47B、 48A-B 和 50。本發(fā)明的肽可用來(lái)將其它分子或化合物，諸如DNA或RNA片段導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中。以下描述了非限制性的示例性技術(shù)和/或可利用本發(fā)明的肽(在一個(gè)實(shí)施方案中為P18)來(lái)導(dǎo)入的特定DNA或RNA片段，所述肽協(xié)助相連接分子進(jìn)入哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞。例如， 可優(yōu)先進(jìn)入細(xì)胞的本發(fā)明的化合物可與基因療法、RNAi方法、造血基因轉(zhuǎn)移、同源重組、核酶技術(shù)、反義技術(shù)、腫瘤免疫療法和腫瘤抑制物、翻譯研究、反基因療法(反義，siRNA &核酶)、凋亡、免疫學(xué)和免疫療法、DNA合成和修復(fù)一起使用?；虔煼ò▽⑼庠椿蜣D(zhuǎn)移到癌細(xì)胞中，例如在適宜于基因表達(dá)的條件下，轉(zhuǎn)移腫瘤抑制物或凋亡誘導(dǎo)物。經(jīng)表達(dá)后，基因產(chǎn)物通過(guò)減緩腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制其轉(zhuǎn)移可能性或?qū)⑵渫耆珰⑺蓝鴮?duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生有利作用。歷史上，癌基因療法的臨床有效性受以下所局限1)缺乏腫瘤中治療性基因表達(dá)的調(diào)控，和幻載體對(duì)腫瘤的選擇性靶向。本發(fā)明的化合物提出了腫瘤細(xì)胞的選擇性靶向。并且，已提出了關(guān)于調(diào)控基因表達(dá)的一些策略。一個(gè)策略是轉(zhuǎn)錄靶向，其中調(diào)控治療基因的啟動(dòng)子通過(guò)腫瘤選擇性轉(zhuǎn)錄因子來(lái)激活。例子包括乳腺癌中MUC-I啟動(dòng)子的使用和結(jié)腸癌中CEA啟動(dòng)子的使用(Kurihara 等人，“Selectivity of a replication-component adenovirus for human breast carcinoma cells expressing the MUCl antigen (用于表達(dá) MUCl 抗原的人類乳腺癌細(xì)胞的復(fù)制組分腺病毒的選擇)，“J Clin. Invest. 106(6) :763-771,2000 ；Konishi ^ 人， “Transcriptionally targeted in vivo gene therapy for carcinoembrionic antigen-producing adenocarcinoma (產(chǎn)生癌胚抗原的腺癌的體內(nèi)基因治療中的轉(zhuǎn)錄靶向)，“J Med. Sci,48(3) :79-89,1999) 反義技術(shù)基于將核酸分子導(dǎo)入到細(xì)胞中，所述核酸分子通常與所選擇的基因表達(dá)的mRNA互補(bǔ)。反義分子通常抑制mRNA分子的翻譯并阻止基因所編碼的多肽的表達(dá)。反義技術(shù)的修改形式可通過(guò)反義分子與基因的DNA結(jié)合而形成三股螺旋從而阻止所選擇基因的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)本發(fā)明可使用的一種特定的反義藥物是G3139(也稱作oblimersen ；由Genta， Inc.，Lexington, MA生產(chǎn))?？墒褂玫牧硪粋€(gè)特定的反義分子是G4460(也稱作c-myb反義，由 Genta, Berkeley Heights, NJ 生產(chǎn))?；赗NA干擾(RNAi)的分子還可與本發(fā)明的肽連接。RNAi通常受雙鏈 RNA( “如1 ^”)、短發(fā)夾1 ^( "shRNA")或其它具有相似特性的核酸分子所調(diào)節(jié)。這些核酸分子由包括切丁酶和Drosha的細(xì)胞酶類所加工或切成較小片段。然后核酸分子的較小片段可被介導(dǎo)mRNA降解的蛋白復(fù)合物(RISC復(fù)合物)所攝取。RISC復(fù)合物將降解與其所攝取的核酸分子的堿基對(duì)互補(bǔ)的mRNA。以這種方式，mRNA被特異性地破壞，從而阻止了所編碼蛋白的生成。核酶技術(shù)基于將核酸分子導(dǎo)入到表達(dá)該核酸分子所結(jié)合的RNA分子的細(xì)胞中，并催化所述靶RNA分子的選擇性裂解。靶RNA分子通常是mRNA分子，但其可以是，例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA分子。由同源重組導(dǎo)致的靶向基因缺失，其需要兩個(gè)基因失活事件(每個(gè)等位基因一個(gè)事件)，這也是可用于本發(fā)明的策略。與本發(fā)明的化合物聯(lián)合施用的特定療法也可針對(duì)調(diào)控對(duì)癌癥發(fā)展具有關(guān)鍵作用的蛋白的表達(dá)的癌癥特異性轉(zhuǎn)錄復(fù)合物(CSTC)。參見，例如，美國(guó)專利申請(qǐng)第 2008/0027002號(hào)，其關(guān)于針對(duì)CSTC的癌癥療法的教導(dǎo)在此通過(guò)引用并入。由于銅氧還蛋白之間的高度結(jié)構(gòu)相似性，可能地是，除天青蛋白之外的銅氧還蛋白和其截短體也能夠通過(guò)非胞吞途徑和胞吞途徑優(yōu)先進(jìn)入癌細(xì)胞，并還能夠在哺乳動(dòng)物中抑制癌前病變的形成。這樣的銅氧還蛋白可發(fā)現(xiàn)于諸如細(xì)菌或植物中。已知一些銅氧還蛋白具有與來(lái)自銅綠假單胞菌的天青蛋白相似的藥物代謝動(dòng)力學(xué)活性。例如，來(lái)自氧化亞鐵硫桿菌(Thiobacillus ferrooxidans)的鐵硫菌藍(lán)蛋白(SEQ ID NO 4)也可進(jìn)入巨噬細(xì)胞并誘導(dǎo)凋亡。Yamada 等人，Cell Cycle 3:1182-1187(2004) ；Yamada 等人，Cell. Micro. 7 1418-1431(2005)。來(lái)自層理席藻(Phormidium laminosum)的質(zhì)體藍(lán)素(SEQ ID NO 3)和來(lái)自裂環(huán)無(wú)色桿菌(Achromobacter cycloclastes)的假天青蛋白(SEQ ID NO 5)也具有針對(duì)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性。美國(guó)專利公開第20060040269號(hào)，于2006年2月23日公布。因此認(rèn)為其它銅氧還蛋白也可用于本發(fā)明的組合物和方法中。并且，保留在哺乳動(dòng)物中抑制癌癥的形成的能力的銅氧還蛋白的變體、衍生物、截短形式和結(jié)構(gòu)等價(jià)物也可用于本發(fā)明的組合物和方法中。這些變體和衍生物可包括，但不局限于本文所公開的銅氧還蛋白的截短體、氨基酸的保守置換形式和蛋白質(zhì)修飾形式，包括但不局限于，聚乙二醇化和α螺旋的全烴化穩(wěn)定。經(jīng)由ρ53的化學(xué)預(yù)防研究了天青蛋白的氨基酸50-77 (p28，SEQ ID NO 2)和ρ53的相互作用并在以下實(shí)施例沈-30中進(jìn)行描述。如本文所公開的，P^滲透人乳腺癌細(xì)胞并由ρ53介導(dǎo)對(duì)人乳腺癌細(xì)胞表現(xiàn)出抗增殖作用，Ρ53是腫瘤抑制子蛋白，其在應(yīng)激時(shí)具有功能活性并觸發(fā)細(xì)胞周期停止或細(xì)胞死亡。利用一系列的GST-pull down分析、甘油梯度離心、微量量熱法實(shí)驗(yàn)、 單分子力光譜分析和計(jì)算機(jī)建模進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)顯示，天青蛋白在P53的N末端或DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域中結(jié)合并提高了其胞內(nèi)水平。本文實(shí)施例26-30和圖M-57所公開的結(jié)果將p28的結(jié)合位點(diǎn)限定到P53的N末端和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，第1-17位、第24-31位、第80-276位或第 297-305位氨基酸中。天青蛋白對(duì)于p53的結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括由天青蛋白Met44和Met64所勾勒出的疏水面，這一推論受到該證據(jù)的支持被破壞的疏水面突變體(突變體天青蛋白M44KM64E)對(duì)人黑素瘤(Mel-2)細(xì)胞的毒性比野生型天青蛋白要小。這顯示了天青蛋白分子的p53結(jié)合結(jié)構(gòu)域包圍著疏水面。一項(xiàng)最近的分子模擬研究顯示了相對(duì)于野生型天青蛋白，突變體復(fù)合物的相互作用自由能的 75kJ/mol的顯著減少，再次表明包圍殘基Met44和Met64的天青蛋白的疏水面對(duì)于與P53的相互作用是重要的。因?yàn)镸et64殘基在p28的p53結(jié)合位點(diǎn)內(nèi) (P^的第15位氨基酸)，競(jìng)爭(zhēng)分析、突變體研究和對(duì)接實(shí)驗(yàn)明顯顯示了其為天青蛋白與p53 結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。腫瘤抑制蛋白p53是重要的核蛋白，其為包括21kDa蛋白p21/Waf 1/Cipl的許多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子和細(xì)胞周期進(jìn)程的抑制子。利用P^處理MCF-7細(xì)胞提高了 P53的水平，導(dǎo)致了 P21的較高的胞內(nèi)水平，p21是細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDK)活性(尤其是分別在&期和(；2/^期調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程的cdc2和CDI^)的強(qiáng)抑制子。在通過(guò)&/M期的進(jìn)程中，cdc2和CDK2激酶主要分別在與細(xì)胞周期蛋白B和細(xì)胞周期蛋白A的結(jié)合中被激活。 在&/M期停滯的細(xì)胞中，CDK抑制子p21與細(xì)胞周期蛋白A有效結(jié)合，雖然在同樣條件下， 細(xì)胞周期蛋白Bl不與p21結(jié)合，并且細(xì)胞周期蛋白Bl的水平繼續(xù)增高。這顯示了 p^在 MCF-7細(xì)胞中誘導(dǎo)的&/M停滯與CDK2和細(xì)胞周期蛋白A的抑制相關(guān)(圖57A)。MCF-7細(xì)胞中p^誘導(dǎo)的p21的增高還伴隨著p27的時(shí)間依賴性增高，p27是Cip/ Kip⑶KI家族的另一成員。Hsu等人，2008最近證實(shí)根據(jù)由熒光素酶分析所測(cè)定的，對(duì)p53 的誘導(dǎo)提高了 p21 和 p27 啟動(dòng)子活性。Cellular and Molecular Life Sciences (CMLS)， 2008。此外，p21啟動(dòng)子和p27啟動(dòng)子的p53DNA結(jié)合活性由p53誘導(dǎo)子，孕酮所激活，這意味著不僅P21受p53的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，p27也受到p53的轉(zhuǎn)錄調(diào)控?？傊?，數(shù)據(jù)顯示了 P^使 P53水平的增高隨之上調(diào)了 p21和p27，包括在MCF-7細(xì)胞中誘導(dǎo)了胞內(nèi)⑶K2水平和細(xì)胞周期蛋白A水平的顯著降低并在&/M期抑制了細(xì)胞周期(圖57A)。已報(bào)道的細(xì)胞周期蛋白Bl和p21之間無(wú)結(jié)合或無(wú)效結(jié)合，表明暴露于P^后細(xì)胞周期蛋白B/cdc2活性的增高可能反映了遵循M8誘導(dǎo)的P21的增加的相似模式。暴露于M8后磷酸化的cdc2(失活形式)的增加伴隨細(xì)胞周期蛋白Bl的增高的細(xì)胞水平，表明cdc2-細(xì)胞周期蛋白B復(fù)合物的增加通過(guò)cdc2磷酸化的增高來(lái)體現(xiàn)。諾可唑在MCF-7和MDA-MB-468人乳腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)了相似的&停滯，伴隨高水平的胞質(zhì)細(xì)胞周期蛋白Bi，諾可唑是已知的微管破壞劑，和p21 的轉(zhuǎn)錄和翻譯激活劑。分化劑諸如全反式視黃酸(ATRA)和丁酸鈉(SB)在口腔鱗狀癌細(xì)胞中產(chǎn)生了相似的生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象和G1停滯，其與G1期細(xì)胞周期調(diào)控蛋白⑶K6、p21和p27的誘導(dǎo)，和&期細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CDK2的抑制相關(guān)。由于M8在MDD2細(xì)胞中沒有使p21增高，且P27在這些細(xì)胞中表現(xiàn)為不存在，⑶K2和細(xì)胞周期蛋白A的水平?jīng)]有顯著改變(圖 57B)且沒有發(fā)生細(xì)胞周期抑制。關(guān)于P^誘導(dǎo)CDK2和細(xì)胞周期蛋白A復(fù)合物(人類細(xì)胞中cdc2活性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物)降低而導(dǎo)致G1和&/M停滯的其它證據(jù)發(fā)現(xiàn)于對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期蛋白A RNAi引入后的( 延遲中，該引入使CDK2-細(xì)胞周期蛋白A復(fù)合物失活而導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在&/M。雖然Cip/Kip家族蛋白諸如p21和p27是細(xì)胞周期蛋白A依賴的⑶K2的有效抑制物，但它們還可作為細(xì)胞周期蛋白D依賴性激酶的陽(yáng)性調(diào)節(jié)物來(lái)行使作用。Cip/Kip家族蛋白能夠穩(wěn)定⑶K4和⑶K6。⑶K4在多種腫瘤中擴(kuò)增和過(guò)表達(dá)，所述腫瘤包括乳腺癌、膠質(zhì)瘤、肉瘤和子宮頸癌，而⑶K6基因在某些類型的惡性腫瘤中擴(kuò)增，包括鱗狀細(xì)胞癌、膠質(zhì)瘤和淋巴瘤。雖然CDK6的起始水平或?qū)φ账降陀贑DK4，但在暴露于p28的MCF-7細(xì)胞中⑶K6的水平是持續(xù)增高的，而⑶K4并非如此。而且，響應(yīng)于p28時(shí)，MDD2細(xì)胞中的⑶K4 和CDK6沒有改變，其中p53和p21沒有增高(圖57B)。Ink4組，CDKI的pl6Ink4a、pl5Ink4b、 PlS1nk4c和pl9Ink4d與在G1調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程的⑶K4和⑶K6特異性結(jié)合并將其抑制。因?yàn)?pl6Ink4a基因在MCF-7細(xì)胞中為純合缺失，⑶KI蛋白應(yīng)對(duì)⑶K6表現(xiàn)出與對(duì)⑶K4相比較小的抑制作用，這為CDK6中所觀察到的在CDK4水平基本上穩(wěn)定的情況下CDK6的增加提供了合理解釋。總體而言，這些結(jié)果表明了 p^結(jié)合p53，提高了 p53的水平，隨之通過(guò)p21和p27 失活CDK2-細(xì)胞周期蛋白A復(fù)合物增強(qiáng)了抗增殖活性，導(dǎo)致體外MCF-7乳腺癌細(xì)胞中的( /M細(xì)胞周期停滯，并在無(wú)胸腺小鼠中抑制了 MCF-7異種移植物的生長(zhǎng)。本發(fā)明的組合物在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、組織和動(dòng)物中抑制癌前病變的發(fā)展的銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、截短體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的肽。在另一些方面，本發(fā)明還提供了為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、組織和動(dòng)物中抑制癌癥的發(fā)展的銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、截短體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的肽。在一些實(shí)施方案中，肽包含p28(SEQ ID NO 2)的 C-末端，比如 SEQ ID NO 35、SEQ ID NO 36 或 SEQ ID NO :37。在另一些實(shí)施方案中，肽在與天青蛋白的位置相同或相似的位置中包含位于SEQ ID而1的第69、70、 75,76和85位的氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)。本發(fā)明的一些實(shí)施方案還提供了為優(yōu)先進(jìn)入癌細(xì)胞的銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、截短體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的肽。在另一些方面，本發(fā)明提供了為通過(guò)胞吞途徑優(yōu)先進(jìn)入細(xì)胞并在那里具有化學(xué)預(yù)防作用的銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、截短體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的肽，所述胞吞途徑包括胞膜窖介導(dǎo)的途徑和高爾基體介導(dǎo)的途徑。在另一些實(shí)施方案中，肽包含P28的C-末端或由p^的C-末端組成，諸如SEQ IDN0. 35、SEQ ID NO. 36或SEQ ID NO. 37。在另一些實(shí)施方案中，肽在與天青蛋白的位置相同或相似的位置中包含位于SEQ ID N0:1的第69、70、75、76和85位的氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)。在另一些實(shí)施方案中，肽在與天青蛋白的位置相同或相似的位置中包含位于SEQ ID N0:1的第 69、70、75、76和85位的氨基酸。在一些實(shí)施方案中，肽是分離的。在一些實(shí)施方案中，肽是基本上純的或藥物級(jí)的。在另一些實(shí)施方案中，肽在包含所述肽或基本上由所述肽組成的組合物中。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，肽是非抗原性的并且在哺乳動(dòng)物中，且更具體地在人中，不引起免疫反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，肽小于全長(zhǎng)銅氧還蛋白，且保留了銅氧還蛋白的一些藥理學(xué)活性。 具體地，在一些實(shí)施方案中，肽可能保留了在小鼠乳腺器官培養(yǎng)中抑制癌前病變的發(fā)展的能力。在另一些實(shí)施方案中，肽保留了通過(guò)諸如胞膜窖介導(dǎo)的胞吞作用直接和優(yōu)先進(jìn)入細(xì)胞的能力。在另一些實(shí)施方案中，肽保留了直接和優(yōu)先進(jìn)入細(xì)胞并在那里具有化學(xué)預(yù)防作用的能力。在其它方面，本發(fā)明還提供了包含為能夠優(yōu)先進(jìn)入癌細(xì)胞的銅氧還蛋白，或銅氧還蛋白的變體、衍生物、截短體或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的至少一種肽的組合物，具體地在藥物組合物中。在具體的實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)所述藥物組合物以用于特定的施用模式，例如但不局限于， 口服施用、腹膜內(nèi)施用或靜脈施用。這樣的組合物可在水中水合，或可被干燥(例如通過(guò)凍干)以用于以后的水合。這樣的組合物可以在除水以外的溶劑中，例如但不局限于，乙醇。本發(fā)明的某些實(shí)施方案還提供了包含肽的組合物，所述肽為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、組織和動(dòng)物中優(yōu)先進(jìn)入癌細(xì)胞和/或腫瘤的銅氧還蛋白的變體、衍生物、截短體或結(jié)構(gòu)等價(jià)物。在一些實(shí)施方案中，肽是P28的C-末端，比如SEQ ID NO. 35或SEQ ID NO. 36。在一些實(shí)施方案中，肽是具有SEQ IDN0. 25的pl8。在一些實(shí)施方案中，肽是pl8的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物。在一些實(shí)施方案中，組合物是與DNA或RNA偶聯(lián)的pl8。在一些實(shí)施方案中，DNA或RNA是基因或基因的部分。在一些實(shí)施方案中，DNA或RNA經(jīng)遞送后具有治療性作用。在一些實(shí)施方案中，肽是具有SEQ IDN0.2的p28。在一些實(shí)施方案中，肽是M8的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物。在一些實(shí)施方案中，組合物是與DNA或RNA偶聯(lián)的p28。在一些實(shí)施方案中，DNA或RNA是基因或基因的部分。在一些實(shí)施方案中，DNA或RNA經(jīng)遞送后具有治療性作用。由于銅氧還蛋白之間的高度結(jié)構(gòu)同源性，考慮了銅氧還蛋白將具有與天青蛋白和 P^相同的化學(xué)預(yù)防性質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白是，但不局限于，天青蛋白、假天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素、鐵硫菌藍(lán)蛋白、橙綠屈撓素、漆樹藍(lán)蛋白、黃瓜堿性蛋白或Laz。在具體的特定的實(shí)施方案中，天青蛋白來(lái)源于銅綠假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、木糖氧化無(wú)色桿菌反硝化亞種I、支氣管炎博德特菌、甲基單胞菌、腦膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、熒光假單胞菌、綠針假單胞菌、苛養(yǎng)木桿菌、百日咳石莼菌(Ulva pertussis)和副溶血性弧菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，天青蛋白來(lái)自銅綠假單胞菌。在另一些具體的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白包含SEQ ID NO :1、3-19的氨基酸序列。本發(fā)明的方面包括為氨基酸序列變體的肽，其與野生型銅氧還蛋白相比具有氨基酸替代、缺失或插入。本發(fā)明的變體可以是野生型銅氧還蛋白的截短體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽包含小于全長(zhǎng)野生型多肽的銅氧還蛋白的區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽包含截短的銅氧還蛋白的約10個(gè)以上的殘基、約15個(gè)以上的殘基或約20個(gè)以上的殘基。在一些實(shí)施方案中，肽包含截短的銅氧還蛋白的不超過(guò)約100個(gè)殘基、不超過(guò)約50個(gè)殘基、不超過(guò)約40個(gè)殘基、不超過(guò)約30個(gè)殘基或不超過(guò)約20個(gè)殘基。在一些實(shí)施方案中， 銅氧還蛋白與肽，且更具體地為SEQ ID N0:l、3-19與本發(fā)明的肽具有至少約70%的氨基酸序列同一性、至少約80%的氨基酸序列同一性、至少約90%的氨基酸序列同一性、至少約95%的氨基酸序列同一性或至少約99%的氨基酸序列同一性。在具體的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白的變體包含銅綠假單胞菌天青蛋白殘基 50-77 (p28，SEQ ID NO :2)、天青蛋白殘基 50-67 (pl8，SEQ IDNO :2 或天青蛋白殘基 36-88 (SEQ ID NO :26)。在另一些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白的變體由銅綠假單胞菌天青蛋白殘基50-77(SEQ ID NO :2)、天青蛋白殘基50-67 (SEQ ID NO 25)或天青蛋白殘基 36-88 (SEQ ID NO 26)組成。在另一些具體的實(shí)施方案中，變體由天青蛋白以外的銅氧還蛋白的等價(jià)殘基組成。還考慮了可設(shè)計(jì)其它銅氧還蛋白變體，其具有與天青蛋白殘基 50-77 (SEQ ID NO 2)或天青蛋白殘基36-88 (SEQ ID NO 26)相似的藥理學(xué)活性。為實(shí)現(xiàn)此目的，利用BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign (DNASTAR)將目標(biāo)銅氧還蛋白氨基酸序列與銅綠假單胞菌天青蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，相關(guān)殘基位于銅綠假單胞菌天青蛋白氨基酸序列上，在目標(biāo)銅氧還蛋白序列上尋找等價(jià)殘基，從而設(shè)計(jì)等價(jià)肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白變體包含橙色綠屈撓菌的橙綠屈撓素的至少第57-89位氨基酸(SEQ ID NO :20)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白變體包含銅綠假單胞菌天青蛋白的至少第50-67位氨基酸(SED ID NO 25)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白變體包含丁香假單胞菌O^seudomonas syringae)天青蛋白的至少第51-77 位氨基酸(SEQ ID N0:21)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白變體包含腦膜炎奈瑟球菌天青蛋白的至少第89-115位氨基酸(SEQ ID NO :22)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白變體包含副溶血性弧菌天青蛋白的至少第52-78位氨基酸(SEQ ID NO 23)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白變體包含支氣管炎博德特菌天青蛋白的至少第51-77位氨基酸(SEQ ID NO 24)。變體還可包括由合成的而非天然存在的氨基酸形成的肽。例如，可將非天然存在的氨基酸整合到該變體肽中以延長(zhǎng)或優(yōu)化組合物在血流中的半衰期。這樣的變體包括，但不局限于D、L-肽類(非對(duì)映異構(gòu)體)(例如Futaki等人，J.Biol. Chem. 276(8) 5836-40(2001) ；Papo 等人，Cancer Res. 64(16) :5779-86(2004) ；Miller 等人， Biochem. Pharmacol. 36(1) 169-76，(1987).；含有非天然氨基酸的肽類(例如 Lee 等人，J. Pept. Res. 63(2) :69-84^)04))，接有烴類環(huán)鉤的含烯烴的非天然氨基酸(例如 khafmeister 等人，J. Am. Chem. Soc. 122 :5891-5892(2000) ；Walenski 等人，Science305 1466-1470(2004)),以及包含ε -(3,5- 二硝基苯甲?；?-Lys殘基的肽。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽是銅氧還蛋白的衍生物。銅氧還蛋白的衍生物是化學(xué)修飾的肽，從而肽仍保留其某些基本活性。例如，天青蛋白的“衍生物”可以是化學(xué)修飾的天青蛋白，其保留了通過(guò)胞吞途徑或非胞吞途徑優(yōu)先進(jìn)入癌細(xì)胞的能力，以及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、組織或動(dòng)物中抑制癌前病變發(fā)展的能力。感興趣的化學(xué)修飾包括但不局限于， 肽的烴穩(wěn)定、酰胺化、乙?；⒘蛩峄?、聚乙二醇(PEG)修飾、磷酸化和糖基化，以及本文所公開的其它方法。此外，衍生的肽可以是銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物與化學(xué)化合物的融合物，所述化合物例如但不局限于，另一肽、藥物分子或其它治療劑或藥劑或可檢測(cè)的探針。感興趣的衍生物包括例如通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的一些方法進(jìn)行化學(xué)修飾，通過(guò)實(shí)施修飾本發(fā)明的肽和組合物在血流中的半衰期可以被延長(zhǎng)或優(yōu)化，所述方法包括但不局限于環(huán)化肽(例如Monk等人，BioDrugs 19(4) =261-78, (2005) ；DeFreest等人，J. Pept. Res. 63 (5) :409-19 (2004))、N-末端和 C-末端修飾(例如 Labrie 等人，Clin. Invest. Med. 13(5) :275-8, (1990))、和接有烴類環(huán)鉤的含烯烴的非天然氨基酸(例如 Schafmeister 等人，J. Am. Chem. Soc. 122 :5891-5892 (2000) ；Walenski 等人，Science 305 1466-1470(2004))ο在一些實(shí)施方案中，可利用方法對(duì)銅氧還蛋白進(jìn)行改變，所述方法包括但不局限于，降低肽的水解的方法、降低肽的脫酰胺作用的方法、降低氧化的方法、降低肽的免疫原性和/或提高肽的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的方法。在一些實(shí)施方案中，可利用增強(qiáng)銅氧還蛋白優(yōu)先進(jìn)入癌細(xì)胞和/或在那里產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用的方法來(lái)對(duì)銅氧還蛋白進(jìn)行修飾。認(rèn)為本文所描述的兩種或多種修飾可在一種被修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽中進(jìn)行組合，以及為提高藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)而將本文所描述的一種或多種修飾與其它修飾進(jìn)行組合是本領(lǐng)域中的技術(shù)人員所熟知的。設(shè)計(jì)這樣的變體和衍生物的許多方法是本領(lǐng)域中所熟知的。生物轉(zhuǎn)化提高肽的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的一種方法是構(gòu)建對(duì)生物轉(zhuǎn)化較不敏感的銅氧還蛋白來(lái)源的肽的變體和衍生物。生物轉(zhuǎn)化可能降低肽的藥理活性并提高其從患者體內(nèi)消除的速率。實(shí)現(xiàn)該目的的一個(gè)途徑是測(cè)定最可能被生物轉(zhuǎn)化的氨基酸和/或氨基酸序列，并將這些氨基酸用對(duì)該特定轉(zhuǎn)化過(guò)程不敏感的氨基酸來(lái)替代。在一些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽可包括非天然氨基酸或修飾的氨基酸。 在一些實(shí)施方案中，某些非天然氨基酸的導(dǎo)入增強(qiáng)了銅氧還蛋白來(lái)源的肽的藥物代謝動(dòng)力學(xué)活性。這樣的導(dǎo)入可以是位點(diǎn)特異性的并且可進(jìn)行這樣的導(dǎo)入以避免體內(nèi)的一些生物化學(xué)修飾。示例性的非天然氨基酸包括b-氨基酸(例如，b3和1^2)、同源氨基酸、環(huán)狀氨基酸、 芳香族氨基酸、脯氨酸和焦谷氨酸衍生物、3-取代的丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、環(huán)取代的苯丙氨酸和酪氨酸衍生物、線性核心氨基酸和二氨基酸?？赏ㄟ^(guò)定點(diǎn)修飾、核糖體翻譯、或通過(guò)肽的化學(xué)合成將這樣的非天然氨基酸整合到肽中。這些方法中的每一種均可用于合成銅氧還蛋白來(lái)源的肽。例如，修飾的來(lái)源于銅氧還蛋白的肽可通過(guò)使用具有非天然氨基酸結(jié)構(gòu)的野生型氨酰基tRNA合成酶(AARQ來(lái)合成以用于產(chǎn)生非天然銅氧還蛋白變體。參見， Hartman,等人，PLoS One, 2 (10) :e972(2007) ；Miranda,等 A, J. Am. Chem. Soc. 129 13153-13159(2007)。核糖體翻譯機(jī)器的特異性限制了利用核糖體翻譯可整合到肽中的非天然氨基酸的多樣性。已報(bào)道作為AARS底物的90種以上的非天然結(jié)構(gòu)單元包括側(cè)鏈和骨架類似物。Hartman，等人，PLoS One, 2 (10) :e972(2007)?？衫萌阜g系統(tǒng)高效地將 50種以上的非天然氨基酸整合到肽中，所述肽含有達(dá)13種不同的非天然氨基酸。Hartman， 等人，PLoS One, 2 (10) :e972(2007)。在一些實(shí)施方案中，可將這樣的氨基酸整合到銅氧還蛋白來(lái)源的肽中?；瘜W(xué)修飾銅氧還蛋白或細(xì)胞色素c551或其變體、衍生物、截短體或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的一種方法可遵循設(shè)計(jì)抗HIV小蛋白——具有提高的藥學(xué)性質(zhì)的CCL-5(RANTEQ所采取的步驟，該方法通過(guò)，例如，疏水性N-末端修飾、總蛋白-聚合物軛合化學(xué)物質(zhì)合成、編碼的和非編碼的氨基酸誘變、肽骨架工程和位點(diǎn)特異性聚合物連接來(lái)進(jìn)行?？笻IV蛋白可通過(guò)在不同的連接位置將天然和非天然氨基酸殘基整合到含有CCL-5類似物的聚合物替代物中來(lái)設(shè)計(jì)。研究表明聚合物修飾的CCL-5衍生物的體外抗HIV活性與CCR-5信號(hào)傳遞相關(guān)聯(lián)，因此對(duì)肽的改變應(yīng)該不會(huì)破壞CCR-5活性。Miranda，等人，J. Am. Chem. Soc. 129 13153-13159(2007)，其公開內(nèi)容在此以其整體通過(guò)引用并入。其它修飾可包括利用旋光性的α -氨基酸。旋光性的α _氨基酸及其衍生物在藥物、農(nóng)業(yè)化學(xué)品和作為手性配體中的用途正在擴(kuò)展。尤其是，手性甘氨酸和丙氨酸等價(jià)物具有重要作用。已提出了用于構(gòu)建α-氨基酸的至少一種立體選擇性策略，在預(yù)定的立體 it^^r^-M^Mt α-MSSIo Lu, ^A "Asymmetric Synthesis of α -amino acids Preparation and alkylation of monocyclic iminolactones derived from α -Methyl trans-cirmamaldehydda -氨基酸的不對(duì)稱合成來(lái)源于a -甲基反式肉桂醛的單環(huán)亞胺內(nèi)酯的制備和烷基化)”于2008年9月11日在網(wǎng)上出版(在J. Org. Chem.中待出版)，其公開內(nèi)容在此通過(guò)引用并入。修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽可利用旋光性的α-氨基酸來(lái)合成以產(chǎn)生富含對(duì)映體的重復(fù)。在含天冬氨酸的肽中水解常為一個(gè)問(wèn)題。天冬氨酸易于脫水而形成環(huán)狀亞胺中間物，導(dǎo)致天冬氨酸轉(zhuǎn)化成可能失活的異天冬氨酸類似物，并最終裂解肽鏈。例如，在肽序列中存在天冬氨酸-脯氨酸的情況下，環(huán)狀亞胺中間物的酸催化的形式可能導(dǎo)致肽鏈裂解。 類似地，在肽序列中存在天冬氨酸-甘氨酸的情況下，環(huán)狀中間物可被水解為原始天冬氨酸形式(無(wú)害的)或異天冬氨酸類似物。最終，所有的天冬氨酸形式可完全轉(zhuǎn)化為異天冬氨酸類似物。具有絲氨酸的相似的序列也可被水解以形成能夠裂解肽鏈的環(huán)狀亞胺中間物。 肽的裂解可導(dǎo)致降低的血漿半衰期以及降低的肽的特定藥理活性?？紤]到在銅氧還蛋白來(lái)源的肽中用其它氨基酸取代天冬酰胺和/或絲氨酸可能導(dǎo)致具有改善的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)(比如肽的較長(zhǎng)的血漿半衰期和提高的藥理活性的特異活性)的肽。在一個(gè)所考慮的變體中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽的一個(gè)或多個(gè)天冬酰胺殘基可被另一氨基酸殘基所替代，且具體地為被谷氨酸殘基所替代。在另一個(gè)所考慮的變體中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽的一個(gè)或多個(gè)絲氨酸殘基可被另一氨基酸殘基所替代，且具體地為被蘇氨酸殘基所替代。在銅氧還蛋白來(lái)源的肽的一些變體中，一個(gè)或多個(gè)天冬酰胺殘基和一個(gè)或多個(gè)絲氨酸殘基是取代的。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行了保守性替代。在另外的實(shí)施方案中，進(jìn)行了非保守性替代。生物轉(zhuǎn)化中的氨基酸殘基的脫酰胺作用是一個(gè)特殊問(wèn)題。這種堿催化的反應(yīng)通常發(fā)生在含天冬酰胺-甘氨酸或谷氨酰胺-甘氨酸的序列中，并遵循與以上的天冬氨酸-甘氨酸序列類似的機(jī)制。天冬酰胺-甘氨酸序列的脫酰胺作用形成了環(huán)狀亞胺中間物，所述環(huán)狀亞胺中間物隨后水解形成天冬氨酸或天冬酰胺的異天冬氨酸類似物。此外，環(huán)狀亞胺中間物可導(dǎo)致D-天冬氨酸或天冬酰胺的D-異天冬氨酸類似物的外消旋作用，所有這些均可能導(dǎo)致肽的失活形式?？紤]了銅氧還蛋白肽中的脫酰胺作用可通過(guò)利用另一種氨基酸來(lái)替代銅氧還蛋白的天冬酰胺-甘氨酸或谷氨酰胺-甘氨酸序列的甘氨酸、天冬酰胺和/或谷氨酰胺來(lái)阻止，并可能導(dǎo)致具有改良的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)(比如肽的較長(zhǎng)的血漿半衰期和提高的藥理活性的特異活性)的肽。在一些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽的一個(gè)或多個(gè)甘氨酸殘基被另一氨基酸殘基所替代。在具體的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽的一個(gè)或多個(gè)甘氨酸殘基被蘇氨酸或丙氨酸殘基所替代。在一些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽的一個(gè)或多個(gè)天冬酰胺或谷氨酰胺殘基被另一氨基酸殘基所替代。在具體的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽的一個(gè)或多個(gè)天冬酰胺或谷氨酰胺殘基被丙氨酸殘基所替代。在另外的具體的實(shí)施方案中，銅綠假單胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)的殘基58和/或63處的甘氨酸， 或其它銅氧還蛋白的等價(jià)甘氨酸，被丙氨酸或蘇氨酸所替代。在另外的具體的實(shí)施方案中， 銅綠假單胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)的殘基59處的甲硫氨酸，或另一個(gè)銅氧還蛋白來(lái)源的肽的等價(jià)的甲硫氨酸殘基，被丙氨酸殘基所替代。在其它的具體的實(shí)施方案中，銅綠假單胞菌天青蛋白(SEQ IDNO=I)殘基63處的甘氨酸，或另一個(gè)銅氧還蛋白來(lái)源的肽的等價(jià)甘氨酸殘基，被蘇氨酸殘基所替代。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行了保守性替代。在另外的實(shí)施方案中，進(jìn)行了非保守性替代。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽包含以下序列，其中下劃線的氨基酸被置換到野生型銅綠假單胞菌P^序列中LSTAADMQAVVTDTMASGLDKDYLKPDD(SEQ ID NO 38)氨基酸的可逆氧化和不可逆氧化是另外的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程，其也可產(chǎn)生可能降低藥理活性、和/或銅氧還蛋白來(lái)源的肽的血漿半衰期的問(wèn)題。半胱氨酸和甲硫氨酸殘基是經(jīng)歷可逆氧化的主要?dú)埢?。在較高PH下加速了半胱氨酸的氧化，其中的硫醇更易于去質(zhì)子化并易于形成鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵。這些二硫鍵通過(guò)利用二硫蘇糖醇(DTT)或三(2-羧乙基膦)鹽酸鹽(TCEP)來(lái)處理可易于在體外逆轉(zhuǎn)。甲硫氨酸通過(guò)化學(xué)途徑或光化學(xué)途徑氧化而形成甲硫氨酸亞砜并進(jìn)而形成甲硫氨酸砜，二者均幾乎不可能逆轉(zhuǎn)。考慮了銅氧還蛋白來(lái)源的肽中的氧化可通過(guò)用其它殘基替代甲硫氨酸和/或半胱氨酸殘基來(lái)防止。在一些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽中的一個(gè)或多個(gè)甲硫氨酸和/ 或半胱氨酸殘基被另一氨基酸殘基所替代。在具體的實(shí)施方案中，甲硫氨酸殘基被亮氨酸或纈氨酸殘基所替代。在其它的具體的實(shí)施方案中，銅綠假單胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)的殘基56和64處的一個(gè)或多個(gè)甲硫氨酸，或其它的銅氧還蛋白來(lái)源的肽中的等價(jià)的甲硫氨酸殘基，被亮氨酸或纈氨酸所替代。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行了保守性替代。在另外的實(shí)施方案中，進(jìn)行了非保守性替代。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的銅氧還蛋白肽包含以下序列其中之一，其中下劃線的氨基酸被置換到野生型銅綠假單胞菌P^序列中LSTAADLQGVVTDGLASGLDKDYLKPDD(SEQ ID NO :39)或LSTAADVQGVVTDGVASGLDKDYLKPDD(SEQ ID NO :40).可能影響銅氧還蛋白來(lái)源的肽的藥理活性、(諸如優(yōu)先進(jìn)入細(xì)胞的能力)，血漿半衰期和/或免疫原性的另一生物轉(zhuǎn)化過(guò)程是二酮哌嗪和焦谷氨酸形成。當(dāng)甘氨酸在自N-末端的第三位時(shí)，且更特別地當(dāng)脯氨酸或甘氨酸在第1位或第2位時(shí)，通常發(fā)生二酮哌嗪形成。該反應(yīng)涉及第二和第三氨基酸之間的酰胺羰基上的N-末端氮的親核攻擊，其導(dǎo)致前兩個(gè)氨基酸裂解形成二酮哌嗪。另一方面，如果谷氨酰胺在N-末端時(shí)，焦谷氨酸形成可能是幾乎不可避免的。這是類似的反應(yīng)，其中N末端氮攻擊谷氨酰胺的側(cè)鏈羰基碳而形成脫酰胺的焦谷氨酰肽類似物。該轉(zhuǎn)化還發(fā)生于N-末端含天冬酰胺的肽中，但程度小得多。考慮了通過(guò)利用另一氨基酸殘基來(lái)替代銅氧還蛋白來(lái)源的肽中的來(lái)自N-末端的第1位、第2位或第3位中的甘氨酸、來(lái)自N-末端的第3位中的脯氨酸或肽的N-末端的天冬酰胺而減少二酮哌嗪和焦谷氨酸形成。在一些實(shí)施方案中，來(lái)自銅氧還蛋白來(lái)源的肽的 N-末端的第1位、第2位或第3位中的甘氨酸被另一氨基酸殘基所替代。在特定的實(shí)施方案中，甘氨酸殘基被蘇氨酸或丙氨酸殘基所替代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自銅氧還蛋白來(lái)源的肽的N-末端的第3位上的脯氨酸被另一氨基酸殘基所替代。在特定的實(shí)施方案中，脯氨酸被丙氨酸殘基所替代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，N-末端的天冬酰胺被另一氨基酸殘基所替代。在特定的實(shí)施方案中，天冬酰胺殘基被谷氨酰胺殘基所替代。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行了保守性替代。在另外的實(shí)施方案中，進(jìn)行了非保守性替代?？赡苡绊戙~氧還蛋白來(lái)源的肽的藥理活性、血漿半衰期和/或免疫原性的另一生物轉(zhuǎn)化過(guò)程是外消旋作用。該術(shù)語(yǔ)不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)赜糜谥赴被峄螂牡氖中酝暾缘恼w丟失。 外消旋作用涉及氨基酸的一個(gè)對(duì)映體(通常是L-形式)堿催化的轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-對(duì)映體和D-對(duì)映體的1 1混合物。通常一個(gè)提高肽的穩(wěn)定性的途徑是通過(guò)生成逆反(D-異構(gòu)體)肽。肽結(jié)構(gòu)的雙翻轉(zhuǎn)通常使側(cè)鏈的表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)保持完整并被廣泛用于穩(wěn)定生物活性肽。Snyder 等人，PLoS Biol. 2 =0186-0193(2004)。D-氨基酸取代的Tat如同L-氨基酸一樣被內(nèi)化到細(xì)胞中。Futaki 等人，J. Biol. Chem. 276 :5836-5840 (2001) ；Huq 等人，Biochemistry 38: 5172-5177(1999)。在一些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被該氨基酸殘基的D-異構(gòu)體所替代。在另外的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽的所有氨基酸殘基均被這些殘基的D-異構(gòu)體所替代。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽是銅氧還蛋白來(lái)源的肽的逆反(D-異構(gòu)體)形式。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽是DDPKLYDKDLGSAMGDTWGQMDAATSL (SEQ ID NO 41)保護(hù)銅氧還蛋白來(lái)源的肽不受生物轉(zhuǎn)化降解的其它方法為N-乙?；虲-酰胺化。這些衍生物可保護(hù)肽不被降解并可使銅氧還蛋白來(lái)源的肽更精確地模仿天然蛋白中的 α氨基和羧基的荷電狀態(tài)。具有N-乙酰化和/或C-酰胺化的肽可通過(guò)商業(yè)供應(yīng)商來(lái)提供。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽的N-末端可以被乙酰化。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽的C-末端可以被酰胺化。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽是
乙?；?LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD-酰胺化(SEQ ID NO 42)。環(huán)化是生物轉(zhuǎn)化的另一方式，其對(duì)包括本文所描述的銅氧還蛋白的治療性肽可能是有益的。環(huán)化可穩(wěn)定治療性肽，使其貯存更長(zhǎng)時(shí)間，以更低劑量來(lái)施用和較小頻率來(lái)施用。已證明環(huán)化保護(hù)肽不受肽酶和蛋白酶降解?？捎没瘜W(xué)方法或酶促方法來(lái)進(jìn)行環(huán)化。一般酶促環(huán)化比化學(xué)環(huán)化問(wèn)題較少，因?yàn)榛瘜W(xué)環(huán)化可能缺少區(qū)域和立體專一性，可能導(dǎo)致多聚化而非環(huán)化，并可能需要復(fù)雜的多步驟過(guò)程。事實(shí)上，已顯示對(duì)于蛋白水解酶硫醚環(huán)化比二硫鍵更具保護(hù)性且更穩(wěn)定。在含羊毛硫抗生素_(甲基)羊毛硫氨酸的細(xì)菌肽中已展示了酶促環(huán)化。E.g.， R. Rink,等人·，“Lantibiotic Structures as Guidelines for the Design of Peptides That Can Be Modified by Lantibioitic Enzymes (羊毛硫抗生素結(jié)構(gòu)作為設(shè)計(jì)可被羊毛硫抗生素酶修飾的肽的指南廣，44Biochem. ,8873-82(2005) ；R. Rink，等人，“I^roduction of Dehydroamino Acid-Containing Peptides by Lactococcus lactis (通過(guò)季L酸iLi求菌產(chǎn)生含脫氫氨基酸的肽)，，73 :6Applied and Environmental Microbiology, 1792-96 (2007)； R. Rink, 等人.,"NisC, the Cylcase of the Lantibiotic Nisin, Can Catalyze Cyclization of Designed Nonlantibiotic P印tides (羊毛硫抗生素乳鏈菌肽的環(huán)化酶， NisC,可催化所設(shè)計(jì)的非羊毛硫抗生素肽的環(huán)化)” 46BioChem.，13179-89 (2007)(其每一項(xiàng)均在此通過(guò)引用并入)。羊毛硫抗生素由革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌產(chǎn)生并抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的生長(zhǎng)。在羊毛硫抗生素中，通過(guò)酶介導(dǎo)的絲氨酸和蘇氨酸殘基的脫水作用而產(chǎn)生了脫氫丙氨酸和脫氫酪氨酸。且然后通過(guò)酶促方法將半胱氨酸偶聯(lián)到脫水的絲氨酸和蘇氨酸殘基上而形成硫醚環(huán)化。天然存在的羊毛硫抗生素顯示了殘基間通過(guò)硫醚鍵的這種偶聯(lián)，所述殘基的間距達(dá)19個(gè)殘基。硫醚環(huán)形成取決于前導(dǎo)肽。環(huán)化的位置取決于環(huán)化酶介導(dǎo)的區(qū)域和立體專一性閉環(huán)作用和可脫水的絲氨酸殘基和蘇氨酸殘基的位置。最為詳細(xì)描述的羊毛硫抗生素是乳鏈菌肽——一種由乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)產(chǎn)生的五環(huán)肽抗生素。乳鏈菌肽由4個(gè)甲基羊毛硫氨酸、1個(gè)羊毛硫氨酸、2個(gè)脫氫丙氨酸、1個(gè)脫氫α -氨基丁酸和26個(gè)未修飾的氨基酸組成。乳鏈菌肽的5個(gè)硫醚交聯(lián)是通過(guò)將半胱氨酸殘基添加到源于絲氨酸和蘇氨酸的脫氫丙氨酸和脫氫酪氨酸上而形成。乳鏈菌肽含有通過(guò)膜相關(guān)酶復(fù)合物翻譯后引入的含硫醚的氨基酸。該酶復(fù)合物包括運(yùn)載體 NisT、絲氨酸和蘇氨酸脫氫酶NisB和環(huán)化酶NisC。NisB使絲氨酸殘基和蘇氨酸殘基脫水， 使其分別轉(zhuǎn)化為脫氫丙氨酸和脫氫酪氨酸。然后MsC催化半胱氨酸的對(duì)映體選擇性與所形成的脫氫殘基偶聯(lián)。NisT協(xié)助經(jīng)修飾的前乳鏈菌肽(prenisin)的轉(zhuǎn)運(yùn)。另一種酶NisP 從前乳鏈菌肽裂解乳鏈菌肽前導(dǎo)肽。環(huán)化酶NisC 已被詳細(xì)描述。Li 等人，"Structure and Mechanism of the Lantibiotic Cylclase Involved in Nisin Biosynthesis (nisin 生物合成中的羊毛硫抗生素的結(jié)構(gòu)和機(jī)制)，，311Science，1464-67(2006)(其全部?jī)?nèi)容在此通過(guò)引用并入)。羊毛硫抗生素中環(huán)化的分析已引導(dǎo)對(duì)肽中易于環(huán)化的氨基酸序列和特性的鑒定。 已顯示NisB酶更經(jīng)常使位于絲氨酸殘基和蘇氨酸殘基側(cè)面的某些氨基酸脫水。已顯示環(huán)化更經(jīng)常發(fā)生于其中疏水殘基、非芳香性殘基鄰近絲氨酸殘基和蘇氨酸殘基的羊毛硫抗生素前肽中。經(jīng)修飾的半胱氨酸的側(cè)面殘基通常比經(jīng)修飾的蘇氨酸和絲氨酸的側(cè)面殘基具有更少疏水性。已發(fā)現(xiàn)的例外包括六肽VSPPAR(SEQ ID NO 43)、YTPPAL(SEQ ID NO 44)禾口FSFFAF (SEQ ID NO :4 。六肽表明在第3位或第4位存在脯氨酸或在兩側(cè)具有苯丙氨酸可防止脫水。通常通過(guò)將脫水殘基與位于C-末端的半胱氨酸相偶聯(lián)而形成環(huán)。然而，可通過(guò)將脫水殘基與位于N末端的半胱氨酸偶聯(lián)來(lái)形成環(huán)。還已顯示乳鏈菌肽脫水和轉(zhuǎn)運(yùn)酶并不是對(duì)乳鏈菌肽特異的，而事實(shí)上可用來(lái)修飾非乳鏈菌肽的肽(和非羊毛硫抗生素肽)。已顯示當(dāng)諸如人類肽激素的肽的N末端與羊毛硫抗生素前導(dǎo)肽融合時(shí)，NisB使所述肽中的絲氨酸殘基和蘇氨酸殘基脫水。在非羊毛硫抗生素肽上，應(yīng)用了相似的環(huán)形成特性；即，脫水的程度可通過(guò)可脫水的絲氨酸殘基和蘇氨酸殘基的側(cè)翼區(qū)域的氨基酸組成來(lái)控制。絲氨酸和蘇氨酸周圍疏水側(cè)翼殘基(例如，丙氨酸和纈氨酸)的存在使得完全脫水并因此增強(qiáng)了硫醚環(huán)形成。N-末端天冬氨酸和C末端側(cè)翼的精氨酸的存在阻止了脫水。還顯示，脯氨酸殘基和苯丙氨酸殘基的存在不利于脫水。通常，親水側(cè)翼殘基的存在阻止了絲氨酸殘基和蘇氨酸殘基的脫水。疏水側(cè)翼利于脫水；親水側(cè)翼不利于脫水。研究已顯示在脫水發(fā)生處，絲氨酸和蘇氨酸的側(cè)翼殘基的平均疏水性為正——N末端側(cè)鏈上為0.40且C-末端側(cè)鏈上為0. 13。而且，未經(jīng)脫水的絲氨酸和蘇氨酸側(cè)翼殘基的平均疏水性為負(fù)——N末端側(cè)鏈上為-0. 36且C-末端側(cè)鏈上為-1. 03。脫水不受一系列側(cè)翼的蘇氨酸殘基的存在所限制并且不受乳鏈菌肽前導(dǎo)肽和待脫水的殘基之間的距離所限制。已顯示NisC在與天然存在的羊毛硫抗生素?zé)o關(guān)的肽中催化區(qū)域?qū)Ｒ恍缘牧蛎循h(huán)的形成。通常，必須將這樣的肽與乳鏈菌肽前導(dǎo)肽融合。在一些例子中，硫醚環(huán)可自發(fā)形成， 例如其中脫氫丙氨酸由兩個(gè)來(lái)自半胱氨酸的氨基酸所間隔。與自發(fā)環(huán)化所不同的是，NisC 催化的環(huán)化對(duì)脫水的前乳鏈菌肽具有立體專一性。因此乳鏈菌肽中的甲基羊毛硫氨酸和羊毛硫氨酸為DL構(gòu)型。據(jù)認(rèn)為非羊毛硫抗生素肽中的環(huán)化也將是立體專一性的?？蓪⑦@些原理應(yīng)用于本文所描述的化合物中，包括銅氧還蛋白及其變體和截短體。硫醚橋事實(shí)上，存在橋下具有達(dá)19個(gè)氨基酸的羊毛硫抗生素酶誘導(dǎo)的硫醚橋。橋下具有 2-4個(gè)氨基酸的硫醚橋是高豐度的。在一些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白可通過(guò)將硫醚鍵引入結(jié)構(gòu)中來(lái)進(jìn)行修飾。例如， 天青蛋白截短體p28 (SEQ ID NO : 可利用這種方法來(lái)修飾。利用軟件包GROMACS (www. gromacs.org)進(jìn)行的延長(zhǎng)的分子動(dòng)力學(xué)模擬(70ns)表明，在37°C下，來(lái)自第6位至第16 位的MSci螺旋的區(qū)域是不穩(wěn)定的，且肽易于采用β折疊構(gòu)象。圖58，A和B。這連同事實(shí)——所推測(cè)的負(fù)責(zé)與Ρ53相互作用的分子的部分保持溶劑接觸，表明P^肽的該區(qū)域中引入硫醚橋可能不影響其功能性。ρ28的氨基酸序列是SEQ ID NO 2(LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD)。已知作為 ρ18 的氨基酸序列為 SEQ ID NO: 25 (LSTAADMQGVVTDGMASG)。序列 SGLDKD (SEQ ID NO. 96)可與 p53 相互作用。硫醚橋可在 N-側(cè)的絲氨酸/蘇氨酸和C側(cè)的半胱氨酸之間形成。絲氨酸/蘇氨酸被脫水且隨后與半胱氨酸偶聯(lián)。蘇氨酸是優(yōu)選的，因?yàn)槠浔冉z氨酸更易于脫水。通常，蘇氨酸的疏水側(cè)翼殘基 (至少一個(gè))是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兲岣吡嗣撍某潭?。作為?cè)翼殘基的帶負(fù)電荷的氨基酸， 谷氨酸和天冬氨酸對(duì)脫水具有強(qiáng)烈的負(fù)電效應(yīng)。通常，親水側(cè)翼殘基，尤其是甘氨酸，不利于脫水。在半胱氨酸之前，對(duì)帶電荷的親水殘基具有輕微偏好性，尤其是谷氨酸/天冬氨酸。參與成環(huán)的氨基酸的數(shù)量取決于硫醚環(huán)的大小。在一個(gè)實(shí)施方案中，截短體天青蛋白序列為L(zhǎng)STAADMQGVVTDGMASGLDKDYLTPGC (SEQ ID NO :46)。硫醚橋在口8 的第 25 位和第 28位之間形成，且將對(duì)羧肽酶進(jìn)行完全防御。第2位、第3位和第25位將被脫水，但導(dǎo)入序列和認(rèn)為與同P53相互作用相關(guān)的序列均未受硫醚環(huán)導(dǎo)入的影響。同樣地，肽活性不應(yīng)改變。蘇氨酸位于兩個(gè)疏水氨基酸之間且因此預(yù)期完全被脫水酶MsB所脫水，根據(jù)特定指導(dǎo)。參見Rink等人，Biochemistry 2005。同樣的指導(dǎo)還預(yù)測(cè)了通過(guò)環(huán)化酶NisC進(jìn)行的涉及第25位和第28位的環(huán)化，尤其由于天冬氨酸位于半胱氨酸之前。在另一個(gè)實(shí)施方案中，截短的天青蛋白序列為L(zhǎng)STAADCQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD (SEQ ID NO :47)并且硫醚橋在第 3 位和第 7 位之間形成。第3位和第7位之間的環(huán)與乳鏈菌肽的環(huán)A相像，并利用了第2位上存在的蘇氨酸。第6位上的天冬氨酸將利于環(huán)化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，截短的天青蛋白序列為，LSTAACMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD (SEQ ID NO 48)，且利用了第 2 位的蘇氨酸來(lái)形成硫醚橋。在另一個(gè)實(shí)施方案中，以上段落中所描述的截短的天青蛋白中的硫醚橋中的兩個(gè)或多個(gè)在一個(gè)肽中組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可生成許多截短的天青蛋白序列并通過(guò)分析在硫橋下具有 1個(gè)羊毛硫氨酸和2-3個(gè)其它氨基酸的環(huán)的肽而篩選蘇氨酸環(huán)。這可能包括以下序列中的一個(gè)或多個(gè)組合LSTACDMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO49)
LSTAATMQCVVTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO50)
LSTAATMQGCVTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO51)
LSTAANTQGCVTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO52)
LSTAANTQGVCTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO53)
LSTAADMTAVCTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO54)
LSTAADMTAWCDGMASGLDKDYLKPDD (SEQIDNO55)
LSTAADMQTWCDGMASGLDKDYLKPDD (SEQIDNO56)
LSTAADMQTVVTCGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO57)
LSTAADMQATVTCGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO58)
LSTAADMQATVTDCMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO59)
LSTAADMQGVTADCMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO60)
LSTAADMQGVTADGCASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO61)
LSTAADMQGWTNGCASGLDKDYLKPDD (SEQIDNO62)
實(shí)踐方法可基因生成大量這樣的序列并以修飾的程度和生產(chǎn)的水平為依據(jù)選擇
用于純化的組。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，在p28 (SEQ ID NO 2)的第12位的蘇氨酸和肽的c_末端之間形成了硫醚橋。第13位的Ca和第28位的天冬氨酸之間的距離可能為17. 52埃，大于1.5納米，暗示了肽的結(jié)構(gòu)的顯著改變。圖58C。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肽序列為L(zhǎng)STAADMQGVVTATMGSGLCKDYLKPDD (SEQ ID NO 63)，硫醚橋從第 14 位至第 2 位距離 4. 38埃。第13位的天冬氨酸到丙氨酸的突變利于第14位的蘇氨酸的脫水。第16位的丙氨酸突變?yōu)楦拾彼嵬耆柚沽说?7位的絲氨酸的脫水并增強(qiáng)了環(huán)化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肽序列為L(zhǎng)STAADMQGWTDLTASGLCKDYLKPDD (SEQ ID NO :64)，硫醚橋從第 15 位至第 20 位距離5. 83埃。在這種情況下，第14位的甘氨酸到亮氨酸的突變利于第15位的蘇氨酸的脫水。三級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定銅氧還蛋白來(lái)源的肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性將影響藥物代謝動(dòng)力學(xué)的大多方面， 除其它外，包括藥理活性、血漿半衰期和/或免疫原性。參見Kanovsky等人.，Cancer Chemother. Pharmacol. 52 :202-208(2003) ；Kanovsky 等人，PNAS 23 :12438-12443(2001)。 肽螺旋常常分離成無(wú)規(guī)卷曲，變得對(duì)蛋白酶攻擊更敏感且可能不能很好地滲透細(xì)胞膜。 Schafmeister 等人，J. Am. Chem. Soc. 122 :5891-5892 (2000)。因此，一個(gè)穩(wěn)定肽的整體結(jié)構(gòu)的方式是穩(wěn)定肽的α-螺旋結(jié)構(gòu)。與螺旋形成相關(guān)的分子內(nèi)氫鍵鍵合減少了極性酰氨基骨架的暴露，因此在轉(zhuǎn)運(yùn)肽中減少了膜滲透的障礙，且從而提高了相關(guān)的藥理活性并提高了肽對(duì)蛋白酶裂解的抗性。同上。銅綠假單胞菌天青蛋白(SEQ ID NO :1)在殘基53-56、 58-64和68-70上具有α -螺旋。一個(gè)穩(wěn)定α -螺旋的方法是將α -螺旋中的螺旋斷裂氨基酸殘基，諸如甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸和天冬氨酸，或螺旋中性氨基酸殘基比如丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、谷氨酰胺、 天冬酰胺、半胱氨酸、組氨酸、賴氨酸或精氨酸，替代為螺旋形成殘基，諸如亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸、色氨酸和甲硫氨酸或螺旋傾向氨基酸殘基替代，例如α-氨基-異丁酸(Aib)。參見 Miranda 等人，J. Med. Chem.，51，2758-2765 (2008)，其公開內(nèi)容在此通過(guò)引用并入。考慮了銅氧還蛋白來(lái)源的肽的α-螺旋可通過(guò)利用其它氨基酸來(lái)替代一個(gè)或多個(gè)甘氨酸殘基、脯氨酸殘基、絲氨酸殘基和/或天冬氨酸殘基來(lái)穩(wěn)定。在具體的實(shí)施方案中，甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸、組氨酸、賴氨酸和/或精氨酸殘基被亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、 酪氨酸、色氨酸、Aib和/或甲硫氨酸殘基所替代。參見Lee等人，Cancer Cell Intl. 11 21 0005)。在另外的具體的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽的α-螺旋中的一個(gè)或多個(gè)絲氨酸殘基或谷氨酰胺殘基可以是取代的。在又一些更具體的實(shí)施方案中，銅綠假單胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)的殘基53-56、58-64和68-70中的絲氨酸和/或谷氨酰胺殘基， 或其它銅氧還蛋白來(lái)源的肽的等價(jià)殘基，可被替代。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，銅綠假單胞菌天青蛋白(SEQ ID NO :1)氨基酸殘基57處的谷氨酰胺殘基，或另一個(gè)銅氧還蛋白來(lái)源的肽的等價(jià)殘基可被替代，更具體地為被色氨酸所替代。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，銅綠假單胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)的氨基酸殘基52處的蘇氨酸殘基，或另一銅氧還蛋白來(lái)源的肽的等價(jià)殘基可被替代，更具體的為被色氨酸所替代。在另一具體的實(shí)施方案中，銅綠假單胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)的氨基酸殘基61處的蘇氨酸殘基，或另一銅氧還蛋白來(lái)源的肽的等價(jià)殘基可被替代，更具體地為被色氨酸所替代。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，銅綠假單胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)氨基酸殘基63處的甘氨酸殘基，或另一銅氧還蛋白來(lái)源的肽的等價(jià)殘基可被替代，更具體地被色氨酸所替代。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，銅綠假單胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)氨基酸殘基52、57、61或63處的一個(gè)或多個(gè)蘇氨酸、谷氨酰胺、或甘氨酸殘基，或另一銅氧還蛋白來(lái)源的肽的等價(jià)殘基可被替代，更具體地為被色氨酸所替代。在具體的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白肽包含以下序列其中之一，其中下劃線的氨基酸被置換到野生型銅綠假單胞菌M8序列中LSffAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO:65)
LSTAADMWGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO:66)
LSTAADMQGVVffDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO:67)
LSTAADMQGVVTDWMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO:68)
LSWAADMWGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO:69)
LSffAADMQGVVffDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO:70)
LSWAADMQGVVTDWMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO:71)
LSTAADMWGVVWDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO:72)
LSTAADMWGVVTDWMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO:73)
LSTAADMQGVVWDWMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO:74)
LSWAADMWGVVffDWMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO:75)在另一些實(shí)施方案中，其它銅氧還蛋白來(lái)源的肽中的等價(jià)氨基酸被色氨酸所替代。穩(wěn)定α -螺旋三級(jí)結(jié)構(gòu)的另一方法包括使用能夠π -堆積的非天然氨基酸殘基。 例如，在 Andrews 和 Tabor (Tetrahedron 55:11711-11743(1999))中，成對(duì)的 ε-(3，5_ 二硝基苯甲?；?-賴氨酸殘基被置換到不同間距的肽的α-螺旋區(qū)域中。整體結(jié)果顯示了 i、(i+4)間距是最有效的穩(wěn)定排列。提高水的百分比，至90%，提高了肽的螺旋含量。同樣 i、(i+4)間距中的ε-?；?賴氨酸殘基對(duì)沒有穩(wěn)定作用，表明穩(wěn)定的大部分由JI-Ji相互作用而產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽可被修飾而使賴氨酸殘基被ε _(3， 5-二硝基苯甲?；?-賴氨酸殘基所替代。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，賴氨酸殘基可以i、 (i+4)間距被ε-(3，5-二硝基苯甲?；?-賴氨酸所替代。另一穩(wěn)定α-螺旋三級(jí)結(jié)構(gòu)的方法使用了 α-螺旋中側(cè)鏈間的靜電相互作用。當(dāng)將His-Cys或His-His殘基對(duì)以i，(i+4)排列替代入肽中時(shí)，在添加Cu、Si或Cd離子后， 肽從約50%螺旋變化到約90%螺旋。當(dāng)將釕(Ru)鹽添加到His-His肽中時(shí)，形成了惰性交換復(fù)合物，大環(huán)cis-[RU-(NH3)4L2]3+復(fù)合物，其中L2是兩個(gè)組氨酸的側(cè)鏈，其提高了螺旋穩(wěn)定性。Ghadiri 和 Fernholz，J.Am. Chem. Soc. 112,9633-9635(1990)。在一些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽可包含大環(huán)ci S- [Ru- (NH3) 4L2]3+復(fù)合物，其中L2是兩個(gè)組氨酸的側(cè)鏈。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)組氨酸-半胱氨酸或組氨酸-組氨酸殘基對(duì)可以i， (i+4)排列替換入銅氧還蛋白來(lái)源的肽的α-螺旋中。在另外的實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)組氨酸-半胱氨酸或組氨酸-組氨酸殘基對(duì)可以i，(i+4)排列替代入銅綠假單胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)的殘基53-56、58-64和68-70中，或其它銅氧還蛋白來(lái)源的肽的等價(jià)殘基中。在一些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽還可包含Cu、Zn、Cd和/或Ru離子。穩(wěn)定α -螺旋三級(jí)結(jié)構(gòu)的另一方法涉及α -螺旋的側(cè)鏈間的二硫鍵形成。還可通過(guò)肽序列中分離的殘基之間的形式共價(jià)鍵來(lái)穩(wěn)定螺旋結(jié)構(gòu)。常用的自然方法是使用二硫鍵。Pierret 等人.，htl. J. Pept. Prot. Res.，46 :471-479 (1995)。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基對(duì)被置換到銅氧還蛋白來(lái)源的肽的α-螺旋中。在另外的實(shí)施方案中，在銅綠假單胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)的殘基53-56、58-64和68-70處、或其它銅氧還蛋白來(lái)源的肽的等價(jià)殘基被替代為一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基對(duì)。穩(wěn)定α-螺旋三級(jí)結(jié)構(gòu)的另一方法涉及側(cè)鏈內(nèi)酰胺橋的使用。內(nèi)酰胺是環(huán)狀酰胺，其能夠自氨基酸的環(huán)化而形成。側(cè)鏈到側(cè)鏈橋已成功用作多種肽和肽類似物中的限制約束，比如兩親性或模型α -螺旋肽、催產(chǎn)素拮抗劑、促黑素類似物、胰高血糖素和SDF-I肽類似物。例如，胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)在某些利于螺旋的條件下逐漸呈螺旋構(gòu)象并可利用內(nèi)酰胺橋來(lái)穩(wěn)定。Miranda等人，J. Med. Chem. , 51, 2758-2765 (2008) 這些內(nèi)酰胺橋可在大小、影響穩(wěn)定性和結(jié)合親和性上不同。同前。這種修飾提高了血漿中化合物的穩(wěn)定性。同前。依據(jù)環(huán)化位點(diǎn)間的間距和殘基的選擇的不同，內(nèi)酰胺橋可用來(lái)誘導(dǎo)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)角或螺旋構(gòu)象。在一些實(shí)施方案中，利用相近的氨基酸(比如i至i+4谷氨酸-賴氨酸限制) 之間的內(nèi)酰胺橋制備了一個(gè)或多個(gè)銅氧還蛋白或變體類似物。在一些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽可包含這種修飾以提高α-螺旋含量。穩(wěn)定α-螺旋三級(jí)結(jié)構(gòu)的另一方法是全碳交聯(lián)方法。已證明全烴交聯(lián)方法提高了螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、蛋白酶抗性和細(xì)胞穿透性。Walensky等人，Science，305， 1466-1470(2004)。含攜帶烯烴的系鏈(tether)的α，α -雙取代的非天然氨基酸被整合到肽中。釕催化的烯烴復(fù)分解生成了全烴“環(huán)鉤”以交聯(lián)螺旋。Schafmeister等人，J.Am. Chem. Soc, 122，5891-5892 (2000) ；Walensky等人，同前。含攜帶烯烴的系鏈的非天然氨基酸可根據(jù) khafmeister 等人(同前)和 Williams 和 Ln (J.Am· Chem. Soc, 113 :9276-9286(1991)) 中所提供的方法來(lái)合成。在一些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽通過(guò)全烴環(huán)鉤來(lái)穩(wěn)定。 在特定的實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于天然氨基酸的含攜帶烯烴的系鏈的一個(gè)或多個(gè)成對(duì)的α， α-雙取代的非天然氨基酸被置換到銅氧還蛋白來(lái)源的肽的α-螺旋中。在另外的實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于天然氨基酸的含攜帶烯烴的系鏈的一個(gè)或多個(gè)成對(duì)的α，α-雙取代的非天然氨基酸被置換到銅綠假單胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)的殘基53-56、58-64和68-70中、 或被置換到其它銅氧還蛋白來(lái)源的肽的等價(jià)殘基中。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽可包含Χ#)(2ΑΑ0Χ3Χ4Χ5ννΧ60Χ7)(8 Asgldkdylkpdx9(seq id no :76)，其中 ^c1 是 l 或乙?；?l，& 是 τ 或 w，& 是 m、L 或 v，X4 是Q或W，&是G或Α，&是T或W，X7是G、T或W，&是M、L或V，和知是D或酰胺化的-D。 在另外的實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽可由XiSAAAKy^AVVXeDXA^SGLDKDY LKPDX9 (SEQ ID NO 76)組成，其中&是L或乙?；腖，&是T或W，&是M、L或V，&是Q 或W，&是G或A，&是T或W，X7是G、T或W，&是M、L或V，且知是D或酰胺化的D。在另外的實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽可包含X1DPKLLGSAX2X3DX4W X5X6X7DAAX8SX9 (SEQ ID NO :77)，其中 & 是 D 或乙?；?D，& 是 M、L 或 V，& 是 G、T 或 W, X4 是T或W，&是G或A，&是Q或W，X7是M、L或V，&是T或W，和知是L或酰胺化的L。在另外的實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的銅氧還蛋白來(lái)源的肽可由^C1DPKLYDKDLGSAX2X3DX4VVX5X6X7DAAX 8SX9 (SEQ ID NO 77)組成，其中X1是D或乙酰化的D，&是M、L或V，&是G、T或W，&是T 或W，&是G或A，&是Q或W，X7是M、L或V，&是T或W，和X9是L或酰胺化的L。感興趣的具體的肽列于表3中。
聚乙二醇化PEG與具有治療和診斷價(jià)值的藥物的共價(jià)連接已延長(zhǎng)了體內(nèi)藥物的血漿半衰期，和/或降低了它們的免疫原性和抗原性。Harris和Chess，Nature Reviews Drug Discovery 2:214-22^2003)。例如，PEG連接已提高了許多治療性蛋白的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，除其它外，包括白介素(Kaufman 等人，J. Biol. Chem. 263 :15064(1988) ；Tsutsumi 等人，J. Controlled Release33 :447 (1995))、干擾素(Kita 等人，Drug Des. Delivery 6 157(1990))、過(guò)氧化氫酶(Abuchowski 等人，J. Biol. Chem. 252 :3582 (1977))、超氧化物歧化酶(Beauchamp 等人，Anal. Biochem. 131 :25(1983))和腺苷脫氨酶(Chen 等人，Biochem. Biophys. Acta 660 :293(1981))。FDA已批準(zhǔn)在食物、美容劑和藥物中將PEG用作載體或基質(zhì)，所述藥物包括可注射制劑、局部制劑、直腸制劑和鼻制劑。PEG顯示了微弱的毒性，并且通過(guò)腎(對(duì)于PEG < 30kDa)或在糞便中(對(duì)于PEG > 20kDa)從體內(nèi)完整地清除。PEG在水中是高度可溶的。治療性肽的聚乙二醇化，可用于通過(guò)減少腎超濾作用來(lái)提高肽在患者的血流中的存在時(shí)間，并從而減少藥物從體內(nèi)的消除。電荷屏蔽可影響腎滲透。電荷屏蔽可能是蛋白可離子化官能團(tuán)，即胺或羧基的藥物化學(xué)修飾的結(jié)果。特別地，用于產(chǎn)生蛋白-PEG衍生物的最常見方法包括將蛋白氨基基團(tuán)轉(zhuǎn)化成具有隨之的正電荷減少的酰胺，并且這可能改變蛋白超濾作用。因?yàn)橐寻l(fā)現(xiàn)腎超濾作用清除陰離子巨分子比清除中性巨分子或陽(yáng)性巨分子要慢，可以預(yù)期PEG與氨基基團(tuán)的軛合延長(zhǎng)了聚乙二醇化的肽在血流中的持久性。分子大小和球狀超濾也可影響治療肽的腎超濾作用。認(rèn)為天然球狀蛋白的腎清除的分子量界限約為70kDa，其接近血清白蛋白的分子量。這樣，具有超過(guò)70kDa分子量的蛋白主要通過(guò)除腎超濾作用以外的途徑從體內(nèi)清除，所述途徑比如肝臟攝取、蛋白水解消化和通過(guò)免疫系統(tǒng)的消除。因此，通過(guò)聚乙二醇化提高治療性肽的大小可降低該肽從患者的血流中的腎超濾作用。此外，治療性肽的聚乙二醇化可降低肽的免疫原性，并保護(hù)肽避免蛋白水解酶、吞噬細(xì)胞和需要與治療性肽直接接觸的其它因子。已特別發(fā)現(xiàn)對(duì)于接近蛋白水解酶、抗體、吞噬細(xì)胞等，傘狀結(jié)構(gòu)的分支PEG比線性PEG提供了更好的保護(hù)作用。Caliceti和Veronese， Adv. Drug. Deliv. Rev. 55 :1261-12778(2003)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的銅氧還蛋白來(lái)源的肽被修飾以使一個(gè)或多個(gè)PEG分子與半胱氨酸分子共價(jià)結(jié)合。共價(jià)結(jié)合不必是從PEG分子到銅氧還蛋白來(lái)源的肽的直接共價(jià)結(jié)合，而可以是共價(jià)結(jié)合至一個(gè)或多個(gè)接頭分子，所述接頭分子進(jìn)而彼此共價(jià)結(jié)合和 /或與銅氧還蛋白來(lái)源的肽共價(jià)結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽具有位點(diǎn)特異性的聚乙二醇化。在特定的實(shí)施方案中，PEG分子可以與銅綠假單胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)的半胱氨酸殘基3、沈和/或112共價(jià)結(jié)合。在另外的實(shí)施方案中，可將一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基置換入銅氧還蛋白來(lái)源的肽中并對(duì)其進(jìn)行聚乙二醇化。在一些實(shí)施方案中，對(duì)銅氧還蛋白來(lái)源的肽進(jìn)行聚乙二醇化的方法除其它以外可以是NHS、還原性氨基化、 malimid或環(huán)氧化物。在另外的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽可于一個(gè)或多個(gè)賴氨酸、 半胱氨酸、組氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸、或N-末端的氨基基團(tuán)或C-末端的羧酸上進(jìn)行聚乙二醇化。在更具體的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽可于一個(gè)或多個(gè)賴氨酸或N-末端氨基基團(tuán)上進(jìn)行聚乙二醇化。在另外的實(shí)施方案中，可將一個(gè)或多個(gè)賴氨酸、半胱氨酸、組氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基置換入銅氧還蛋白來(lái)源的肽中并進(jìn)行聚乙二醇化。在另外的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽可于一個(gè)或多個(gè)氨基基團(tuán)上進(jìn)行聚乙二醇化。在另外的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽可以隨機(jī)的、非位點(diǎn)特異性的方式來(lái)進(jìn)行聚乙二醇化。在一些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽的基于PEG的聚合物可具有約200道爾頓至約100，000道爾頓、約2，000道爾頓至約20，000道爾頓、或約2，000道爾頓至約5，000道爾頓的平均分子量。在另外的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽可由一種或多種分支的PEG分子組成，尤其是約50kDa的分支的PEG分子。在另外的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白來(lái)源的肽可包含一個(gè)或多個(gè)線性PEG分子， 尤其是約5kDa的線性PEG分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肽是銅氧還蛋白、或其變體、結(jié)構(gòu)等價(jià)物或衍生物，其為特異性結(jié)合葡萄糖調(diào)節(jié)的蛋白78(GRP78)并被內(nèi)化到癌細(xì)胞中的13-mer環(huán)狀低聚肽P印42 的軛合物。根據(jù) Yoneda 等人，“A cell-penetrating peptidic GRP78ligand for tumor cell-specific prodrug therapy，(用于腫瘤細(xì)胞特異性前藥治療的細(xì)胞滲透肽GRP78配體)，，Bioorganic Medicinal Chemistry Letters 18 :1632-1636(2008)中所公開的合成方法，可將銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、結(jié)構(gòu)等價(jià)物或衍生物與Pep42軛合，其公開內(nèi)容在此通過(guò)引用整體并入。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肽是銅氧還蛋白的結(jié)構(gòu)等價(jià)物。測(cè)定銅氧還蛋白和其它蛋白之間的顯著結(jié)構(gòu)同源性的研究的例子包括Toth等人.(Developmental Cell 1 82-92(2001))。具體地，銅氧還蛋白和結(jié)構(gòu)等價(jià)物之間的顯著結(jié)構(gòu)同源性可通過(guò)利用 VAST 算法來(lái)測(cè)定。Gibrat 等人，Curr Opin Struct Biol 6:377-385(1996) ；Madej 等人， Proteins 23:356-3690(1995)。在特定的實(shí)施方案中，來(lái)自銅氧還蛋白與結(jié)構(gòu)等價(jià)物的結(jié)構(gòu)對(duì)比的VAST ρ值可能小于約10_3，小于約10_5，或小于約10_7。在另一些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白和結(jié)構(gòu)等價(jià)物之間的顯著結(jié)構(gòu)同源性可通過(guò)利用DALI算法來(lái)測(cè)定。Holm & Sander， J. Mol. Biol. 233 123-138 (1993)。在特定的實(shí)施方案中，成對(duì)結(jié)構(gòu)對(duì)比的DALI Z評(píng)分為至少約3. 5，至少約7. 0，或至少約10. 0?？紤]了本發(fā)明的組合物的肽，可以是超過(guò)一種的銅氧還蛋白的多個(gè)變體、衍生物、 截短體和/或結(jié)構(gòu)等價(jià)物。例如，肽可以是已被聚乙二醇化而使其成為變體和衍生物的天青蛋白的截短體。在一個(gè)實(shí)施方案中，利用含烯烴的系鏈的α，α-雙取代的非天然氨基酸，隨后通過(guò)釕催化的烯烴復(fù)分解進(jìn)行全烴“環(huán)鉤”而合成本發(fā)明的肽。Scharmeister等人， J.Am. Chem. Soc. 122 :5891-5892(2000) ；Walensky 等人，Science 305 :1466-1470(2004)。 此外，作為天青蛋白的結(jié)構(gòu)等價(jià)物的肽可與其它的肽相融合，從而使肽成為結(jié)構(gòu)等價(jià)物和衍生物。這些實(shí)例僅為了示例而并不限制本發(fā)明。銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物可與銅結(jié)合或可不與銅結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物具有銅綠假單胞菌天青蛋白且尤其是P28的一些藥理學(xué)活性。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白和銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物可抑制或阻止哺乳動(dòng)物細(xì)胞、組織或動(dòng)物，且具體為但不局限于乳腺細(xì)胞中的癌前病變的發(fā)展。本發(fā)明還提供了銅氧還蛋白和銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物，其可具有抑制哺乳動(dòng)物癌前病變的發(fā)展的能力，所述哺乳動(dòng)物癌前病變具體為但不局限于黑素瘤、乳腺癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、肺癌、結(jié)腸直腸癌、頭頸癌、膀胱癌、前列腺癌、皮膚和子宮頸癌細(xì)胞。對(duì)癌細(xì)胞的發(fā)展的抑制是癌前病變的發(fā)展的任何與對(duì)照治療相比統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的減少、或增加的速率的降低。因?yàn)楝F(xiàn)在已知銅氧還蛋白能夠優(yōu)先通過(guò)胞吞途徑進(jìn)入癌細(xì)胞，并且還能夠抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞、組織或動(dòng)物、且具體為乳腺細(xì)胞、且更具體為小鼠乳腺細(xì)胞中癌前病變的發(fā)展并最終抑制癌癥的發(fā)展，現(xiàn)在可能設(shè)計(jì)保留這種活性的銅氧還蛋白的變體和衍生物。這樣的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物可通過(guò)以下方法來(lái)生成，例如，構(gòu)建銅氧還蛋白和銅氧還蛋白來(lái)源的肽的多種變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物的“文庫(kù)”，且然后利用本領(lǐng)域中已知的多種方法其中之一，比如實(shí)施例1中示例的方法來(lái)檢驗(yàn)每一個(gè)的優(yōu)先進(jìn)入和/或化學(xué)預(yù)防活性，且具體為在小鼠乳腺器官培養(yǎng)中的優(yōu)先進(jìn)入和/或化學(xué)預(yù)防活性?？紤]了所得的具有化學(xué)預(yù)防活性和/或優(yōu)先進(jìn)入細(xì)胞的能力的銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物可用于本發(fā)明的方法中，代替或補(bǔ)充天青蛋白或P28。在一些特定的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物可將小鼠乳腺器官培養(yǎng)物(MMOC)中7，12_ 二甲基苯并蒽(DMBA)誘導(dǎo)的癌前病變發(fā)展抑制到統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同于未處理的對(duì)照的程度。通過(guò)利用實(shí)施例1中或Mehta等人(J Natl Cancer Inst 93 :1103-1106(2001))和 Mehta 等人.(Meth Cell Sci 19:19-24(1997))描述的 MMOC 模型系統(tǒng)，可檢驗(yàn)肽的這種活性。其它用于確定癌癥發(fā)展是否被抑制的方法也是本領(lǐng)域中熟知的，也可以使用。在一些特定的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物在MMOC模型中抑制乳腺腺泡病變(MAL)的發(fā)展至統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同于未處理的對(duì)照的程度。在一些特定的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物在MMOC模型中抑制乳腺導(dǎo)管病變 (MDL)的發(fā)展至統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同于未處理的對(duì)照的程度。通過(guò)利用如實(shí)施例1中所描述的 DMBA誘導(dǎo)形成癌前病變的MMOC模型系統(tǒng)，可以檢測(cè)肽的這些活性。對(duì)MMOC模型系統(tǒng)中癌前病變的發(fā)展評(píng)價(jià)可通過(guò)如實(shí)施例1中提供的形態(tài)學(xué)分析或組織病理學(xué)分析確定。在一些特定的實(shí)施方案中，變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、組織和動(dòng)物中優(yōu)先進(jìn)入癌細(xì)胞和/或腫瘤中。在一些實(shí)施方案中，變體是P18的衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物。在一些實(shí)施方案中，變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、組織和動(dòng)物中選擇性地進(jìn)入癌細(xì)胞和/或腫瘤和遞送DNA或RNA。在一些實(shí)施方案中，DNA或RNA是基因或基因的部分。在一些實(shí)施方案中，DNA或RNA經(jīng)遞送后具有治療作用。在一些實(shí)施方案中，變體是P28的衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物。在一些實(shí)施方案中，變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、組織和動(dòng)物中選擇性地進(jìn)入癌細(xì)胞和/或腫瘤和遞送DNA或RNA。在一些實(shí)施方案中，DNA或RNA是基因或基因的部分。在一些實(shí)施方案中，DNA或RNA經(jīng)遞送后具有治療作用。銅氧還蛋白這些小的藍(lán)銅蛋白(銅氧還蛋白)是電子傳遞蛋白(10-20kDa)，其參與細(xì)菌電子傳遞鏈或具有未知功能。銅離子單獨(dú)被蛋白基質(zhì)結(jié)合。兩個(gè)組氨酸和一個(gè)半胱氨酸配體圍繞銅的特殊的扭曲三角形平面排列產(chǎn)生金屬位點(diǎn)很奇特的電子特性和深色的藍(lán)顏色。很多銅氧還蛋白以結(jié)晶學(xué)上中到高的分辨率被表征。通常銅氧還蛋白具有低序列同源性但具有高的結(jié)構(gòu)同源性。Gough &Clothia, Structure 12 :917-925(2004) ；De Rienzo 等人，Protein Science9 1439-1454 Q000)。例如，天青蛋白的氨基酸序列與橙綠屈撓素B的氨基酸序列為31%相同，與鐵硫菌藍(lán)蛋白的氨基酸序列為16. 3%相同，與質(zhì)體藍(lán)素的氨基酸序列為20. 3%相同，與假天青蛋白的氨基酸序列為17. 3%相同。參見表1。然而，這些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)相似性更顯著。天青蛋白與橙綠屈撓素B的結(jié)構(gòu)對(duì)比的VAST ρ值為10_7 4，天青蛋白與鐵硫菌藍(lán)蛋白的結(jié)構(gòu)對(duì)比的VAST P值為10_5，天青蛋白與質(zhì)體藍(lán)素的結(jié)構(gòu)對(duì)比的VAST ρ值為10_5 6，天青蛋白與假天青蛋白的結(jié)構(gòu)對(duì)比的VAST ρ值為10_41。所有的銅氧還蛋白具有八-鏈回形拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(Greek key) β -桶或β -夾層折疊， 并具有高度保守的位點(diǎn)結(jié)構(gòu)。De Rienzo等人，Protein Science9 :1439-1454(2000) 由于很多長(zhǎng)鏈脂肪族殘基諸如甲硫氨酸和亮氨酸的存在，顯著的疏水區(qū)存在于天青蛋白、花青苷、藍(lán)細(xì)菌質(zhì)體藍(lán)素、黃瓜堿性蛋白的銅位點(diǎn)周圍，且小范圍存在于假天青蛋白和真核質(zhì)體藍(lán)素。同前。疏水區(qū)也小范圍發(fā)現(xiàn)于漆樹花青苷和鐵硫菌藍(lán)蛋白銅位點(diǎn)，但是具有不同的特征。同前。表1.利用VAST算法將來(lái)自銅綠假單胞菌的天青蛋白(IJZG)與其它蛋白進(jìn)行序列和結(jié)構(gòu)比對(duì)。
PDB比對(duì)長(zhǎng)度1%氨基酸同一性P-值2評(píng)分3RMSD4描述IAOZ A 28218.310e-712.21.9抗壞血酸氧化酶IQHQA1133110e-7.412.11.9橙綠屈撓素B1V54 B 17920.310e-6.011.22.1細(xì)胞色素C氧化酶1GY2A9216.310e-5.011.11.8鐵較υ菌藍(lán)蛋白3MSPA748.110e-6.710.92.5活動(dòng)的主要精子蛋白5IIUZ7420.310e-5.610.32.3質(zhì)體藍(lán)素IKGYE905.610e-4.610.13.4肝配蛋白b2IPMY7517.310e-4.19.82.3假天青蛋白1比對(duì)長(zhǎng)度疊加在兩個(gè)結(jié)構(gòu)之間的相同C-α原子對(duì)的數(shù)量，即多少殘基用于計(jì)
算3D重疊。2P值VAST ρ值是所述對(duì)比的顯著性的量度，表示為概率。例如，如果P值為 0. 001，則純隨機(jī)性地看見該性質(zhì)相符的幾率為1/1000。運(yùn)用MMDB數(shù)據(jù)庫(kù)中有500個(gè)獨(dú)立和不相關(guān)的域的假定，調(diào)整VAST的ρ值是為了多重比較的效果。因而被500除后，所述ρ 值符合每個(gè)域?qū)Τ蓪?duì)比較的P值。3評(píng)分VAST結(jié)構(gòu)相似性評(píng)分。該數(shù)字與二級(jí)結(jié)構(gòu)重疊元素的數(shù)字以及重疊的質(zhì)量相關(guān)。較高的VAST評(píng)分與較高的相似性相關(guān)聯(lián)。4RMSD 以埃為單位的均方根重疊殘基。在兩個(gè)結(jié)構(gòu)最佳重疊之后這一數(shù)字被計(jì)算，作為等價(jià)C-α原子之間均方距離的方根。注意RMSD值隨結(jié)構(gòu)比對(duì)的范圍而標(biāo)定，當(dāng)使用RMSD描述整個(gè)結(jié)構(gòu)相似性時(shí)，必須考慮其大小。5線蟲(C. elegans)主要精子蛋白被證明在卵母細(xì)胞成熟中是一種肝配蛋白拮抗物。Kuwabara, Genes and Development 17:155-161 (2003)。天青蛋白天青蛋白是具有1 個(gè)氨基酸殘基的含銅蛋白，其屬于銅氧還蛋白家族，在某些細(xì)菌中參與電子傳遞。天青蛋白包括來(lái)自銅綠假單胞菌(PA) (SEQ ID N0:1)、木糖氧化產(chǎn)堿菌(A. xylosoxidans)和反硝化產(chǎn)堿菌的那些。Murphy等人.，J. Mol. Biol. 315 859-871(2002)。天青蛋白之間的氨基酸序列同一性在60-90%之間變化，這些蛋白顯示了高的結(jié)構(gòu)同源性。所有天青蛋白具有特征性的具有回形拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)模體的夾層，并且單個(gè)銅原子總是位于該蛋白的同一區(qū)域。此外，天青蛋白在銅位點(diǎn)周圍具有基本中性的疏水區(qū)。同前。質(zhì)體藍(lán)素質(zhì)體藍(lán)素是藍(lán)藻細(xì)菌、藻類和植物的可溶性蛋白，其在每個(gè)分子中含有一個(gè)分子的銅，并且它們的氧化型為藍(lán)色。它們出現(xiàn)在葉綠體中，作為電子載體發(fā)揮作用。自從在 1978年測(cè)定了白楊質(zhì)體藍(lán)素的結(jié)構(gòu)，藻類(柵藻(kenedesmus)、滸苔(^iteromorpha)、衣藻(Chlamydomonas))和植物(法國(guó)菜豆(French bean))質(zhì)體藍(lán)素的結(jié)構(gòu)已通過(guò)晶體學(xué)或 NMR方法進(jìn)行了測(cè)定，且已將白楊結(jié)構(gòu)精確到1.33A的分辨率。SEQ ID NO :3顯示了來(lái)自層理席藻，一種喜溫藍(lán)藻類細(xì)菌的質(zhì)體藍(lán)素的氨基酸序列。感興趣的另一質(zhì)體藍(lán)素來(lái)自百日咳石莼菌。雖然藻類和維管植物之間的質(zhì)體藍(lán)素序列趨異(例如衣藻蛋白和白楊蛋白之間的序列同一性為62%)，但三維結(jié)構(gòu)是保守的(例如在衣藻蛋白和白楊蛋白之間Ca位置的0.76A rms偏差)。結(jié)構(gòu)特征包括位于八鏈反平行β _桶的一個(gè)末端的扭曲四面體型銅結(jié)合位點(diǎn)、顯著的負(fù)電區(qū)和平坦的疏水表面。銅位點(diǎn)對(duì)于其電子傳遞功能是優(yōu)化的，負(fù)電和疏水區(qū)被設(shè)想?yún)⑴c生理反應(yīng)配偶體的識(shí)別。化學(xué)修飾、交聯(lián)和定點(diǎn)誘變?cè)囼?yàn)已證實(shí)負(fù)電和疏水區(qū)在與細(xì)胞色素f的結(jié)合相互作用中的重要性，并驗(yàn)證了質(zhì)體藍(lán)素中的兩個(gè)功能重要的電子傳遞通路的模型。一條假定的電子傳遞通路是相對(duì)短的(約4A)，并包括疏水區(qū)中暴露于溶劑的銅配體His-87，而另一條更長(zhǎng)(約12-15A)，包括負(fù)電區(qū)中近保守的殘基 Tyr_83。 Redinbo 等)κ, J. Bioenerg. Biomembr. 26 :49-66 (1994)。鐵硫菌藍(lán)蛋白鐵硫菌藍(lán)蛋白是獲自硫桿菌屬(現(xiàn)在被稱作酸硫桿狀菌屬)含銅藍(lán)的單鏈多肽。 利用多波長(zhǎng)不規(guī)則衍射對(duì)來(lái)自氧化亞鐵硫桿菌的極其穩(wěn)定和高氧化性的銅氧還蛋白鐵硫菌藍(lán)蛋白(SEQ ID NO 4)的氧化型進(jìn)行X-射線晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定，分辨率精確到1.9A。鐵硫菌藍(lán)蛋白由核心夾層折疊構(gòu)成，所述核心夾層折疊由六鏈和七鏈b-片層構(gòu)成。與其它銅氧還蛋白類似，銅離子同分布于扭曲四面體的四個(gè)保守殘基(His 85、Cysl38、Hisl43、 Metl48)組成的簇相配位。Walter, R. L.等人，J. Mol. Biol. 263 :730-51 (1996)。假天青蛋白假天青蛋白是含藍(lán)銅的單鏈多肽家族。SEQ ID NO :5顯示了獲自裂環(huán)無(wú)色桿菌的假天青蛋白的氨基酸序列。假天青蛋白的X-射線結(jié)構(gòu)分析顯示了其與天青蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)，盡管這些蛋白之間具有低序列同源性。假天青蛋白和天青蛋白的整體結(jié)構(gòu)之間存在兩個(gè)主要區(qū)別。相對(duì)于天青蛋白，假天青蛋白具有由兩個(gè)α-螺旋組成的羧基末端延伸。在中部肽區(qū)域，天青蛋白包含伸長(zhǎng)的環(huán)，而在假天青蛋白中具有縮短的環(huán)，其形成含有短α-螺旋的瓣(flap)。在銅原子位點(diǎn)上唯一的主要不同是，MET側(cè)鏈構(gòu)象和Met-S銅鍵長(zhǎng)度，其在假天青蛋白中明顯短于在天青蛋白中。植物花青苷(Phytocyanin)可鑒定為植物花青苷的蛋白質(zhì)包括但不局限于黃瓜堿性蛋白、漆樹花青苷、 mavicyanin、香辣根花青素、黃瓜剝皮銅氧還蛋白、推定的豌豆莢中的藍(lán)銅蛋白，以及一種來(lái)自擬南芥(Arabidopsis thaiiana)的藍(lán)銅蛋白。除黃瓜堿性蛋白和豌豆莢蛋白的所有其它蛋白中，通常位于軸向藍(lán)銅位點(diǎn)的甲硫氨酸配體被谷氨酰胺所替換。橙綠屈撓素從嗜熱綠色滑動(dòng)光合細(xì)菌橙色綠屈撓菌分離得到三種小型藍(lán)銅蛋白，命名為橙綠屈撓素A、橙綠屈撓素B-I和橙綠屈撓素B-2。兩種B型是糖蛋白，并且性質(zhì)幾乎彼此相同，但與A型不同。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示其表觀單體分子量分別為 14 (A)、18 (B-2)和 22(B-I)kDa。橙綠屈撓素A的氨基酸序列已被測(cè)定并顯示橙綠屈撓素A為一個(gè)具有139個(gè)殘基的多肽。Van Dreissche 等人，Protein Science 8:947-957(1999)。如果在已知的小銅蛋白質(zhì)體藍(lán)素和天青蛋白中均為進(jìn)化上保守的金屬配體的話，那么His58、Cysl23、HisUS和 Metl32以預(yù)期方式被分隔。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)也指出橙綠屈撓素具有與銅綠假單胞菌天青蛋白和白楊葉質(zhì)體藍(lán)素相似的普通桶狀結(jié)構(gòu)。但是，橙綠屈撓素看起來(lái)具有小銅蛋白序列類的序列特征。天青蛋白的共有序列的總體相似性大體上與質(zhì)體藍(lán)素的共有序列的總體相似性相同，即總體相似性為30. 5%。橙綠屈撓素N端序列區(qū)域1-18顯著地富含甘氨酸和羥基氨基酸。同前，參見來(lái)自橙色綠屈撓菌的橙綠屈撓素的A鏈的示例性氨基酸序列SEQ ID NO 15 (NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)ΑΑΜ12874)。橙綠屈撓素B分子具有標(biāo)準(zhǔn)的銅氧還蛋白折疊。已研究了來(lái)自橙色綠屈撓菌的橙綠屈撓素B的晶體結(jié)構(gòu)。Bond等人，J. Mol. Biol. 306 :47-67(2001).除了一個(gè)額外的N-端鏈以外，其分子與細(xì)菌銅氧還蛋白天青蛋白非常相似。如同在其它銅氧還蛋白中一樣，其中一個(gè)銅配基位于多肽的鏈4上，其它三個(gè)沿著鏈7和鏈8之間的大環(huán)。參照后面三個(gè)配基之間的氨基酸間隔討論了銅位點(diǎn)的幾何學(xué)。橙綠屈撓素B的晶體學(xué)特征的銅結(jié)合域可能被N端尾部限于細(xì)胞膜的外周胞質(zhì)側(cè)，該N端尾部顯示出與其它幾個(gè)膜相關(guān)電子傳遞蛋白中已知的鏈顯著的序列同一性。B型的氨基酸序列呈現(xiàn)于McManus等人J. Biol. Chem. 267 6531-6540(1992)中。參見來(lái)自橙色綠屈撓菌的橙綠屈撓素鏈B的示例性氨基酸序列SEQ ID NO 16 (NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)1QHQA)。漆樹花青苷漆樹花青苷是植物花青苷的一個(gè)亞類，是植物銅氧還蛋白的遍在家族。本文包括了作為漆樹花青苷的示例性序列SEQ ID N0:14。來(lái)自山葵根的一種漆樹花青苷——香辣根花青素的晶體結(jié)構(gòu)(Koch等人，J.Am. Chem. Soc. 127 :158-166(2005))和黃瓜漆樹花青苷的晶體結(jié)構(gòu)(Hart等人.，ftOtein Science 5:2175-2183(1996))也是已知的。該蛋白具有與其它植物花青苷相似的總折疊。肝配蛋白B2蛋白胞外域三級(jí)結(jié)構(gòu)具有與漆樹花青苷顯著的相似性。Toth等人，Developmental Cell 1:83-92(2001)。漆樹花青苷的示例性氨基酸序列可在國(guó)立生物技術(shù)信息中心蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)1JER，SEQ ID NO :14中找到。黃瓜堿性蛋白
本文包括了來(lái)自黃瓜堿性蛋白的示例性氨基酸序列SEQ ID NO :17。已將黃瓜堿性蛋白(CBP)，I型藍(lán)銅蛋白的晶體結(jié)構(gòu)分辨率精確到1.8A。該分子類似其它藍(lán)銅蛋白，具有回形拓?fù)洇峦盃罱Y(jié)構(gòu)，但桶狀結(jié)構(gòu)在一側(cè)開口，最好描述為“β-三明治”或“β-玉米面豆卷”。Guss等人，J. MoL Biol. 262 :686-705(1996)。肝配蛋白B2蛋白胞外域三級(jí)結(jié)構(gòu)與黃瓜堿性蛋白具有高度相似性(50個(gè)α碳rms偏差1.5Α)。Toth等人，Developmental Celll :83-92(2001)。銅原子具有通常的藍(lán)銅NNSS ‘配位，其鍵長(zhǎng)為Cu-N(His39) = 1.93 A,
Cu-S(Cys79) = 2.16 A,Cu-N(His84) = 1.95 A,Cu-S(Met89) = 2.61 Α。二硫化物連
接，(Cys52)-S-S-(Cys85)，在穩(wěn)定分子結(jié)構(gòu)中具有重要作用。在藍(lán)銅蛋白的亞家族(植物花青苷)，以及一種非金屬蛋白豚草過(guò)敏原Ra3中，多肽折疊是典型的，且CBP與其具有高度序列同一性。目前可鑒定為植物花青苷的蛋白是CBP、漆樹花青苷、mavicyanin、香辣根花青素、黃瓜剝皮銅氧還蛋白、推定的豌豆莢中的藍(lán)銅蛋白、以及來(lái)自擬南芥的藍(lán)銅蛋白。在除CBP和豌豆莢蛋白以外的其它所有蛋白中，通常位于軸向藍(lán)銅位點(diǎn)的甲硫氨酸配體被谷氨酰胺所替代。黃瓜堿性蛋白的示例性序列可在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)2CBP，SEQ ID NO 17中找到。使用方法本發(fā)明提供了在其他的健康患者中阻止惡性腫瘤的方法，所述方法包括向患者施用為如以上所描述的銅氧還蛋白，或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的至少一種肽。化學(xué)預(yù)防治療基于阻斷癌發(fā)生相關(guān)進(jìn)程可預(yù)防癌癥的發(fā)展的假說(shuō)?，F(xiàn)已知銅氧還蛋白銅綠假單胞菌天青蛋白和截短的天青蛋白肽M8通過(guò)抑制癌前病變的初始形成，或殺死或抑制所呈現(xiàn)的癌前病變的生長(zhǎng)抑制了癌前病變的發(fā)展。因此考慮了可將如以上所描述的具有抑制癌前病變的發(fā)展的能力的銅氧還蛋白， 或其變體、截短體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物在其它健康的患者中用于化學(xué)預(yù)防治療。在一些實(shí)施方案中，所述其它健康的患者指比一般人群具有發(fā)生癌癥的較高風(fēng)險(xiǎn)的患者。可通過(guò)利用本發(fā)明的組合物治療來(lái)預(yù)防的癌癥包括但不局限于，黑素瘤、乳腺癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、肺癌、結(jié)腸癌、頭頸癌、膀胱癌、前列腺癌、皮膚癌和宮頸癌。在一些實(shí)施方案中，患者可以是人。在另一些實(shí)施方案中，患者非人。本發(fā)明還包括優(yōu)先進(jìn)入癌細(xì)胞的組合物和方法?，F(xiàn)已知銅氧還蛋白，尤其是天青蛋白衍生物P18和p^通過(guò)本文所描述的某些機(jī)制進(jìn)入癌細(xì)胞，所述機(jī)制包括胞膜窖介導(dǎo)的胞吞作用，且可由高爾基體來(lái)介導(dǎo)。因此考慮了可使用銅氧還蛋白或其變體、衍生物、或結(jié)構(gòu)等價(jià)物進(jìn)入癌細(xì)胞并殺死癌細(xì)胞，并還可使用其穿越細(xì)胞膜轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)。本發(fā)明還包括研究癌癥的發(fā)展的方法，所述方法包括將哺乳動(dòng)物細(xì)胞在致癌物誘導(dǎo)前或誘導(dǎo)后與包含銅氧還蛋白或其變體、衍生物、截短體或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的組合物相接觸， 并觀察細(xì)胞發(fā)展。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是小鼠乳腺細(xì)胞，而在另一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是可能在哺乳動(dòng)物中變?yōu)閻盒约?xì)胞的其它細(xì)胞。比一般群體處于發(fā)生癌癥的較高風(fēng)險(xiǎn)的患者可以是具有高風(fēng)險(xiǎn)特征的患者、具有癌前病變的患者和其初始癌癥已被治愈或其癌前病變已被明確治療的患者。一般參見Tsao 等人，CA Cancer J Clin 54:150-18(^2004)。高風(fēng)險(xiǎn)特征可以是患者的行為因素、遺傳因素、環(huán)境因素或生理因素。使患者易患多種類型的癌癥的行為因素包括，但不局限于，吸煙、不良飲食、飲酒、激素替換治療、較高的體重指數(shù)、未經(jīng)產(chǎn)、檳榔使用、頻繁漱口劑的使用、暴露于人乳頭瘤病毒、兒童和慢性日光照射、首次性交的早期年齡、多個(gè)性伴侶和口服避孕藥的使用。使患者易患多種類型的癌癥的遺傳因素包括，但不局限于癌癥的家族史、BRCAl 和BRCA2的基因攜帶者身份、乳腺瘤的病史、家族性腺瘤性息肉病(FAP)、遺傳性非息肉性結(jié)腸直腸癌(HNPCC)、紅色或金黃色毛發(fā)和淺膚色表型、著色性干皮病和種族。使患者易患多種類型的癌癥的環(huán)境特征包括，但不局限于，暴露于氡、多環(huán)芳香烴類、鎳、鉻酸鹽、砷、石棉、氯甲基醚、苯并[a]芘、輻射和來(lái)自橡膠或涂料的職業(yè)性暴露的芳香胺類。使患者易患多種類型的癌癥的其它混雜因素包括，但不局限于，具有氣流阻塞的慢性阻塞性肺疾病、慢性膀胱感染、血吸蟲病、老齡和免疫受損狀況。此外，處于發(fā)生癌癥的較高風(fēng)險(xiǎn)的患者可通過(guò)使用多種已建立的用于某些類型的癌癥的風(fēng)險(xiǎn)模型來(lái)測(cè)定。例如，易患乳腺癌的患者可利用，除其它以外，feil風(fēng)險(xiǎn)模型或 Claus 模型來(lái)測(cè)定。參見 Gail 等人，J Natl Cancer Inst 81 :1879-1886(1989) ；Cuzick, Breast 12 :405-411(2003) ；Huang 等人，Am J Epidemiol 151:703-714 0000)。具有癌前病變的患者比一般群體處于發(fā)生癌癥的較高風(fēng)險(xiǎn)?；颊咧械陌┣安∽兊拇嬖诳赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種方法來(lái)測(cè)定?？稍诨颊咧袦y(cè)量源自癌前病變的中間標(biāo)記物或生物標(biāo)記物，以測(cè)定患者是否具有癌前病變。染色體畸變發(fā)生于絕大多數(shù)癌癥患者中的腫瘤細(xì)胞中和鄰近的組織學(xué)正常的組織中。染色體畸變的進(jìn)程與癌前病變到浸潤(rùn)性癌癥的表型進(jìn)程平行。Thiberville等人，Cancer Res. 55 :5133-5139 (1995)。因此可將與癌癥相關(guān)的染色體畸變用作檢測(cè)患者中癌前病變的中間標(biāo)記物。與癌癥相關(guān)的常見染色體畸變包括，但不局限于，腫瘤抑制子基因的等位缺失或雜合丟失(LOH)，所述腫瘤抑制子基因諸如3p (FHIT和其它)、9p (pl6INK4、pi. 5INK4B和pl9層的9p21)、17p (p53基因和其它基因的17pl3)和13q(視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因Rb和其它基因的13ql4)。3p和9p中的缺失與吸煙和肺癌的早期階段相關(guān)。Mao等人，J. Natl. Cancer Inst. 89 :857-862 (1997)。影響3p、 5q、8p、17p和18q的缺失在上皮癌中是常見的改變。一般參見Tsao等人.，CA Clin. Cancer J. Clin. 54:153 0004)。與癌癥相關(guān)的其它染色體突變包括激活癌基因的那些。其存在可用作中間標(biāo)記物的癌基因包括，但不局限于，Ras、c-myc、表皮生長(zhǎng)因子、erb_B2和細(xì)胞周期蛋白E、Dl和Bi。一般參見同前巧4處。其它中間標(biāo)記物可以是癌前細(xì)胞和癌癥細(xì)胞中上調(diào)的基因的產(chǎn)物。在癌前細(xì)胞中可能上調(diào)的基因包括，但不局限于環(huán)氧合酶C0X-1和C0X-2、端粒酶。癌癥細(xì)胞和一些癌前細(xì)胞的其它生物標(biāo)記物包括，但不局限于，P53、表皮生長(zhǎng)因子受體(GFR)、增殖細(xì)胞核抗原 (PCNA)、RAS、C0X-2、Ki-67、DNA 異倍體、DNA 聚合酶-α、ER、Her2neu、E_ 鈣粘著蛋白、RAR β、 hTERT、pl6INK4a、FHIT (3pl4)、Bcl_2、VEGF-R、HPV 感染、L0H9p21、LOH 17p、p_AKT、hnRNPA2/ Bi、RAF、Myc, c_KIT、細(xì)胞周期蛋白 Dl、E 和 Bi、IGFU bcl_2、pl6、LOH 3p21. 3、L0H3p25、 L0H9p 2 ULOH 17p 13、LOH 13 q、L0H8p、hMSH2、APC、DCC、DPC4、JV18、BAX、PSA、GSTP1、NF-kB、 API、D3S2、HPV 感染、LOH 3pl4、L0H4q、LOH 5p、膀胱腫瘤抗原(BTA)、BTK TRAK(Alidex, Inc. ,Redmond WA)、尿道基質(zhì)蛋白22、纖維蛋白降解產(chǎn)物、自分泌運(yùn)動(dòng)因子受體、BCLA-4、細(xì)胞角蛋白20、透明質(zhì)酸、CYFRA 21-l、BCA、i3-人絨毛膜促性腺激素和組織多肽抗原(TPA)。 一般參見同前155-157處。其初始癌癥已被治愈或其癌前病變已被明確治療的患者也比一般群體處于發(fā)生癌癥的較高風(fēng)險(xiǎn)。第二原發(fā)性腫瘤指具有癌癥史的患者中的新型原發(fā)性癌。第二原發(fā)性腫瘤是頭頸癌中死亡的首要原因。同前150處。第二原發(fā)性腫瘤與轉(zhuǎn)移的不同之處在于前者新生而后者源自已有的腫瘤。乳腺癌、頭頸癌、肺癌和皮膚癌的癌癥或癌前病變已被治愈的患者處于發(fā)生第二原發(fā)性腫瘤的極高風(fēng)險(xiǎn)中?？蓪~氧還蛋白或其變體、衍生物、截短體或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的組合物通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種途徑和在多種方案中施用給患者。在特定的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物被靜脈施用、肌內(nèi)施用、皮下施用、局部施用、口腔施用或通過(guò)吸入來(lái)施用。可通過(guò)將肽遞送到處于發(fā)生癌癥風(fēng)險(xiǎn)的患者中的部位的任何方式來(lái)向患者施用組合物。在特定的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白或其變體、衍生物、截短體或結(jié)構(gòu)等價(jià)物是靜脈施用的。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法可包括向患者共施用一個(gè)單位劑量的包含銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物、截短體或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的組合物和一個(gè)單位劑量的包含另一化學(xué)預(yù)防藥物的組合物，以任何順序在大約同時(shí)施用，或在施用其它之后的大約給定時(shí)間內(nèi)來(lái)施用，例如，施用其它藥物后的大約1分鐘至大約60分鐘，或施用其它藥物后的大約1小時(shí)至大約12小時(shí)。感興趣的化學(xué)預(yù)防藥物包括，但不局限于，他莫昔芬、芳香酶抑制物諸如來(lái)曲唑和阿納托唑(Arimidex ),類視黃醇類諸如N-[4-羥苯基]維胺酯0-HPR，芬維 A胺)、非甾體抗炎劑(NSAID)諸如阿司匹林(aspirin)和舒林酸(sulindac)、塞來(lái)考昔 (celecoxib) (C0X-2抑制物)、二氟甲基鳥氨酸(DFMO)、熊去氧膽酸、3_羥基_3_甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制物、EKI-785 (EGFR抑制物)、貝伐單抗(bevacizumab) (VEGF受體的抗體)、西妥昔單抗(cetuximab) (EGFR的抗體)、視黃醇諸如維生素Α、β -胡蘿卜素、13-順式視黃酸、異維甲酸和棕櫚酸視黃酯、α -生育酚、干擾素、溶瘤腺病毒dll520(0NYX-015)、 吉非替尼(gefitinib)、依曲替酯(etretinate)、非那司提(finasteride)、吲哚_3_甲醇、 白藜蘆醇(resveratrol)、氯原酸、雷洛昔芬和奧替普拉(oltipraz)。用于協(xié)助化合物進(jìn)入癌細(xì)胞和腫瘤的組合物本發(fā)明涉及用于遞送貨物化合物進(jìn)入細(xì)胞的方法和材料。根據(jù)本發(fā)明的貨物化合物的遞送通過(guò)使用適宜的轉(zhuǎn)運(yùn)多肽來(lái)完成。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述貨物化合物與轉(zhuǎn)運(yùn)多肽連接。適宜的轉(zhuǎn)運(yùn)肽包括銅氧還蛋白，或含有“銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域”的銅氧還蛋白的片段。術(shù)語(yǔ)“銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域”指包含銅氧還蛋白進(jìn)入哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞所需要的氨基酸序列的銅氧還蛋白的片段。通過(guò)本發(fā)明遞送的貨物化合物包括但不限于蛋白質(zhì)、脂蛋白、多肽、肽、多糖、核酸，包括RNA、DNA和反義核酸、染料、熒光和放射性標(biāo)簽、微粒或納米微粒、毒素、無(wú)機(jī)分子和有機(jī)分子、小分子和藥物(例如，化學(xué)預(yù)防藥物)。在一些實(shí)施方案中，所述藥物和毒素殺死腫瘤細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白是天青蛋白，比如來(lái)自銅綠假單胞菌的天青蛋白(SEQ ID NO :1)。在本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白尤其是質(zhì)體藍(lán)素、鐵硫菌藍(lán)蛋白或假天青蛋白。在特定的實(shí)施方案中，天青蛋白尤其來(lái)自銅綠假單胞菌、丁香假單胞菌、腦膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、副溶血性弧菌或支氣管炎博德特菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，遞送貨物化合物以殺死細(xì)胞或延遲細(xì)胞周期進(jìn)程，所述細(xì)胞比如癌細(xì)胞。這樣的癌細(xì)胞可以是，例如尤其是骨肉瘤細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞、白血病細(xì)胞、軟組織肉瘤細(xì)胞或乳腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞或前列腺癌細(xì)胞。例如，所述貨物化合物可以尤其是細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，例如P53 ；細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制物，比如pl6、p21或p27 ；自殺蛋白，諸如胸苷激酶或硝基還原酶；細(xì)胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)蛋白，諸如白細(xì)胞介素1、白細(xì)胞介素2或粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)； 或毒素，諸如銅綠假單胞菌外毒素A。在其它實(shí)施方案中，遞送了上述化合物種類之一的生物活性片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，遞送貨物化合物以生成靶組織的圖像。例如，所述靶組織可以是癌癥，且貨物化合物可以是常用于生成用于X-射線計(jì)算機(jī)斷層攝影(CT)、磁共振成像(MRI)和超聲的檢測(cè)的圖像的化合物。在這些實(shí)施方案中，所述貨物化合物是伽馬射線或正電子發(fā)射放射同位素、磁共振成像造影劑、X射線造影劑或超聲造影劑。本發(fā)明還包括將DNA或RNA選擇性地導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞的方法。在這樣的實(shí)施方案中，所述DNA或RNA是貨物化合物。在一些實(shí)施方案中，該方法包括提供與DNA或 RNA偶聯(lián)的pl8或p28，并將所述化合物導(dǎo)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，所述DNA 或RNA是基因或基因片段。在一些實(shí)施方案中，所述DNA或RNA經(jīng)導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞后具有治療性作用。銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其允許肽優(yōu)先進(jìn)入到癌細(xì)胞中，以及將相連接的貨物轉(zhuǎn)運(yùn)到哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞中而不是非癌細(xì)胞中。已發(fā)現(xiàn)銅氧還蛋白包含蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域，其可促進(jìn)相連接的貨物進(jìn)入哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，可使用完整的銅氧還蛋白來(lái)協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)相連的貨物選擇性地進(jìn)入癌細(xì)胞。在另一些實(shí)施方案中，可使用銅氧還蛋白的部分轉(zhuǎn)運(yùn)相連的貨物進(jìn)入癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域由銅氧還蛋白的區(qū)域組成，該區(qū)域長(zhǎng)度小于全長(zhǎng)的野生型蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域由銅氧還蛋白的超過(guò)約10個(gè)殘基、 約15個(gè)殘基或者約20個(gè)殘基組成。在一些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域由銅氧還蛋白的不超過(guò)約50個(gè)殘基、約40個(gè)殘基或者約30個(gè)殘基組成。在一些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域與銅氧還蛋白具有至少約90%的氨基酸序列同一性、至少約95%的氨基酸序列同一性或者至少約99%的氨基酸序列同一性。在一些實(shí)施方案中，所述銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域是天青蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，天青蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域至少含有銅綠假單胞菌天青蛋白的第50-77位氨基酸，P^(SEQ ID NO :2)。在本發(fā)明另一些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域至少含有銅綠假單胞菌天青蛋白的第36-77位氨基酸(SEQ ID NO :27)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域至少含有銅綠假單胞菌天青蛋白的第36-89位氨基酸(SEQ ID NO 28)。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域至少含有銅綠假單胞菌天青蛋白的第36-1 位氨基酸(SEQ ID NO :29)。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域至少含有銅綠假單胞菌天青蛋白的第50-67位氨基酸(SEQ ID N0:25)。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域至少含有銅綠假單胞菌天青蛋白的第53-70位氨基酸(SEQ ID N0:30)。在本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域至少含有銅綠假單胞菌天青蛋白的第53-64位氨基酸(SEQID NO 31)。本文所描述的實(shí)施例，特別是實(shí)施例19，表明在pl8上不存在的p^的C-末端區(qū)域(第50-67位氨基酸)極可能與細(xì)胞膜上的特定的殘基接觸并提供通向細(xì)胞的通道。就此，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域是至少含有P^的第66-77位氨基酸(SEQ ID NO. 35)的天青蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域是至少含有P28的第68-77位氨基酸(SEQ ID NO. 36)的天青蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域。 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域是至少含有P28的第67-77位氨基酸(SEQ ID NO. 37)的天青蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域包含位于SEQ IDN0. 2的第69、70、75、76和85位的氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域包含位于SEQ ID NO. 2的第69、70、75、76和85位的氨基酸。 在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域是來(lái)自除銅綠假單胞菌天青蛋白之外的銅氧還蛋白的進(jìn)入結(jié)構(gòu)域。在不同的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域可以是來(lái)自藍(lán)細(xì)菌層理席藻的質(zhì)體藍(lán)素(SEQ ID NO :3)、來(lái)自氧化亞鐵硫桿菌的鐵硫菌藍(lán)蛋白 (SEQ ID NO 4)；來(lái)自裂環(huán)無(wú)色桿菌的假天青蛋白(SEQ ID NO :5)、來(lái)自丁香假單胞菌的天青蛋白(SEQ ID NO :21)、來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌的天青蛋白(SEQ ID N0:10)、來(lái)自副溶血弧菌的天青蛋白(SEQ ID NO 8)或來(lái)自橙色綠屈撓菌的橙綠屈撓素(SEQ ID N0:15和16) 的片段。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域至少含有橙色綠屈撓菌橙綠屈撓素B的第57-89位氨基酸(SEQ ID NO :20)。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域至少含有丁香假單胞菌天青蛋白的第51-77位氨基酸(SEQ ID N0:21)。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域至少含有腦膜炎奈瑟氏球菌Laz的第89-115 位氨基酸(SEQ ID N0:22)。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域至少含有副溶血弧菌天青蛋白的第52-78位氨基酸(SEQ ID NO :23)。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中， 銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域至少含有支氣管炎博德特菌天青蛋白的第51-77位氨基酸(SEQ ID NO 24)。銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域的修飾在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域被化學(xué)修飾或遺傳改變以產(chǎn)生保留了優(yōu)先進(jìn)入細(xì)胞和/或?qū)⒇浳锘衔镛D(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞的能力的變體。例如，實(shí)施例14顯示了在第M、61和70位導(dǎo)入脯氨酸殘基的銅綠假單胞菌天青蛋白保留了其進(jìn)入 UISO-Mel-2細(xì)胞的能力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域包含保守的氨基酸序列 DGXXXXXDXXYXKXXD (SEQ ID NO 32)或 DGXXX)(DXX^(KX)(D (SEQ ID NO :33)，其中 D 是天冬氨酸、G是甘氨酸、Y是酪氨酸、K是賴氨酸和X是任意氨基酸。參見實(shí)施例17。銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域的變體可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)合成。衍生物是直接形成自天然化合物或經(jīng)修飾或部分取代形成的氨基酸序列。類似物是與天然化合物結(jié)構(gòu)相似但不相同、 在某些組分或側(cè)鏈有所不同的氨基酸序列。類似物可以是合成的，也可以來(lái)自不同的進(jìn)化起源。如果衍生物或類似物含有修飾的氨基酸，則變體可以是全長(zhǎng)的或不是全長(zhǎng)的。銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域的變體包括但不局限于包含某些區(qū)域的分子，所述區(qū)域與銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域基本上同源，在相同大小的氨基酸序列上或當(dāng)與比對(duì)的序列進(jìn)行比較(其中通過(guò)同源性算法進(jìn)行比對(duì))時(shí)，具有至少約65%、70%、75%、85%、90%、95%、98%或99%的同一性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域的變體與銅綠假單胞菌的天青蛋白第50-77位殘基，p28(SEQ ID NO 2)具有顯著的結(jié)構(gòu)相似性。在另一些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域的變體與銅綠假單胞菌的天青蛋白殘第50-67位殘基，pl8 (SEQ ID NO 25)具有顯著的結(jié)構(gòu)相似性。測(cè)定銅氧還蛋白和其它蛋白之間顯著的結(jié)構(gòu)同源性的研究的例子包括iToth等人(Developmental cell 1 :82-92 (2001))。具體的，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域的變體與銅綠假單胞菌的天青蛋白第50-77位殘基(SEQ ID NO : 之間顯著的結(jié)構(gòu)同源性是通過(guò)使用 VAST 算法測(cè)定的(Gibrat 等人，Curr Opin Struct Biol 6:377-385(1996)； Madej等人，Proteins 23:356-3690(1995))。在特定的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域變體與銅綠假單胞菌天青蛋白第50-77位殘基(SEQ ID NO 2)結(jié)構(gòu)對(duì)比的VAST ρ值小于約10_3，小于約10_5或者小于約10_7。在另一些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域的變體與銅綠假單胞菌天青蛋白第50-77位殘基(SEQ ID NO⑵之間顯著的結(jié)構(gòu)同源性可通過(guò)使用 DALI 算法(Holm & Sande, J Mol. Biol. 233 :123-138(1993))來(lái)測(cè)定。在具體的實(shí)施方案中，配對(duì)結(jié)構(gòu)對(duì)比的DALIZ評(píng)分為至少約3. 5、至少約7. 0或者至少約10. 0?？墒褂帽绢I(lǐng)域中已知的方法對(duì)銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域進(jìn)行修飾，比如寡聚核苷酸介導(dǎo)的(定點(diǎn))誘變、丙氨酸掃描、PCR誘變和本文所公開的方法和技術(shù)。可對(duì)克隆的DNA進(jìn)行定點(diǎn)誘變(Carter, Biochem J. 237 :1-7(1986) ；ZolIer 禾Π Smith，Methods Enzymo 1. 154 329-50(1987))、盒式誘變(cassette mutagenesis)、限制性選擇誘變(Wells 等人，Gene 34:315-23(1985))或其它已知的技術(shù)以產(chǎn)生銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域變體核酸。此外，編碼與銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域具有結(jié)構(gòu)相似性的進(jìn)入結(jié)構(gòu)域的核苷酸可通過(guò)本領(lǐng)域中熟知的方法來(lái)合成。并且，野生型或變體銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域的蛋白分子可通過(guò)本領(lǐng)域中所熟知的方法來(lái)合成。編碼銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域和與貨物化合物連接的銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域的復(fù)合物的核酸在另一方面，本發(fā)明提供了編碼融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含與貨物化合物連接的銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域，其中所述貨物化合物是蛋白質(zhì)或肽。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可通過(guò)本領(lǐng)域中已知技術(shù)的組合來(lái)制備。例如，可通過(guò)化學(xué)合成或克隆分別制備銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域和貨物化合物的核酸序列。然后用連接酶將核酸序列順序相連而得到感興趣的核酸分子。使用銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域遞送貨物化合物的方法已知許多富精氨酸肽通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜而轉(zhuǎn)位并攜帶蛋白質(zhì)貨物化合物進(jìn)入此類細(xì)胞。Suzuki. T.，等人· J.Biol· Chem. 277 :2437-43 0002)。例如，HIV Tat 蛋白的富精氨酸的11個(gè)氨基酸短片段(第47-57位氨基酸)允許貨物蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。Schwarze, SR.，等人.Trends Cell Biol. 10 :290-95 (2000)。已顯示增加 α -螺旋含量并優(yōu)化精氨酸殘基位置的合成的進(jìn)入結(jié)構(gòu)域增強(qiáng)了其作為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的潛力。Ho， Α.，等人Cancer Res. 61 :474-77 (2001)。相比之下，銅氧還蛋白天青蛋白只有一個(gè)精氨酸殘基。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括協(xié)助貨物化合物進(jìn)入細(xì)胞的那些銅氧還蛋白片段的使用，比如pl8(SEQ ID NO. 25)和p28 (SEQ ID NO. 2)。這樣的片段可通過(guò)鑒定進(jìn)入細(xì)胞所需的那些片段的任何方法來(lái)測(cè)定。在一個(gè)這樣的方法中，將銅氧還蛋白片段與標(biāo)記物質(zhì)連接并進(jìn)行檢驗(yàn)以測(cè)定銅氧還蛋白片段是否進(jìn)入細(xì)胞?？墒褂眠@樣的方法來(lái)鑒定以上所討論的銅氧還蛋白的適宜片段。在本發(fā)明的不同實(shí)施方案中，所述貨物化合物連接于銅氧還蛋白或其片段，比如來(lái)自銅綠假單胞菌的天青蛋白(SEQ ID NO 1)；來(lái)自藍(lán)細(xì)菌層理席藻的質(zhì)體藍(lán)素(SEQ ID NO 3)；來(lái)自氧化亞鐵硫桿菌的鐵硫菌藍(lán)蛋白(SEQ ID NO 4)；或來(lái)自裂環(huán)無(wú)色桿菌的假天青蛋白(SEQ ID NO :5)、來(lái)自丁香假單胞菌的天青蛋白的片段(SEQ ID N0:21)、來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌的天青蛋白(SEQ ID NO :10)、來(lái)自副溶血弧菌的天青蛋白(SEQ IDN0:19)、來(lái)自支氣管炎博德特菌的天青蛋白(SEQ ID N0:8)、來(lái)自橙色綠屈撓菌的橙綠屈撓素A和B(SEQ ID NO :15和16)，以及其它天青蛋白和天青蛋白樣蛋白。在另一些實(shí)施方案中，所述貨物與銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域諸如 p28 (SEQ ID NO 2), ρ 18 (SEQ ID NO :25)，或 SEQ IDNO :35-37 中任何一個(gè)連接。在本發(fā)明的不同實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域可在體外、離體或體內(nèi)將貨物化合物遞送到細(xì)胞中。例如，可通過(guò)將銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域和貨物化合物的復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)諸如巴氏涂片(pap smear)中來(lái)實(shí)現(xiàn)體外遞送?？蛇x地，可通過(guò)將復(fù)合物加入取自患者的樣品如血液、組織或骨髓中并將處理后的樣品返回至患者來(lái)實(shí)現(xiàn)離體遞送。還可通過(guò)將所述復(fù)合物直接施用給患者來(lái)實(shí)現(xiàn)遞送。本發(fā)明的方法可用于治療、預(yù)防、診斷或研究目的。通過(guò)本發(fā)明所遞送的貨物化合物包括但不限于蛋白質(zhì)、脂蛋白、多肽、肽、多糖、 核酸，包括反義核酸，染料、微粒和納米顆粒、毒素、有機(jī)分子和無(wú)機(jī)分子、小分子及藥物。在一個(gè)實(shí)施方案中，可檢測(cè)的物質(zhì)，例如，熒光物質(zhì)，比如綠色熒光蛋白；發(fā)光物質(zhì)；酶，比如β -半乳糖苷酶；或?qū)⒎派錁?biāo)記的蛋白或生物素化的蛋白遞送至細(xì)胞而賦予細(xì)胞可檢測(cè)的表型。相似地，可將標(biāo)記有可檢測(cè)的物質(zhì)諸如熒光物質(zhì)的微?；蚣{米顆粒進(jìn)行遞送。適宜的納米顆粒的一個(gè)例子可見于2002年5月7日授權(quán)的美國(guó)專利第6，383，500 號(hào)，其在此通過(guò)引用并入。許多這樣的可檢測(cè)物質(zhì)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。在一些實(shí)施方案中，所述貨物化合物是適宜于X-射線計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)(CT)、磁共振成像、超聲成像或放射性核素閃爍成像術(shù)的可檢測(cè)物質(zhì)。在這些實(shí)施方案中，向患者施用貨物化合物以用于診斷目的。造影劑可作為貨物化合物來(lái)施用以加強(qiáng)通過(guò)X-射線CT、 MRI和超聲獲得的圖像。通過(guò)銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域來(lái)施用靶向腫瘤組織的放射性核素貨物化合物可用于放射性核素閃爍成像術(shù)。在一些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域可含有具有貨物化合物或不具有貨物化合物的放射性核素。在另一些實(shí)施方案中，所述貨物化合物是發(fā)出伽馬射線或正電子的放射性同位素、磁共振成像造影劑、χ-射線造影劑或超聲造影劑。適宜于貨物化合物的超聲造影劑包括，但不局限于，生物相容性氣體微氣泡、液體載體以及表面活性劑微球，在靶向部分與微氣泡之間可進(jìn)一步包含任選的連接部分k。在該上下文中，術(shù)語(yǔ)液體載體意為水溶液，且術(shù)語(yǔ)表面活性劑意為可降低溶液界面張力的任何兩親性物質(zhì)。ΕΡ0727225Α2中公開了用于形成表面活性劑微球的適宜的表面活性劑列表， 在此通過(guò)引用并入。術(shù)語(yǔ)表面活性劑微球包括納米球、脂質(zhì)體、運(yùn)載體及其類似物。生物相容性氣體可以是空氣或碳氟化合物，例如C3-C5全氟烷，其提供回聲產(chǎn)生的差異而在超聲成像中形成反差。使所述氣體包囊于或含于微球中，所述微球任選地通過(guò)連接基團(tuán)而連接著銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域。連接可以是共價(jià)的、離子的或者通過(guò)范德華力。此類造影劑的具體例子包括脂質(zhì)包囊的全氟碳，其具有多種腫瘤新生血管受體結(jié)合肽、多肽或肽模擬物。適宜于作為貨物化合物使用的X-射線造影劑包括，但不局限于一種或多種原子序號(hào)20或以上的、X射線吸收原子或“重”原子，在銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域和X-射線吸收原子之間可進(jìn)一步包含任選的連接部分Ln。X-射線造影劑中經(jīng)常使用的重原子是碘。最近， 已公開了包含金屬螯合物的X-射線造影劑(例如美國(guó)專利第5，417，959號(hào))和包含多個(gè)金屬離子的多螯合物(例如美國(guó)專利第5，679，810號(hào))。更近地，已公開了作為X-射線造影劑的多核簇狀復(fù)合物(multinuclear cluster complexes)(例如美國(guó)專利第5，804，161 號(hào)、PCT W091/14460，和 PCT WO 92/17215)。適宜用作貨物化合物的MRI造影劑包括，但不局限于，一種或多種順磁性金屬離子，在銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域和順磁性金屬離子之間可進(jìn)一步包含任選的連接部分Ln。順磁性金屬離子以金屬?gòu)?fù)合物或金屬氧化物微粒的形式存在。美國(guó)專利第5，412，148號(hào)和第5，760，191號(hào)描述了用于MRI造影劑中順磁性金屬離子的螯合劑的例子。美國(guó)專利第 5，801，228號(hào)、第5，567，411號(hào)和第5，281，704號(hào)描述了在MRI造影劑中使用的用于復(fù)合一個(gè)以上順磁性金屬離子的多螯合劑的例子。美國(guó)專利第5，520，904號(hào)描述了用作MRI造影劑的由順磁性金屬離子組成的顆?；M合物的例子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，遞送貨物化合物以殺死細(xì)胞或延遲細(xì)胞周期進(jìn)程，所述細(xì)胞比如癌細(xì)胞。這樣的癌細(xì)胞可以是，例如，骨肉瘤細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞、白血病細(xì)胞、軟組織肉瘤細(xì)胞或乳腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞或前列腺癌細(xì)胞。 例如，所述貨物化合物可以是細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，例如P53 ；細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制物，比如pl6、p21或p27 ；自殺蛋白，諸如胸苷激酶或硝基還原酶；細(xì)胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)蛋白，諸如白細(xì)胞介素1、白細(xì)胞介素2或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)；或毒素， 諸如銅綠假單胞菌外毒素A。在另一些實(shí)施方案中，遞送了上述化合物種類之一的生物活性片段。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述貨物化合物是核酸。在一些實(shí)施方案中，所述核酸編碼上述種類的化合物之一。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述貨物化合物是用于治療癌癥的藥物。這樣的藥物包括，例如5-氟尿嘧啶；干擾素α ；氨甲喋呤；他莫昔芬；和長(zhǎng)春新堿。上述例子僅用于示例目的，許多其它此類化合物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在另一些實(shí)施方案中，所述核酸用于基因治療。適用于治療癌癥的貨物化合物包括但不局限于，烷化劑，比如氮芥、烷基磺酸鹽、 亞硝脲、氮丙啶和三氮烯(triazene)；抗代謝物，比如葉酸拮抗劑、嘌呤類似物及嘧啶類似物；抗生素，比蒽環(huán)類、博來(lái)霉素、絲裂霉素、放線菌素D和普卡霉素(plicamycin)；酶， 比如L-天冬酰胺酶；法呢基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制物；5 α -還原酶抑制物；3型17 β -羥基類固醇脫氫酶抑制物；激素劑，比如糖皮質(zhì)激素、雌激素/抗雌激素、雄激素/抗雄激素、 黃體酮及促黃體生成素釋放激素拮抗劑、醋酸奧曲肽(octreotide acetate)；微管破壞劑，諸如海鞘素或其類似物和衍生物；微管穩(wěn)定劑，比如紫杉烷類(taxane)，諸如紫杉醇 (Taxol )、多西紫杉醇(Taxotere )，及其類似物，和埃坡霉素諸如埃坡霉素A-F和其類似物；植物衍生制品，諸如長(zhǎng)春花生物堿、表鬼白毒素、紫杉烷類；和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制物 ’異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶抑制物；和混合制劑，例如羥基脲、普魯芐胼、米托坦(mitotan)、六甲蜜胺 (hexamethylmelamine)、鉬配位復(fù)合物，諸如順鉬和卡鉬；以及其它用于抗癌的劑和細(xì)胞毒性劑，諸如生物反應(yīng)修飾物、生長(zhǎng)因子；免疫調(diào)節(jié)物和單克隆抗體。這些種類的抗癌劑和細(xì)胞毒性劑的代表性例子包括但不限于鹽酸氮芥、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、白消安、亞硝脲氮芥、羅莫司汀 (Iomustine)、司莫司汀(semustine)、鏈脲霉素、硫替哌、達(dá)卡巴嗪(dacartazine)、氨甲喋呤、硫鳥嘌呤、巰嘌呤、氟達(dá)拉濱(fludarabine)、pentastatin、克拉屈濱(cladribin)、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、鹽酸阿霉素、柔紅霉素、伊達(dá)比星(idarubicin)、硫酸博來(lái)霉素、絲裂霉素C、放線菌素D、番紅菌素、番紅霉素、喹癌菌素、盤皮海綿內(nèi)酯、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿、酒石酸脫水長(zhǎng)春花堿、鬼白亞乙苷、磷酸鬼白亞乙苷、替尼泊苷、紫杉醇、他莫昔芬、雌氮芥、雌氮芥磷酸鈉、氟他胺(flutamide)、布舍瑞林(buserelin)、亮丙瑞林(Ieuprolide)、蝶啶、 diyneses、左旋咪唑、aflacon、干擾素、白細(xì)胞介素、阿地白介素、非格司亭(filgrastim)、 沙莫司亭(sargramostim)、利妥昔單抗(rituximab)、卡介苗、維甲酸、鹽酸依立替康、倍他米松(betamethosone)、鹽酸吉西他濱、六甲蜜胺和托泊替康(topoteca)及其任何類似物或衍生物。這些種類的優(yōu)選成員包括，但不局限于，紫杉醇、順鉬、卡鉬、阿霉素、洋紅霉素、柔紅霉素、氨基蝶呤、氨甲蝶呤、甲氨蝶呤、絲裂霉素C、海鞘素743或紫菜霉素、5-氟尿嘧啶、 6-巰基嘌呤、吉西他濱、阿糖胞苷、鬼白毒素或者鬼白毒素衍生物諸如鬼白亞乙苷、磷酸鬼臼亞乙苷或替尼泊苷、苯丙氨酸氮芥、長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春新堿、異長(zhǎng)春堿、脫乙酰長(zhǎng)春花堿及環(huán)氧長(zhǎng)春堿。用作貨物化合物的抗癌和其它細(xì)胞毒性劑的例子包括如下德國(guó)專利第 4138042. 8 號(hào)；WO 97/19086、WO 98/22461、WO 98/25929、WO 98/38192、WO 99/01124、 WO 99/02224、WO 99/02514、WO 99/03848、WO 99/07692、WO 99/27890、WO 99/28324、 WO 99/43653、WO 99/54330、WO 99/54318、WO 99/54319、WO 99/65913、WO 99/67252、WO 99/67253和WO 00/00485中發(fā)現(xiàn)的埃坡霉素衍生物；WO 99/24416中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制物(還參見美國(guó)專利第6，040，321號(hào))；及WO 97/30992和W098/54966中發(fā)現(xiàn)的異戊二烯基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制物；和諸如美國(guó)專利第6，011，029中一般和具體描述的那些劑(此美國(guó)專利的所述化合物可與任何NHR調(diào)節(jié)物(包括但不局限于本發(fā)明中的那些)諸如AR調(diào)節(jié)物、ER調(diào)節(jié)物以及LHRH調(diào)節(jié)物或者手術(shù)去勢(shì)聯(lián)用，特別是在治療癌癥中)。當(dāng)連同本發(fā)明的化合物用作貨物化合物時(shí)，可以Wiysicians，Desk Reference (內(nèi)科醫(yī)生案頭參考資料，PDR)中指定的或按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所測(cè)定的那些量來(lái)使用上述其它治療劑。含有銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域的藥物組合物含有、包含銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域或由銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域組成的藥物組合物，以及含有與貨物化合物連接的銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域的復(fù)合物的藥物組合物可通過(guò)任何常規(guī)方法來(lái)制備，例如，通過(guò)常規(guī)混合、溶解、顆?；?、包被糖衣、乳化、包囊化、封入 (entrapping)或凍干方法。所述復(fù)合物可易于與本領(lǐng)域中熟知的藥學(xué)上可接受的載體相組合。這種載體使制劑能夠以片劑、丸劑、糖衣片、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑、懸液和類似的形式來(lái)配制。適宜的賦形劑還可包括，例如，充填劑和纖維素制劑。其它賦形劑可包括，例如，調(diào)味劑、著色劑、防粘劑、增稠劑以及其它可接受的添加劑、佐劑或粘合劑。這種組合物可用于例如細(xì)胞類型的檢測(cè)或成像或用于與細(xì)胞死亡有關(guān)的病癥的治療或其預(yù)防。所述組合物可以足以預(yù)防或治療與細(xì)胞死亡抗性有關(guān)的病癥的量來(lái)施用。 如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“與細(xì)胞死亡抗性有關(guān)的病癥”指疾病、狀態(tài)或不適，其特征為由適當(dāng)?shù)?、熟練的醫(yī)師或臨床醫(yī)師判定的、與同種健康細(xì)胞相比至少細(xì)胞壽命延長(zhǎng)的趨勢(shì)。通常， 宿主生物體是哺乳動(dòng)物，比如人或動(dòng)物。含有銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域的組合物的施用含有銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域的組合物可通過(guò)任何適宜的途徑來(lái)施用，例如，通過(guò)口服、口腔、吸入、舌下、直腸、陰道、經(jīng)尿道、鼻腔、局部、經(jīng)皮(即透皮)或胃腸外(包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下及冠狀動(dòng)脈內(nèi)施用)來(lái)施用。組合物及其藥物制劑可以有效達(dá)到其預(yù)期目的的任何的量來(lái)施用。當(dāng)施用以用于治療與細(xì)胞死亡抗性有關(guān)的病癥時(shí)，所述組合物應(yīng)以治療有效量來(lái)施用。“治療有效量”是有效預(yù)防受治療者的現(xiàn)有癥狀的發(fā)展或緩解現(xiàn)有癥狀的量。治療有效量的測(cè)定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。當(dāng)然，適宜的劑量將根據(jù)以下而不同，例如所應(yīng)用的含有銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域的化合物、宿主、施用方式以及被治療或診斷的病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重性。然而，在本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，在每日劑量為約0. 001到約20mg/kg體重的含有銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域的化合物時(shí)獲得了令人滿意的人體療效。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于治療人體的指定的每日劑量的范圍為從約0. 7mg到約1400mg的含有銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域的化合物，其可例如以每日劑量、每周劑量、每月劑量和/或持續(xù)給藥來(lái)方便地施用。每日劑量可以是每天1 到12次的不連續(xù)劑量?？蛇x地，劑量可以每?jī)商?、每三天、每四天、每五天、每六天、每周及類似遞增至每31天來(lái)施用?？墒褂萌我膺m當(dāng)?shù)慕o藥形式包括片劑、貼劑、靜脈內(nèi)施用及其類似的形式進(jìn)行連續(xù)的、間歇的或單劑的給藥。更具體地，組合物以治療有效量來(lái)施用。在具體的實(shí)施方案中，治療有效量為從約0. 01-20mg/kg體重。在具體的實(shí)施方案中，劑量水平為約 10mg/kg/ 日、約 15mg/kg/ 日、約 20mg/kg/ 日、約 25mg/kg/ 日、約 30mg/kg/ 日、約 35mg/kg/ 日、約 40mg/kg/ 日、約 45mg/kg/ 日或約 50mg/kg/ 日。在某些實(shí)施方案中，將含有銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域的化合物導(dǎo)入患者的方法為與其它治療癌癥的已知藥物共同施用。這種方法為本領(lǐng)域所熟知。在具體的實(shí)施方案中，含有銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域的化合物為混合劑的一部分，或與含有或具有其它治療癌癥的藥物共同給藥。這種藥物包括，例如，本文所列的那些，且具體為5-氟尿嘧啶、干擾素α、氨甲蝶呤、他莫昔芬和長(zhǎng)春新堿。以上例子僅用于示例，許多其它此類化合物為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。編碼銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域或組合進(jìn)入結(jié)構(gòu)域與貨物化合物的融合蛋白的核酸分子可插入到載體中并用作基因治療載體?；蛑委熭d體可通過(guò)諸如靜脈內(nèi)注射、局部施用(Nabel等人，美國(guó)專利第5，3 , 470號(hào)1994. USA)，或立體定向注射(stereotactic injection) (Chen 等人，Proc Natl Acad Sci USA，第 91 卷，第 3054-57 頁(yè)(1994))遞送至受治療者?；蛑委熭d體的藥物制品可包括可接受的稀釋劑或可包含基因遞送運(yùn)載體嵌入其中的緩釋基質(zhì)。可選地，當(dāng)完整的基因遞送載體例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可由重組細(xì)胞完整產(chǎn)生時(shí)，藥物制品可包括一種或多種產(chǎn)生基因遞送系統(tǒng)的細(xì)胞。在一方面，組合物以DNA被遞送，因此復(fù)合物是在原位產(chǎn)生的。在一個(gè)實(shí)施方案中，DNA 是“裸露的”，如例如 Ulmer 等人，Science259 1745-49 (1993)所描述和 cohen, Science 259 :1691-92(1993)中所綜述的。通過(guò)將DNA包被在載體上(例如可被有效轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞的生物可降解的珠子)可提高裸露DNA的攝取。在此類方法中，DNA可存在于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種遞送系統(tǒng)中的任何中，所述系統(tǒng)包括核酸表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)菌和病毒表達(dá)系統(tǒng)。將DNA整合入這些表達(dá)系統(tǒng)的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。見例如WO 90/11092、 WO 93/24640, WO 93/17706 和美國(guó)專利第 5，736，524 號(hào)。用于從生物體到生物體穿梭遺傳物質(zhì)的載體可分為兩大類克隆載體是復(fù)制型質(zhì)粒或噬菌體，并具有在適當(dāng)宿主細(xì)胞中繁殖非必需的且外源DNA可插入其中的區(qū)域；外源 DNA如同其為載體的成分一樣被復(fù)制和繁殖。表達(dá)載體(比如質(zhì)粒、酵母或動(dòng)物病毒基因組)被用來(lái)將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入宿主細(xì)胞或組織中，從而轉(zhuǎn)錄和翻譯外源DNA，例如組合物的DNA。在表達(dá)載體中，導(dǎo)入的DNA與諸如啟動(dòng)子的元件可操作地連接，所述元件向宿主細(xì)胞發(fā)出信號(hào)以轉(zhuǎn)錄所插入的DNA。某些啟動(dòng)子是尤其有用的，例如應(yīng)答特定因子而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。將組合物多核苷酸與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可操縱地連接可調(diào)控野生型-天青蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域組合物多肽或片段的表達(dá)。典型的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的例子包括對(duì)α-干擾素、熱休克、重金屬離子和類固醇例如糖皮質(zhì)激素(Kaufman，Methods Enzymo 1. 185 487-511(1990))及四環(huán)素響應(yīng)的那些啟動(dòng)子。其它所需的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括對(duì)構(gòu)建體所導(dǎo)入的細(xì)胞而言不是內(nèi)源性的但是當(dāng)外源提供誘導(dǎo)劑時(shí)在那些細(xì)胞中是響應(yīng)的那些啟動(dòng)子。 通常，有用的表達(dá)載體常為質(zhì)粒。然而，考慮了其它形式的表達(dá)載體例如病毒載體(如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)。載體的選擇取決于所用的生物體或細(xì)胞，以及載體的所需命運(yùn)。通常，載體包含信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、標(biāo)記基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄終止序列。包含銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域-貨物化合物復(fù)合物的試劑盒在另一方面，本發(fā)明提供了試劑盒，其在包裝或容器內(nèi)含有以下的一種或多種 (1)包含銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域本身(比如pl8或p28)或包含與貨物化合物連接的銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域的試劑；( 含有藥學(xué)上可接受的佐劑或賦形劑的試劑；C3)施用工具，比如注射器；(4)施用說(shuō)明書。還考慮了其中同一容器內(nèi)含有成分(1)-(4)中的兩個(gè)或多個(gè)的實(shí)施方案。包含銅氧還蛋白、銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域、銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域-貨物化合物復(fù)合物，或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的藥物組合物包含銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的藥物組合物可通過(guò)任何常規(guī)方法生產(chǎn)，例如通過(guò)常規(guī)混合、溶解、顆?；?、包被糖衣、乳化、包囊化、封入或凍干方法?；旧霞兊幕蛩幬锛?jí)的銅氧還蛋白或其變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物可易于與本領(lǐng)域公知的藥學(xué)可接受載體組合。這種載體使制劑能夠以片劑、丸劑、糖衣片、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑、 懸液等形式配制。適宜的載體或賦形劑還可包括，例如，充填劑和纖維素制劑。其它賦形劑可包括，例如調(diào)味劑、著色劑、防粘劑、增稠劑以及其它可接受的添加劑、佐劑或粘合劑。在一些實(shí)施方案中，所述藥物制劑基本上不含防腐劑。在另一些實(shí)施方案中，所述藥物制劑可至少含有一種防腐劑。藥物劑型的一般方法見于Ansel等人，！Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (藥物齊[J型禾口藥物遞送系統(tǒng))(Lippencott Williams & Wilkins，Baltimore MD(1999)) 可將本發(fā)明使用的包含銅氧還蛋白、或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的藥物組合物以多種途徑來(lái)施用，包括通過(guò)注射(例如，皮內(nèi)注射、皮下注射、肌內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射和類似的注射)，通過(guò)吸入、通過(guò)局部施用、通過(guò)栓劑、通過(guò)采用透皮貼劑或通過(guò)口腔來(lái)施用。 藥物遞送系統(tǒng)的一般信息可在Ansel等人，同前中找到。在一些實(shí)施方案中，可對(duì)包含銅氧還蛋白、或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的藥物組合物進(jìn)行配制并直接用作皮下注射和靜脈注射等的注射劑?？勺⑸涞闹苿┯绕淇捎欣赜脕?lái)治療適宜于化學(xué)預(yù)防治療的患者。包含銅氧還蛋白、或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的藥物組合物還可與預(yù)防劑諸如聚丙二醇或相似的包膜劑混合后來(lái)進(jìn)行口服。當(dāng)通過(guò)注射施用時(shí)，可將銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物配制成水溶液，具體為在諸如Hanks溶液、林格溶液或生理鹽水緩沖液的生理相容緩沖液中。溶液可包含配制劑，諸如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?？蛇x地，銅氧還蛋白、或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物可以是粉末形式，在使用前用適宜的運(yùn)載體諸如無(wú)菌無(wú)熱原水來(lái)構(gòu)建。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物不添加佐劑或?yàn)樵鰪?qiáng)肽所刺激的免疫反應(yīng)而添加的任何其他物質(zhì)。 在一些實(shí)施方案中，藥物組合物包含抑制對(duì)肽的免疫反應(yīng)的物質(zhì)。當(dāng)通過(guò)靜脈流體來(lái)施用時(shí)，用來(lái)施用銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的靜脈流體可由類晶體或膠體組成。本文所用的類晶體是礦物鹽或其它水溶性分子的水溶液。本文所用的膠體包含較大的不可溶的分子，比如明膠。靜脈流體可以是無(wú)菌的。如表2所描述的，可用于靜脈內(nèi)施用的類晶體流體包括但不局限于，生理鹽水 (0. 9%濃度的氯化鈉溶液)、林格乳酸鹽或林格溶液和5%的葡萄糖水溶液，有時(shí)稱作D5W。表2.常用類晶體溶液的組合物
溶液其它名稱[Na+][Cl1][葡萄糖]D5W5%葡萄糖002522/3 & 1/33.3%葡萄糖/0.3% 鹽水5151168半張生理鹽水0.45% NaCl77770生理鹽水0.9% NaCl1541540林格乳酸鹽*林格溶液1301090*林格乳酸鹽也具有^mmol/L乳酸鹽、4mmol/L K+和3mmol/L Ca2+。當(dāng)通過(guò)吸入來(lái)施用時(shí)，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物可利用適宜的推進(jìn)劑諸如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氧化碳或其它適宜的氣體以氣霧劑噴霧形式從加壓包或噴霧器中遞送。在加壓氣霧劑的情況下，可以通過(guò)提供閥釋放計(jì)量的量來(lái)確定劑量單位。用于吸入器或吹入器的諸如明膠的藥囊和藥筒可配制成含有所述蛋白和適宜的粉末基質(zhì)諸如乳糖或淀粉的粉末混合物。當(dāng)通過(guò)局部施用時(shí)，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物可配制成如本領(lǐng)域中熟知的溶液、凝膠、軟膏、乳膏、凝膠劑、懸浮液等。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)透皮貼劑來(lái)施用。當(dāng)通過(guò)栓劑施用時(shí)(例如直腸或陰道)，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物組合物也可以配制成含有常規(guī)栓劑基質(zhì)的組合物。當(dāng)通過(guò)口服施用時(shí)，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物可易于通過(guò)將銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物與本領(lǐng)域中熟知的藥學(xué)上可接受的載體混合而配制?？衫霉腆w載體諸如甘露醇、乳糖、硬脂酸鎂及其類似物；所述載體能使銅氧還蛋白及其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物配制成片劑、丸劑、錠劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑、懸浮液等，用于待治療的受治療者的口服攝入。對(duì)于口服固體劑型例如粉末、膠囊和片劑，適合的賦形劑包括填充物例如糖、纖維素制劑、顆?；瘎┖驼澈蟿１绢I(lǐng)域熟知的其它常規(guī)載體，也包括多價(jià)載體，例如細(xì)菌莢膜多糖、葡聚糖或基因工程載體。此外，包括銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的持續(xù)釋放制劑允許在延長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)釋放銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物，而不使用持續(xù)釋放制劑，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物會(huì)在引起或增強(qiáng)治療效果之前從受治療者系統(tǒng)中被清除、和/或例如被蛋白酶和簡(jiǎn)單的水解降解。本發(fā)明的肽在血流中的半衰期可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的幾種方法延長(zhǎng)或優(yōu)化。本發(fā)明的肽變體可包括，但不局限于，可能提高其在血流中的穩(wěn)定性、特定活性、存在時(shí)間、和/或降低銅氧還蛋白的免疫原性，并保留所述肽在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、組織和動(dòng)物中抑制癌前病變發(fā)展的能力。所述變體包括，但不局限于那些減少肽的水解、減少肽的脫酰胺作用、減少氧化、降低免疫原性、提高肽的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性或增加肽的尺寸的變體。所述肽還包括環(huán)化的肽(參見 Monk 等人，BioDrugs 19(4) =261-78, (2005) ；DeFreest 等人， J. Pept. Res. 63 (5) :409-19 (2004))，D，L-肽(非對(duì)映體，F(xiàn)utaki 等人，J. Biol. Chem. Feb 23 ；276 (8) :5836-40(2001) ；Papo 等人，Cancer Res. 64(16) :5779-86(2004) ；Miller 等人，Biochem. Pharmacol. 36(1) =169-76, (1987))；含有非天然氨基酸的肽(參見 Lee 等人·，J. Pept. Res. 63 (2) :69-84 (2004))，N-末端修飾和 C-末端修飾(參見 Labrie 等人·， Clin. Invest. Med. 13(5) :275-8, (1990))，烴類環(huán)鉤(參見 khafmeister 等人，J. Am. Chem. Soc. 122 :5891-5892(2000) ；Walenski 等人，Science 305 :1466-1470(2004))和聚乙二醇化。在各種實(shí)施方案中，藥物組合物包括載體和賦形劑(包括但不局限于緩沖液、碳水化合物、甘露醇、蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸諸如甘氨酸、抗氧化劑、抑菌劑、螯合劑、懸浮劑、 增稠劑和/或防腐劑)、水、油、鹽溶液、水性右旋葡萄糖和甘油溶液、模擬生理?xiàng)l件需要的其它藥學(xué)上可接受的輔助劑，例如緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、潤(rùn)濕劑及其類似物。應(yīng)當(dāng)意識(shí)到， 雖然可以采用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的任何適宜的載體來(lái)施用本發(fā)明的組合物，但載體的類型可根據(jù)施用方式而不同。還可使用熟知的技術(shù)將化合物包在脂質(zhì)體中。生物可降解的微球也可以作為載體用于本發(fā)明的藥物組合物。例如在美國(guó)專利第4，897，268號(hào)；第 5,075, 109 號(hào)；第 5, 928, 647 號(hào)；第 5,811, 128 號(hào)；第 5，820，883 號(hào)；第 5,853, 763 號(hào)；第 5，814，344號(hào)和第5，942，252號(hào)中已公開了適宜的生物可降解的微球?？赏ㄟ^(guò)常規(guī)的熟知的滅菌技術(shù)或可通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾對(duì)藥物組合物進(jìn)行滅菌。所得的水溶液可以包裝原樣使用，或凍干，在施用前將凍干制劑與無(wú)菌溶液混合。銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的施用銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物，比如P18或p28，可被配制成藥物組合物來(lái)施用，并可通過(guò)任何適宜的途徑來(lái)施用，例如，通過(guò)口服、口腔、吸入、舌下、直腸、陰道、經(jīng)尿道、鼻、局部、經(jīng)皮膚即經(jīng)皮或胃腸外(包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和冠狀動(dòng)脈內(nèi))或玻璃體施用。其藥物制劑可以任何有效實(shí)現(xiàn)其想要的目的的量來(lái)施用。更具體地，組合物以治療有效量來(lái)施用。在特定的實(shí)施方案中，治療有效量一般從約0. 01-20mg/天/kg體重。
包含銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的化合物單獨(dú)或與其它活性劑和 /或貨物化合物聯(lián)合可用于預(yù)防癌癥。當(dāng)然，適合的劑量將取決于，例如，所使用的銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的化合物、宿主、施用模式和潛在癌癥的性質(zhì)和嚴(yán)重度。 然而，通常在人類中獲得滿意效果的每日劑量為約0.01-20mg/kg體重。在人類中方便施用的銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的化合物的每日指定劑量在從約0. 7mg到約 1400mg的范圍中，例如每日劑量、周劑量、月劑量和/或連續(xù)劑量。每日劑量可以是不連續(xù)的劑量，從每天1次到每天12次?？蛇x地，劑量可以為每?jī)商?、每三天、每四天、每五天、每六天、每周，并且以類似天?shù)增加直至31天或更長(zhǎng)進(jìn)行施用。可選地，給藥可以是連續(xù)的， 使用貼劑、靜脈內(nèi)施用及類似的施用。主治醫(yī)師根據(jù)病人的情況來(lái)決定準(zhǔn)確的配方、施用途徑和劑量?？蓚€(gè)別地調(diào)整用藥劑量和間隔，以提供足以維持治療作用的活性銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物(有或沒有貨物化合物)的血漿水平。通常，所需的銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物與按照預(yù)期的施用途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥物實(shí)踐所選擇的藥用載體混合施用。在一方面，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物作為DNA來(lái)遞送，從而在原位產(chǎn)生多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，DNA是“裸露的”，例如，在Ulmer等人，(Science 259 1745-1749(1993))中所述和 Cohen 綜述(Science 259:1691-1692(1993))?？赏ㄟ^(guò)將 DNA 涂布到載體(例如，生物可降解珠)來(lái)提高裸DNA的攝入，且然后DNA被有效地運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中。用這種方法，DNA可存在于本領(lǐng)域普通人員已知的任意多種遞送系統(tǒng)內(nèi)，包括核酸表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)菌和病毒表達(dá)系統(tǒng)。將DNA整合到這樣的表達(dá)系統(tǒng)中所用的技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是熟知的。參見例如，W090/11092, W093/24640, WO 93/17706和美國(guó)專利第 5，736，524 號(hào)。用于在生物體間穿梭傳送遺傳物質(zhì)的載體可分為兩大類克隆載體是復(fù)制型質(zhì)?；蚴删w，具有在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中增殖必需的區(qū)域，其中可以插入外源DNA;所述外源 DNA被復(fù)制和增殖，如同其為載體的組分一樣。表達(dá)載體(例如，質(zhì)粒、酵母或動(dòng)物病毒基因組)用來(lái)將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入到宿主細(xì)胞或組織中以轉(zhuǎn)錄并翻譯外源DNA，如銅氧還蛋白的DNA。在表達(dá)載體中，導(dǎo)入的DNA與諸如啟動(dòng)子的元件可操作地連接，所述元件傳遞信號(hào)至宿主細(xì)胞以高度轉(zhuǎn)錄插入的DNA。一些啟動(dòng)子是特別有用的，例如響應(yīng)于特定因子來(lái)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。將銅氧還蛋白和其變體和衍生物同可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可操作地連接能夠調(diào)控響應(yīng)于特定因子的銅氧還蛋白和其變體和衍生物的表達(dá)。典型的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的例子包括對(duì)α-干擾素、熱激、重金屬離子和類固醇諸如糖皮質(zhì)激素(Kaufman， Methods Enzymo 1. 185 :487-511 (1990))和四環(huán)素響應(yīng)的那些啟動(dòng)子。其它理想的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括對(duì)于導(dǎo)入構(gòu)建體的細(xì)胞不是內(nèi)源性的那些啟動(dòng)子，然而，當(dāng)外源提供誘導(dǎo)劑時(shí)，在那些細(xì)胞中是應(yīng)答性的。一般，有用的表達(dá)載體常為質(zhì)粒。然而，其它形式的表達(dá)載體，例如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺病毒相關(guān)病毒)被考慮了。此外， 本發(fā)明的肽，包括在一個(gè)實(shí)施方案中的P18，可用作載體以選擇性遞送治療化合物進(jìn)入癌細(xì)胞或腫瘤。載體選擇取決于所用的生物體或細(xì)胞和載體的預(yù)期的命運(yùn)。通常，載體包括信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、標(biāo)記基因、多接頭位點(diǎn)、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。包含銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的藥盒
在一方面，本發(fā)明提供了包含以下的一種或多種處于包裝或容器中的方案或藥盒(1)包含至少一種銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的藥理活性組合物；(2) 另外的化學(xué)預(yù)防藥物，(3)向患者施用所述生物活性組合物的器材，例如注射器、噴霧器等。當(dāng)提供藥盒時(shí)，所述組合物的不同組分可以視情況包裝在獨(dú)立的容器中，在使用前立刻混合。這樣的獨(dú)立包裝的組分可以允許長(zhǎng)期貯存而不失去活性組分的功能。藥盒中所含的試劑可在任意種類的容器中提供，從而保持了不同組分的使用期且其不被容器的材料所吸收或改變。例如，密閉的玻璃安瓿可以含有凍干的銅氧還蛋白和其變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物，或在中性、不反應(yīng)氣體諸如氮?dú)庀掳b的緩沖液。安瓿可以由任何適宜的材料組成，例如玻璃、有機(jī)聚合物諸如聚碳酸酯、聚苯乙烯等，陶瓷、金屬或通常用于保存相似試劑的任何其它材料。其它適宜的容器的例子包括簡(jiǎn)易瓶，其由與安瓿相似的物質(zhì)制成，以及包殼(envelope)，其可以包括箔內(nèi)襯的內(nèi)部，諸如鋁或合金。其它容器包括試管、小瓶、燒瓶、瓶、注射器或類似物。容器可具有無(wú)菌存取口，例如有塞子的瓶子，該塞子可以用皮下注射針刺穿。其它容器可具有兩室，兩室被易于除去的膜隔開，去除膜后允許組分混合?？沙サ哪た梢允遣Ａ?、塑料、橡膠等。藥盒還可提供說(shuō)明材料。說(shuō)明書可以印在紙上或其它載體上，和/或以電子可讀介質(zhì)提供，例如軟盤、⑶_R0M、DVD-R0M、壓縮盤、錄像帶、錄音帶、閃存裝置等。詳細(xì)的說(shuō)明書可以不與藥盒物理聯(lián)系在一起；而是可以指引使用者到藥盒的制造商或經(jīng)銷商指定的互聯(lián)網(wǎng)站，或作為電子郵件來(lái)提供。銅氧還蛋白、銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域和其變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物的修飾可對(duì)銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物進(jìn)行化學(xué)修飾或遺傳改變以產(chǎn)生如上所述的變體和衍生物。所述變體和衍生物可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)合成?？蓪?duì)銅氧還蛋白進(jìn)入結(jié)構(gòu)域進(jìn)行類似修飾。除天然存在的銅氧還蛋白的等位基因變體，還可通過(guò)突變將變化導(dǎo)入到銅氧還蛋白編碼序列中，突變引起所編碼的銅氧還蛋白的氨基酸序列的變化，但這不會(huì)顯著改變銅氧還蛋白抑制癌前病變發(fā)展的能力?！胺潜匦琛卑被釟埢强稍谝吧偷你~氧還蛋白序列中發(fā)生改變而不改變藥理學(xué)活性的殘基，而“必需”氨基酸殘基是這種藥理學(xué)活性所需要的。例如銅氧還蛋白中保守的氨基酸殘基預(yù)期是尤其不適合改變的，且因此是“必需”的?？蛇M(jìn)行不改變所述多肽的藥理學(xué)活性的保守置換的氨基酸是本領(lǐng)域中熟知的?？捎玫谋Ｊ刂脫Q如表3中“優(yōu)選置換”所示。只要所述置換實(shí)質(zhì)上沒有改變化合物的藥理學(xué)活性，一種類型的氨基酸被相同類型的另一種氨基酸替代的保守置換在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。表3.優(yōu)選置換
權(quán)利要求
1.一種方法，所述方法包括通過(guò)使癌細(xì)胞與細(xì)胞毒性的銅氧還蛋白相接觸而殺死所述癌細(xì)胞，其中所述細(xì)胞毒性的銅氧還蛋白通過(guò)一種或多種胞吞途徑優(yōu)先進(jìn)入所述癌細(xì)胞， 并且其中所述細(xì)胞毒性的銅氧還蛋白是天青蛋白的截短體，其中所述天青蛋白的截短體包含來(lái)自SEQ ID NO 2的C-末端的氨基酸。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述天青蛋白的截短體來(lái)自銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)0
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述天青蛋白的截短體包含SEQIDNO :2。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述天青蛋白的截短體由SEQIDNO :2組成。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞毒性的銅氧還蛋白通過(guò)胞膜窖介導(dǎo)的胞吞作用優(yōu)先進(jìn)入所述癌細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述細(xì)胞毒性的銅氧還蛋白進(jìn)入所述癌細(xì)胞是通過(guò)高爾基體來(lái)介導(dǎo)的。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞毒性的銅氧還蛋白包含無(wú)論所述癌細(xì)胞的狀態(tài)如何能夠與所述癌細(xì)胞的細(xì)胞膜接觸的氨基酸。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述細(xì)胞毒性的銅氧還蛋白與所述癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上的氨基酸接觸。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述細(xì)胞毒性的銅氧還蛋白與所述癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上的細(xì)胞表面肽接觸。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述細(xì)胞毒性的銅氧還蛋白與所述癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上的受體接觸。
11.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述細(xì)胞毒性的銅氧還蛋白包含位于SEQID NO 1中的第69、70、75、76和85位的氨基酸中的每一個(gè)。
12.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述細(xì)胞毒性的銅氧還蛋白包含選自由SEQID NO :35、SEQ ID NO 36和SEQ ID NO 37組成的組的氨基酸序列。
13.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述細(xì)胞毒性的銅氧還蛋白由選自由SEQID NO 35、SEQ ID N0:36和SEQ ID NO :37組成的組的氨基酸序列組成。
14.一種分離的肽，所述分離的肽能夠與癌細(xì)胞的細(xì)胞膜接觸，通過(guò)胞膜窖介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入所述癌細(xì)胞，并殺死所述癌細(xì)胞，其中所述分離的肽包含來(lái)自SEQ ID N0:2的 C-末端的氨基酸。
15.如權(quán)利要求14所述的分離的肽，其中所述分離的肽與所述癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上的氨基酸接觸。
16.如權(quán)利要求14所述的分離的肽，其中所述分離的肽與所述癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上的細(xì)胞表面肽接觸。
17.如權(quán)利要求14所述的分離的肽，其中所述分離的肽與所述癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上的受體接觸。
18.如權(quán)利要求14所述的分離的肽，其中所述分離的肽進(jìn)入所述癌細(xì)胞是由高爾基體來(lái)介導(dǎo)的。
19.如權(quán)利要求14所述的分離的肽，其中所述分離的肽來(lái)自銅綠假單胞菌。
20.如權(quán)利要求14所述的分離的肽，其中所述分離的肽包含SEQIDNO :2。
21.如權(quán)利要求14所述的分離的肽，其中所述分離的肽由SEQID NO :2組成。
22.如權(quán)利要求14所述的分離的肽，其中所述分離的肽包含選自由SEQID NO 35、SEQ ID NO 36和SEQ ID NO :37SEQ ID NO 36組成的組的氨基酸序列。
23.如權(quán)利要求14所述的分離的肽，其中所述分離的肽由選自由SEQIDNO 35、SEQ ID N0:36和SEQ ID NO :37SEQ ID NO :36組成的組的氨基酸序列組成。
24.一種分離的肽，所述分離的肽能夠與癌細(xì)胞的細(xì)胞膜接觸，通過(guò)胞膜窖介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入所述癌細(xì)胞，并殺死所述癌細(xì)胞，其中所述分離的肽包含見于SEQ ID N0:1的第 69、70、75、76和85位的氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)。
25.如權(quán)利要求24所述的分離的肽，其中所述分離的肽包含位于SEQIDN0:1中的第 69、70、75、76和85位的氨基酸中的每一個(gè)。
26.如權(quán)利要求24所述的分離的肽，其中所述分離的肽與所述癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上的氨基酸接觸。
27.如權(quán)利要求24所述的分離的肽，其中所述分離的肽與所述癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上的細(xì)胞表面肽接觸。
28.如權(quán)利要求24所述的分離的肽，其中所述分離的肽與所述癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上的受體接觸。
29.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求14所述的分離的肽。
30.如權(quán)利要求29所述的藥物組合物，還包含藥學(xué)上可接受的載體。
31.如權(quán)利要求30所述的藥物組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的載體適宜于靜脈內(nèi)施用。
32.一種方法，所述方法包括通過(guò)向哺乳動(dòng)物患者施用治療有效量的權(quán)利要求29所述的藥物組合物來(lái)治療所述患者。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述患者是人。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述患者處于比一般群體高的發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述癌癥選自黑素瘤、乳腺癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、肺癌、結(jié)腸直腸癌、頭頸癌、膀胱癌、前列腺癌、皮膚癌和宮頸癌。
36.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述患者具有至少一種高風(fēng)險(xiǎn)特征。
37.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述患者具有癌前病變。
38.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述患者已被治愈癌癥或癌前病變。
39.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述藥物組合物通過(guò)選自由靜脈注射、肌內(nèi)注射、 皮下注射、吸入法、局部施用、透皮貼劑、栓劑、玻璃體注射和口腔組成的組的方式來(lái)施用。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述施用的方式是通過(guò)靜脈注射。
41.一種藥盒，所述藥盒包括在小管中的權(quán)利要求29所述的組合物。
42.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求24所述的分離的肽。
43.如權(quán)利要求42所述的藥物組合物，還包含藥學(xué)上可接受的載體。
44.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的載體適宜于靜脈內(nèi)施用。
45.一種方法，所述方法包括通過(guò)向哺乳動(dòng)物患者施用治療有效量的權(quán)利要求42所述的組合物來(lái)治療所述患者。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述患者是人。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述患者處于比一般群體高的發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其中所述癌癥選自黑素瘤、乳腺癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、肺癌、結(jié)腸直腸癌、頭頸癌、膀胱癌、前列腺癌、皮膚癌和宮頸癌。
49.如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述患者具有至少一種高風(fēng)險(xiǎn)特征。
50.如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述患者具有癌前病變。
51.如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述患者已被治愈癌癥或癌前病變。
52.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述藥物組合物通過(guò)選自由靜脈注射、肌內(nèi)注射、 皮下注射、吸入法、局部施用、透皮貼劑、栓劑、玻璃體注射和口腔組成的組的方式來(lái)施用。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其中所述施用的方式是通過(guò)靜脈注射。
54.一種藥盒，所述藥盒包括在小管中的權(quán)利要求42所述的組合物。
55.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求14所述的分離的肽和貨物化合物。
56.如權(quán)利要求55所述的藥物組合物，其中所述分離的肽與所述貨物化合物連接。
57.如權(quán)利要求56所述的藥物組合物，其中所述貨物化合物是他莫昔芬。
58.如權(quán)利要求55所述的藥物組合物，其中所述貨物化合物選自由蛋白、脂蛋白、多肽、肽、多糖、核酸、染料、微粒、納米顆粒、毒素和藥組成的組。
59.如權(quán)利要求55所述的藥物組合物，其中所述貨物化合物是可檢測(cè)的物質(zhì)。
60.如權(quán)利要求59所述的藥物組合物，其中所述貨物化合物是通過(guò)X-射線CT可檢測(cè)的X-射線造影劑。
61.如權(quán)利要求59所述的藥物組合物，其中所述貨物化合物是通過(guò)MRI可檢測(cè)的磁共振成像造影劑。
62.如權(quán)利要求59所述的藥物組合物，其中所述貨物化合物是超聲造影劑并且是通過(guò)超聲可檢測(cè)的。
63.如權(quán)利要求55所述的藥物組合物，還包含藥學(xué)上適宜的載體。
64.一種方法，所述方法包括通過(guò)將細(xì)胞與權(quán)利要求55所述的藥物組合物相接觸而將貨物化合物遞送到所述細(xì)胞中。
65.一種方法，所述方法包括通過(guò)向患者施用權(quán)利要求59所述的藥物組合物來(lái)診斷癌癥。
66.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求24所述的分離的肽和貨物化合物。
67.如權(quán)利要求66所述的藥物組合物，其中所述分離的肽與所述貨物化合物連接。
68.如權(quán)利要求67所述的藥物組合物，其中所述貨物化合物是他莫昔芬。
69.如權(quán)利要求66所述的藥物組合物，其中所述貨物化合物選自由蛋白、脂蛋白、多肽、肽、多糖、核酸、染料、微粒、納米顆粒、毒素和藥組成的組。
70.如權(quán)利要求66所述的藥物組合物，其中所述貨物化合物是可檢測(cè)的物質(zhì)。
71.如權(quán)利要求70所述的藥物組合物，其中所述貨物化合物是通過(guò)X-射線CT可檢測(cè)的X-射線造影劑。
72.如權(quán)利要求70所述的藥物組合物，其中所述貨物化合物是通過(guò)MRI可檢測(cè)的磁共振成像造影劑。
73.如權(quán)利要求70所述的藥物組合物，其中所述貨物化合物是超聲造影劑并且是通過(guò)超聲可檢測(cè)的。
74.如權(quán)利要求66所述的藥物組合物，還包含藥學(xué)上適宜的載體。
75.一種方法，所述方法包括通過(guò)將細(xì)胞與權(quán)利要求66所述的藥物組合物相接觸而將貨物化合物遞送到所述細(xì)胞中。
76.一種方法，所述方法包括通過(guò)向患者施用權(quán)利要求70所述的藥物組合物來(lái)診斷癌癥。
全文摘要
本發(fā)明公開了通過(guò)細(xì)胞毒性化合物的優(yōu)先進(jìn)入來(lái)殺死和/或抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)的方法和材料。細(xì)胞毒性化合物的優(yōu)先進(jìn)入是通過(guò)使用來(lái)源于包括天青蛋白的p18截短體和p28截短體的銅氧還蛋白的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
文檔編號(hào)A61K38/00GK102325542SQ200980157000
公開日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2009年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月18日
發(fā)明者克雷格·貝蒂, 塔帕斯·達(dá)斯古普塔, 山田徹, 布萊德·泰勒, 拉杰沙瓦瑞·梅塔 申請(qǐng)人:Cdg醫(yī)療公司