專利名稱：抗-hepcidin-25選擇性抗體及其用途的制作方法
抗-HEPCIDIN-25選擇性抗體及其用途本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是抗人hepcidin-25的抗體的領(lǐng)域。更特別的，本發(fā)明 涉及一些疾病的治療，例如貧血，通過(guò)向需要其的患者施用抗hepcidin-25選擇性抗體。本 發(fā)明還涉及檢測(cè)h印cidin-25和/或診斷以升高的h印cidin-25水平為特征的疾病病況的 方法和試劑盒，。人h印cidin，是主要由肝細(xì)胞表達(dá)的多肽，被認(rèn)為是重要的鐵調(diào)控蛋白，其負(fù)調(diào)控 腸的鐵吸收、巨噬細(xì)胞的鐵再循環(huán)和從肝鐵儲(chǔ)藏中的鐵移動(dòng)。過(guò)量產(chǎn)生hepcidin表現(xiàn)出在 貧血和/或慢性疾病貧血的病理生理學(xué)中扮演主要角色。目前，貧血和/或慢性疾病貧血的合適且有效的療法是有限的。尤其是促紅細(xì)胞 生成素施用僅對(duì)所有患者的約50%有效，并與不理想的副作用相關(guān)聯(lián)。此外，由于污染、感 染和鐵過(guò)載，輸血也是不理想的。人h印cidin編碼為84個(gè)氨基酸的前原肽(pr印rop印tide)，含有典型的N端 24個(gè)氨基酸的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)序列和35個(gè)氨基酸的原區(qū)(proregion)，所述原區(qū)具有共 同的弗林蛋白酶(furin)切割位點(diǎn)，其后緊接著C端25個(gè)氨基酸的生物學(xué)活性鐵調(diào)控激 素(hepcidin-25, SEQ IDNO :1)。各種N端截短形式的h印cidin，例如h印cidin-20 (例 如，對(duì)于人，SEQ ID NO 1的氨基酸6-25)和h印cidin-22 (例如，對(duì)于人，SEQ IDNO 1的 氨基酸4-25)也是已知在體內(nèi)形成的。然而，即使不是唯一，h印cidin-25被認(rèn)為是與人 中的h印cidin生理學(xué)最相關(guān)的形式。選擇性調(diào)控h印cidin-25而非其前體或截短形式的 濃度的療法是特別理想的。特別的是，選擇性結(jié)合h印cidin-25而非其前體或截短形式的 抗體將為與升高的hepcidin-25水平相關(guān)的病癥的治療或診斷提供多種優(yōu)勢(shì)。例如，與 非選擇性的h印cidin抗體相比，高親和力的h印cidin-25選擇性抗體將降低副作用的風(fēng) 險(xiǎn)，且有效治療所需的臨床劑量較低，因?yàn)橹委熜钥贵w將不結(jié)合h印cidin的生理學(xué)相關(guān)形 式。盡管之前已報(bào)道過(guò)針對(duì)hepcidin的非人多克隆和單克隆抗體(參見例如，美國(guó)專利申 請(qǐng)公開2006/0019339、2007/0224186和2008/0213277)，本領(lǐng)域仍然極其需要選擇性結(jié)合 hepcidin-25的單克隆抗體。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是提供了與人h印cidin-25選擇性的 結(jié)合在h印cidin-25的氨基酸1_7(含端點(diǎn))中的抗體。此類抗體可用于在人中增加血清 鐵水平、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白和/或血細(xì)胞比容，用于治療疾病、病況或 病癥，例如貧血。另外，對(duì)h印cidin的現(xiàn)有免疫測(cè)定不區(qū)分活性的、生理學(xué)相關(guān)的h印cidin-25與 無(wú)活性的、生理學(xué)不相關(guān)的h印cidin種類(參見例如，Kemna, E. H.等人，Haematologica, 93(1) 90-7(2008) ；Roe Μ. A.等人，Br J Nutr.，97 :544_9 (2007)；和 Luukkonen S.和 Punnonen K.，Clin Chem Lab Med.，44 1361-2 (2006))。目前，目前可獲得的選擇性測(cè) 定h印cidin-25的唯一方法涉及LC/MS(液相色譜/質(zhì)譜)或類似的繁瑣方法，所述方法 需要分離不同類型的h印cidin(參見例如，Gutierrez, J. Α.等人，BioTechniques, 38 S13-S17(2005) ；Murphy 等人，Blood, 110 1048-54(2007)和 Kemna, E. H.等人，Clin. Chem. ,53 :620_8 (2007))。雖然這些測(cè)定可以是準(zhǔn)確和精準(zhǔn)的，它們的復(fù)雜性、昂貴和需要 高水平的操作專家妨礙了它們的常規(guī)應(yīng)用。因此，出于在檢測(cè)或測(cè)量hepcidin-25的免疫測(cè)定中的應(yīng)用，還極其需要以高親和力選擇性結(jié)合人hepcidin-25的抗體。因此，本發(fā)明的 另一個(gè)方面提供了在相對(duì)簡(jiǎn)單但仍高敏感、強(qiáng)效且選擇性的免疫測(cè)定中使用hepcidin-25 選擇性抗體的方法，用于在哺乳動(dòng)物組織和生物學(xué)流體中檢測(cè)和測(cè)量hepcidin-25。本發(fā)明提供了在h印cidin-25的氨基酸1_7 (含端點(diǎn))中選擇性的結(jié)合人 h印cidin-25的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體選擇性的結(jié)合具有SEQ ID NO 1 顯示的氨基酸序列的多肽，而非相關(guān)的前體和截短的多肽，并包括選自以下的6個(gè)CDR (i) 分別具有SEQ ID NOs :9、10、11、32、33和34所示的氨基酸序列的LCDRU LCDR2、LCDR3、 HCDRU HCDR2 和 HCDR3 ； (ii)分別具有 SEQ ID NOs :12、13、14、35、36 和 37 所示的氨基酸 序列的 LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDRU HCDR2 和 HCDR3 ； (iii)分別具有 SEQ ID NOs :45、13、 14、35、36 和 37 所示的氨基酸序列的 LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDRU HCDR2 和 HCDR3 ； (iv) 分別具有SEQ ID NOs :12、13、14、38、36和37所示的氨基酸序列的LCDRU LCDR2、LCDR3、 HCDRU HCDR2 和 HCDR3 ； (ν)分別具有 SEQ ID NOs 15、10、16、39、40 和 41 所示的氨基酸序 列的 LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDRU HCDR2 和 HCDR3 ； (vi)分別具有 SEQ ID NOs :20、21、22、 42、43 和 44 所示的氨基酸序列的 LCDRl、LCDR2、LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ； (vii)分別 具有 SEQ IDNOs 20、21、23、42、43 和 44 所示的氨基酸序列的 LCDRl、LCDR2、LCDR3、HCDRl、 HCDR2和HCDR3 ； (viii)分別具有SEQ ID NOs :24、25、23、42、43和44所示的氨基酸序列的 LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2 和 HCDR3 ； (ix)分別具有 SEQ ID NOs :26、25、27、42、43 和44所示的氨基酸序列的LCDRl、LCDR2、LCDR3、HCDRl、HCDR2和HCDR3 ；和(χ)分別具有 SEQ ID NOs :26、25、28、42、43和44所示的氨基酸序列的1^0 1丄0)1 2丄0)1 3、!10)1 1、!10)1 2 和 HCDR3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合在包含在人hepcidin-25的氨基 酸1-7 (含端點(diǎn))中所含表位的抗體，即，SEQ ID NO 1的DTHFPIC或嚙齒類動(dòng)物 hepcidin-25 (SEQ ID NO :2或3)的DTNFPIC。優(yōu)選的，本發(fā)明的抗體包含輕鏈可變區(qū) (“LCVR”)多肽和重鏈可變區(qū)(“HCVR”)多肽，其中(i) LCVR和HCVR多肽分別具有如SEQ ID NOs 48和49顯示的氨基酸序列；(ii) LCVR和HCVR多肽分別具有如SEQ ID NOs 50和 51顯示的氨基酸序列；(iii) LCVR和HCVR多肽分別具有如SEQID NOs :52禾口 51顯示的氨 基酸序列；(iv) LCVR和HCVR分別具有如SEQ ID NOs :53和54顯示的氨基酸序列；(v) LCVR 和HCVR分別具有如SEQ ID NOs 55和56顯示的氨基酸序列；(vi) LCVR和HCVR分別具有 如SEQ ID NOs 59和58顯示的氨基酸序列；(vii) LCVR和HCVR分別具有如SEQ ID NOs 60 和58顯示的氨基酸序列；(viii) LCVR和HCVR分別具有如SEQ ID NOs 61和58顯示的氨 基酸序列；(ix)LCVR和HCVR分別具有如SEQ ID NOs 62和58顯示的氨基酸序列；或(χ) LCVR和HCVR分別具有如SEQ ID NOs 63和58顯示的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明抗體的分離的核酸分子；包含編碼 本發(fā)明抗體的核酸分子的載體，所述編碼本發(fā)明抗體的核酸分子任選的與用載體轉(zhuǎn)化的宿 主細(xì)胞識(shí)別的控制序列有效連接；包含載體的宿主細(xì)胞，所述載體包含編碼本發(fā)明抗體的 核酸分子；生產(chǎn)本發(fā)明抗體的方法，包括培養(yǎng)包含載體的宿主細(xì)胞，所述載體包含編碼本發(fā) 明抗體的核酸分子，使得表達(dá)核酸，并任選的從宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中回收抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明的抗體，和可藥用 的載體或稀釋劑。優(yōu)選的，藥物組合物包含同質(zhì)的或基本同質(zhì)的本發(fā)明的單克隆抗體的群
7體，以及可藥用的載體或稀釋劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了選擇性結(jié)合成熟的人hepcidin的人工程化 的單克隆抗體，用于治療。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了選擇性結(jié)合成熟的人hepcidin的人工程化 的單克隆抗體，用于在人對(duì)象中治療或預(yù)防貧血。本發(fā)明還涉及選擇性結(jié)合成熟的人h印cidin的人工程化的單克隆抗體的用途， 用于制備藥物。本發(fā)明還涉及選擇性結(jié)合成熟的人h印cidin的人工程化的單克隆抗體在 這樣的方法中的用途，所述方法用于在動(dòng)物中，優(yōu)選的在哺乳動(dòng)物物種中，更優(yōu)選的在人對(duì) 象中增加血清鐵水平、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白和/或血細(xì)胞比容。本發(fā)明還提供了增加血清鐵水平、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白和/或 血細(xì)胞比容的方法，包括向需要其的人對(duì)象施用有效量的結(jié)合成熟的人h印cidin的人工 程化的單克隆抗體。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了在人對(duì)象中治療疾病、病況或病癥的方法，所述 疾病、病況或病癥受益于增加的血清鐵水平、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白和/ 或血細(xì)胞比容，包括但不限于貧血，例如由感染、炎癥、慢性疾病和/或癌癥導(dǎo)致的貧血。本發(fā)明還提供了測(cè)量從哺乳動(dòng)物中獲得的組織或生物學(xué)流體的樣品中的 hepcidin-25的量的方法，所述方法包括步驟(i)從所述哺乳動(dòng)物獲得組織或生物學(xué)流體 的樣品；(ii)使所述樣品與h印cidin-25選擇性抗體或其片段接觸；和(iii)通過(guò)定量、半 定量或定性的方式直接或間接的檢測(cè)所述樣品中的hepcidin-25的量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可用于定量從哺乳動(dòng)物中獲得的組織或生物 學(xué)流體的樣品中的h印cidin-25的量，包括(i)用與包含在SEQ ID NO =USEQ ID N0:3(小 鼠5-25)或SEQ ID NO :2(大鼠5_25)的氨基酸5_25 (含端點(diǎn))中所含的表位結(jié)合的第一種 抗體包被固體支持物；(ii)從所述哺乳動(dòng)物獲得組織或生物學(xué)流體的測(cè)試樣品；(iii)將 測(cè)試樣品應(yīng)用到抗體包被的固體支持物上；(iii)在對(duì)于hepcidin-第一種抗體結(jié)合合適 的條件下，允許任何存在的h印cidin形成h印cidin-第一種抗體復(fù)合體；(iv)去除未結(jié)合 的樣品；(ν)向固體支持物應(yīng)用與在人或嚙齒類hepcidin-25的氨基酸1-7(含端點(diǎn))中所 含的表位(即，分別是DTHFPIC或DTNFPIC)結(jié)合的第二種抗體；(vi)在對(duì)于第二種抗體結(jié) 合任何h印cidin-25-第一種抗體復(fù)合體合適的條件下，允許任何存在的h印cidin-25形成 第二種抗體_h印cidin-25-第一種抗體復(fù)合體；以及(ν)去除未結(jié)合的第二種抗體；(vi) 和檢測(cè)第二種抗體的存在或缺失?？梢灾苯踊蜷g接的檢測(cè)第二種抗體的存在或缺失，并可 以對(duì)其定量、半定量或定性的測(cè)量。
附圖簡(jiǎn)介

圖1描述了用抗h印Cidin-25選擇性Mab 3. 23從人血清中免疫沉淀的人 h印cidin形式的MALDI-T0F質(zhì)譜。信號(hào)1具有與完整的人h印cidin-25 (近似分子量(MW) 為2790道爾頓(Da))預(yù)期質(zhì)量相符的質(zhì)量。信號(hào)2具有與完整的人h印cidin-20 (MW 為2192Da)預(yù)期質(zhì)量相符的質(zhì)量。如色譜顯示，抗h印Cidin-25Mab 3.23與可檢測(cè)的 量的h印cidin-25結(jié)合，并與更少的量的h印cidin-20結(jié)合。Mab 3. 23沒有表現(xiàn)出與 hepcidin-22(MW 2436Da)、h印cidin-24 (MW 2674Da)或原 _h印cidin (MW 6929Da)可檢測(cè)的水平結(jié)合。使用陽(yáng)離子、線性模式方法，在MALDI-T0F質(zhì)譜儀上產(chǎn)生質(zhì)譜，所述方法基本 如下文實(shí)施例6所述，使用α-氰基-4-羥基肉桂酸(肽基質(zhì))作為樣品基質(zhì)。圖2描述了圖1所示質(zhì)譜在相關(guān)區(qū)域(MW 2000-3000Da)中的放大圖像。如色譜 顯示，Mab 3. 23結(jié)合h印cidin-25(信號(hào)1)，且以更低的程度結(jié)合h印cidin-20 (信號(hào)2)。 抗 h印cidin 選擇性 Mab 3. 23 沒有表現(xiàn)出與 h印cidin-22 (MW 2436Da)或 h印cidin-24 (MW 2674Da)可檢測(cè)的水平結(jié)合。圖3描述了用抗h印cidin-25選擇性Mab 5E8從人血清中免疫沉淀的人h印cidin 形式的MALDI-T0F質(zhì)譜。信號(hào)1具有與完整的人h印Cidin-25(2790Da)預(yù)期質(zhì)量相符的質(zhì) 量。如色譜顯示，抗h印Cidin-25Mab 5E8僅與可檢測(cè)的量的h印cidin-25結(jié)合。使用陽(yáng)離 子、線性模式方法，在MALDI-T0F質(zhì)譜儀上產(chǎn)生質(zhì)譜，所述方法基本如下文實(shí)施例6所述，使 用α-氰基-4-羥基肉桂酸(肽基質(zhì))作為樣品基質(zhì)。圖4描述了圖3所示質(zhì)譜在相關(guān)區(qū)域(MW 2000-3000Da)的放大圖像。如色譜顯 示，Mab 5E8結(jié)合可檢測(cè)的量的h印cidin-25 (信號(hào)1)。Mab 5E8沒有結(jié)合可檢測(cè)的水平 的11印(^乜11-20(麗為21920&)、11印(^乜11-22(麗 2436Da)、h印cidin-24 (MW 2674Da)或 原-h印cidin(MW 6929Da)。圖5顯示了通過(guò)梯度稀釋合成的h印cidin_25(實(shí)心圓)產(chǎn)生的h印cidin-25 的校準(zhǔn)曲線的圖，起自10yg/L(10ng/mL)的濃度，并如實(shí)施例8描述的進(jìn)行MSD免疫測(cè) 定。MSD免疫測(cè)定是對(duì)h印cidin-25特異性的，且不識(shí)別h印cidin-20 (實(shí)心三角)或 h印cidin-22 (空心圓)。本文使用下列縮寫ACN:乙腈；BSA:牛血清白蛋白；DTT 二硫蘇糖醇；EDTA 乙 二胺四乙酸；ELISA 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定；IMAC 固定的金屬-親和層析；IPTG 異丙基 β -D-I-硫代半乳糖吡喃糖苷；Mab 單克隆抗體；Mabs 單克隆抗體(復(fù)數(shù))；MALDI-T0F 基質(zhì)相關(guān)的激光解吸離子化飛行時(shí)間；PBS 磷酸緩沖鹽溶液；sra 表面等離振子共振； TFA 三氟乙酸。該公開文本中使用的所有氨基酸縮寫都是美國(guó)專利商標(biāo)局接受的，如37C. F. R. § 1.822(B) (2)中所述。本發(fā)明提供了通過(guò)靶向包含在h印cidin-25的氨基酸1-7 (含端點(diǎn))中的表位，來(lái) 選擇性結(jié)合h印cidin-25的抗體。此類抗體可用于在人中增加血清鐵水平、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì) 數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白和/或血細(xì)胞比容，用于治療疾病、病況或病癥，例如貧血。此外， 本發(fā)明提供了在相對(duì)簡(jiǎn)單但仍高敏感和選擇性免疫測(cè)定中使用此類抗體的方法，用于在哺 乳動(dòng)物組織和生物學(xué)流體中檢測(cè)和/或測(cè)量hepcidin-25。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“hepcidin”指已知存在于哺乳動(dòng)物中的任何形式的 h印cidin蛋白。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“成熟的h印cidin”指在哺乳動(dòng)物中表達(dá)的任何 成熟的、生物活性形式的h印cidin蛋白。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“人h印cidin”指存在于 人中的任何形式的h印cidin蛋白。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“人h印cidin-25”指具有如 SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的成熟形式的人h印cidin?？贵w的一般結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域普遍已知的。對(duì)于IgG類型的抗體，存在通過(guò)鏈內(nèi)和鏈 間二硫鍵交聯(lián)的4條氨基酸鏈(2條“重”鏈和2條“輕”鏈)。當(dāng)在一些生物系統(tǒng)中表達(dá) 時(shí)，具有未修飾的人Fc序列的抗體在Fc區(qū)域是糖基化的?？贵w可以在其它位置也是糖基 化的?？贵w的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)象是本領(lǐng)域普遍已知的。每條重鏈包含N端重鏈可變區(qū)(“HCVR”)和重鏈恒定區(qū)(“HCCR”)。IgG、IgD和IgA的重鏈恒定區(qū)包括3個(gè)結(jié)構(gòu)域(CHl、 CH2和CH3) ；IgM和IgE包括4個(gè)結(jié)構(gòu)域(CHI、CH2、CH3和CH4)。各輕鏈包含輕鏈可變區(qū) (本文中“LCVR”)和輕鏈恒定區(qū)(本文中“LCCR”)。各輕/重鏈對(duì)的可變區(qū)形成抗體結(jié)合位點(diǎn)。HCVR和LCVR區(qū)可以進(jìn)一步細(xì)分為高 變區(qū)，名為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其中散布著更保守的區(qū)域，名為框架區(qū)(FR)。各HCVR和LCVR 包含3個(gè)CDR和4個(gè)FR,從氨基端至羧基端以下列順序排列=FRU CDRU FR2、CDR2、FR3、 ⑶R3、FR4。在本文中，重鏈的3個(gè)⑶R被稱為“⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3”，而輕鏈的3個(gè)CDR 被稱為“⑶RL1、⑶RL2和⑶RLH3”。⑶R含有與抗原形成特異性相互作用的大部分殘基。根 據(jù)普遍已知的常規(guī)安排每個(gè)結(jié)構(gòu)域的氨基酸(例如，Kabat，“Sequences of Proteins of Immunological Interest，，，National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。本發(fā)明的抗體可以具有選自任何免疫球蛋白類別(IgA、IgD、IgG、IgM和IgE)的 重鏈恒定區(qū)。優(yōu)選的，本發(fā)明的抗體含有源自人或小鼠IgGFc區(qū)的恒定區(qū)。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指源自單拷貝或克隆的抗體，包括例如任何真核的、原核的或 噬菌體克隆，而不指生產(chǎn)抗體的方法。優(yōu)選的，本發(fā)明的單克隆抗體以同質(zhì)的或基本同質(zhì)的 群體存在。本發(fā)明的抗體可以是完整的，即包括完整的或全長(zhǎng)的恒定區(qū)(包括Fc區(qū))，或者 是此類抗體的部分或片段，只要任何縮短的形式包含抗原結(jié)合部分且保留了抗原結(jié)合能 力。此類縮短的形式包括例如Fab片段、Fab’片段或F(ab’)2片段，所述片段包括所公開 的抗h印cidin-25選擇性抗體的⑶R或可變區(qū)。此外，此類縮短的抗體形式可以是單鏈 Fv片段，所述片段可以通過(guò)將編碼LCVR和HCVR的DNA與接頭序列連接來(lái)生產(chǎn)。(參見， Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore 編著，Springer-Verlag，New York，第269-315頁(yè)，1994)。不論是否說(shuō)明了片段或部分，除 非另外指出，本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”包括此類片段或部分以及單鏈形式。只要蛋白質(zhì)部分 或蛋白質(zhì)片段保留了選擇性結(jié)合h印cidin-25且在體內(nèi)或體外中和一種或多種哺乳動(dòng)物 hepcidin-25的生物活性特征的能力，它就包含在術(shù)語(yǔ)“抗體”中?？梢允褂帽绢I(lǐng)域普遍已知的技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的抗體，例如重組技術(shù)、噬菌體展示 技術(shù)、合成技術(shù)或此類技術(shù)的組合，或本領(lǐng)域容易已知的其它技術(shù)(參見例如，Jayasena, S. D. , Clin. Chem.，45 1628-50 (1999)和 Fellouse, F. A.等人，J. Mol. Biol. ,373(4) 924-40(2007))。下表1和2描述了用于本發(fā)明抗體的優(yōu)選的⑶R。表 權(quán)利要求
1.單克隆抗體，如通過(guò)25°c下Sra所確定的，所述抗體以在約50nM和約SOOpM之間的 Kd結(jié)合由SEQ ID NO 1顯示的氨基酸序列組成的人h印cidin_25。
2.權(quán)利要求1的抗體，其中如通過(guò)25°C下Sra所確定的，所述抗體以下述Kd結(jié)合 原-h印cidin和人h印cidin-20，其中所述Kd比抗體結(jié)合人h印cidin-25的Kd至少高約10倍。
3.權(quán)利要求1的抗體，其中如通過(guò)25°C下Sra所確定的，所述抗體以下述Kd結(jié)合 原-h印cidin和人h印cidin-20，其中所述Kd比抗體結(jié)合人h印cidin-25的Kd至少高50倍。
4.權(quán)利要求1的抗體，其中如通過(guò)25°C下Sra所確定的，所述抗體以下述Kd結(jié)合 原-h印cidin和人h印cidin-20，其中所述Kd比抗體結(jié)合人h印cidin-25的Kd至少高100倍。
5 權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)的抗體，其中如通過(guò)25°C下SI3R所確定的，所述抗體結(jié)合人 hepcidin-22 的 Kd 大于約 200nM。
6.權(quán)利要求1-5的任一項(xiàng)的抗體，如通過(guò)25°C下SI3R所確定的，所述抗體還以下述Kd 結(jié)合小鼠和/或大鼠h印cidin-25 (分別是SEQ ID NO :3或4)，所述Kd低于約500nM。
7.權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)的抗體，其包括選自以下的6個(gè)⑶R⑴分別具有SEQ ID NOs :9、10、11、32、33和；34所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(ii)分別具有SEQID NOs :12、13、14、35、36和37所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(iii)分別具有SEQ ID NOs :45、13、14、35、36和 37所示的氨基酸序列的 LCDI 1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(iv)分別具有SEQID NOs :12、13、14、38、36和37所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3；(ν)分別具有SEQ ID NOs :15、10、16、39、40和41所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3；(vi)分別具有SEQID NOs :20、21、22、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(vii)分別具有SEQID NOs :20、21、23、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(viii)分別具有SEQID NOs :24、25、23、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、 LCDR2、LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(ix)分別具有SEQID NOs J6、25、27、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；禾口(χ)分別具有SEQ ID NOs J6、25J8、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3。
8.選擇性結(jié)合h印cidin-25的單克隆抗體，其包括選自以下的6個(gè)⑶R⑴分別具有SEQ ID而8:9、10、11、32、33和；34所示的氨基酸序列的^1 1、1^0)1 2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(ii)分別具有SEQID NOs :12、13、14、35、36和37所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3；(iii)分別具有SEQID NOs :45、13、14、35、36和37所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(iv)分別具有SEQID NOs :12、13、14、38、36和37所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(ν)分別具有SEQ ID NOs :15、10、16、39、40和41所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(vi)分別具有SEQID NOs :20、21、22、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(vii)分別具有SEQID NOs :20、21、23、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(viii)分別具有SEQID NOs :M、25、23、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、 LCDR2、LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(ix)分別具有SEQID NOs :26、25、27、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；禾口(χ)分別具有SEQ ID NOs :26,25,28,42,43和44所示的氨基酸序列的LCDRl、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3。
9.權(quán)利要求1-8的任一項(xiàng)的抗體，其是人工程化的單克隆抗體。
10.權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的抗體，其中單克隆抗體是片段。
11.單克隆抗體，所述抗體包括輕鏈可變區(qū)(LCVI )多肽和重鏈可變區(qū)(HCVI )多肽，其中(i)LCVR和HCVR多肽分別具有如SEQID NOs 48和49顯示的氨基酸序列；(ii)LCVR和HCVR多肽分別具有如SEQID NOs 50和51顯示的氨基酸序列；(iii)LCVR和HCVR多肽分別具有如SEQ ID NOs 52和51顯示的氨基酸序列；(iv)LCVR和HCVR多肽分別具有如SEQ ID NOs 53和M顯示的氨基酸序列；(v)LCVR和HCVR多肽分別具有如SEQID NOs 55和56顯示的氨基酸序列；(vi)LCVR和HCVR多肽分別具有如SEQID NOs 59和58顯示的氨基酸序列；(vii)LCVR和HCVR多肽分別具有如SEQID NOs 60和58顯示的氨基酸序列；(viii)LCVR和HCVR多肽分別具有如SEQID NOs 61和58顯示的氨基酸序列；(ix)LCVR和HCVR多肽分別具有如SEQ ID NOs 62和58顯示的氨基酸序列；或(x)LCVR和HCVR分別具有如SEQID NOs 63和58顯示的氨基酸序列。
12.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-11的任一項(xiàng)的抗體組合一種或多種可藥用的載 體、稀釋劑或賦形劑。
13.權(quán)利要求1-11的任一項(xiàng)的抗體用于治療中的用途。
14.權(quán)利要求1-11的任一項(xiàng)的抗體在制備治療貧血的藥物中的用途。
15.權(quán)利要求1-11的任一項(xiàng)的單克隆抗體，其用于在人對(duì)象中增加血清鐵水平、網(wǎng)織 紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白和/或血細(xì)胞比容的方法中。
16.權(quán)利要求1-11的任一項(xiàng)的抗體在制備在人對(duì)象中增加血清鐵水平、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白和/或血細(xì)胞比容的藥物中的用途。
17.權(quán)利要求1-11的任一項(xiàng)的抗體，其用于在人對(duì)象中增加血清鐵水平、網(wǎng)織紅細(xì)胞 計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白和/或血細(xì)胞比容的方法中。
18.增加血清鐵水平、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白和/或血細(xì)胞比容的方 法，其包括向人對(duì)象施用有效量的權(quán)利要求1-11的任一項(xiàng)的抗體。
19.在需要其的人對(duì)象中治療貧血的方法，其包括向人對(duì)象施用有效量的權(quán)利要求 1-11的任一項(xiàng)的抗體。
20.測(cè)量組織或生物學(xué)流體的樣品中的hepcidin-25的量的方法，所述方法包括步驟(i)獲得組織或生物學(xué)流體的樣品；(ii)使樣品與抗體或其片段接觸，如通過(guò)25°c下sra所確定的，所述抗體或其片段以 在約50nM和約800pM之間的Kd與包含在SEQ IDNO 1的氨基酸1_7 (含端點(diǎn))中所含的表 位結(jié)合，并以至少高約10倍的Kd與原-h印cidin和人h印cidin-20結(jié)合；和(iii)定量、半定量或定性的檢測(cè)所述樣品中與抗體或片段結(jié)合的hepcidin-25的量。
21.權(quán)利要求20的方法，其中如通過(guò)25°C下Sra所確定的，抗體或抗體片段進(jìn)一步以 大于約200nM的KD結(jié)合人h印cidin_22。
22.定量組織或生物學(xué)流體的樣品中的h印cidin-25蛋白質(zhì)的量的方法，其包括(i)用與(a)包含在SEQID NO=I的氨基酸1_7(含端點(diǎn))中所含的表位，或(b)包含 在SEQ ID N0:1的氨基酸5-25(含端點(diǎn))中所含的表位結(jié)合的第一種抗體包被固體支持 物；( )將樣品應(yīng)用到所述抗體包被的固體支持物上；(iii)去除未結(jié)合的樣品；(iv)如果第一種抗體結(jié)合表位(a)，則向固體支持物應(yīng)用與表位(b)結(jié)合的第二種抗 體，或者如果第一種抗體結(jié)合表位(b)，則向固體支持物應(yīng)用與表位(a)結(jié)合的第二種抗 體；(ν)去除未結(jié)合的第二種抗體；和(vi)定量、半定量或定性的檢測(cè)所述樣品中與第二種抗體結(jié)合的hepcidin-25的量。
23.權(quán)利要求22的方法，其中結(jié)合表位(a)的抗體進(jìn)一步包括選自以下的6個(gè)CDR⑴分別具有SEQ ID NOs :20、21、22、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(ii)分別具有SEQID NOs :20、21、23、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3；(iii)分別具有SEQID NOs :24、25、23、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(iv)分別具有SEQID NOs :26、25、27、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(ν)分別具有SEQ ID NOs J6、25J8、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3。
24.權(quán)利要求22-23的任一項(xiàng)的方法，其中結(jié)合表位(a)的抗體包括選自以下的LCVR 禾口 HCVR ⑴分別具有如SEQ ID NOs 59和58顯示的氨基酸序列的LCVR和HCVR ；(ii)分別具有如SEQID NOs 60和58顯示的氨基酸序列的LCVR和HCVR ；(iii)分別具有如SEQID NOs 61和58顯示的氨基酸序列的LCVR和HCVR ；(iv)分別具有如SEQID NOs 62和58顯示的氨基酸序列的LCVR和HCVR ； (ν)分別具有如SEQ ID NOs 63和58顯示的氨基酸序列的LCVR和HCVR。
25.權(quán)利要求22-M的任一項(xiàng)的方法，其中結(jié)合表位(a)的抗體選自Mab5E8、Mab 0B1、 Mab 0B3、Mab 0H4 禾口 Mab OE1。
26.權(quán)利要求22-25的任一項(xiàng)的方法，其中結(jié)合表位(b)的抗體包括具有如SEQID NOs 82和83顯示的氨基酸序列的LCVR和HCVR。
27.權(quán)利要求22-25的任一項(xiàng)的方法，其中結(jié)合表位(b)的抗體包括具有如SEQID NOs 84和85顯示的氨基酸序列的LCVR和HCVR。
28.權(quán)利要求22-27的任一項(xiàng)的方法，其中僅第一種或第二種抗體用可檢測(cè)的部分標(biāo)記。
29.權(quán)利要求20-28的任一項(xiàng)的方法，其中所述檢測(cè)是間接的。
30.權(quán)利要求20-29的任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品是血液、血漿、血清、尿、腦脊液 (CSF)、羊膜液、唾液、汗、腹水(ascite fluid)、淋巴、囊液(cyst fluid)、乳汁、創(chuàng)傷滲液 (wound fluid)或源自上述的，且其中所述樣品在酶免疫測(cè)定(EIA)、ELISA、夾心ELISA測(cè) 定、放射性免疫測(cè)定、沉淀反應(yīng)或熒光免疫測(cè)定中與所述抗體或其片段相接觸。
31.用于檢測(cè)或定量hepcidin-25的試劑盒，其包括權(quán)利要求1_11的任一項(xiàng)的抗體。
全文摘要
提供了與人hepcidin-25的N端結(jié)合的單克隆抗體，特征是具有對(duì)多肽的高親和力和選擇性。本發(fā)明的抗體可用于在人中增加血清鐵水平、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白和/或血細(xì)胞比容，和用于在人對(duì)象中治療多種病癥，例如貧血。本發(fā)明的抗體還可用作分析工具，例如在夾心ELISA中。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102112489SQ200980129864
公開日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2009年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月6日
發(fā)明者D·D·M·梁, D·R·威徹, P·P·亞齊, 唐鷹, 欒鵬 申請(qǐng)人:伊萊利利公司