專利名稱：具有降低的蛋白酶活性的骨移植物以及選擇和使用的方法
具有降低的蛋白酶活性的骨移植物以及選擇和使用的方法相關(guān)申請的交叉引用
本申請要求2008年12月19日提交的美國臨時(shí)申請系列號NO. 61/139，448、2009年2 月 4 日提交的 61/149，998,2009 年 2 月 20 日提交的 61/154，311 根據(jù) 35 U. S. C. § 119(e) 的權(quán)益，它們的內(nèi)容通過將它們完全引用合并在本文中。
背景技術(shù)：
骨移植物(例如骨同種異體移植物)可以移植到個(gè)體中來促進(jìn)骨骼的痊愈、強(qiáng)化骨骼和 /或改善骨骼功能。在某些情況下，來自人類供體的骨移植到另一個(gè)人中。示范性的人類骨同種異體移植物是死后從人類供體分離的骨骼的碎片。一種或更多種多肽(例如生長因子)可以與骨移植物一起施用來提高骨移植物的有效性。例如，重組的人類血小板衍生生長因子BB (rhPDGF-BB)是強(qiáng)力的傷口愈合多肽以及骨細(xì)胞的增殖和征募的刺激物。特別地，人類骨移植物與PDGF的組合可以用于在骨折和其他骨損傷的骨治愈中的骨再生(參見，例如，2007年2月9日提交的美國申請公開號NO. 2007/0207185)。改進(jìn)骨移植物(例如骨同種異體移植物)是用于治療、穩(wěn)定、防止和/或延遲骨、牙周組織、韌帶、軟骨或肌腱狀況、疾病或缺陷與目標(biāo)多肽(例如促進(jìn)骨修復(fù)、痊愈或生長的多肽)一起施用所需的。理想地，骨移植物對目標(biāo)多肽的生物學(xué)功能和/或結(jié)構(gòu)具有最小的影響。發(fā)明概述
在一個(gè)方面，本發(fā)明特征在于選擇骨移植物(例如骨同種異體移植物)用于與目標(biāo)多肽 (例如，血小板衍生的生長因子(PDGF))—起向個(gè)體施用的方法。在某些實(shí)施方式中，所述方法涉及測量與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性，由此根據(jù)與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的量來確定是否選擇該骨移植物用于與目標(biāo)多肽一起向個(gè)體施用。在某些實(shí)施方式中，所述方法涉及選擇具有可接受水平的蛋白酶活性的骨移植物用于與目標(biāo)多肽一起向個(gè)體施用。在某些實(shí)施方式中，選擇用于與PDGF—起向個(gè)體施用的骨移植物的方法包括選擇具有小于約 50胰蛋白酶當(dāng)量(其中1胰蛋白酶當(dāng)量是使用蛋白酶底物，例如在QuantiCleave蛋白酶分析試劑盒(Pierce，Rockford, IL)中的琥珀?；睦业鞍祝喈?dāng)于1 ng胰蛋白酶的蛋白酶活性的量)的蛋白酶活性的骨移植物用于與PDGF—起向個(gè)體施用。在某些實(shí)施方式中， 選擇用于與PDGF —起向個(gè)體施用的骨移植物的方法包括選擇具有約50到約65胰蛋白酶當(dāng)量之間(例如，約50到約55，約55到約60，或約60到約65胰蛋白酶當(dāng)量)的蛋白酶活性的骨移植物用于與PDGF —起向所述個(gè)體施用。在某些實(shí)施方式中，選擇用于與PDGF — 起向個(gè)體施用的骨移植物的方法包括選擇具有小于約50胰蛋白酶當(dāng)量(例如，小于約45、 小于約40、小于約35、小于約30、小于約25、小于約20、小于約15、小于約10、小于約5、約 0胰蛋白酶當(dāng)量)的蛋白酶活性的骨移植物用于與PDGF —起向所述個(gè)體施用。在某些實(shí)施方式中，選擇用于與PDGF —起向個(gè)體施用的骨移植物的方法包括選擇具有約50、55、60或 65的任一胰蛋白酶當(dāng)量的蛋白酶活性的骨移植物用于與PDGF —起向所述個(gè)體施用。在任何所述方法的某些實(shí)施方式中，所述方法包括向所述個(gè)體施用選擇的骨移植物和所述目標(biāo)多肽。在某些實(shí)施方式中，測量兩種或更多種骨移植物的蛋白酶活性，具有最低蛋白酶活性的骨移植物與所述目標(biāo)多肽一起向個(gè)體施用。在某些實(shí)施方式中，選擇的骨移植物的蛋白酶活性小于約50胰蛋白酶當(dāng)量。在某些實(shí)施方式中，選擇的骨移植物的蛋白酶活性在約50 到約65胰蛋白酶當(dāng)量之間(例如，約50到約55、約55到約60、或約60到約65胰蛋白酶當(dāng)量)。在某些實(shí)施方式中，選擇的骨移植物的蛋白酶活性是約50、55、60或65胰蛋白酶當(dāng)量的任一個(gè)。在某些實(shí)施方式中，選擇的骨移植物的蛋白酶活性是小于約50胰蛋白酶當(dāng)量 (例如，小于約45、小于約40、小于約35、小于約30、小于約25、小于約20、小于約15、小于約 10、小于約5、約0胰蛋白酶當(dāng)量)。在任何所述方法的某些實(shí)施方式中，測量與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性包括(a) 從所述骨移植物移除與骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分，和(b)測量被所述移除的蛋白酶裂解的多肽底物的量，從而測定與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的量。在某些實(shí)施方式中，步驟(a)包括提高包含所述骨移植物和蛋白酶的溶液的離子強(qiáng)度。在某些實(shí)施方式中，步驟(a)包括在鹽溶液孵育所述骨移植物和蛋白酶。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液是NaCl溶液。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液含有約0. 15 M NaCl到約1. 5 M NaCl 之間，或約0. 3 M NaCl到約1. 5 M NaCl之間。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液含有約0. 3 M NaCl。在某些實(shí)施方式中，步驟(b)包括分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物以及骨移植物。在某些實(shí)施方式中，高性能液相層析被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。在某些實(shí)施方式中，空間排阻層析被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。在某些實(shí)施方式中，其他分離方法被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和/或骨移植物。其他示范性的分離方法包括簡單離心、離子交換層析和電泳。在任何所述方法的某些實(shí)施方式中，測量與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性包括測量由與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性所裂解的多肽底物的量。在某些實(shí)施方式中，測量裂解的多肽底物的量包括(a)孵育所述多肽底物和所述骨移植物，(b)從所述骨移植物中移除裂解的多肽底物的總量的至少一部分，和(C)測量裂解的多肽底物的量。在某些實(shí)施方式中，步驟(b)包括提高包含所述骨移植物和所述多肽底物的溶液的離子強(qiáng)度。在某些實(shí)施方式中，步驟(b)包括在鹽溶液中孵育所述骨移植物和所述多肽底物。在某些實(shí)施方式中， 所述鹽溶液是NaCl溶液。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液含有約0. 15 M到約2. 0 M NaCl 之間。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液含有約0.6 M NaCl。在某些實(shí)施方式中，步驟(c)包括分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。在某些實(shí)施方式中，高性能液相層析被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。在某些實(shí)施方式中，空間排阻層析被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。在某些實(shí)施方式中，其他分離方法被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和/或骨移植物。其他示范性的分離方法包括簡單離心、離子交換層析和電泳。在任何所述方法的某些實(shí)施方式中，目標(biāo)多肽和多肽底物是相同的。在某些實(shí)施方式中，目標(biāo)多肽和多肽底物是不同的。在某些實(shí)施方式中，所述目標(biāo)多肽是PDGF。在某些實(shí)施方式中，所述骨移植物包括添加到所述骨移植物中的磷酸鈣(例如β-磷酸三鈣)。 在某些實(shí)施方式中，所述骨移植物包括添加到所述骨移植物中的一種或更多種其他化合物 (例如甘油)。
在一個(gè)方面，本發(fā)明特征在于測量與骨移植物(例如，骨同種異體移植物)相關(guān)的蛋白酶活性的方法在某些實(shí)施方式中，所述方法包括(a)從所述骨移植物移除與骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分，和(b)測量被所述移除的蛋白酶裂解的多肽底物的量， 從而測定與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的量。在某些實(shí)施方式中，所述測量與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的方法包括(a)通過在含有約0. 15 M NaCl到約1.5 M NaCl (例如， 約0. 3 M NaCl到約1. 5 M NaCl之間)的鹽溶液中孵育所述骨移植物，從所述骨移植物中移除與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分；和(b)測量由所述移除的蛋白酶裂解的PDGF的量，從而測定與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的量。在任何所述方法的某些實(shí)施方式中，步驟(a)包括提高包含所述骨移植物和蛋白酶的溶液的離子強(qiáng)度。在某些實(shí)施方式中，步驟(a)包括在鹽溶液孵育所述骨移植物和蛋白酶。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液是NaCl溶液。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液含有約0. 15 M NaCl到約1. 5 M NaCl 之間，或約0. 3 M NaCl到約1. 5 M NaCl之間。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液含有約0. 3 M NaCl。在某些實(shí)施方式中，步驟(b)包括分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物以及骨移植物。在某些實(shí)施方式中，高性能液相層析被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。在某些實(shí)施方式中，空間排阻層析被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。在某些實(shí)施方式中，其他分離方法被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和/或骨移植物。其他示范性的分離方法包括簡單離心、離子交換層析和電泳。 在某些實(shí)施方式中，所述測量與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的方法包括(i )從所述骨移植物中移除與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分；和(ii)測量從所述骨移植物移除的一種或更多種蛋白酶的量或濃度，從而測定與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的量。在某些實(shí)施方式中，所述多肽底物是PDGF。在某些實(shí)施方式中，所述骨移植物包括添加到所述骨移植物的磷酸鈣(例如，β-磷酸三鈣)。在某些實(shí)施方式中，所述骨移植物包括添加到所述骨移植物中的一種或更多種其他化合物(例如甘油)。在任何所述方法的某些實(shí)施方式中，測量與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的方法包括測量由與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性裂解的多肽底物的量。在某些實(shí)施方式中，測量裂解的多肽底物的量包括(i)孵育所述多肽底物和所述骨移植物，(ii)從所述骨移植物中移除裂解的多肽底物的總量的至少一部分，和(iii)測量裂解的多肽底物的量。在某些實(shí)施方式中，測量與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的方法包括(i )孵育PDGF和所述骨移植物，從所述骨移植物移除裂解的PDGF的總量的至少一部分，和(iii)測量裂解的PDGF的量。在某些實(shí)施方式中，步驟(ii)包括提高包含所述骨移植物和所述多肽底物的溶液的離子強(qiáng)度。在某些實(shí)施方式中，步驟(ii )包括在鹽溶液中孵育所述骨移植物和所述多肽底物。 在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液是NaCl溶液。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液含有約0. 15 M到約2.0 M NaCl之間。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液含有約0. 6 M NaCl。在某些實(shí)施方式中，步驟(iii)包括分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物以及骨移植物。在某些實(shí)施方式中，高性能液相層析被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。在某些實(shí)施方式中，空間排阻層析被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。在某些實(shí)施方式中，其他分離方法被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和/ 或骨移植物。其他示范性的分離方法包括簡單離心、離子交換層析和電泳。在某些實(shí)施方式中，所述多肽底物是PDGF。在某些實(shí)施方式中，所述骨移植物包括添加到所述骨移植物中的磷酸鈣(例如，β-磷酸三鈣)。在某些實(shí)施方式中，所述骨移植物包括添加到所述骨移植物中的一種或更多種其他化合物(例如甘油)。在一個(gè)方面，本發(fā)明特征在于降低與骨移植物(例如，骨同種異體移植物)相關(guān)的蛋白酶活性的方法。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括從所述骨移植物移除與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分。在某些實(shí)施方式中，所述降低與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的方法涉及通過在含有約0. 15 M NaCl到約1. 5 M NaCl或約0. 3 M NaCl到約 1.5 M NaCl之間的鹽溶液中孵育所述骨移植物，從所述骨移植物中移除與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括測量其余與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的量。在某些實(shí)施方式中，移除蛋白酶包括提高包含骨移植物和蛋白酶的溶液的離子強(qiáng)度。在某些實(shí)施方式中，移除蛋白酶包括在鹽溶液中孵育所述骨移植物和蛋白酶。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液是NaCl溶液。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液含有約0. 15 M NaCl到約1. 5 M NaCl之間，或約0. 3 M NaCl到約1. 5 M NaCl之間。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液含有約0.3 M NaCl。在某些實(shí)施方式中，所述骨移植物包括添加到所述骨移植物中的磷酸鈣(例如，β-磷酸三鈣)。在某些實(shí)施方式中，所述骨移植物包括添加到所述骨移植物中的一種或更多種其他化合物(例如甘油)。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括向骨移植物添加蛋白酶抑制物。在一個(gè)方面，本發(fā)明特征在于制備骨移植物的方法(例如，用于個(gè)體中骨、牙周組織、韌帶、軟骨或肌腱狀況的治療的骨移植物或骨同種異體移植物)。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括改進(jìn)，所述改進(jìn)包括除去與骨移植物(例如，經(jīng)歷一個(gè)或更多個(gè)處理步驟使得適用于人類的骨移植物)相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分。在某些實(shí)施方式中，移除蛋白酶包括提高包含骨移植物和蛋白酶的溶液的離子強(qiáng)度。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括改進(jìn)，所述改進(jìn)包括提高包含所述骨移植物((例如，經(jīng)歷了一個(gè)或更多個(gè)處理步驟使得適用于人類的骨移植物)和蛋白酶的溶液的離子強(qiáng)度。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括改進(jìn)， 所述改進(jìn)包括用鹽溶液洗滌所述骨移植物(例如，經(jīng)歷一個(gè)或更多個(gè)處理步驟使得適用于人類的骨移植物)。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括在鹽溶液中孵育骨移植物和蛋白酶。 在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液是NaCl溶液，例如約0. 15 M NaCl到約1. 5 M NaCl之間， 或約0. 3 M NaCl到約1. 5 M NaCl之間。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液是約0. 3 M NaCl0 在某些實(shí)施方式中，所述骨移植物包括添加到所述骨移植物中的磷酸鈣(例如，β -磷酸三鈣)。在某些實(shí)施方式中，所述骨移植物包括添加到所述骨移植物中的一種或更多種其他化合物(例如甘油)。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括向骨移植物添加蛋白酶抑制物。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療個(gè)體的方法。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括向個(gè)體使用骨移植物(例如，骨同種異體移植物)和目標(biāo)多肽(例如，PDGF)。在某些實(shí)施方式中，所述骨移植物已經(jīng)根據(jù)蛋白酶活性的水平進(jìn)行了選擇。在某些實(shí)施方式中，所述方法涉及(a)選擇具有可接受水平的蛋白酶活性的骨移植物，和(b)向所述個(gè)體施用所述骨移植物和目標(biāo)多肽。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括向個(gè)體施用骨移植物和PDGF，其中所述骨移植物的蛋白酶活性小于約50胰蛋白酶當(dāng)量。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括向個(gè)體施用骨移植物和PDGF，其中所述骨移植物的蛋白酶活性在約50到約65胰蛋白酶當(dāng)量之間 (例如，約50到約55、約55到約60、或約60到約65胰蛋白酶當(dāng)量)。在某些實(shí)施方式中， 所述方法包括向個(gè)體施用骨移植物和PDGF，其中所述骨移植物的蛋白酶活性是約50、55、60或65胰蛋白酶當(dāng)量的任一個(gè)。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括向個(gè)體施用骨移植物和PDGF，其中所述骨移植物的蛋白酶活性小于約50胰蛋白酶當(dāng)量(例如，小于約45、小于約 40、小于約35、小于約30、小于約25、小于約20、小于約15、小于約10、小于約5、約0胰蛋白酶當(dāng)量)。在某些實(shí)施方式中，在向所述個(gè)體施用骨移植物之前，與骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分已經(jīng)被除去。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括在步驟(b)之前從所述骨移植物移除與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分。在某些實(shí)施方式中， 所述方法包括在步驟(b)之前向所述骨移植物添加蛋白酶抑制物。在某些實(shí)施方式中，測量兩種或更多種骨移植物的蛋白酶活性，具有最低蛋白酶活性的骨移植物與所述目標(biāo)多肽一起向個(gè)體施用。在某些實(shí)施方式中，選擇的骨移植物的蛋白酶活性小于約50胰蛋白酶當(dāng)量。在某些實(shí)施方式中，選擇的骨移植物的蛋白酶活性在約50到約65胰蛋白酶當(dāng)量之間 (例如，約50到約55、約55到約60、或約60到約65胰蛋白酶當(dāng)量)。在某些實(shí)施方式中，選擇的骨移植物的蛋白酶活性是約50、55、60或65胰蛋白酶當(dāng)量的任一個(gè)。在某些實(shí)施方式中，選擇的骨移植物的蛋白酶活性是小于約50胰蛋白酶當(dāng)量(例如，小于約45、小于約40、 小于約35、小于約30、小于約25、小于約20、小于約15、小于約10、小于約5、約0胰蛋白酶當(dāng)量)。在任何所述方法的某些實(shí)施方式中，選擇具有可接受水平的蛋白酶活性的骨移植物包括(i)從所述骨移植物移除與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分；和 (ii)測量被所述移除的蛋白酶裂解的多肽底物的量，從而測定與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的量。在某些實(shí)施方式中，步驟(i )包括提高包含所述骨移植物和蛋白酶的溶液的離子強(qiáng)度。在某些實(shí)施方式中，步驟(i)包括在鹽溶液孵育所述骨移植物和蛋白酶。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液是NaCl溶液。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液含有約0. 15 M NaCl 到約1. 5 M NaCl之間，或約0. 3 M NaCl到約1. 5 M NaCl之間。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液含有約0.3 M NaCl。在某些實(shí)施方式中，步驟(ii)包括分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物以及骨移植物。在某些實(shí)施方式中，高性能液相層析被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。在某些實(shí)施方式中，空間排阻層析被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。在某些實(shí)施方式中，其他分離方法被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和/或骨移植物。其他示范性的分離方法包括簡單離心、 離子交換層析和電泳。在任何所述方法的某些實(shí)施方式中，選擇具有可接受水平的蛋白酶活性的骨移植物包括測量由與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性裂解的所述多肽底物的量。在某些實(shí)施方式中，測量裂解的多肽底物的量包括(i)孵育所述多肽底物和所述骨移植物，(ii)從所述骨移植物中移除裂解的多肽底物的總量的至少一部分，和(iii)測量裂解的多肽底物的量。 在某些實(shí)施方式中，步驟(i i )包括提高包含所述骨移植物和所述多肽底物的溶液的離子強(qiáng)度。在某些實(shí)施方式中，步驟(ii)包括在鹽溶液中孵育所述骨移植物和所述多肽底物。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液是NaCl溶液。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液含有約0.15 M 到約2.0 M NaCl之間。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液含有約0. 6 M NaCl。在某些實(shí)施方式中，步驟(iii)包括分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物以及骨移植物。在某些實(shí)施方式中，高性能液相層析被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。在某些實(shí)施方式中，空間排阻層析被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。在某些實(shí)施方式中，其他分離方法被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和/或骨移植物。其他示范性的分離方法包括簡單離心、離子交換層析和電泳。在任何所述方法的某些實(shí)施方式中，目標(biāo)多肽和多肽底物是相同的。在某些實(shí)施方式中，目標(biāo)多肽和多肽底物是不同的。在某些實(shí)施方式中，所述目標(biāo)多肽是PDGF。在某些實(shí)施方式中，所述骨移植物包括添加到所述骨移植物中的磷酸鈣(例如，β-磷酸三鈣)。 在某些實(shí)施方式中，所述骨移植物包括添加到所述骨移植物中的一種或更多種其他化合物 (例如甘油)。在任何所述方法的某些實(shí)施方式中，所述治療方法包括向個(gè)體施用骨移植物和目標(biāo)多肽(例如，PDGF)。在某些實(shí)施方式中，與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分已經(jīng)從所述骨移植物中除去。在某些實(shí)施方式中，治療個(gè)體的方法包括(a)從骨移植物移除與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分，和(b)向所述個(gè)體施用所述骨移植物和目標(biāo)多肽。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括向個(gè)體施用骨移植物和PDGF，其中與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分已經(jīng)通過在鹽溶液(例如，含有約0. 3 M NaCl和約1. 5 M NaCl之間的鹽溶液)中孵育骨移植物從所述骨移植物中移除。在某些實(shí)施方式中，蛋白酶抑制物被添加到所述骨移植物中。在任何所述方法的某些實(shí)施方式中，所述方法包括測量其余與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的量。在某些實(shí)施方式中，移除與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分包括提高包含所述骨移植物和蛋白酶的溶液的離子強(qiáng)度。在某些實(shí)施方式中，移除與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分包括在鹽溶液中孵育所述骨移植物和蛋白酶。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液是NaCl溶液。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液含有約 0. 15 M NaCl到約1. 5 M NaCl之間，或約0. 3 M NaCl到約1. 5 M NaCl之間。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液含有約0.3 M NaCl。在某些實(shí)施方式中，所述目標(biāo)多肽是PDGF。在某些實(shí)施方式中，所述骨移植物包括添加到所述骨移植物中的磷酸鈣(例如，β-磷酸三鈣)。 在某些實(shí)施方式中，所述骨移植物包括添加到所述骨移植物中的一種或更多種其他化合物 (例如甘油)。在一個(gè)方面，本發(fā)明特征在于在此描述的用作藥物的任何骨移植物(例如，骨同種異體移植物)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明特征在于與任何目標(biāo)多肽一起用作藥物的在此描述的任何骨移植物。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明特征在于與任何目標(biāo)多肽一起用于治療個(gè)體(例如，患有骨、牙周組織、韌帶、軟骨或肌腱狀況的個(gè)體)的方法中的在此描述的骨移植物。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明特征在于在此描述的任何骨移植物與任何目標(biāo)多肽一起用于制造藥物的用途，例如，用于治療個(gè)體的藥物(例如，患有骨、牙周組織、韌帶、軟骨或肌腱狀況的個(gè)體)。本發(fā)明還特征在于包含或由骨移植物(例如，骨同種異體移植物)和鹽(例如，NaCl 的溶液)組成的組合物。在某些實(shí)施方式中，所述組合物還包含目標(biāo)多肽(例如，PDGF)。在某些實(shí)施方式中，所述組合物包括約0.00001 M到約1.5 M鹽，約0.01 M到約1.5 M鹽，約 0.01到約0.15 M鹽，約0.15 M到約1.5 M鹽，或約0.3 M到約1.5 M鹽。在某些實(shí)施方式中，所述組合物包括約0. 00001 M到約1.5 M NaCl，或0.01 M到約1.5 M NaCl，約0.01到約 0. 15 M NaCU^J 0. 15 M 到約 1. 5 M NaCl，或約 0. 3 M 到約 1. 5 M NaCl。本發(fā)明還特征在于通過在此描述的任何方法產(chǎn)生的組合物，例如，包含骨移植物(例如，骨同種異體移植物)和鹽溶液的組合物。在某些實(shí)施方式中，所述組合物還包含目標(biāo)多肽(例如，PDGF )。要理解的是，在此描述的各種實(shí)施方式的一種、一些或所有性質(zhì)可以組合來形成本發(fā)明的實(shí)施方式。本發(fā)明的這些和其他方面對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將變得是明顯的。附圖的簡要描述
附

圖1是研究PDGF從骨移植物結(jié)合和釋放的示范性方案的概述。附圖2是顯示利用提高的鹽濃度在1小時(shí)和M小時(shí)自骨移植物的PDGF釋放的圖形。圖形顯示了利用PBS溶液(最左側(cè)的柱)或提高NaCl溶液的濃度到1.5 M (最右側(cè)的柱)在1小時(shí)或M小時(shí)后釋放的PDGF的量。附圖3是顯示PDGF以40_60%的回收率從骨移植物快速地洗脫，以及PDGF回收率很少取決于混合時(shí)間的圖形?；旌蠒r(shí)間是10分鐘(左側(cè)柱)、60分鐘(中間柱)和過夜(右側(cè)柱)，而洗脫是即時(shí)的，通過添加鹽、在15，330Xg旋轉(zhuǎn)2分鐘，取上清用于分析。對照實(shí)驗(yàn)中的PDGF作為100%。這個(gè)圖形表明，某些PDGF保持與骨移植物締合。附圖4A是顯示利用空間排阻層析(SEC)來確定從人類骨移植物基質(zhì)洗脫的PDGF 的量，以及分析其天然大小和/或聚集的層析譜。SE-HPLC顯示了 PDGF的天然大小和它的相互作用，PDGF聚集和樣品的其他成分。附圖4B顯示了利用標(biāo)明不同分子大小的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物的空間排阻柱校準(zhǔn)。附圖4C是顯示使用不同濃度的PDGF的SEC柱的校準(zhǔn)的圖形。附圖5A和5B是顯示SEC分布是溫度和釋放時(shí)間依賴性的層析譜。這些層析譜顯示了在更高溫度和更久的釋放時(shí)間下非特異性多肽的顯著的洗脫。PDGF的洗脫在測試的條件下沒有很大改變。附圖6A和6B是顯示SEC分布是樣品依賴性的層析譜。附圖7是顯示利用QuantiCleave 蛋白酶分析(Pierce, Rockford, IL)測量的蛋白酶活性的圖形。人類骨移植物07-0720-A稱重為50、25和12.5 mg等分量置于懸浮液中 (A)，同樣的骨移植物與0.66 M NaCl在室溫下孵育60分鐘，然后用20 mM乙酸鈉洗滌三次 (Aff),同樣的骨移植物與0. 66 M NaCl孵育60分鐘，然后用乙酸鈉洗滌，在存在5 mM EDTA 的情況下測量蛋白酶活性(AWE)，從與0. 66 M NaCl在室溫下孵育60分鐘的骨移植物獲得的骨移植物上清液(AWS)，相同的但是在存在5 mM EDTA的情況下分析的(AWSE)。顯示的數(shù)據(jù)是每mg干燥骨移植物標(biāo)準(zhǔn)化的三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值。附圖8是研究不同批次骨移植物的、PDGF自骨移植物的結(jié)合和釋放的示范性方案的概述。附圖9A和9B是顯示人類骨移植物的年齡/性別對PDGF釋放沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的影響的表和圖。附圖10是一圖形，顯示了對于各種骨移植物樣品，通過ELISA (左側(cè)柱)或SEC (右側(cè)柱)測量的自人類骨抑制物的PDGF的回收率。實(shí)驗(yàn)中使用的PDGF的原始量與PDGF的回收量相比標(biāo)準(zhǔn)化為100%。附圖11是一圖形，概述了對于10種不同的骨移植物樣品，通過ELISA (左側(cè)柱)或 SEC (右側(cè)柱)測量的自人類骨抑制物的PDGF的回收率。附圖12是層析譜，顯示了利用反相HPLC來確定PDGF的量，以及檢測由于蛋白水解裂解和/或化學(xué)修飾它的化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變。附圖13A-13E是層析譜，顯示了從各種骨移植物樣品(附圖13A-13D)和PDGF對照 (附圖13E)釋放的PDGF的反相HPLC分布。顯示了三份運(yùn)行。新的峰BC和⑶表明在骨移植物含有蛋白質(zhì)水解活性的情況下PDGF的蛋白水解裂解產(chǎn)物。附圖14A和14B是PDGF樣品的總離子電流(TIC)分布，以及顯示通過ESI LC/MS 的PDGF裂解產(chǎn)物鑒定的表格。附圖15是PDGF的氨基酸序列，顯示了分離自人類血小板的PDGF的示范性的蛋白水解裂解位點(diǎn)(Hart et al. , Purification of PDGF-AB and PDGF-BB from human platelet extracts and identification of all three PDGF dimers in human platelets Biochemistry, 29:166-172, 1990，通過引用將其全部合并在本文中，特別是對于PDGF多肽)。PDGF的同樣的裂解由含有蛋白水解活性的人類骨移植物誘導(dǎo)，如附圖14 所示。附圖16是研究蛋白酶活性自骨移植物去除的示范性的方案的概述。附圖17A-17E是層析譜，顯示了與人類骨移植物07_0720_Α提取物(上清液)孵育不同時(shí)間的PDGF的反相HPLC分布。附圖18Α和18Β是顯示PDGF蛋白水解裂解的時(shí)間依賴性的圖形。附圖19A-19C是層析譜，顯示了在0.3 M鹽洗脫之后，與固體人類骨移植物 07-0720-Α孵育不同時(shí)間的PDGF的反相HPLC分布。附圖20是一圖形，顯示了在用無菌水(左側(cè)柱)、無菌鹽水(中間柱)或無菌洗脫緩沖液(右側(cè)柱)洗滌5分鐘之后，PDGF從DMFDBA的積累的釋放。附圖21A-21D顯示了各種同種異體移植物批次中含有的蛋白質(zhì)/肽的分子功能比較。附圖22顯示了包含5%或更高的各種同種異體移植物批次中任一同種異體移植物的頂部蛋白質(zhì)的比較。發(fā)明的詳細(xì)說明
本發(fā)明部分地基于令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即，骨移植物(例如，人類骨同種異體移植物)可以具有殘余的蛋白酶活性，甚至在它們已經(jīng)被處理以降低內(nèi)源多肽的量來最小化移植到人類中時(shí)的不良反應(yīng)之后。特別地，發(fā)現(xiàn)的是，與人類骨移植物相關(guān)的殘余的蛋白酶活性的量是可變的。這種殘余的蛋白酶活性對于要與目標(biāo)多肽(例如，PDGF) —起施用給個(gè)體的骨移植物是不希望的，因?yàn)榈鞍酌富钚钥赡芰呀饽繕?biāo)多肽(在目標(biāo)多肽被施用給個(gè)體之前或之后)。目標(biāo)多肽的裂解產(chǎn)生了目標(biāo)多肽結(jié)構(gòu)方面的變異性，因?yàn)楫a(chǎn)生了全長和裂解的多肽的混合物。此外，裂解的多肽的百分比可能隨著時(shí)間增加。相比之下，目標(biāo)多肽的更均一的組成是期望的，以最小化或防止生物學(xué)活性或穩(wěn)定性方面的改變，這可能由于目標(biāo)多肽的結(jié)構(gòu)方面的變化而發(fā)生。特別地，對于涉及向個(gè)體(例如，患有骨、牙周組織、韌帶、軟骨或肌腱狀況的人類)施用目標(biāo)多肽和骨移植物的治療方法，期望的是最小化由于與骨移植物基質(zhì)的相互作用、對目標(biāo)多肽的結(jié)構(gòu)(例如，它的一級、二級或三級結(jié)構(gòu))和/或功能的改變。本發(fā)明還提供了測量與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的方法。這種測量允許人們確定特定的骨移植物是否應(yīng)當(dāng)與目標(biāo)多肽一起施用給個(gè)體(例如，患有骨、牙周組織、韌帶、軟骨或肌腱狀況的人類)。另外，本發(fā)明特征在于降低與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性水平的方法。這些方法容許產(chǎn)生具有可接受水平的蛋白酶活性(或沒有蛋白酶活性)的骨移植物用于治療應(yīng)用。在以下小節(jié)中，首先描述了示范性的骨移植物、目標(biāo)多肽和多肽底物。然后，解釋了表征骨移植物和/或選擇具有期望性質(zhì)的骨移植物的示范性的方法。接下來，描述了降低與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性水平的方法。然后公開了示范性的治療方法和試劑盒。示范件的骨移棺物
示范性的骨移植物包括骨同種異體移植物、同基因移植物、自體移植物和異種移植物。 骨同種異體移植物包來自供體的骨或骨細(xì)胞，其可以移植到同一物種的遺傳上不同的成員中。來自遺傳上相同的供體，即，同卵雙胞胎，的移植的骨或骨細(xì)胞被稱為同基因移植物。 當(dāng)細(xì)胞或組織從同一個(gè)體的一個(gè)位置移植到另一個(gè)位置時(shí)，這稱為自體移植物。相比之下， 來自另一個(gè)物種的移植物被稱為異種移植物。在某些情況下，來自人類供體的骨被移植給另一個(gè)人。示范性的人類骨同種異體移植物是從死后的人類供體分離的骨骼的碎片。骨移植物可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法礦化或部分地或完全地脫礦質(zhì)廣4%的殘余通常是使用的大多數(shù)脫礦質(zhì)作用)。在特定的實(shí)施方式中，所述骨移植物是未脫礦質(zhì)的。在特定的實(shí)施方式中， 所述骨移植物是使用標(biāo)準(zhǔn)方法去有機(jī)化的。在特定的實(shí)施方式中，所述骨移植物是未脫礦質(zhì)和去有機(jī)化的。在某些實(shí)施方式中，所述骨移植物含有(i)礦化的骨和(ii)部分地或完全地脫礦質(zhì)的骨的組合。如果希望，所述骨移植物可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法部分地或完全地脫去蛋白質(zhì)，例如，脫蛋白質(zhì)的?；蛉祟惞菈K。示范性的骨移植物包括脫礦質(zhì)凍干的骨移植物(DFDBA)、凍干的骨移植物(FDBA)、新鮮冷凍的骨同種異體移植物、顆粒脫礦質(zhì)的骨基質(zhì) (DBM)或骨塊(參見，例如U. S. S. N. 60/890，763，2007年2月20日提交的；2007年2月9 日提交的美國專利公開No. 2007/0207185 ；2006年11月17日提交的美國專利公開No. 2007/0129807 ；通過引用將它們完全合并在本文中，特別是對于骨移植物)。在某些實(shí)施方式中，所述骨移植物是自體的皮層的、多孔的或皮層-松質(zhì)骨塊。在某些實(shí)施方式中，骨移植物是去有機(jī)化的異種材料，例如，BioOss (Geistlich Biomaterials, Inc ·)。在某些實(shí)施方式中，骨移植物是用于人類的商業(yè)上制備的骨移植物。在某些實(shí)施方式中，骨移植物已經(jīng)被處理從而它適用于人類。使得骨移植物適用于人類的示范性的處理步驟包括，但不限于，生物負(fù)擔(dān)控制、生物負(fù)擔(dān)評估、最小化的污染、嚴(yán)格的清潔、消毒和清洗、磨碎、冷凍干燥、等分、包裝、末端消毒、礦化、脫礦質(zhì)作用、冷凍干燥、無菌制備、骨塊或顆粒形成，或兩種或更多種上述的任何組合。在某些實(shí)施方式中，骨移植物經(jīng)歷了 Allowash XG (生物負(fù)擔(dān)控制、生物負(fù)擔(dān)評估、最小化的污染、嚴(yán)格的清潔、消毒和清洗)。在各種實(shí)施方式中，骨同種異體移植物是磨碎的或未磨碎的，凍干的或未凍干的，消毒，或僅僅無菌地制備的。在某些實(shí)施方式中，骨移植物用一種或更多種化學(xué)的(例如，過氧化氫、洗滌劑、表面活性劑，例如 nonoxynyl-9或異丙基醇)或抗生素(例如，多粘菌素或桿菌肽)處理。在某些實(shí)施方式中， 骨移植物暴露于Y射線或氧化乙烯用于滅菌。不是所有的骨移植物都終末消毒。在某些實(shí)施方式中，骨移植物被處理來除去病毒和/或細(xì)菌。在某些實(shí)施方式中，在添加目標(biāo)多肽之前，骨移植物被洗滌(例如，在水、鹽水或洗脫緩沖液中洗滌)。示范性的骨移植物來源于一種或更多種以下類型的骨肱骨、尺骨、橈骨、股骨、脛骨、腓骨、膝蓋骨、距骨、腕骨(wrist bones)、腕(carpals)、掌骨、指骨、跗骨、跖骨、肋骨、胸骨、脊椎、肩胛骨、鎖骨、骨盆、骶骨和顱面骨。骨移植物的示范性的供體包括靈長類(例如，人類、猴、大猩猩、猿、狐猴，等等)、牛、馬、豬、羊、犬和貓。在某些實(shí)施方式中，骨移植物包括顆粒、共混物、網(wǎng)格或塊?？梢允褂萌魏魏线m的總尺寸的骨移植物，例如，對于治療特定大小的骨缺損或損傷有用的總尺寸。在某些實(shí)施方式中，骨移植物由任何合適大小的顆粒組成，例如，約50到約750 μ m之間，約50到約500 μ m之間，約125到約500 μ m之間，約250到約710 μ m之間，或約125到約1000 μ m之間。在某些實(shí)施方式中，骨移植物由平均直徑約50 ym到約100 mm或約0. 1 mm到約100 mm之間的骨塊組成。在某些實(shí)施方式中，顆粒是小于約100 ym (例如，約50到約90 ym 之間)或大于355 μ m (例如，約360到約1000 μ m之間)，因?yàn)榫哂屑s100到約355 μπι之間的顆粒大小的骨移植物與某些應(yīng)用所希望的相比是較小可流動的。流動性是指材料作為勻質(zhì)混合物通過套管或小的測流管的能力，，那就是說，沒有液體與顆粒的分離。在某些實(shí)施方式中，寬泛的大小范圍(例如，約250到約710 μ m之間)被用于最大化來自骨移植物的產(chǎn)量。例如，磨碎的皮層骨在標(biāo)準(zhǔn)的碾磨設(shè)備上加工，其產(chǎn)生一定范圍大小內(nèi)的顆粒。容許的大小范圍越寬闊，產(chǎn)量越大。在特定的實(shí)施方式中，骨移植物包含或由比例約1:1的凍干的磨碎的皮層骨與脫礦質(zhì)凍干的磨碎的皮層骨組成。在一些這樣的實(shí)施方式中，不添加外源的磷酸鈣。根據(jù)某些實(shí)施方式，多孔的骨移植物可以包含直徑范圍約1 μ m到約1 mm的孔。 在一個(gè)實(shí)施方式中，骨移植物包含直徑范圍約100 μπι到約1 mm的大孔。在另一個(gè)實(shí)施方式中，骨移植物包含直徑范圍約10 μπι到約100 ym的中孔。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，骨移植物包含直徑小于約10 μ m的微孔。本發(fā)明的實(shí)施方式期待包含大孔、中孔、微孔或其任何組合的骨移植物。在一個(gè)實(shí)施方式中，多孔的骨移植物包括具有大約、或大于25、30、40、 50、60、70、75、80、85、90或95%的任一的孔隙度的骨移植物。在某些實(shí)施方式中，骨移植物的多孔結(jié)構(gòu)容許細(xì)胞(例如，成骨細(xì)胞)浸潤到基質(zhì)的孔洞中。在某些實(shí)施方式中，骨移植物包含具有多方向和/或互連的孔洞的多孔結(jié)構(gòu)。在其他實(shí)施方式中，骨移植物包含具有不互連的孔洞的多孔結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方式中，骨移植物包含具有互連的孔洞和不互連的孔洞的混合的多孔結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方式中，骨移植物是多孔的，能夠以從約1到約15倍骨移植物質(zhì)量的量吸水。在某些實(shí)施方式中，骨移植物包括添加到骨移植物中的磷酸鈣(例如，外源的磷酸鈣)。例如，2007年2月9日提交的美國公開NO. 2007/0207185中公開的任何所述磷酸鈣可以使用(通過引用將其完全合并在本文中，特別是對于磷酸鈣)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，適合與骨移植物一起使用的磷酸鈣具有約0. 5到約2. 0的鈣磷原子比。適合與骨移植物一起使用的磷酸鈣的非限制性實(shí)例包括無定形的磷酸鈣、磷酸一鈣一水合物(MCPM)、無水的磷酸一鈣(MCPA)、磷酸二鈣二水合物(DCPD)、無水的磷酸二鈣(DCPA)、磷酸八鈣(0CP)、 α-磷酸三鈣、β-磷酸三鈣(β-TCP)、羥磷灰石(OHAp)、不良結(jié)晶的羥磷灰石、磷酸四鈣 (TTCP)、十磷酸七鈣、偏磷酸鈣、焦磷酸鈣二水合物、碳酸化的磷酸鈣和焦磷酸鈣。在某些實(shí)施方式中，所述基質(zhì)包括相比添加的磷酸鈣，例如，β-TCP的重量，按重量計(jì)算約1、2、3、4、 5或6的任一倍數(shù)的骨移植物。在某些實(shí)施方式中，基質(zhì)包括按重量計(jì)算約80%的骨移植物 (例如，骨同種異體移植物)和按重量計(jì)算約20%的其他磷酸鈣，例如，β-TCP。在某些實(shí)施方式中，磷酸鈣(例如，β-TCP)具有大約或大于40、50、60、70、75、80、85、90或95%的任一的孔隙度。
在某些實(shí)施方式中，生物相容的粘合劑添加到骨移植物(例如，單獨(dú)的骨移植物或骨移植物與外源磷酸鈣的混合物)。例如，可以使用2007年2月9日提交的美國公開NO. 2007/0207185中公開的任何生物相容的粘合劑(通過完全引用將其合并在文本中，特別是對于生物相容的粘合劑)。在某些實(shí)施方式中，生物相容的粘合劑可以包括膠原蛋白、彈性蛋白、多糖、核酸、碳水化物、蛋白質(zhì)、多肽、聚(α-羥酸)、聚(內(nèi)脂)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、 聚氨基甲酸酯、聚(原酸酯)、聚(酸酐-共-亞胺)、聚(原碳酸酯)、聚(α-羥基烷酸酯)、聚 (二螺烷酮)、聚(磷脂)、聚乙酸、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(D，L-丙交酯)(PDLLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、聚(L-丙交酯-共_D，L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯-共-碳酸三亞甲酯)、聚羥基乙酸、多羥基丁酸(PHB)、聚(ε-己內(nèi)酯)、聚(δ-戊內(nèi)酯)、 聚(Y-丁內(nèi)酯)、聚(己內(nèi)酯)、聚丙烯酸、多聚羧酸、聚(烯丙胺鹽酸鹽)、聚(二烯丙基-二甲基氯化銨)、聚(乙烯亞胺)、聚丙烯延胡索酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、碳纖維、聚(乙二醇)、聚(氧化乙烯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡硌烷酮)、聚(乙基嚷唑啉)、聚(氧化乙烯)-共-聚(氧化丙烯)嵌段共聚物、聚(對苯二甲酸亞乙酯)聚酰胺以及其共聚物和混合物。在其他實(shí)施方式中，生物相容的粘合劑可以包含海藻酸、阿拉伯樹膠、瓜耳豆膠、黃原膠、明膠、幾丁質(zhì)、殼聚糖、殼聚糖乙酸酯、殼聚糖乳酸酯、硫酸軟骨素、 N，0-羧甲基殼聚糖、葡聚糖(例如，α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、Y-環(huán)糊精，或硫酸葡聚糖鈉)、 纖維蛋白膠、卵磷脂、磷脂酰膽堿衍生物、甘油、透明質(zhì)酸、透明質(zhì)酸鈉、纖維素(例如，甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或羥乙基纖維素)、氨基葡萄糖、蛋白多糖、淀粉 (例如羥乙基淀粉或溶性淀粉)、乳酸、pluronic酸、甘油磷酸鈉、糖原、角蛋白、絲以及其衍生物和混合物。在某些實(shí)施方式中，骨移植物的多孔結(jié)構(gòu)允許在約1小時(shí)之后大于或大約20、30、 40、50、60或70%的任一的目標(biāo)多肽(例如，PDGF)的釋放(根據(jù)使用合適的分析例如在此描述的ELISA或空間排阻層析分析測量的目標(biāo)多肽的量)。在其他實(shí)施方式中，骨移植物的多孔結(jié)構(gòu)允許在約8小時(shí)后大于或大約20、30、40、50、60或70%的任一的目標(biāo)多肽(例如， PDGF)的釋放。在其他實(shí)施方式中，骨移植物的多孔結(jié)構(gòu)允許在約M小時(shí)后大于或大約20、 30、40、50、60或70%的任一的目標(biāo)多肽(例如，PDGF)的釋放。在某些實(shí)施方式中，骨移植物是生物可吸收的?！吧锟晌盏摹笔侵腹且浦参镌隗w內(nèi)被再吸收或再成型的能力。再吸收過程涉及通過體液、酶或細(xì)胞的作用原始材料的降解和消除。再吸收的材料可以由治療的個(gè)體在新組織的形成中使用，或可以被治療的個(gè)體重新利用，或可以被分泌。在某些實(shí)施方式中，骨移植物可以在體內(nèi)施用的一年內(nèi)再吸收。 在其他實(shí)施方式中，骨移植物可以在體內(nèi)施用的1、3、6或9個(gè)月內(nèi)再吸收。生物再吸收性取決于(1)基質(zhì)材料的性質(zhì)(即，它的化學(xué)組成，物理結(jié)構(gòu)和大小)；(2)基質(zhì)放置的體內(nèi)位置；(3)使用的基質(zhì)材料的量；(4)被治療的個(gè)體的代謝狀態(tài)(糖尿病/非糖尿病、骨質(zhì)疏松的、吸煙者、年齡、類固醇使用，等等)；(5)治療的損傷或狀況的程度和/或類型；和(6)除了基質(zhì)之外其他材料的使用，例如，其他骨合成代謝的、分解代謝的和抗分解代謝的因子。示范性的目標(biāo)多肽
任何目標(biāo)多肽可以與在此描述骨移植物一起使用。術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換地使用，是指任何長度的氨基酸的聚合物。所述聚合物可以是線性或分枝的，它可以包含修飾的氨基酸，它可以被非氨基酸中斷。該術(shù)語還涵蓋天然地或通過插入被修飾的氨基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂質(zhì)化、乙?；?、磷酸化、或任何其他操作或修飾，例如，與標(biāo)記成分結(jié)合。還包括在該定義內(nèi)的是，例如，含有一種或更多種氨基酸的類似物(包括，例如，非天然氨基酸，等等)以及本領(lǐng)域已知的其他修飾的多肽。在某些實(shí)施方式中，目標(biāo)多肽是能夠被與骨移植物相關(guān)的一種或更多種蛋白酶裂解的多肽。如果希望，目標(biāo)多肽被與骨移植物相關(guān)的一種或更多種蛋白酶裂解的能力可以使用在此描述任何方法(例如，通過孵育目標(biāo)多肽與骨移植物，從骨移植物分離目標(biāo)多肽， 以及測量被裂解的目標(biāo)多肽的量)來測量。理想地，在此描述的方法降低可以裂解目標(biāo)多肽的、與骨移植物相關(guān)的蛋白酶的量。在某些實(shí)施方式中，超過一種目標(biāo)多肽(例如，2、3、4、5 或更多種不同的多肽)在此處描述的方法、整合物或試劑盒中使用。在某些實(shí)施方式中，所述目標(biāo)多肽促進(jìn)骨修復(fù)、痊愈或生長。在某些實(shí)施方式中，目標(biāo)多肽是PDGF，其是在損傷的位點(diǎn)從血小板天然地釋放的生長因子。PDGF與VEGF協(xié)同促進(jìn)新血管形成，并且刺激間葉細(xì)胞衍生的細(xì)胞，包括肌腱細(xì)胞(tenocyte)、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的趨化性和增殖。在某些實(shí)施方式中，PDGF 包含 PDGF 同二聚體和異二聚體，包括 PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC、 PDGF-DD，和其混合物和衍生物。在某些實(shí)施方式中，PDGF包含PDGF-BB。在其他實(shí)施方式中，PDGF包含重組人類PDGF，例如，rhPDGF_BB。在某些實(shí)施方式中，PDGF包含PDGF片段。 在一個(gè)實(shí)施方式中，rhPDGF-B包含以下片段完整B鏈的氨基酸序列1_31、1_32、33_108、 33-109和/或1-108。PDGF的B鏈的完整的氨基酸序列(氨基酸1_109)在美國專利No. 5，516，896的附圖15中提供了(通過引用將其完全合并在此，特別是對于PDGF多肽)。要理解的是，本發(fā)明的rhPDGF組合物可以包含完整的rhPDGF-B (氨基酸1-109)和其片段的組合。可以采用PDGF的其他片段，例如，在美國專利No. 5，516，896中公開的那些。根據(jù)某些實(shí)施方式，rhPDGF-BB包含完整rhPDGF-B (氨基酸1-109)的大于或大約65%、75%、80%、 85%、90%、95% 或 99% 的任一。在某些實(shí)施方式中，目標(biāo)多肽是被與也裂解PDGF的、與骨移植物相關(guān)的一種或更多種蛋白酶(例如，氨基肽酶、羧肽酶和金屬蛋白酶)裂解的多肽。例如，目標(biāo)多肽可以具有對于PDGF附圖15中所示的一個(gè)或更多個(gè)裂解位點(diǎn)在Serl、Leu5或Arg32之后的肽鍵的裂解。在某些實(shí)施方式中，目標(biāo)多肽含有至少約2、3、4、5、6、7或更多個(gè)的任一的連續(xù)的氨基酸，其相同于包括Serl、Leu5或Arg32的PDGF多肽的2、3、4、5、6、7或更多個(gè)連續(xù)氨基酸。在某些實(shí)施方式中，目標(biāo)多肽含有至少約4、5、6、7或更多個(gè)的任一的連續(xù)的氨基酸， 其大于或約80、85、95、99或100%相同于包括Serl、Leu5或Arg32的PDGF多肽的連續(xù)氨基酸?？梢詼y量序列同一性，例如，使用帶有其中指定的默認(rèn)參數(shù)的序列分析軟件(例如， Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705)。 這種軟件程序通過對各種氨基酸替換、刪除和其他修飾指定同源性程度來匹配相似的序列。在某些實(shí)施方式中，目標(biāo)多肽是獲自天然來源的。在其他實(shí)施方式中，目標(biāo)多肽是通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的。在某些實(shí)施方式中，目標(biāo)多肽或其片段可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的肽合成技術(shù)，例如固相肽合成來生產(chǎn)。當(dāng)從天然來源獲得時(shí)，目標(biāo)多肽可以是，例如，衍生自生物液體的。根據(jù)某些實(shí)施方式，生物液體可以包括與活有機(jī)體相關(guān)的任何處理的或未處理的液體，包括血液。生物液體還可以包括血液成分，其包括血小板濃縮物、機(jī)采(apheresed)血小板、富含血小板的血漿、血漿、血清、新鮮冰凍血漿和血沉棕黃層。生物液體可以包含分離自血漿、重懸浮在生理性液體中的血小板。當(dāng)通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)時(shí)，編碼單個(gè)單體的DNA序列(例如，PDGF B-鏈或A-鏈) 可以插入到培養(yǎng)的原核或真核細(xì)胞中用于表達(dá)以隨后生產(chǎn)同二聚體(例如，PDGF-BB或 PDGF-AA)。重組技術(shù)生產(chǎn)的同二聚體PDGF可以在某些實(shí)施方式中使用。在某些實(shí)施方式中，PDGF的同二聚體在工程化的酵母細(xì)胞例如釀酒酵母中生產(chǎn)。在其他實(shí)施方式中，PDGF 異二聚體可以通過將編碼異二聚體的兩種單體單位的DNA序列插入到培養(yǎng)的原核或真核細(xì)胞中，并容許翻譯的單體單元被所述細(xì)胞處理以產(chǎn)生異二聚體(例如，PDGF-AB)來產(chǎn)生。 商業(yè)上可獲得的重組目標(biāo)多肽(例如，人類PDGF-BB)可以從各種來源獲得。在某些實(shí)施方式中，目標(biāo)多肽是高度純化的形式。如在此使用的，“純化的多肽”包括組合物，在摻入本發(fā)明的溶液中之前所述組合物具有大于或大約按重量計(jì)算95%的目標(biāo)多肽。溶液可以使用任何藥學(xué)上可接受的緩沖液或稀釋劑來制備。在其他實(shí)施方式中，目標(biāo)多肽可以是基本上純化的。如在此使用的，“基本上純化的多肽”包括組合物，在摻入本發(fā)明的溶液中之前所述組合物具有按重量計(jì)算大約5%到約95%的目標(biāo)多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，基本上純化的多肽包括組合物，在摻入本發(fā)明的溶液中之前所述組合物具有按重量計(jì)算大約65%到約95%的目標(biāo)多肽。在其他實(shí)施方式中，基本上純化的目標(biāo)多肽包括組合物，在摻入到本發(fā)明的溶液中之前所述組合物具有按重量計(jì)算約70%到約95%、約75%到約95%、約80%到約95%、約85%到約95%、或約90%到約95%的目標(biāo)多肽。純化的目標(biāo)多肽和基本上純化的目標(biāo)多肽可以摻入到骨移植物中。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述目標(biāo)多肽可以是部分純化的。示范性的部分純化的多肽(例如，PDGF)包含在富含血小板的血漿、新鮮冰凍血漿、或任何需要采集和分離以產(chǎn)生目標(biāo)多肽的其他血液產(chǎn)品的環(huán)境中具有目標(biāo)多肽的組合物。本發(fā)明的實(shí)施方式期待的是， 在此提供的任何多肽同種型，包括同二聚體和異二聚體，可以是純化的或部分純化的。包含多肽混合物的本發(fā)明的組合物可以包含處于部分地純化的比例中的目標(biāo)多肽的同種型、變體或片段。在某些實(shí)施方式中，部分地純化的和純化的PDGF可以如2005年6月23日提交的美國公開No. 2006/0084602中描述的制備(通過引用將其完全合并在本文中，特別是對于PDGF多肽)。示范性的多肽底物
能夠被蛋白酶裂解的任何多肽可以用作在此描述的任何方法中的多肽底物，用于測量與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性或選擇具有可接受水平的蛋白酶活性的骨移植物。示范性的多肽底物包括在此描述的任何目標(biāo)多肽。在某些實(shí)施方式中，多肽底物是已知被一種或更多種蛋白酶裂解的多肽(例如，氨基肽酶、羧肽酶和/或金屬蛋白酶)。在某些實(shí)施方式中， 所述多肽底物是商業(yè)上可獲得的多肽(例如，QuantiCleave 蛋白酶分析試劑盒(Pierce， Eockfrd, IL)中的琥珀?；睦业鞍?，牛血紅蛋白(cat. # H2625，Sigma-Aldrich, St. Louis，M0)，明膠(Cat. # G7765, Sigma, St Louis, M0)，或來自牛奶的酪蛋白熒光素異硫氰酸 I 型(Cat. # C0403, Sigma-Aldrich, St. Louis , M0))。表征和/或選擇骨移植物的示范性的方法
如果希望，在此描述的任何骨移植物可以被分析，以確定與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的量(例如，一種或更多種氨基肽酶、羧肽酶和/或金屬蛋白酶的活性)(例如，來預(yù)測當(dāng)目標(biāo)多肽與所述骨移植物一起施用時(shí)多少目標(biāo)多肽將被與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性裂解)。在一個(gè)這樣的方面中，本發(fā)明特征在于測量與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的方法。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括測量被與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性裂解的多肽底物(例如，PDGF)的量。在某些實(shí)施方式中，測量裂解的多肽底物的量包括包括(i)孵育所述多肽底物和所述骨移植物，(ii)從所述骨移植物中移除裂解的多肽底物的總量的至少一部分，和(iii)測量裂解的多肽底物的量。在某些實(shí)施方式中，步驟(ii)包括提高包含所述骨移植物和所述多肽底物的溶液的離子強(qiáng)度。在某些實(shí)施方式中，步驟(ii)包括在鹽溶液中孵育所述骨移植物和所述多肽底物。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液是NaCl溶液，例如約0.15 M NaCl到約2.0 M NaCl之間，或約0.6 M NaCl。在某些實(shí)施方式中，步驟(iii) 包括分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物以及骨移植物。在某些實(shí)施方式中，高性能液相層析(HPLC)被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。在某些實(shí)施方式中，空間排阻層析(SEC)被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。在某些實(shí)施方式中，所述多肽底物是PDGF。 如在實(shí)施例中描述的，開發(fā)了方法來在結(jié)合骨移植物之后分離PDGF或其他目標(biāo)多肽。例如，當(dāng)rhPDGF-BB與骨移植物的混合物用低離子強(qiáng)度緩沖液洗滌時(shí)，與骨移植物基質(zhì)結(jié)合的rhPDGF-BB的小于10%從骨移植物上取回(通過rhPDGF-BB從骨移植物上向溶液中的釋放)。提高緩沖液的離子強(qiáng)度提高了從骨移植物上釋放的rhPDGF-BB的量(附圖2)。 鹽(例如，NaCl)的最佳濃度是0. 6 M，然而可以使用其他濃度例如約0. 15 M到約2. 0 M之間。rhPDGF-BB從基質(zhì)的釋放在這些條件下幾乎是即時(shí)的(附圖3)。其他單價(jià)的或二價(jià)的鹽可以用于實(shí)現(xiàn)rhPDGF或其他目標(biāo)多肽從骨移植物上的釋放，例如，KCl、LiCl、(NH4) 2S04、 NaHPO4,等等。如果希望，ELISA分析可以用于測量從骨移植物釋放的PDGF或其他目標(biāo)多肽的量(例如，可溶的多肽的量)。在實(shí)施例中描述的ELISA分析測量PDGF與其受體的結(jié)合， 容許測量仍然能結(jié)合其受體的PDGF的量。實(shí)施例描述了反相HPLC (RPHPLC)和SEC方法， 例如，高性能空間排阻層析(HPSEC)，用于從骨移植物分離裂解的PDGF和未裂解的PDGF， 容許測定被與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶裂解的PDGF的百分比。例如，這些方法容許測定結(jié)構(gòu)中的改變(例如，裂解或化學(xué)修飾)以及多肽聚集的程度。例如，如果PDGF聚集，它的大小提高，在更早的洗脫時(shí)間洗脫，如37°C的附圖5B所示。RPHPLC分布(例如，新的峰的出現(xiàn))中的任何改變表明rhPDGF-BB結(jié)構(gòu)上的可能的變化，最可能是由于某些氨基酸殘基的蛋白水解裂解或化學(xué)修飾，或兩者。這些方法同時(shí)容許從不然可能阻礙rhPDGF-BB的分析的內(nèi)源骨移植物多肽中分離rhPDGF-BB。為了使用SEC方法測量rhPDGF-BB的量，與 rhPDGF-BB相應(yīng)的峰被整合，通過使用根據(jù)已知濃度的rhPDGF-BB標(biāo)準(zhǔn)物計(jì)算的校準(zhǔn)曲線來測定rhPDGF-BB濃度，如附圖4A-4C所示。為了使用RPHPLC方法測量rhPDGF-BB的量， 使用屬于rhPDGF-BB的成分的所有峰面積的總和。實(shí)際上，某些骨移植物誘導(dǎo)rhPDGF-BB 的蛋白水解裂解，如在RPHPLC分布圖中新的峰的出現(xiàn)所展現(xiàn)的(附圖14A)。因?yàn)樾碌姆蹇梢栽赗PHPLC分布圖中分離，RPHPLC方法可以用于通過質(zhì)譜法(附圖14B)或任何其他標(biāo)準(zhǔn)方法(例如，Edman N-末端測序)鑒定新的多肽峰。因而，可以鑒定引起裂解的rhPDGF-BB (附圖15)或其他目標(biāo)多肽和/或蛋白酶中的裂解位點(diǎn)。如果希望，目標(biāo)多肽的功能性質(zhì)可以在它從骨移植物釋放之后利用標(biāo)準(zhǔn)的基于細(xì)胞的分析來測量，例如，測量相應(yīng)于與目標(biāo)生長因子孵育的細(xì)胞增殖的分析(例如，基于細(xì)胞的堿性磷酸酶生物分析)。例如，可以使用測量rhPDGF-BB對MG-63細(xì)胞生長的刺激作用的分析。在某些實(shí)施方式中，測量與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的方法包括(a)從骨移植物中移除與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分；和(b)測量被所述移除的蛋白酶裂解的多肽底物的量，從而確定與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的量。在某些實(shí)施方式中，步驟(a)包括提高包含所述骨移植物和蛋白酶的溶液的離子強(qiáng)度。在某些實(shí)施方式中，步驟(a)包括在鹽溶液孵育所述骨移植物和蛋白酶。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液是 NaCl溶液，例如約0. 15 M NaCl到約1. 5 M NaCl之間，或約0. 3 M NaCl到約1. 5 M NaCl 之間。在某些實(shí)施方式中，步驟(b)包括分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物以及骨移植物。在某些實(shí)施方式中，HPLC或SEC被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。在某些實(shí)施方式中，測量與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的方法包括(i)從骨移植物中移除與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分；和(ii)測量從所述骨移植物移除的一種或更多種蛋白酶的量或濃度，從而確定與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的量。在某些實(shí)施方式中，所述多肽底物是PDGF。如在實(shí)施例中進(jìn)一步描述的，開發(fā)了方法來從骨移植物在移除蛋白酶活性的至少一部分。使用0.3 M NaCl，蛋白酶活性幾乎完全地從人類骨移植物中洗脫，然而可以使用其他濃度的鹽，例如，約0. 15 M到約1.5 M之間。八十分鐘是利用PDGF作為底物在37°C 分析蛋白酶活性的最佳時(shí)間，然而可以使用其他孵育時(shí)間和溫度。如果希望，標(biāo)準(zhǔn)的Edman N-末端測序可以用于在其從骨移植物上移除之后鑒定蛋白酶。做為選擇或另外地，利用標(biāo)準(zhǔn)方法，例如在此描述的那些，質(zhì)譜法可以用于在從骨移植物移除蛋白酶之后測定蛋白酶的大小和身份。在一個(gè)方面，本發(fā)明特征在于選擇骨移植物用于與目標(biāo)多肽(例如，PDGF)— 起向個(gè)體施用的方法。在某些實(shí)施方式中，所述方法涉及測量與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性，由此根據(jù)與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的量來確定是否選擇該骨移植物用于與目標(biāo)多肽一起向個(gè)體施用。在某些實(shí)施方式中，所述方法涉及選擇具有可接受水平的蛋白酶活性的骨移植物用于與目標(biāo)多肽一起向個(gè)體施用。在某些實(shí)施方式中，測量兩種或更多種骨移植物的蛋白酶活性，具有最低蛋白酶活性的骨移植物與所述目標(biāo)多肽一起向個(gè)體施用。在某些實(shí)施方式中，選擇的骨移植物的蛋白酶活性小于約50胰蛋白酶當(dāng)量。在某些實(shí)施方式中，選擇的骨移植物的蛋白酶活性在約50到約65胰蛋白酶當(dāng)量之間(例如，約50到約55、 約55到約60、或約60到約65胰蛋白酶當(dāng)量)。在某些實(shí)施方式中，選擇的骨移植物的蛋白酶活性是約50、55、60或65胰蛋白酶當(dāng)量的任一個(gè)。在某些實(shí)施方式中，選擇的骨移植物的蛋白酶活性是小于約50胰蛋白酶當(dāng)量(例如，小于約45、小于約40、小于約35、小于約 30、小于約25、小于約20、小于約15、小于約10、小于約5、約0胰蛋白酶當(dāng)量)。在某些實(shí)施方式中，所述方法還涉及選擇結(jié)合可接受量的起始目標(biāo)多肽和/或釋放結(jié)合到骨移植物的可接受百分比的目標(biāo)多肽的骨移植物。
在一個(gè)方面，本發(fā)明特征在于降低與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的方法。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括從所述骨移植物移除與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分。在某些實(shí)施方式中，移除蛋白酶包括提高包含骨移植物和蛋白酶的溶液的離子強(qiáng)度。 在某些實(shí)施方式中，移除所述蛋白酶包括在鹽溶液(例如，NaCl溶液)中孵育所述骨移植物和蛋白酶。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液含有約0. 15 M NaCl到約1. 5 M NaCl之間，或約0. 3 M NaCl到約1. 5 M NaCl之間。在某些實(shí)施方式中，所述鹽溶液含有約0. 3 M NaCl0 在某些實(shí)施方式中，所述方法包括測量其余與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的量。在某些實(shí)施方式中，所述骨移植物在移除蛋白酶之后保留至少部分它的骨誘導(dǎo)活性。在某些實(shí)施方式中，所述骨移植物在蛋白酶移除之后保留至少一部分與之締合的內(nèi)源多肽(例如，BMPs)。 在某些實(shí)施方式中，骨移植物然后施用給個(gè)體，如下所述。在某些實(shí)施方式中，蛋白酶抑制物可以添加到骨移植物中。例如，可以添加特異于骨移植物中的一種或更多種蛋白酶的蛋白酶抑制物，例如，對于組織蛋白酶G、基質(zhì)金屬蛋白酶-9和/或胃促胰酶的蛋白酶抑制物。洗滌骨移棺物的示范件的方法
在某些實(shí)施方式中，在添加目標(biāo)多肽之前，骨移植物(例如，人類骨同種異體移植物)被洗滌(例如，在水、鹽水或洗脫緩沖液中洗滌)。這個(gè)洗滌步驟可以附加于或代替從骨移植物中一部分蛋白酶活性的移除。在某些實(shí)施方式中，這個(gè)洗滌步驟從骨移植物中除去酸性殘余物。在某些實(shí)施方式中，這個(gè)洗滌步驟改善骨移植物保持目標(biāo)多肽的能力。例如，附圖20概述了在水、鹽水或洗脫緩沖液中洗滌脫礦質(zhì)的人類骨移植物怎樣影響PDGF與骨移植物的結(jié)合。趨勢表明，在無菌水中洗滌骨移植物5分鐘導(dǎo)致在60分鐘研究的末尾從DM骨移植物釋放的PDGF的量的降低。更多的PDGF在5分鐘的鹽水洗滌之后釋放，在洗脫緩沖液中洗滌處于水和鹽水洗滌之間。洗滌如下進(jìn)行。骨移植物樣品廣0. 1 g)置于小的塑料管中，然后將1. 0 ml的水、 鹽水溶液或洗脫緩沖液添加到樣品中。容許混合物在室溫保持5分鐘，偶爾用手輕輕地混合。在5分鐘的結(jié)束時(shí)，利用吸移管從骨移植物材料脫除液體，其余液體通過用無菌的棉花 Q-tip敷涂器壓縮材料來除去。在這之后，0.3 mg/ml rhPDGF_BB的溶液添加到洗滌的骨移植物中，移除樣品用于通過ELISA在60分鐘內(nèi)PDGF定量。示范性的處理方法
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了使用在此描述的任何骨移植物和一種或更多種目標(biāo)多肽治療個(gè)體的方法。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括向個(gè)體施用骨移植物和目標(biāo)多肽(例如，PDGF)。在某些實(shí)施方式中，所述骨移植物已經(jīng)根據(jù)蛋白酶活性的水平進(jìn)行了選擇。在某些實(shí)施方式中，在向所述個(gè)體施用骨移植物之前，與骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分已經(jīng)被從骨移植物除去。在某些實(shí)施方式中，測量兩種或更多種骨移植物的蛋白酶活性，具有最低蛋白酶活性的骨移植物與所述目標(biāo)多肽一起向個(gè)體施用。在某些實(shí)施方式中，選擇的骨移植物的蛋白酶活性小于約50胰蛋白酶當(dāng)量。在某些實(shí)施方式中，選擇的骨移植物的蛋白酶活性在約50到約65胰蛋白酶當(dāng)量之間(例如，約50到約55、約55到約 60、或約60到約65胰蛋白酶當(dāng)量)。在某些實(shí)施方式中，選擇的骨移植物的蛋白酶活性是約50、55、60或65胰蛋白酶當(dāng)量的任一個(gè)。在某些實(shí)施方式中，選擇的骨移植物的蛋白酶活性是小于約50胰蛋白酶當(dāng)量(例如，小于約45、小于約40、小于約35、小于約30、小于約 25、小于約20、小于約15、小于約10、小于約5、約0胰蛋白酶當(dāng)量)。在各種實(shí)施例中，目標(biāo)多肽(例如PDGF)的活性可以在與骨移植物接觸后維持至少約30分鐘、至少約1小時(shí)、至少約2小時(shí)、至少約4小時(shí)、至少約8小時(shí)、至少約M小時(shí)、至少約2天、至少約3天、至少約 5天、至少約1周。
由骨移植物(例如，人類骨同種異體移植物)和rhPDGF-BB組成的混合物可以用于骨的治療、骨、牙周組織、韌帶或軟骨的生長的促進(jìn)；骨質(zhì)增大；關(guān)節(jié)固定(arthrodetic)操作；脊柱的治療；頌的骨壞死(ONJ)或放射性骨壞死(ORNJ)的治療；肌腱或回旋套損傷的治療；或牽引成骨術(shù)(distraction osteogenesis)(參見，例如2005年6月23日提交的美國公開No. 2006/0084602 ；2007年2月9日提交的美國公開No. 2007/0207185 ；2006 年11月17日提交的美國公開No. 2007/0129807 ；2007年11月5日提交的PCT公開No. WO 2008/073628 ；2008 年 6 月 3 日提交的 PCT 申請 No. WO PCT/US2008/065666 ；2008 年 2月20日提交的PCT公開No. WO 2008/103690 ;2008年7月2日提交的美國公開No. 2008/0027470 ;2008年2月7日提交的美國申請No. 61/026，934 ；它們每一個(gè)通過完全引用合并在本文中，特別是對于骨的治療、骨、牙周組織、韌帶或軟骨的生長的促進(jìn)；骨質(zhì)增大；關(guān)節(jié)固定操作；脊柱的治療；ONJ或ORNJ的治療；肌腱或回旋套損傷的治療；或牽引成骨術(shù))。除了 PDGF之外或作為替代，任何其他目標(biāo)多肽可以與骨移植物一起施用用于治療、 穩(wěn)定、防止和/或延緩骨、牙周組織、韌帶、軟骨或肌腱狀況。因而，本發(fā)明還提供了治療骨 (例如，受損的或疏松骨)、橈骨遠(yuǎn)端的骨折、椎骨體、牙周組織、韌帶或軟骨的方法。另外，本發(fā)明提供了骨質(zhì)增大、關(guān)節(jié)固定操作、骨壞死或放射性骨壞死的治療、肌腱或回旋套損傷的治療以及牽引成骨術(shù)的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療骨的方法包括提供包含目標(biāo)多肽和骨移植物(例如，安置在骨移植物中的目標(biāo)多肽)的組合物以及將所述組合物向骨應(yīng)用。在某些實(shí)施方式中，向受損的骨應(yīng)用所述組合物可以包括將組合物模塑到受損的骨的輪廓。例如，組合物可以模塑到骨折位置中，從而填充骨折產(chǎn)生的空間。在另一個(gè)實(shí)施方式中，治療骨的方法包括提供包含目標(biāo)多肽和骨移植物的組合物，將所述組合物放置在注射器中，以及在受損的骨的位置注射所述組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，包含目標(biāo)多肽和骨移植物的組合物可以注射到骨折產(chǎn)生的空間中。在某些實(shí)施方式中，注射組合物可以包括用注射器穿透環(huán)繞或覆蓋受損骨的位置的組織，并在受損的骨的位置沉積所述組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，例如，注射器可以穿透皮膚和覆蓋骨折位置的底層組織，例如，肌肉，隨后將本發(fā)明的組合物沉積在骨折處和圍繞骨折處。在這樣的實(shí)施方式中，用于暴露要治療的骨折位置的侵入性的技術(shù)，例如， 切口和組織脫除可以被最小化。在某些實(shí)施方式中，組合物直接應(yīng)用到損傷位置，目標(biāo)多肽被釋放以促進(jìn)骨愈合。 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物可以直接應(yīng)用到受損的、破壞的、損傷的或骨折的骨。 在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物可以應(yīng)用于用來便于骨折穩(wěn)定的硬體，例如，髓內(nèi)的釘、螺絲，以及例如整形外科領(lǐng)域的普通技術(shù)的醫(yī)師使用的其他硬體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物可以應(yīng)用于骨中的開口，例如，拔出骨折、螺栓孔、接受髓內(nèi)的釘子的孔洞， 或到髓管的孔洞的位置。本發(fā)明的組合物被用于促進(jìn)骨的愈合，包括骨折、骨缺損和骨融合。任何骨都可以用本發(fā)明的組合物治療，包括但不限于肱骨、尺骨、橈骨、股骨、脛骨、腓骨、膝蓋骨、距骨、 腕骨、腕、掌骨、指骨、跗骨、跖骨、肋骨、胸骨、脊椎、肩胛骨、鎖骨、骨盆、骶骨和顱面骨。在某些實(shí)施方式中，治療的個(gè)體患有骨質(zhì)疏松癥。本發(fā)明還提供了用于橈骨特別是遠(yuǎn)端橈骨以及腕部的相關(guān)解剖結(jié)構(gòu)的骨折、破壞或損傷的治療方法。本發(fā)明可以加快遠(yuǎn)端的橈骨的骨折中的愈合應(yīng)答，包括骨折位置的骨
23質(zhì)接合。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，遠(yuǎn)端橈骨的骨折包括所有的骨折類型，包括關(guān)節(jié)內(nèi)的和關(guān)節(jié)外的骨折，如遠(yuǎn)端橈骨骨折AO分類系統(tǒng)所描述的。在某些實(shí)施方式中，遠(yuǎn)端橈骨骨折包括A型骨折(關(guān)節(jié)外的)。在其他實(shí)施方式中，遠(yuǎn)端橈骨骨折包括B型骨折(部分關(guān)節(jié)的)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，遠(yuǎn)端橈骨骨折包括Cl型骨折(整個(gè)關(guān)節(jié)的，簡單關(guān)節(jié)的以及干骺端的骨折)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，遠(yuǎn)端橈骨骨折包括C2型骨折(整個(gè)關(guān)節(jié)的，簡單關(guān)節(jié)的以及復(fù)雜的干骺端的骨折)。在某些實(shí)施方式中，遠(yuǎn)端橈骨骨折包括C3型骨折(整個(gè)關(guān)節(jié)的， 復(fù)雜關(guān)節(jié)的以及干骺端的骨折)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，治療遠(yuǎn)端橈骨的骨折的方法包括提供包含目標(biāo)多肽和骨移植物(例如，安置在骨移植物中的目標(biāo)多肽)的組合物以及向遠(yuǎn)端橈骨中的骨折應(yīng)用所述組合物。在某些實(shí)施方式中，應(yīng)用所述組合物包括向遠(yuǎn)端橈骨的骨折中注射所述組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，注射包括組合物向骨折位置內(nèi)的透皮膚的注射。在另一個(gè)實(shí)施方式中，組合物被注射到遠(yuǎn)端橈骨的開口或外科手術(shù)暴露的骨折中。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，應(yīng)用包括用刮勺或其他設(shè)備將組合物安置在骨折中。在某些實(shí)施方式中，治療遠(yuǎn)端橈骨的骨折的方法進(jìn)一步包括復(fù)位骨折和/或穩(wěn)定骨折。復(fù)位骨折，根據(jù)某些實(shí)施方式，包括切開復(fù)位術(shù)。 在其他實(shí)施方式中，復(fù)位骨折包括閉合復(fù)位術(shù)。此外，穩(wěn)定遠(yuǎn)端橈骨骨折，在某些實(shí)施方式中，包括向骨折應(yīng)用外部或內(nèi)部固定設(shè)備，例如，掌板。在另一個(gè)實(shí)施方式中，治療遠(yuǎn)端橈骨的骨折的方法包括加速骨折中的新骨填充，其中加速包括提供包含目標(biāo)多肽和骨移植物的組合物以及將所述組合物應(yīng)用于所述骨折。本發(fā)明提供了對于治療脊柱，包括椎骨體的結(jié)構(gòu)有用的方法。在某些實(shí)施方式中， 提供了促進(jìn)椎骨體的骨形成的方法。在其他實(shí)施方式中，提供了防止或降低椎骨壓縮斷裂的可能性的方法。在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了防止或降低與椎體成形術(shù)和后凸成形術(shù)相關(guān)的繼發(fā)的椎骨壓縮斷裂的可能性的方法。本方法在治療患有骨質(zhì)疏松癥的個(gè)體的椎骨體中是有用的。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了促進(jìn)椎骨體中的骨形成的方法，包括提供包含目標(biāo)多肽和骨移植物(例如，安置在骨移植物中的目標(biāo)多肽)的組合物，以及向至少一個(gè)椎骨體應(yīng)用所述組合物。將所述組合物應(yīng)用到至少一個(gè)椎骨體，在某些實(shí)施方式中，包括將所述組合物注射到至少一個(gè)椎骨體中。在某些實(shí)施方式中，組合物可以應(yīng)用于多個(gè)椎骨體。在某些實(shí)施方式中，應(yīng)用所述組合物包括用組合物注射至少一個(gè)椎骨體。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物被注射到椎骨體的松質(zhì)骨中。在某些實(shí)施方式中，椎骨體包括胸椎骨體、腰椎骨體或其組合。在某些實(shí)施方式中，椎骨體包括頸椎骨體、尾椎骨體、骶骨或其組
I=I O在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了方法，包括防止或降低椎骨的壓縮斷裂的可能性的方法，包括繼發(fā)的椎骨壓縮斷裂。防止或降低椎骨的壓縮斷裂的可能性，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，包括提供包含處于骨移植物中的目標(biāo)多肽的組合物，以及向至少一個(gè)椎骨體應(yīng)用所述組合物。在某些實(shí)施方式中，將到組合物應(yīng)用到至少一個(gè)椎骨體包括將到組合物注射到至少一個(gè)椎骨體中。在一個(gè)實(shí)施方式中，在第一椎骨體的椎體成形術(shù)或后凸成形術(shù)之后，組合物被應(yīng)用于第二椎骨體，在某些情況下，鄰近的椎骨體。在某些實(shí)施方式中，包含安置在骨移植物中的目標(biāo)多肽的組合物被應(yīng)用于至少一個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)椎骨體。如在此使用的，“高風(fēng)險(xiǎn)椎骨體”(HVB)是指T5到T12以及Ll到L4的椎骨的椎骨體，它們處于經(jīng)歷繼發(fā)的椎骨壓縮斷裂的最大風(fēng)險(xiǎn)中。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物在第一椎骨體的椎體成形術(shù)或后凸成形術(shù)之后應(yīng)用于第二椎骨體。在某些實(shí)施方式中，所述第二椎骨體鄰近所述第一椎骨體。在其他實(shí)施方式中，所述第二椎骨體不鄰近所述第一椎骨體。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物在第一椎骨體的椎體成形術(shù)或后凸成形術(shù)之后應(yīng)用于第三椎骨體。在某些實(shí)施方式中， 第三椎骨體鄰近所述第一椎骨體。在其他實(shí)施方式中，所述第三椎骨體不鄰近所述第一椎骨體。本發(fā)明的實(shí)施方式另外期待在此提供的組合物在第一椎骨體的椎體成形術(shù)或后凸成形術(shù)之后向多個(gè)椎骨體的應(yīng)用，包括高風(fēng)險(xiǎn)的椎骨體。要理解的是，如在此使用的，第一、第二和第三椎骨體不是指脊柱中的任何特定位置，對于抑制椎骨的壓縮斷裂的方法，包括繼發(fā)的壓縮斷裂，可以應(yīng)用于各種類型的椎骨體，包括胸椎骨體、腰椎骨體、頸椎骨體、尾椎骨體和骶骨。本發(fā)明還提供了促進(jìn)哺乳動物中骨、牙周組織、韌帶或軟骨的生長的方法，通過向所述骨、牙周組織、韌帶或軟骨應(yīng)用包含目標(biāo)多肽和骨移植物(例如，安置在骨移植物中的目標(biāo)多肽)的組合物。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括骨、牙周組織、韌帶或軟骨的愈合和 /或這樣的組織和結(jié)構(gòu)的再生。在某些實(shí)施方式中，所述骨、牙周組織、韌帶或軟骨是破壞的或損傷的，需要再生或愈合。本發(fā)明還提供了進(jìn)行骨質(zhì)增大操作的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，進(jìn)行骨質(zhì)增大操作的方法包括提供包含目標(biāo)多肽和骨移植物(例如，安置在骨移植物中的目標(biāo)多肽)的組合物，以及將所述組合物應(yīng)用于期望的骨質(zhì)增大的至少一個(gè)位置。在某些實(shí)施方式中，進(jìn)行骨質(zhì)增大操作的方法包括將組合物應(yīng)用于上頌骨或下頌骨中骨質(zhì)增大的至少一個(gè)位置。在某些實(shí)施方式中，所述組合物被擠入到上頌骨或下頌骨中期望的骨質(zhì)增大的位置。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在包含目標(biāo)多肽和骨移植物的組合物向植入位置放置之前，以及任選的之后， 目標(biāo)多肽被應(yīng)用于植入位置。增強(qiáng)骨在上頌骨或下頌骨中的沉積，牙槽脊可以被增強(qiáng)，以便隨后接收植入物。這樣的植入物可以用于各種用途，包括，作為牙齒或其他牙科設(shè)備的支持物，用于各種口腔和上頌面的應(yīng)用，包括拔牙槽、竇提升和嵴增高。本發(fā)明還提供了進(jìn)行關(guān)節(jié)固定操作的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，進(jìn)行關(guān)節(jié)固定操作的方法包括提供包含目標(biāo)多肽和骨移植物(例如，安置在骨移植物中的目標(biāo)多肽)的組合物，以及將所述組合物應(yīng)用于關(guān)節(jié)中期望的骨融合位置。在某些實(shí)施方式中，進(jìn)行關(guān)節(jié)固定操作的方法包括將所述組合物應(yīng)用于多個(gè)關(guān)節(jié)中期望的骨融合的位置。在某些實(shí)施方式中，所述組合物被包裝入到關(guān)節(jié)中期望的骨融合的位置。在某些實(shí)施方式中，組合物可以被包裝，從而所述組合物與關(guān)節(jié)中要融合的骨的整個(gè)表面積接觸。組合物可以另外應(yīng)用于骨融合位置的附近以進(jìn)一步強(qiáng)化融合的關(guān)節(jié)。在某些實(shí)施方式中，進(jìn)行關(guān)節(jié)固定操作的方法進(jìn)一步包括對準(zhǔn)關(guān)節(jié)和插入至少一個(gè)固定設(shè)備，例如，螺絲，到關(guān)節(jié)的至少一個(gè)骨中。在某些實(shí)施方式中，多個(gè)螺絲被插入到關(guān)節(jié)的至少一個(gè)骨中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明方法包括加速關(guān)節(jié)固定操作中的骨質(zhì)連接，其中加速骨質(zhì)連接包括提供包含目標(biāo)多肽和骨移植物(例如，安置在骨移植物中的目標(biāo)多肽)的組合物，以及將所述組合物應(yīng)用于關(guān)節(jié)中骨融合的至少一個(gè)位置。任何關(guān)節(jié)中的骨可以使用本發(fā)明的組合物和方法來融合。這樣的關(guān)節(jié)包括，但不限于，腳、腳趾、踝、膝蓋、髖部、脊柱、肋骨、胸骨、鎖骨、關(guān)節(jié)、肩部、肩胛骨、肘、腕部、手、手指、頌和顱骨的關(guān)節(jié)。要理解的是，本發(fā)明可以應(yīng)用于四肢或脊柱骨骼中關(guān)節(jié)固定的任何期望的位置。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，關(guān)節(jié)固定操作包括腳和踝的關(guān)節(jié)固定術(shù)，包括距骨下的關(guān)節(jié)固定術(shù)、距骨周骨關(guān)節(jié)固定術(shù)、三關(guān)節(jié)固定術(shù)、和踝關(guān)節(jié)固定術(shù)。本發(fā)明還提供了治療、防止或減緩ONJ或ORNJ的發(fā)展的方法。組合物可以通過任何適當(dāng)手段的施用。在一個(gè)實(shí)施方式中，包含目標(biāo)多肽和骨移植物(例如，安置在骨移植物中的目標(biāo)多肽)的組合物的施用可以通過直接在期望的位置應(yīng)用所述組合物來實(shí)現(xiàn)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，包含目標(biāo)多肽和骨移植物(例如，安置在骨移植物中的目標(biāo)多肽)的組合物的施用可以通過直接在期望的位置應(yīng)用所述組合物來實(shí)現(xiàn)。這樣的位置包括，但不限于， 上頌骨、下頌骨和它們的附件，其包括牙槽的結(jié)構(gòu)，以及受到ONJ或ORNJ影響的任何其他骨或軟組織。在下頌骨中，磨牙后墊之前的位置可能構(gòu)成期望的位置。例如，當(dāng)在患有ONJ 或ORNJ的患者的上頌骨或下頌骨打開外科區(qū)域，清除和準(zhǔn)備了壞死的位置時(shí)，組合物可以通過注射器遞送、通過針頭或套管、通過刮勺、鉗子、匙或其他可接受的裝置的直接應(yīng)用來應(yīng)用。在其他實(shí)施方式中，當(dāng)鑒定出預(yù)計(jì)對于ONJ或ORNJ脆弱的位置時(shí)，該位置可以外科地暴露，應(yīng)用組合物，或者所述組合物可以通過注射器和針頭注射穿過皮膚應(yīng)用到達(dá)期望位置的附近，而不外科地暴露下頌骨或上頌骨中的位置。在其他實(shí)施方式中，組合物可以通過直接透皮膚施用應(yīng)用于期望的位置。在某些實(shí)施方式中，組合物與牙科的操作同時(shí)地，或在牙科操作之后不久施用。例如，存在風(fēng)險(xiǎn)并且有牙科的外科操作例如拔除的患者，在一個(gè)實(shí)施方式中，與例如拔牙藥物或敷藥一起共同施用含有多肽的組合物。又一個(gè)實(shí)施例是口腔-牙科囊腫切除術(shù)，其中含有多肽的組合物置入囊的溝槽中。又一個(gè)實(shí)施例包括牙周的操作，其中齒齦組織被切割，進(jìn)行齒槽和/或根間的骨-牙手術(shù)，含有多肽的組合物與牙周治療敷藥共同施用。在某些實(shí)施方式中，施用的組合物的量通過外科移除的骨體積，例如，來自拔牙槽、囊切除術(shù)，或在牙周骨手術(shù)期間的，來確定。在某些實(shí)施方式中，對于使用組合物的ORNJ 或ONJ的預(yù)防性處置，牙周韌帶增厚的放射照相測定可以考慮為診斷依據(jù)。本發(fā)明還提供了將肌腱附著或重附著到骨、強(qiáng)化肌腱對骨的附著、以及肌腱治療的方法，例如，展現(xiàn)了撕裂、脫離或任何其他張力或變形的肌腱。在一個(gè)實(shí)施方式中，將肌腱再附著到骨的方法包括提供包含安置在生物相容性基質(zhì)中的PDGF溶液的組合物，以及將所述組合物應(yīng)用于骨上肌腱重附著的至少一個(gè)位置。在另一個(gè)實(shí)施方式中，強(qiáng)化肌腱對骨的附著的方法包括提供包含安置在生物相容性基質(zhì)中的PDGF溶液的組合物，以及將所述組合物應(yīng)用于對骨的肌腱附著的至少一個(gè)位置。在某些實(shí)施方式中，強(qiáng)化肌腱對骨的附著的方法幫助防止或抑制肌腱從骨脫離，，例如，在回旋套損傷中。本發(fā)明還提供了治療回旋套撕裂的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療回旋套撕裂的方法包括提供包含目標(biāo)多肽和骨移植物(例如，安置在骨移植物中的目標(biāo)多肽)的組合物， 以及將所述組合物應(yīng)用于肱骨頭上肌腱重附著的至少一個(gè)位置。在某些實(shí)施方式中，將所述組合物應(yīng)用于肌腱重附著的至少一個(gè)位置可以包括將所述組合物模塑到肱骨頭上重附著位置的輪廓。例如，組合物可以模塑到肱骨頭的表面上形成的通道內(nèi)，用于接收分離的肌腱。組合物可以應(yīng)用于肌腱向骨的插入位置的附近以進(jìn)一步強(qiáng)化附著。在某些實(shí)施方式中， 治療回旋套撕裂的方法進(jìn)一步包括在肱骨頭中安置至少一個(gè)錨定裝置，例如，骨錨，其中所述骨錨進(jìn)一步包含目標(biāo)多肽(例如，安置在骨移植物中的目標(biāo)多肽)，以及將至少一個(gè)分離的肌腱偶聯(lián)到所述骨錨上。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，肌腱可以通過縫合術(shù)固定到骨錨上。縫
26合術(shù)還可以在使用之前浸透在目標(biāo)多肽(例如，PDGF)的溶液中，或包被在多肽-組合物中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，治療肌腱的方法包括提供包含目標(biāo)多肽和骨移植物(例如， 安置在骨移植物中的目標(biāo)多肽)的組合物，以及將所述組合物應(yīng)用于至少一個(gè)肌腱的表面。 在某些實(shí)施方式中，所述至少一個(gè)肌腱是損傷的或破壞的肌腱，例如，展現(xiàn)了撕裂、脫離或任何其他變形的肌腱。在某些實(shí)施方式中，刺激和/或加速骨生成的方法包括提供包含目標(biāo)多肽和骨移植物(例如，安置在骨移植物中的目標(biāo)多肽)的組合物，以及將有效量的組合物應(yīng)用于骨牽引(bone distraction)的至少一個(gè)位置。在某些實(shí)施方式中，包含目標(biāo)多肽和骨移植物(例如，安置在骨移植物中的目標(biāo)多肽)的組合物在骨牽引期間應(yīng)用。在其他實(shí)施方式中，組合物在骨牽弓I之后應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方式中，有效量的組合物在骨牽弓I期間和之后應(yīng)用。本發(fā)明還提供了在骨牽引之后加速骨接合的方法。在某些實(shí)施方式中，在骨牽引之后加速骨接合的方法包括提供包含目標(biāo)多肽和骨移植物(例如，安置在骨移植物中的目標(biāo)多肽)的組合物，以及將有效量的組合物應(yīng)用于骨牽引的至少一個(gè)位置。本發(fā)明另外提供了進(jìn)行骨牽引操作的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，進(jìn)行骨牽引操作的方法包括(a)將骨分配到第一骨段和第二骨段，(b)移動所述第一和第二骨段的至少一個(gè)以產(chǎn)生所述第一和第二骨段之間的空隙，和(C)刺激所述空隙中的骨生成，其中刺激骨生成包括提供目標(biāo)多肽和骨移植物的組合物(例如，安置在骨移植物中的目標(biāo)多肽)，以及至少部分地安置有效量的組合物到所述空隙中。在某些實(shí)施方式中，步驟(b)和(C)可以按需要重復(fù)多次以將骨延長任何期望的量。在本發(fā)明方法的某些實(shí)施方式中，應(yīng)用組合物包括在骨牽引的位置中注射組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，注射包括在牽引位置組合物的透皮膚的注射。在另一個(gè)實(shí)施方式中，組合物被注射到骨牽弓I的開口或外科暴露的位置中。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，應(yīng)用組合物包括用刮勺或其他設(shè)備將組合物安置在骨牽引的位置中。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物在骨牽引操作的牽引階段期間被應(yīng)用于骨牽引的至少一個(gè)位置。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物在骨牽引之后的固結(jié) (consolidation)階段期間應(yīng)用于骨牽引的至少一個(gè)位置。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物在牽引和固結(jié)階段期間應(yīng)用于骨牽引的至少一個(gè)位置。如在此提供的，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，骨牽引操作包括在雙側(cè)性的下頌骨發(fā)育不全、偏側(cè)矮小癥、先天的短股骨、腓骨半肢畸形、單側(cè)萎縮、軟骨發(fā)育不全、神經(jīng)纖維瘤、弓形腿、生長板骨折、骨缺損、顱面的應(yīng)用、骨髓炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎和脊髓灰質(zhì)炎的治療中使用的那些。在某些實(shí)施方式中，骨移植物使用標(biāo)準(zhǔn)方法來篩選以確定它不被來自供體的病毒污染。要治療的骨的類型可以相同于、或不同于用作骨移植物的來源的骨的類型。本發(fā)明的方法可以用于治療任何個(gè)體。對于本文中使用的，除非另外明顯地說明， 在此使用的“個(gè)體”是指哺乳動物，包括但不限于靈長類(例如，人類、猴、大猩猩、猿、狐猴， 等等)、牛、馬、豬、羊、犬和貓。因而，本發(fā)明在人類醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)情境中具有用途，包括在農(nóng)用牲畜和馴養(yǎng)寵物中的用途。個(gè)體可以被診斷患有，或懷疑患有，或存在風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生適應(yīng)癥， 例如，骨、牙周組織、韌帶、軟骨或肌腱狀況。個(gè)體可以展現(xiàn)與適應(yīng)癥相關(guān)的一種或更多種癥狀。個(gè)體可以遺傳地或另外地傾向于發(fā)生這樣的狀況。
如在此使用的，“有需要的”包括個(gè)體，他患有狀況或疾病，或有狀況或疾病的“風(fēng)險(xiǎn)”。如在此使用的，“風(fēng)險(xiǎn)”個(gè)體是處于發(fā)生狀況的風(fēng)險(xiǎn)中的個(gè)體。在此處描述的治療方法之前，“有風(fēng)險(xiǎn)”的個(gè)體可以或可以不患有可檢測的疾病或狀況，可以或可以不展示可檢測的疾病?！坝酗L(fēng)險(xiǎn)”表示個(gè)體具有一種或更多種所謂的風(fēng)險(xiǎn)因素，其是可測量的參數(shù)，是與疾病或狀況的發(fā)生相關(guān)的并且是本領(lǐng)域已知的。具有一種或更多種這些風(fēng)險(xiǎn)因素的個(gè)體相比沒有這些風(fēng)險(xiǎn)因素的個(gè)體具有發(fā)生疾病或狀況的更高的概率。這些風(fēng)險(xiǎn)因素包括但不限于，年齡、性另I」、人種、膳食、早先的疾病史、前體疾病的存在、遺傳(即，繼承的)考慮，以及環(huán)境暴露。如在此使用的，“治療”是獲得有益的或期望的結(jié)果的方法，包括理想的臨床結(jié)果。 對本發(fā)明來說，有益的或期望的臨床結(jié)果包括，但不限于，以下的一種或更多種降低由疾病引起的癥狀、提高患有疾病的人的生活質(zhì)量、降低治療疾病所需其他藥物的劑量和/或延遲疾病的發(fā)展。如在此使用的，“延遲疾病的發(fā)展”是指延遲、阻礙、減慢、阻滯、穩(wěn)定和/或推遲疾病的發(fā)展(例如，骨、牙周組織、韌帶、軟骨或肌腱狀況)。這種延遲可以有改變的持續(xù)時(shí)間， 取決于疾病史和/或治療的個(gè)體。對本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，足夠的或顯著的延遲實(shí)際上可以涵蓋預(yù)防，因?yàn)閭€(gè)體不發(fā)生疾病。如在此使用的，骨移植物、多肽、藥物、化合物或藥物組合物的“有效劑量”或“有效量”是足以引起有益的或期望的結(jié)果的量。對于預(yù)防用途，有益的或期望的結(jié)果包括這些結(jié)果，例如，消除或降低風(fēng)險(xiǎn)、減少嚴(yán)重度、或延遲疾病的發(fā)作，包括疾病的生物化學(xué)的、組織學(xué)的和/或行為的癥狀，在疾病的發(fā)展期間出現(xiàn)的其并發(fā)癥和中間病理表型。對治療用途， 有益的或期望的結(jié)果包括臨床的結(jié)果，例如，降低由疾病引起的一種或更多種癥狀、提高患病者的生活質(zhì)量、降低治療疾病所需其他藥物的劑量、增強(qiáng)其他藥物的效果，例如，通過靶向，延遲疾病的發(fā)展和/或延長存活。有效劑量可以在一次或更多次施用中施用。對于本發(fā)明來說，骨移植物、多肽、藥物化合物或藥物組合物的有效劑量是足以直接或間接地實(shí)現(xiàn)預(yù)防或治療的量。在臨床的情境中要理解的是，骨移植物、多肽、藥物、化合物或藥物組合物的有效劑量可以或可以不與其他骨移植物、多肽、藥物、化合物或藥物組合物一起實(shí)現(xiàn)。因而，“有效劑量”可以被認(rèn)為是在施用一種或更多種治療試劑的情境中，單個(gè)試劑可以被認(rèn)為以有效量給予，如果與一種或更多種其他試劑一起可以實(shí)現(xiàn)期望的結(jié)果。如在此使用的，“一起”是指除了其他治療形式(例如，目標(biāo)多肽)之外，一種治療形式(例如，骨移植物)的施用。因而，“一起”是指在其他治療形式向個(gè)體施用之前、 期間或之后，一種治療形式的施用。在某些實(shí)施方式中，骨移植物和目標(biāo)多肽同時(shí)地 (simultaneously)、連續(xù)地或并存地(concurrently)施用。在某些實(shí)施方式中，在目標(biāo)多肽和骨移植物同時(shí)地都施用給個(gè)體之前，目標(biāo)多肽結(jié)合或被安置在骨移植物中。在某些實(shí)施方式中，骨移植物被施用給個(gè)體(有或者沒有結(jié)合的目標(biāo)多肽)，然后在個(gè)體中骨移植物的位置之處或附近施用目標(biāo)多肽。在某些實(shí)施方式中，包含目標(biāo)多肽的溶液通過在一種或更多種緩沖液中溶解目標(biāo)多肽來形成。適用于本發(fā)明的多肽溶液的緩沖液可以包括但不限于，碳酸鹽、磷酸鹽(例如，磷酸鹽緩沖鹽水)、組氨酸、乙酸鹽(例如，乙酸鈉)、酸性緩沖液，例如乙酸和HC1，以及有機(jī)緩沖液，例如賴氨酸、Tris緩沖液(例如，三(羥基甲基)氨基乙烷)、N-2-羥基乙基哌嗪-N，-2-乙烷磺酸(HEPES)和3- (N-嗎啉代)丙烷磺酸(MOPS)。緩沖液可以根據(jù)與目標(biāo)多肽的生物相容性，以及緩沖液阻礙不希望的多肽修飾的能力來選擇。緩沖液可以另外根據(jù)與宿主組織的相容性來選擇。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用乙酸鈉緩沖液。所述緩沖液可以采用不同的摩爾濃度，例如，約0. 1 mM到約100 mM，約1 mM到約50 mM，約5 mM到約40 mM, 約10 mM到約30 mM，約15 mM到約25 mM，或這些范圍內(nèi)的任何摩爾濃度。在某些實(shí)施方式中，乙酸鹽緩沖液采用約20 mM的摩爾濃度。在另一個(gè)實(shí)施方式中，包含目標(biāo)多肽的溶液可以通過在水中溶解凍干的目標(biāo)多肽來形成，其中在溶解之前，目標(biāo)多肽從合適的緩沖液中凍干。本發(fā)明提供的組合物和方法可以包含骨移植物以及目標(biāo)多肽的溶液，其中所述溶液分散在骨移植物中。在某些實(shí)施方式中，目標(biāo)多肽(例如，PDGF)在溶液中以約0.01 mg/ ml 至Ij約 10. 0 mg/ml、約 0. 05 mg/ml 至Ij約 5. 0 mg/ml 或約 0. 1 mg/ml 至Ij約 1. 0 mg/ml 的濃度范圍存在。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述目標(biāo)多肽在溶液中以0.3 mg/ml的濃度存在。 在其他實(shí)施方式中，目標(biāo)多肽在溶液中以任一以下濃度存在約0.05 mg/ml、約0. 1 mg/ml、 約 0.15 mg/ml、約 0.2 mg/ml、約 0.25 mg/ml、約 0.3 mg/ml、約 0.35 mg/ml、約 0.4 mg/ml、 約 0.45 mg/ml、約 0.5 mg/ml、約 0. 55 mg/ml、約 0.6 mg/ml、約 0.65 mg/ml、約 0.7 mg/ml、 約 0. 75 mg/ml、約 0. 8 mg/ml、約 0. 85 mg/ml、約 0. 9 mg/ml、約 0. 95 mg/ml、或約 1. 0 mg/ ml。要理解的是，這些濃度僅僅是特定實(shí)施方式的實(shí)例，目標(biāo)多肽的濃度可以在上述的任何濃度范圍之內(nèi)，或是任何其他合適的濃度。各種量的目標(biāo)多肽可以在本發(fā)明的組合物中使用?？梢允褂玫哪繕?biāo)多肽的量包括以下范圍內(nèi)的量約1 Pg到約50 mg，約10 yg到約 25 mg，約 100 μ g 到約 10 mg，禾口約 250 μ g 到約 5 mg。在某些實(shí)施方式中，約1. 5 mL的目標(biāo)多肽(例如，PDGF或其他生長因子)的溶液與約2立方厘米(cc)的骨移植物組合。在各種實(shí)施方式中，目標(biāo)多肽(例如，PDGF或其他生長因子)的溶液與骨移植物的量的比例是約1 2、34或1 1 (液體體積(mL)與干燥體積(cc) 的比例)。在某些實(shí)施方式中，溶液中PDGF的濃度在約0. 1到約1. 0 mg/mL之間。在本發(fā)明的實(shí)施方式中目標(biāo)多肽(例如，PDGF或其他生長因子)的濃度可以使用如美國專利No. 6，221，625 ；5，747，273 ；和5, 290, 708中描述的酶聯(lián)免疫分析來測定(通過引用將它們完全合并在本文中，特別是對于ELISA分析)，或用于測定多肽濃度的本領(lǐng)域已知的任何其他分析。當(dāng)在此提供時(shí)，PDGF的摩爾濃度根據(jù)PDGF 二聚體的分子量(例如， PDGF-BB, MW 約 25 kDa)來確定。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，包含目標(biāo)多肽(例如，PDGF)的溶液可以具有約3.0到約 8.0的pH值。在一個(gè)實(shí)施方式中，包含目標(biāo)多肽的溶液具有約5.0到約8.0的pH值，更理想的約5. 5到約7. 0，最理想的約5. 5到約6. 5，或這些范圍內(nèi)的任何值。在某些實(shí)施方式中，包含目標(biāo)多肽的溶液的PH值可以相容于目標(biāo)多肽或任何其他期望的生物學(xué)活性試劑的延長的穩(wěn)定性和效力。例如，PDGF—般在酸性環(huán)境中更穩(wěn)定。因而，根據(jù)某些實(shí)施方式， 本發(fā)明包含多肽溶液(例如，PDGF溶液)的酸性貯存制劑。根據(jù)某些實(shí)施方式，溶液理想地具有約3. 0到約7. 0的pH值，更理想地約4. 0到約6. 5。然而，目標(biāo)多肽的生物學(xué)活性可以在具有中性PH值范圍的溶液中被優(yōu)化。因此，在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明包含多肽溶液的中性PH值的制劑。根據(jù)這個(gè)實(shí)施方式，多肽溶液理想的具有約5. 0到約8. 0的pH值，更理想的約5. 5到約7. 0，最理想的約5. 5到約6. 5。
在某些實(shí)施方式中，含有多肽的溶液的pH值可以被改變來優(yōu)化目標(biāo)多肽與基質(zhì)底物的結(jié)合動力學(xué)。如果希望，隨著材料的PH值平衡到鄰近的材料，目標(biāo)多肽的結(jié)合可能變得不穩(wěn)定。在某些實(shí)施方式中，包含目標(biāo)多肽的溶液的PH值可以通過在此描述的緩沖液來控制。各種多肽展現(xiàn)了不同的PH值范圍，在這些范圍中它們是穩(wěn)定的。多肽穩(wěn)定性主要由等電點(diǎn)和多肽上的電荷反映。PH值范圍可能影響多肽的構(gòu)象結(jié)構(gòu)以及多肽對蛋白水解降解、水解、氧化以及可能引起對多肽的結(jié)構(gòu)和/或生物學(xué)活性的修飾的其他過程的易感性。根據(jù)某些實(shí)施方式，本發(fā)明的組合物和方法可以進(jìn)一步包含目標(biāo)多肽以外的一種或更多種生物學(xué)活性試劑。示范性的生物學(xué)活性試劑包括有機(jī)分子、無機(jī)材料、多肽、 肽、核酸(例如，基因、基因片段、小干擾核糖核酸(siRNA)、基因調(diào)節(jié)序列、核轉(zhuǎn)錄因子和反義分子)、核蛋白、多糖(例如，肝素)、糖蛋白和脂蛋白?？梢該饺氲奖景l(fā)明的組合物中的生物學(xué)活性化合物的非限制性實(shí)例包括，例如，抗癌試劑、抗生素、鎮(zhèn)痛藥、抗炎癥試劑、 免疫抑制劑、酶抑制物、抗組胺劑、激素、肌肉松弛藥、前列腺素、營養(yǎng)因子、骨誘導(dǎo)多肽、生長因子、維生素(例如，維生素D3)、鈣增補(bǔ)劑、破骨細(xì)胞抑制物(例如，二碳磷酸鹽化合物 (bisphosphonates))和疫苗，在2005年6月23日提交的美國公開No. 2006/0084602中公開了(通過引用將其完全合并在本文中，特別是對于生物學(xué)活性試劑)。在其他實(shí)施方式中， 本發(fā)明的組合物和方法可以進(jìn)一步包含細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)、穩(wěn)定多肽例如白蛋白、抗細(xì)菌試劑、 蛋白酶抑制物(例如，乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-二( β -氨基乙酯)-N, N，N’，N’ -四乙酸(EGTA)、抑肽酶、E-氨基己酸(EACA)，等等)、肽或含有蛋白酶抑制物的有機(jī)分子(例如， α 1抗胰蛋白酶(胰蛋白酶/彈性蛋白酶抑制物)、卵類粘蛋白、胰腺的抑制物、amastin-HCl (金屬蛋白酶抑制物)、抗蛋白酶(絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制物)、抑肽酶(絲氨酸蛋白酶抑制物))和/或其他生長因子例如成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、角質(zhì)化細(xì)胞生長因子(KGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、止血因子，例如 FXIII，骨形態(tài)發(fā)生多肽(BMP)，或其他 PDGF，包括 PDGF-AA、PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC 和 /或PDGF-DD的組合物。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物和方法進(jìn)一步包括穩(wěn)定劑，例如，被與骨移植物相關(guān)的一種或更多種蛋白酶裂解的多肽。在某些實(shí)施方式中，被與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶裂解的一種或更多種多肽添加到骨移植物，以降低被蛋白酶裂解的目標(biāo)多肽(例如，PDGF)的量。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物和方法進(jìn)一步包含至少一種造影劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，造影劑任選地與本發(fā)明的組合物組合，以便于應(yīng)用的或注射的組合物的可視化。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，造影劑是可操作以至少部分地提供在成像時(shí)兩種或更多種身體組織的區(qū)分的物質(zhì)。根據(jù)某些實(shí)施方式，造影劑包含陽離子的造影劑、陰離子的造影劑、 非離子的造影劑，或其混合物。在某些實(shí)施方式中，造影劑包含不透射線的造影劑。在某些實(shí)施方式中，不透射線的造影劑包含碘化合物，包括(S)--N，N’_: [ 2-羥基-1-(羥基甲基)-乙基]_2’ 4，6-三碘-5-乳酰氨-異酞酰胺(碘帕醇)和其衍生物(參見，例如2007年 2月9日提交的美國公開No. 2007/0207185，通過引用將其完全合并在本文中，特別是對于造影劑)。在某些實(shí)施方式中，至少一種試劑(例如，生物學(xué)活性試劑、蛋白酶抑制物或造影劑)局部地施用。在這樣的實(shí)施方式中，試劑可以摻入到骨移植物中，或另外安置于要治療的骨的位置之中或周圍。在其他實(shí)施方式中，至少一種試劑(例如，生物學(xué)活性試劑)全身地、口服地或靜脈內(nèi)地施用給個(gè)體。在各種實(shí)施方式中，在目標(biāo)多肽添加到骨移植物之前、 期間或之后，一種或更多種蛋白酶抑制物被添加給骨移植物。示范件的試劑念
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含第一容器和第二容器的試劑盒，所述第一容器包含在此描述的目標(biāo)多肽(例如，PDGF)，所述第二容器包含在此描述的骨移植物(例如，人類骨移植物)。在某些實(shí)施方式中，所述第一容器具有包含預(yù)定濃度的目標(biāo)多肽(例如，PDGF)的溶液。在某些實(shí)施方式中，目標(biāo)多肽的濃度可以根據(jù)要治療的骨、牙周組織、韌帶、軟骨或肌腱狀況的性質(zhì)來預(yù)先確定。在某些實(shí)施方式中，根據(jù)要治療的骨、牙周組織、韌帶、軟骨或肌腱狀況，骨移植物包含預(yù)定的量。在某些實(shí)施方式中，可以有超過一個(gè)容器，包含不同類型的骨移植物。在某些實(shí)施方式中，選擇的骨移植物的蛋白酶活性小于約50胰蛋白酶當(dāng)量。 在某些實(shí)施方式中，選擇的骨移植物的蛋白酶活性在約50到約65胰蛋白酶當(dāng)量之間(例如，約50到約55、約55到約60、或約60到約65胰蛋白酶當(dāng)量)。在某些實(shí)施方式中，選擇的骨移植物的蛋白酶活性是約50、55、60或65胰蛋白酶當(dāng)量的任一個(gè)。在某些實(shí)施方式中，選擇的骨移植物的蛋白酶活性是小于約50胰蛋白酶當(dāng)量(例如，小于約45、小于約40、 小于約35、小于約30、小于約25、小于約20、小于約15、小于約10、小于約5、約0胰蛋白酶當(dāng)量)。在某些實(shí)施方式中，注射器可以便于目標(biāo)多肽的溶液在骨移植物中的分散，用于在外科的位置，例如骨破壞或損傷的位置應(yīng)用。試劑盒還可以含有使用說明書。與骨移植物和目標(biāo)多肽來治療骨、牙周組織、韌帶、軟骨或肌腱狀況的用途相關(guān)的說明一般包括關(guān)于預(yù)期的治療的劑量、給藥日程以及施用途徑的信息。容器可以是單位劑量、散裝(例如，多劑量包裝)或亞單位劑量的。本發(fā)明的試劑盒中提供的說明書一般是在標(biāo)簽或包裝插頁(例如，包括在試劑盒中的紙片)上的書面說明，但是計(jì)算機(jī)可讀的說明(例如，在磁存儲或光存儲盤上帶有的說明)也是可接受的。標(biāo)簽或包裝插頁表明，組合物是用于治療、防止或延遲在此描述的骨、牙周組織、韌帶、軟骨或肌腱狀況的發(fā)展。說明書可以提供用于實(shí)踐在此描述的任何方法。本發(fā)明的試劑盒處在適合的包裝中。適合的包裝包括但不限于，小瓶、瓶子、罐子、 柔性包裝(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等等。試劑盒或容器可以具有無菌的通路端口 (例如，所述容器可以是具有可被皮下注射針刺穿的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或小瓶)。試劑盒可以進(jìn)一步包含生物學(xué)活性試劑(除了目標(biāo)多肽之外)、造影劑、蛋白酶抑制物、緩沖液或上述的任何組合。提供以下實(shí)施例來說明而不是限制本發(fā)明。 實(shí)施例實(shí)施例1. PDGF從凍干的骨移植物(“FDBA”)基質(zhì)的結(jié)合和釋放
附圖1概述了研究PDGF從骨移植物結(jié)合和釋放的示范性方案。對于某些實(shí)驗(yàn)，量按比例縮小兩倍或十倍以保存骨移植物材料。特別地，100 111^的人類骨移植物(1^作徹丨，Inc .)與100 μ 1處在20mM NaOAc pH 6. 0中濃度0. 3 mg/mL PDGF混合十分鐘。骨移植物由干燥顆粒組成。骨移植物在銷售之前是凍干的(稱為凍干的骨同種異體移植物，或FDBA)。然后，添加處在20 mM NaOAc pH 6. 0或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(沒有NaOAc)中的200 μ 1的 NaCl(各種濃度的)。使用不同濃度的NaCl來得到附圖2中列出的NaCl的終濃度。溶液然后孵育1小時(shí)或M小時(shí)。溶液中的PDGF通過在4°C在 2000 Xg離心5分鐘從不溶的人類骨移植物中分離，然后利用包被了人類PDGF-BB的受體的平板通過比色ELISA Quantikine 分析(R & D Systems, Minneapolis, MN)測定從基質(zhì)釋放的rhPDGF-BB的量。附圖2表明，通過鹽孵育釋放了顯著量的PDGF，釋放是快速并且是鹽依賴性的。附圖3表明，PDGF釋放與混合時(shí)間無關(guān)，收率是40_60%。特別地，PDGF(0. 3 mg/ml 的0.5 mL)與凍干的骨移植物廣0.5 ml)孵育，并在室溫下混合10分鐘、60分鐘或過夜。然后，如上附圖1所述的添加1 mL的1 M NaCl。最終的NaCl濃度是667 mM。通過在15，334 X g離心2分鐘從骨移植物分離PDGF，含有PDGF的上清液通過SEC、RPHPLC、ELISA和非還原的SDS-PAGE分析。對照實(shí)驗(yàn)中的PDGF標(biāo)準(zhǔn)化為100%。從人類FDBA洗脫的rhPDGF-BB通過非還原的SDS-PAGE電泳不能與rhPDGF-BB的對照樣品電泳地區(qū)分(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，使用標(biāo)準(zhǔn)的基于MG-63細(xì)胞的生物分析(數(shù)據(jù)未顯示)測定的，與rhPDGF-BB的對照樣品相比， 從FDBA用NaCl洗脫的rhPDGF在十分鐘后保持了它的生物效能。釋放的PDGF使用標(biāo)準(zhǔn)的 ELISA分析來測量。ELISA分析利用來自R & D Systems公司的Quantikine 人類PDGF-BB 免疫分析根據(jù)廠家的方案進(jìn)行(參見，例如，網(wǎng)址rndsystems. com/pdf/dbbOO. pdf)。簡要地，人類PDGF-BB的受體包被在平板上，然后結(jié)合PDGF，用二級抗體-HRP軛合物和發(fā)色團(tuán)四甲基聯(lián)苯胺評估用于檢測。附圖3表明某些PDGF保持與骨移植物結(jié)合。做為選擇，上清液中 rhPDGF-BB 的濃度使用空間排阻 HPLC (SEC)在 TOSOH Biosep TSK-Gel, 7. 8 mm χ 3 cm HPLC 柱以及 TOSOH Biosep TSK-Ge 1,6. 0 mm χ 4. 0 cm 前置柱(Tosoh Bioscience, San Francisco, CA)上，通過整合PDGF的洗脫分布圖和利用5種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)PDGF的校準(zhǔn)來測定，如附圖4C所示。SEC被用于定量從凍干的骨移植物基質(zhì)洗脫的PDGF的量，和分析它的天然結(jié)構(gòu)和聚集(附圖 4A-4C、5A、5B、6A 和 6B)。骨移植物( 1 mL)與 PDGF (0.3 mg/ml ； 1 1 vol/ vol)混合，立即用2 mL的1 M NaCl洗脫，在15，3!MXg離心2分鐘。100 μ 1的上清液通過 SEC 分析。SEC 利用 T0S0H Bios印TSK-Gel，7. 8 mmX 30 cm HPLC 柱，用 T0S0H Biosep TSK-Gel 6.0 mmX 4.0 cm HPLC 保衛(wèi)柱(T0S0H Bioscience, S. San Francisco, CA)用移動相0. 05 M乙酸鈉pH 4. 0中的0. 4 M NaCl以0. 8 mL/分鐘的流速在室溫下進(jìn)行。附圖4C是顯示SEC柱的校準(zhǔn)的圖形。SEC顯示了 PDGF的天然大小和它的相互作用，PDGF聚集和樣品的其他成分(附圖 4A和4B)。例如，如果與骨移植物對照或PDGF對照相比，在骨移植物和PDGF的SEC分布圖中出現(xiàn)了新的高分子量峰，則發(fā)生骨移植物與PDGF的相互作用和/或PDGF自身聚集成二聚體的聚簇，由于它與骨移植物的相互作用。在一定條件下觀察到了新的高分子量峰。SEC 分布圖是溫度和釋放時(shí)間依賴性的(附圖5A和5B)。這些層析譜顯示了在更高溫度和更久的釋放時(shí)間下非特異性多肽的顯著的洗脫。在附圖5A和5B的測試的條件下，PDGF的洗脫保持大約相同的。SEC分布圖也是樣品依賴性的(附圖6A和6B)。其他化合物，例如，MEM和乙酸，代替NaCl來測試，也引起了某些PDGF從凍干的骨移植物的釋放。實(shí)施例2. PDGF從骨移植物的結(jié)合和釋放
附圖8概述了研究不同批次骨移植物的、PDGF自骨移植物的結(jié)合和釋放的示范性方案。具體地，0. 5 mL的人類骨移植物與0. 5 ml處在20 mM NaOAc pH 6. 0中濃度0. 3 mg/mL PDGF混合一小時(shí)。然后，添加在20 mM NaOAc pH 6.0中的IM NaCl 1 mL。在添加鹽之后，上清液立即通過在15，334Xg離心從骨移植物分離，進(jìn)行進(jìn)一步分析(SEC、RPHPLC和 ELISA)。在PDGF釋放上沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的人類骨移植物的年齡/性別效應(yīng)(附圖9A和 9B)。利用SEC和RPHPLC根據(jù)總峰面積對附圖9A和9B的PDGF定量。附圖10顯示了通過如實(shí)施例1對各種骨移植物樣品所描述的ELISA或SEC測量的、從骨移植物的PDGF的回收率。實(shí)驗(yàn)中使用的PDGF的原始量標(biāo)準(zhǔn)化為100%。這個(gè)數(shù)據(jù)也在附圖11中對10種不同的骨移植物樣品概述。反相HPLC也用于定量PDGF的量和由于蛋白水解裂解和/或化學(xué)修飾的它的結(jié)構(gòu)改變(附圖12和13A-13E)。樣品通過200 mM DTT和4 M胍HCl，pH 8. 8在50°C還原5分鐘。 反相 HPLC 使用 Vydac C18 柱 5 μ m 4. 6 mm χ 250 mm，帶有 5 μ m 的保衛(wèi)筒(Grace Davison Discovery Sciences, Hesperia, CA)使用 0. 06% 三氟醋酸中 M_80% 的乙腈梯度，在 37°C 以1. 2 mL/分鐘的流速進(jìn)行60分鐘。附圖12說明了幾種可能的PDGF片段或化學(xué)地修飾的多肽。對于附圖13A-13D，三個(gè)運(yùn)行與PDGF對照比較(附圖13E)。PDGF 裂解產(chǎn)物還利用 ESI LC/MS 在 Thermo LCA Deca XP MAX 上，用 Tune 和 Xcal^ Vydac C18 fe 5 μ m 4. 6 mm χ 250 mm(L 5 μ m #!胃(Grace Davison Discovery Sciences, Hesperia, CA)) ± ^v , B, ^ ffl Agilent 1100 % ^lJ, Agilent G1312A Bin 泵、Agilent G1329A ALS、Agilent G1330B ALS 和 Agilent G1314A VWD 來鑒定。數(shù)據(jù)獲自MS模式的m/z 200-2000 (附圖14A和14B)。實(shí)施例3. PDGF從骨移棺物的結(jié)合和釋放
附圖16概述了研究蛋白酶活性自骨移植物去除的示范性的方案。特別地，(i)20 mM NaOAc, pH 6. 0中0. 3 M NaCl與(ii)人類骨移植物樣品07-0720-A的1:1 (體積/重量) 混合物在37°C孵育一小時(shí)。然后，利用標(biāo)準(zhǔn)方法沉淀固體骨移植物來將它從液體上清液(骨移植物提取物)分離。固體骨移植物淀積物與0. 240 mg/mL的PDGF在37°C孵育80分鐘或過夜。上清液(骨移植物提取物)與0. MO mg/ml的PDGF在37°C孵育0、5、10、20、40、80或 160分鐘。然后如實(shí)施例2描述的對樣品進(jìn)行反相HPLC。與上清液(骨移植物提取物)孵育不同時(shí)間的PDGF的反相HPLC分布在附圖17A-17E中顯示。骨移植物提取物/上清液的 PDGF裂解是時(shí)間依賴性的(附圖18A和18B)。與骨移植物淀積物孵育不同時(shí)間的PDGF的反相HPLC分布在附圖19A-19C中顯示。在附圖17A-17E和19A-19C中，18. 3分鐘的峰代表裂解的PDGF。附圖19A-19C表明，在0. 3 M鹽洗脫之后少量的蛋白酶活性保留在骨移植物淀積物中。實(shí)施例4. PDGF從骨移植物的結(jié)合和釋放
以下使用QuantiCleaveTM蛋白酶分析試劑盒，Pierce, Cat. # 23263描述了蛋白酶活性的示范性的分析。人類骨移植物樣品07-0720被包括在80%骨移植物和20% β -TCP 的懸浮液中(類似于實(shí)施例1中描述的)。通過在500 mL DI水中溶解BupH硼酸鹽緩沖液包，產(chǎn)生50 mM硼酸鹽，pH 8. 5來制備分析緩沖液。琥珀?；睦业鞍兹芤和ㄟ^在5 ml同種異體移植物重懸浮緩沖液中溶解一瓶(10 mg)凍干琥珀酰化的酪蛋白來產(chǎn)生0.2 mg/ml 溶液來制備(這個(gè)溶液可以用于96孔微量培養(yǎng)板中的48份樣品)。胰蛋白酶貯備溶液通過在1 ml的分析緩沖液中溶解凍干的TPCK胰蛋白酶來產(chǎn)生50 mg/ml貯備溶液來制備。這個(gè)儲備物的等分量(10-50 yl)進(jìn)行冷凍，保存在-80°C。胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)物通過從10 yg/ml開始連續(xù)稀釋胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)物來制備。TNBSA工作溶液通過向14. 9 ml分析緩沖液中添加100 μ 1提供的TNBSA貯備溶液來制備。同種異體移植物重懸浮緩沖液(ARB)通過混合一體積的 20 mM NaOAc,pH6. 0 和兩體積的 20 mM NaOAc 和 1 M NaCl 來制備。EDTA 100 mM 貯備溶液通過稱重2. 92 g的EDTA和添加80 ml水來制備。這個(gè)EDTA溶液用2. 5 M NaOH 滴定到PH 7. 00，最終體積調(diào)節(jié)到100 ml。80%骨移植物和20% TCP懸浮液稱重(50、25或12. 5 mg)到1. 5 ml離心管中，添加200 μ 1的同種異體移植物重懸浮緩沖液。底物溶液(100 μ )與50 μ 1的胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)物或50 μ 1的骨移植物上清液(如實(shí)施例2描述制備的)和200 μ 1琥珀?；睦业鞍椎孜锓跤?，在室溫下混合20分鐘。TNBS (50 μ 1)添加到每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物和上清液中。TNBS (100 μ 1)添加到每個(gè)骨移植物懸浮液中?；旌衔镌谑覝叵路跤硗?0分鐘。離心骨移植物，200 μ 1的產(chǎn)生的上清液添加到具有胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)物的微量培養(yǎng)板中。450 nm的光吸收在Spectramax平板讀取器(Molecular Devices)上測量。對于這個(gè)分析，分析以下的樣品和對照?！癆”表示沒有洗滌的對照骨移植物。就在添加底物之前添加補(bǔ)充體積的ARB?！癆c”表示與“Α”相同的對照，只是添加等體積的ARB 而不是底物?！癆W”表示與150 μ 1的ARB在室溫下孵育60分鐘、然后用1 ml NaOAc, pH 6. 0洗滌3次的骨移植物，骨移植物在15，344Xg旋轉(zhuǎn)2分鐘后分離自上清液(“AWS”)，然后如對單獨(dú)的骨移植物(A)進(jìn)行的來分析。所有對照(在樣品名稱中以“C”表示)按照常規(guī)的樣品來制備，只是代替蛋白酶底物(琥珀?；睦业鞍椎娜芤?，僅添加ARB到孵育混合物中。這些對照說明了從骨移植物用ARB洗脫的肽，其給出對三硝基苯磺酸磺酸(TNBS，其與肽的N-末端氨基基團(tuán)特異性反應(yīng)，在450 nm下給出信號)的假陽性信號。減去了那些對照的樣品值在附圖7中示出?！癆WEc”表示與“AW”相同的對照，只是添加等體積的ARB代替底物。“AWES”表示來自“AWE”與100 μ L ARB初步孵育60分鐘的上清液?！癆WEcSc”表示與 “AWES”相同的對照，只是添加等體積的ARB代替底物。樣品命名中“E”表示的樣品是如AW 和AWS樣品一樣獲得的，只是在存在5 mM EDTA (與蛋白酶底物一起添加到反應(yīng)混合物中) 的情況下進(jìn)行蛋白酶分析。附圖7顯示了使用這種方法測量的蛋白酶活性。來自沒有蛋白酶底物的對照的信號被減去，以產(chǎn)生這個(gè)附圖的數(shù)據(jù)，因?yàn)閺墓且浦参锵疵摰碾脑诜治鲋挟a(chǎn)生了大信號。蛋白酶活性在來自鹽洗滌的可溶的上清液和不溶的骨移植物淀積物之間是均勻分布的?？扇艿牡鞍酌割A(yù)計(jì)展現(xiàn)了更快的裂解動力學(xué)，由于與保留在骨移植物之上或之中的不溶的蛋白酶相比增強(qiáng)的底物擴(kuò)散。實(shí)施例5.示范性的蛋白酶測定方法
如果希望，標(biāo)準(zhǔn)方法可以用于鑒定與骨移植物相關(guān)的一種或更多種蛋白酶和/或存在的一種或更多種其他多肽。特別地，以下方法容許鑒定大多數(shù)或所有的與骨移植物相關(guān)的多肽。這些多肽可以包括能裂解目標(biāo)多肽(例如，PDGF)的一種或更多種蛋白酶。原理上，來自如實(shí)施例3描述制備的骨移植物的鹽洗脫液使用IOOODa截?cái)嗟某瑸V設(shè)備濃縮至少 100X，然后在MudPIT (Mulditimensional蛋白質(zhì)鑒定技術(shù))LC MS/ MS 實(shí)驗(yàn)(網(wǎng)址 fields, scripps. edu/mudpit/ 或 cshprotocols. cshlp. org/cgi/content/ full/2006/^8/pdb.prot4555，通過引用將它們?nèi)亢喜⒃诒疚闹?，特別是對于LC MS/MS方法)中直接使用，或在SDS PAGE上分離，切下，在凝膠中用胰蛋白酶消化，最后通過LC MS/MS或MALDI MS使用標(biāo)準(zhǔn)方案測定樣品中存在的多肽。在MudPIT實(shí)驗(yàn)中，稀釋的樣品加載到離子交換毛細(xì)管柱上。然后，來自柱的級分在C18柱上分離并注入質(zhì)譜儀中。在某些實(shí)施方式中，進(jìn)行骨移植物洗脫物的胰蛋白酶消化，然后使用LC MS/MS分析產(chǎn)生的混合物。為了確認(rèn)數(shù)據(jù)，多次正交方法可以應(yīng)用和相互參照。在某些實(shí)施方式中，蛋白酶鑒定的最后確認(rèn)是一實(shí)驗(yàn)，其中使用通過MS鑒定的作為底物的目標(biāo)多肽(例如，PDGF)和懷疑的蛋白酶的特異性肽底物。骨移植物鹽洗脫物的裂解與購自供應(yīng)商的純化的懷疑的蛋白酶的裂解比較。在某些實(shí)施方式中，多個(gè)蛋白酶同時(shí)地促進(jìn)目標(biāo)多肽(例如，PDGF)的蛋白水解降解。例如，可以使用以下方案。這個(gè)示范性的方案涉及SDS-PAGE蛋白質(zhì)分離，在凝膠胰蛋白酶消化以及MALDI MS中。如果希望，樣品可以按比例擴(kuò)大或縮小，取決于骨移植物中存在的蛋白質(zhì)的濃度。1)稱重一等分量的骨移植物(例如，LifeNet, # 07—720B-320)到15 mL錐形管中。2)添加1 :1 v/w的重懸浮緩沖液，充分混合，在室溫下在旋轉(zhuǎn)器上孵育1小時(shí)。a.對于重懸浮緩沖液的制備，將1體積的20 mM NaOAc溶液混合到2體積的20mM NaOAc 禾口 1 M NaCl 溶液中。3)在最大速度下旋轉(zhuǎn)骨同種異體移植物樣品和對照2分鐘。4)使用1000道爾頓超濾設(shè)備將上清液濃縮到100 μ 1。5)跑凝膠來測試蛋白酶的存在。a.將來自骨移植物樣品的10 μ 1上清液組合到10 μ 1 Laemmli樣品緩沖液 (BioRad # 161-0737)中。b.在90°C孵育5分鐘。
C.在14Xg旋轉(zhuǎn)樣品1分鐘。
d.加載到 10 孔 12% Tris-HCl 凝膠(BioRad # 161-1156)上。
e.在200 V跑動 30分鐘。
f.用H20洗滌三次，每次20分鐘。
g·用 Coomassie 染料(BioRad # 161-0786)染色過夜。
6)使用標(biāo)準(zhǔn)方法處理凝膠。
用于隨后通過質(zhì)譜法分析的凝膠內(nèi)的胰蛋白酶消化如下進(jìn)行。
用高純度的清潔劑，將它們用于這個(gè)操作。搖晃和/或超聲處理不是必需的。常規(guī)試劑使用以下常規(guī)試劑。1)碳酸氫銨，0.79g溶解在100 ml milliQ水中，過濾消毒(任選的)，置入緊密蓋好的瓶子中。1個(gè)月后更換。2)乙腈。3) 二硫蘇糖醇(DTT，1M. 2 g/mol)。通過稱重小于10 mg并添加合適量的milliQ 水，在1.5 mL試管中制備新鮮的45 mM溶液。DTT僅在2D凝膠電泳期間樣品沒有被早先還原和烷基化時(shí)是必需的。4)碘乙酰胺(IA，185 g/mol)。通過稱重小于10 mg并添加合適量的milliQ水，在1. 5 mL試管中制備新鮮的100 mM溶液。IA僅在2D凝膠電泳期間樣品沒有被早先還原和烷基化時(shí)是必需的。5)三氟乙酸(TFA) (10 Xl mL 安瓿，Pierce cat #28904)。在通風(fēng)櫥中，打開 1 mL安瓿，50:50與miIliQ水混合用于50%貯備溶液，然后在miIliQ水中1:5稀釋來制備 10%工作儲備溶液。都可以保存在-20°C。6)修飾的胰蛋白酶(5個(gè)小瓶，每個(gè)含有20 μ g凍干的胰蛋白酶；Promega cat #V5111，使用胰蛋白酶金)。重懸浮來制備0.1 mg/mL工作貯備溶液。小心地等分量10X20 μ 1到0.5 mL試管中，在-20°C保存。特異于銀染色的蛋白質(zhì)的試劑
以下試劑特異于銀染色的蛋白質(zhì)鐵氰化鉀和硫代硫酸鈉。在清潔的15 mL試管中，在 5 mL milliQ水中溶解50 mg鐵氰化鉀和80 mg硫代硫酸鈉。這個(gè)溶液是不穩(wěn)定的，應(yīng)當(dāng)每次新鮮地制備和在30分鐘內(nèi)使用。特異于肽凈化和濃縮的試劑
推薦以下的10 μ 移液器(或有10 μ 尖頭的)以及ZipTipClS吸移管尖頭 (Millipore cat #ZTC18S096)。工作溶液
以下工作溶液通常10-20個(gè)反應(yīng)僅需要1 mL。每天新鮮制備
1) 50mM碳酸氫銨，50%乙腈?；旌系润w積的100 mM碳酸氫銨和100%乙腈。2) 25 mM碳酸氫銨。組合250 μ 1 100 mM碳酸氫銨和750 μ 1 milliQ水。3) 0. 1% 三氟乙酸(TFA)。稀釋 10 μ 10% TFA 至Ij 990 μ 1 milliQ 水中。4) 60% 乙腈，0.1% TFA。組合 600 μ 1 乙腈、390 μ 1 milliQ 水和 10 μ 1 10% TFA。在以下的步驟1-6之間，吸移管尖頭不需要改變。存在著最小的樣品交叉污染風(fēng)險(xiǎn)，直到胰蛋白酶進(jìn)入凝膠切片以及開始消化樣品時(shí)。搖晃和/或超聲處理不是必需的。步驟1.條帶切除。對于濕的凝膠，在條帶的頂角插入直剃刀的角邊緣，沿著條帶的長切下(剃刀不劃過凝膠)。最好是最小化過量的凝膠，如有必要更好是廢棄一點(diǎn)蛋白質(zhì)。 這幫助降低背景(和提高總體蛋白質(zhì)濃度)。切條帶的側(cè)面，然后將條帶切割成1 mm的立方體，置入0.5 mL試管中。對于乙酸酯層中的凝膠，利用直剃刀的角邊緣切下條帶，置入0.5 mL試管中。步驟2.平衡。使用100 μ 1的50 mM碳酸氫銨15分鐘。對于乙酸酯層中的凝膠， 使用鉗子除去乙酸酯碎片，除去再次膨脹的凝膠切片，切成1 mm立方體，放回試管中。丟棄洗滌液。分離步驟不需要使考馬斯亮藍(lán)染色的蛋白質(zhì)脫色。充分的脫色在進(jìn)行步驟4-5期間實(shí)現(xiàn)。步驟3.銀去除(由 Gharahdaghi et al. , Electrophoresis 20:601 適應(yīng)改變的)。添加100 μ 1的鐵氰化鉀/硫代硫酸鈉溶液到含有凝膠切片的試管中，放置5分鐘(或更久，如果褐色沒有從凝膠去除)。丟棄溶液，替換為過量的(250 μ 1) 100 mM碳酸氫銨10 分鐘。除去碳酸氫銨，替換為100 mM碳酸氫銨10分鐘。重復(fù)這種碳酸氫銨洗滌，直到黃顏色從凝膠切片上去掉。丟棄最后的洗滌液。
步驟4.還原/烷基化。(如果樣品來自包括了還原和烷基化的2DE方案，這個(gè)步驟可以省略)。向樣品添加150 μ 1 50mM碳酸氫銨。添加10 μ 1 45 mM DTT在50°孵育 15分鐘。然后添加(向同一試管)10 μ 1的100 mM碘乙酰胺，在室溫下置于暗處15分鐘。 這引起半胱氨酸殘基的脲基甲基化(對每個(gè)半胱氨酸殘基凈添加57道爾頓)。步驟5.平衡/脫水。用50-100 μ 1 100%乙腈替換液體10分鐘，或直到凝膠切片變成白色(可能需要重復(fù)一次)。移除液體，在真空離心機(jī)中干燥5分鐘。脫水的凝膠切片可以在蓋好的0. 5 mL試管中在-20°C保存數(shù)月。作為可選的步驟，在100%乙腈之前，除去液體，替換為100 μ 1 50%乙腈，25mM碳酸氫銨(與50 mM乙腈1 :1混合)，放置15分鐘。這可以重復(fù)一次來進(jìn)一步除去殘余的考馬斯染料。步驟6.消化。在10-15 μ 1的0.01 μ g/μ 1修飾的胰蛋白酶(Promega)中在 12.5 mM碳酸氫銨中再次膨脹脫水的凝膠切片。將合適量的0.1 mg/ml儲備胰蛋白酶溶液 1:10稀釋到12.5 mM碳酸氫銨中，每份樣品小心地添加10-15 μ 1。這是胰蛋白酶進(jìn)入凝膠時(shí)的關(guān)鍵步驟；僅使用覆蓋凝膠切片所必需的。在20分鐘后，相比有過量的剩余，更好是所有的溶液進(jìn)入凝膠。消化在37°C 2小時(shí)完成，如有必要可以過夜。從步驟7開始，對每個(gè)樣品使用新的吸移管尖頭。步驟7.覆蓋(任選的)。如有必要，在所有的胰蛋白酶溶液進(jìn)入凝膠切片廣20分鐘)之后，以5 μ 1的間隔添加另外的12. 5 mM碳酸氫銨(沒有額外的胰蛋白酶)直到凝膠切片剛好被覆蓋(不添加過量)。步驟8.肽提取。除去上清液到新標(biāo)簽的0. 5 mL試管中，其可能含有從凝膠切片中彌散出的一些肽。用15-25 μ 1 60%乙腈，0.1% TFA從凝膠切片提取肽。15分鐘之后， 移除提取物，在新試管中與上清液組合，如上重復(fù)第二次提取。當(dāng)將第二次提取物轉(zhuǎn)移到含有第一次提取物和上清液的新試管時(shí)，上下吸移幾次以確保試劑的完全混合。最后，使用真空離心機(jī)來干燥新試管中的提取物/上清液至干，但是在液體蒸發(fā)之后不放置過長時(shí)間 (時(shí)間隨不同的真空離心機(jī)而變化，使用上文列出的體積可能花費(fèi)30-60分鐘，根據(jù)需要進(jìn)行檢查)。步驟9.重構(gòu)和質(zhì)量分析。肽溶解在4 μ 1 0. 1% TFA中。樣品可以直接通過LC/ MS分析。豐富的樣品可以直接通過MALDI-TOF MS分析，較不豐富的樣品通常需要使用 ZipTipC18 (Millipore,目錄編號ZTC18S096)吸移管尖頭(需要10 μ 1移液器)凈化和濃縮。a.在 60% 乙腈、0. 1% TFA (2X 10 μ 1)中平衡尖頭。b.在 0.1% TFA (2 χ 10 μ L)中洗滌。c.通過重復(fù)吸移Γ5次)加載到10 μ 樣品。d.在 0.1% TFA (2 χ 10 μ L)中洗滌。e.通過重復(fù)吸移，洗脫到2 μ 1 60%乙腈、0. 1% TFA中。(在洗脫之前2 μ 1置入
新鮮的試管中)。步驟10. 用于MALDI-TOF MS的樣品制備。施加0.4 μ 1肽混合物到MALDI靶點(diǎn)上，用0. 4 μ 1 α -氰-4-羥基肉桂酸基質(zhì)(60%乙腈和0. 1% TFA中的5 mg/mL,補(bǔ)充有 1 mg/ml檸檬酸銨)覆蓋。
MALDI-TOF MS. 肽混合物通過基質(zhì)輔助的激光脫附飛行時(shí)間(MALDI-T0F)和 T0F/T0F 串聯(lián)質(zhì)譜法，使用 Voyager 4700 質(zhì)譜儀(Applied Biosystems，F(xiàn)ramingham MA)來分析。以完整分子肽離子的肽質(zhì)量圖形式的質(zhì)譜數(shù)據(jù)(M+H)，以及來自單獨(dú)肽離子的片段數(shù)據(jù)，用于查詢Swiss-Prot和NCBInr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的蛋白質(zhì)匹配，利用運(yùn)行 MASCOT 搜索引擎(Matrix Science)的 GPS Explorer 軟件(Applied Biosystems)。胰蛋白酶自溶的肽離子(m/z = 842.51,2211. 10)用于肽質(zhì)量圖的內(nèi)部校準(zhǔn)，容許用小于20 ppm 的質(zhì)量準(zhǔn)確性進(jìn)行檢索。檢索還容許1個(gè)錯(cuò)誤的裂解，半胱氨酸巰基的完整的脲基甲基化， 以及甲硫氨酸殘基的部分氧化。棚列6. iSi寸鵬去靴·辦■析
這項(xiàng)研究的目的是鑒定在rhPDGF-BB從這種材料洗脫的條件下，從人類同種異體移植物洗脫的肽部分的主要成分，并通過LC/MS/MS比較來自有和沒有蛋白水解活性的同種異體移植物的洗脫物的肽分布，鑒定引起rhPDGF-BB裂解的可能的蛋白酶候選物。材料和設(shè)備
以下材料用于進(jìn)行測試
權(quán)利要求
1.一種選擇用于與目標(biāo)多肽一起向個(gè)體施用的骨移植物的方法，包括測量與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性，由此根據(jù)與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的量來確定是否選擇該骨移植物用于與所述目標(biāo)多肽一起向所述個(gè)體施用。
2.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括向所述個(gè)體施用所述選擇的骨移植物和所述目標(biāo)多肽。
3.權(quán)利要求1的方法，其中測量兩種或更多種骨移植物的蛋白酶活性，具有最低蛋白酶活性的骨移植物與所述目標(biāo)多肽一起向個(gè)體施用。
4.權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)的方法，其中選擇的骨移植物的蛋白酶活性小于約50胰蛋白酶當(dāng)量。
5.權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)的方法，其中測量與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性包括(a)從所述骨移植物移除與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分；和(b)測量被所述移除的蛋白酶裂解的多肽底物的量，從而確定與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的量。
6.權(quán)利要求5的方法，其中步驟(a)包括提高包含所述骨移植物和蛋白酶的溶液的離子強(qiáng)度。
7.權(quán)利要求6的方法，其中步驟(a)包括在鹽溶液中孵育所述骨移植物和蛋白酶。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述鹽溶液是NaCl溶液。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述鹽溶液含有約0.15 M NaCl到約1. 5 M NaCl之間。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述鹽溶液含有約0.3 M NaCl。
11.權(quán)利要求5的方法，其中步驟(b)包括分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。
12.權(quán)利要求11的方法，其中高性能的液相層析被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。
13.權(quán)利要求11的方法，其中空間排阻層析被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。
14.權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)的方法，其中測量與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性包括測量由與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性所裂解的多肽底物的量。
15.權(quán)利要求14的方法，其中測量裂解的多肽底物的量包括(a)孵育多肽底物和骨移植物，(b)從所述骨移植物中移除裂解的多肽底物的總量的至少一部分，和(c)測量裂解的多肽底物的量。
16.權(quán)利要求15的方法，其中步驟(b)包括提高包含所述骨移植物和所述多肽底物的溶液的離子強(qiáng)度。
17.權(quán)利要求16的方法，其中步驟(b)包括在鹽溶液中孵育所述骨移植物和所述多肽底物。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述鹽溶液是NaCl溶液。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述鹽溶液含有約0.15 M到約2. 0 M NaCl之間。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述鹽溶液含有約0.6 M NaCl。
21.權(quán)利要求15的方法，其中步驟(c)包括分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。
22.權(quán)利要求21的方法，其中高性能的液相層析被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。
23.權(quán)利要求21的方法，其中空間排阻層析被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。
24.權(quán)利要求5-23的任一項(xiàng)的方法，其中所述目標(biāo)多肽和多肽底物是相同的。
25.權(quán)利要求5-23的任一項(xiàng)的方法，其中所述目標(biāo)多肽和多肽底物是不同的。
26.權(quán)利要求1-25的任一項(xiàng)的方法，其中所述目標(biāo)多肽是血小板衍生的生長因子 (PDGF)0
27.一種選擇用于與PDGF —起向個(gè)體施用的骨移植物的方法，包括選擇具有小于約50 胰蛋白酶當(dāng)量的蛋白酶活性的骨移植物用于與PDGF —起向個(gè)體施用。
28.一種用于測量與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的方法，所述方法包括(a)從所述骨移植物移除與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分；和(b)測量被所述移除的蛋白酶裂解的多肽底物的量，從而確定與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的量。
29.權(quán)利要求觀的方法，其中步驟(a)包括提高包含所述骨移植物和蛋白酶的溶液的離子強(qiáng)度。
30.權(quán)利要求四的方法，其中步驟(a)包括在鹽溶液中孵育所述骨移植物和蛋白酶。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述鹽溶液是NaCl溶液。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述鹽溶液含有約0.15 M NaCl到約1. 5 M NaCl之間。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述鹽溶液含有約0.3 M NaCl。
34.權(quán)利要求觀的方法，其中步驟(b)包括分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。
35.權(quán)利要求34的方法，其中高性能的液相層析被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。
36.權(quán)利要求34的方法，其中空間排阻層析被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。
37.權(quán)利要求觀-36的任一項(xiàng)的方法，其中所述多肽底物是PDGF。
38.一種用于測量與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的方法，所述方法包括(a)通過在含有約0.15 M NaCl到約1. 5 M NaCl的鹽溶液中孵育所述骨移植物來從所述骨移植物移除與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分；和(b)測量被所述移除的蛋白酶裂解的PDGF的量，從而確定與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的量。
39.一種用于測量與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的方法，所述方法包括測量由與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性裂解的多肽底物的量。
40.權(quán)利要求39的方法，其中測量裂解的多肽底物的量包括 (i)孵育多肽底物和骨移植物，( )從所述骨移植物中移除裂解的多肽底物的總量的至少一部分，和 (iii)測量裂解的多肽底物的量。
41.權(quán)利要求40的方法，其中步驟(ii)包括提高包含所述骨移植物和所述多肽底物的溶液的離子強(qiáng)度。
42.權(quán)利要求41的方法，其中步驟(ii)包括在鹽溶液中孵育所述骨移植物和所述多肽底物。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述鹽溶液是NaCl溶液。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述鹽溶液含有約0.15 M到約2. 0 M NaCl之間。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述鹽溶液含有約0.6M NaCl。
46.權(quán)利要求40的方法，其中步驟(iii)包括分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。
47.權(quán)利要求46的方法，其中高性能的液相層析被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。
48.權(quán)利要求46的方法，其中空間排阻層析被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。
49.權(quán)利要求39-48的任一項(xiàng)的方法，其中所述多肽底物是PDGF。
50.一種用于測量與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的方法，所述方法包括(i)孵育PDGF和骨移植物，(ii)從所述骨移植物中移除裂解的PDGF的總量的至少一部分，和(iii)測量裂解的PDGF的量。
51.一種降低與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的方法，包括從所述骨移植物移除與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分。
52.權(quán)利要求51的方法，進(jìn)一步包括測量仍然與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的量。
53.權(quán)利要求51-52的任一項(xiàng)的方法，其中移除所述蛋白酶包括提高包含所述骨移植物和蛋白酶的溶液的離子強(qiáng)度。
54.權(quán)利要求53的方法，其中移除所述蛋白酶包括在鹽溶液中孵育所述骨移植物和蛋白酶。
55.權(quán)利要求M的方法，其中所述鹽溶液是NaCl溶液。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述鹽溶液含有約0.15 M NaCl到約1. 5 M NaCl之間。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述鹽溶液含有約0.3 M NaCl。
58.一種降低與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的方法，包括通過在含有約0. 15 M NaCl到約1. 5 M NaCl的鹽溶液中孵育所述骨移植物來從所述骨移植物移除與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分。
59.一種治療個(gè)體的方法，所述方法包括向個(gè)體施用骨移植物和目標(biāo)多肽，其中所述骨移植物已經(jīng)根據(jù)蛋白酶活性的水平進(jìn)行了選擇。
60.權(quán)利要求59的方法，其中在向所述個(gè)體施用骨移植物之前，與骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分已經(jīng)被除去。
61.權(quán)利要求59的方法，其中測量兩種或更多種骨移植物的蛋白酶活性，具有最低蛋白酶活性的骨移植物與所述目標(biāo)多肽一起向個(gè)體施用。
62.權(quán)利要求59-61的任一項(xiàng)的方法，其中選擇的骨移植物的蛋白酶活性小于約50胰蛋白酶當(dāng)量。
63.權(quán)利要求59-62的任一項(xiàng)的方法，其中選擇具有可接受水平的蛋白酶活性的骨移植物包括(i)從所述骨移植物移除與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分；和 ( )測量被所述移除的蛋白酶裂解的多肽底物的量，從而確定與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性的量。
64.權(quán)利要求63的方法，其中步驟(i)包括提高包含所述骨移植物和蛋白酶的溶液的離子強(qiáng)度。
65.權(quán)利要求64的方法，其中步驟(i)包括在鹽溶液中孵育所述骨移植物和蛋白酶。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述鹽溶液是NaCl溶液。
67.權(quán)利要求66的方法，其中所述鹽溶液含有約0.15 M NaCl到約1. 5 M NaCl之間。
68.權(quán)利要求67的方法，其中所述鹽溶液含有約0.3M NaCl。
69.權(quán)利要求63的方法，其中步驟(ii)包括分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。
70.權(quán)利要求69的方法，其中高性能的液相層析被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。
71.權(quán)利要求69的方法，其中空間排阻層析被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。
72.權(quán)利要求59-62的任一項(xiàng)的方法，其中選擇具有可接受水平的蛋白酶活性的骨移植物包括測量由與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性裂解的多肽底物的量。
73.權(quán)利要求72的方法，其中測量裂解的多肽底物的量包括 (i)孵育多肽底物和骨移植物，( )從所述骨移植物移除裂解的多肽底物的總量的至少一部分，和 (iii)測量裂解的多肽底物的量。
74.權(quán)利要求73的方法，其中步驟(ii)包括提高包含所述骨移植物和所述多肽底物的溶液的離子強(qiáng)度。
75.權(quán)利要求74的方法，其中步驟(ii)包括在鹽溶液中孵育所述骨移植物和所述多肽底物。
76.權(quán)利要求75的方法，其中所述鹽溶液是NaCl溶液。
77.權(quán)利要求76的方法，其中所述鹽溶液含有約0.15 M到約2. 0 M NaCl之間。
78.權(quán)利要求77的方法，其中所述鹽溶液含有約0.6M NaCl。
79.權(quán)利要求73的方法，其中步驟(iii)包括分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。
80.權(quán)利要求79的方法，其中高性能的液相層析被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。
81.權(quán)利要求79的方法，其中空間排阻層析被用于分離裂解的多肽底物、未裂解的多肽底物和骨移植物。
82.權(quán)利要求63-81的任一項(xiàng)的方法，其中所述目標(biāo)多肽和多肽底物是相同的。
83.權(quán)利要求63-81的任一項(xiàng)的方法，其中所述目標(biāo)多肽和多肽底物是不同的。
84.權(quán)利要求59-83的任一項(xiàng)的方法，其中所述目標(biāo)多肽是PDGF。
85.一種治療個(gè)體的方法，所述方法包括向個(gè)體施用骨移植物和PDGF，其中所述骨移植物的蛋白酶活性小于約50胰蛋白酶當(dāng)量。
86.一種治療個(gè)體的方法，所述方法包括向個(gè)體施用骨移植物和目標(biāo)多肽，其中與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分已經(jīng)從所述骨移植物移除。
87.權(quán)利要求86的方法，進(jìn)一步包括測量仍然與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的量。
88.權(quán)利要求86-87的任一項(xiàng)的方法，其中移除與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分包括提高包含所述骨移植物和蛋白酶的溶液的離子強(qiáng)度。
89.權(quán)利要求88的方法，其中移除與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分包括在鹽溶液中孵育所述骨移植物和蛋白酶。
90.權(quán)利要求89的方法，其中所述鹽溶液是NaCl溶液。
91.權(quán)利要求90的方法，其中所述鹽溶液含有約0.15 M NaCl到約1. 5 M NaCl之間。
92.權(quán)利要求91的方法，其中所述鹽溶液含有約0.3M NaCl。
93.權(quán)利要求86-92的任一項(xiàng)的方法，其中所述目標(biāo)多肽是PDGF。
94.一種治療個(gè)體的方法，所述方法包括向個(gè)體施用骨移植物和PDGF，其中通過在鹽溶液中孵育所述骨移植物，與所述骨移植物相關(guān)的蛋白酶的總量的至少一部分已經(jīng)從所述骨移植物移除。
全文摘要
本發(fā)明特征在于具有降低的蛋白酶活性的骨移植物(例如，骨同種異體移植物)。這些骨移植物例如，與目標(biāo)多肽(例如，血小板衍生的生長因子)一起對于治療、穩(wěn)定、防止和/或延遲個(gè)體(例如，人類)中的骨、牙周組織、韌帶、軟骨或肌腱狀況是有用的。另外，本發(fā)明提供了測量與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性、降低與骨移植物相關(guān)的蛋白酶活性水平、選擇具有可接受水平的蛋白酶活性的骨移植物的方法，以及向個(gè)體施用骨移植物和目標(biāo)多肽的方法。
文檔編號A61K33/42GK102316890SQ200980156893
公開日2012年1月11日 申請日期2009年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者E. 哈特 C., S. 楊 C., B. 斯內(nèi)爾 L., 克里 V. 申請人:生物模擬治療公司