專利名稱：Peg化的重組人生長激素化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物組合物，該藥物組合物包含適合的藥物賦形劑并且還包含臨床 有效量的重組人生長激素(rhGH)PEG化的前藥，其比可獲得的人生長激素產(chǎn)品可以更少 頻率地施用，并且可能不引起注射副作用脂肪萎縮。本發(fā)明還涉及此類前藥。
背景技術(shù)：
生長激素(GH)是在人和其它動物中刺激生長和細胞繁殖的激素。其是191個 氨基酸、單鏈多肽激素，其是前葉垂體側(cè)翼中促生長素細胞合成、貯存并且分泌的。當 涉及重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的生長激素時，該激素也稱為促生長素并且縮寫為“rhGh”。生長激素在體內(nèi)具有多種功能，最顯著的功能是增加兒童期的身高，并且數(shù)種 疾病可以通過GH的治療應(yīng)用來治療。生長激素缺乏的作用取決于他們發(fā)生的年齡而不同。在兒童期，生長不足和身 材矮小癥是GH缺乏的主要現(xiàn)象。其還可能引起性不成熟。在成年期，缺乏的作用更加 明顯，并且可能包括力量、精力和骨量的不足，以及心血管風(fēng)險的增加。GH缺乏存在很多原因，包括特定基因的突變、涉及下丘腦和/或垂體的先天畸 形，以及損傷、手術(shù)或疾病引起的垂體損害。缺乏是通過補充外源GH來治療的。在目前應(yīng)用中的所有GH是生物合成的人 GH,通過重組DNA技術(shù)制備。在兒童期發(fā)作(在完成生長期后)或成人發(fā)作(通常是 后天垂體腫瘤的結(jié)果)的GH缺乏的兒童和成年人中，GH用作替代治療。在這些患者 中，優(yōu)勢包括減少脂肪量、增加瘦肉量、增加骨密度、改善脂質(zhì)分布、減少心血管風(fēng)險 因素和改善心理社會健康。Genentech Inc (US)第一個克隆了 rhGH，并且其描述于專利 EP-B22242 中。2006年，在美國和歐洲(以及它們的生產(chǎn)商)可獲得的合成的生長激素包括 Nutropin (Genentech)、 Humatrope (Eli Lilly)、 Genotropin (Pfizer)、 Norditropin (Novo Nordisk)、Saizen (Merck Serono)禾口 Omnitrope (Sandoz)。盡管分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)顯著地增加了很多蛋白質(zhì)和/或多肽(下文稱為蛋白 質(zhì))的利用度，但是所述蛋白質(zhì)的治療用途時常受到其它因素的阻礙，例如由于腎和受 體介導(dǎo)的清除引起的短的血漿半衰期、聚集、蛋白質(zhì)降解、較差的生物利用度和物理性 質(zhì)(預(yù)先排除有效的制劑)。增加蛋白質(zhì)利用度的原理是通過將蛋白質(zhì)與衍生化的化合物的綴合，所述的衍 生的化合物包括但不限于聚乙二醇和聚丙二醇。公認的某些優(yōu)點包括降低免疫原性 和抗原性，增加作用持續(xù)時間和改變藥物動力學(xué)性質(zhì)。[Veronese，F(xiàn).M. "Enzymes for Human Therapy Surface StructureModifications (用于人類治療的酶表面結(jié)構(gòu)修飾)”， Chimica Oggi, 7 53-56 (1989)](本文參考文獻 5)。對于醫(yī)學(xué)用途，通過PEG化的rhGH可能通過增加其體內(nèi)半衰期(從而實現(xiàn)劑量 減少或給藥頻率降低)、改善其穩(wěn)定性和降低其抗原性或它們的組合來改善分子特性。
通常，對分子進行該類型的修飾是本領(lǐng)域眾所周知的并且專利文獻中可獲得很 多專利，這些專利描述了這種概念。例如EP-B 1196443中描述了 Hoftnann La Roche的 PEG化的促紅細胞生成素(EPO)，其要求包含與EPO共價鍵合的PEG的特別的連接體， 在Nektar/La Roche公司的EP-B975369中描述了 PEG化的干擾素α，并且在Hoftnann La Roche公司的EP-B 1562634中描述了另一種PEG化的干擾素α。rhGH的體內(nèi)清除被認為是通過下面兩種機理發(fā)生的。第一種是腎清除，其中 rhGH是從循環(huán)中通過腎小球過濾清除的。rhGH的腎清除已被很好地證明，并且因此 合成的rhGH的PEG化是解決該問題的一個明顯的選擇。腎清除占rhGH總清除的約 25-53% (Girard，J.Mehls，O.J.Clin.Invest.1994 年 3 月；93(3) 1163-1171，本文參考文 獻3) ο第二種機理是肝清除(肝臟)。GH的肝攝取是通過溶酶體降解后的受體介導(dǎo)的 胞吞作用而發(fā)生的。第三種機理是在其它組織(例如軟骨的軟骨細胞)中的受體介導(dǎo)的清除。通過 PEG化降低GH對GH受體的結(jié)合親和力，從而減少受體介導(dǎo)的清除。但是，對于施用rhGH存在特有的問題。皮下施用rhGH的一個主要缺點是在接 受治療的患者中發(fā)生脂肪萎縮。脂肪萎縮是用于脂肪組織局部丟失的醫(yī)學(xué)術(shù)語。皮下施用rhGH制劑已經(jīng)出現(xiàn)脂 肪萎縮問題，其被認為是由注射部位局部高濃度的生長激素復(fù)合物引起的。Bayakgebiz A.等人在 J.Pediatr.Endocrinol.Metab，1999 年 1-2 月；12(1) 95-7 中描述了此類醫(yī)學(xué)記錄(本文參考文獻1)。這是一個由于6.7kb基因缺失引起單獨GH 缺乏的患者的記錄，該患者接受高劑量rhGH治療并且在治療6年后在注射部位發(fā)生了局 部脂肪萎縮，而沒有任何抗體檢測。人們懷疑脂肪萎縮的病因?qū)W是高劑量rhGH的直接脂 解作用。與施用rhGh相關(guān)的脂肪萎縮被認為是由于rhGH活性本身、更高濃度和延長的 暴露引起的。這些更高濃度發(fā)生在注射部位附近。在rhGH被PEG化的情況中，由于增加停留時間，高生長激素活性在注射部位附 近聚集的機會甚至更高。在PEG化的rhGH制劑的情況中，組織將經(jīng)歷持續(xù)并且增加暴 露于生長激素活性，這是由于這樣一個事實PEG化的綴合物具有藥理學(xué)活性所需的活 性，并且綴合物由于綴合物的大小而擴散有限。結(jié)果是增加了注射部位的脂解作用。WO-A 2005/079838描述了 PEG化的hGH，其中hGH部分通過氨基官能團連 接至聚乙二醇聚合物上，由于氨基的穩(wěn)定性，其可以認為是永久的結(jié)合。此類PEG化的 hGH化合物的實例(其出現(xiàn)脂肪萎縮)是化合物PHA-794428?；衔颬HA-794428是 PEG化的rhGH，并且還在Pharmacia公司(被Pfizer獲得)的W0_A 2005/079838中描 述，并且進一步在 Horm.Res.2006 ； 65 (增刊 4): 1-213，CF1-98GH/IGF Treatment with title "Firstin-human study of PEGylated recombinant human growth hormone”(題為"PEG 化的重組人生長激素的首次在人類中的研究”的CF1-98GH/IGF治療)，Philip Harris等 人(本文參考文獻4)中描述。根據(jù)www.clinicaltrials.gov上公開的臨床試驗信息，該試驗于2007年12月10日
結(jié)束。Pfizer決定終止該計劃是由于在2期臨床研究中在單獨注射PHA 794428后報道注射部位脂肪萎縮的病例。WO-A 2006/102659 (Nektar)也描述并且提出了通過酰胺鍵形成的rhGH_PEG綴 合物(線性和分支類型)。在WO-A 2006/102659中所解決的問題描述于第2頁第
段。根據(jù)該申請人，所解決的問題是減少給藥頻率。因為rhGH治療典型地需要每天注 射，患者特別是兒科患者不喜歡這種不便和與該治療有關(guān)的不適。Nektar的WO-A中描 述的方案是提供新的PEG-rhGH綴合物。在W0-A
的表6中，可以看出與沒有PEG的天然生長激素相比， PEG-rhGH綴合物具有相對低的體外活性。盡管低的體外活性，PEG化的rhGH綴合物 在體內(nèi)被活化。與閱讀部分
相關(guān)“盡管初步的體外結(jié)果表明增加與hGH連接 的PEG的量降低其刺激hGH受體的能力，基于初步的體內(nèi)結(jié)果，其表明生物活性的降低 超出增加半衰期和/或血漿利用度的平衡，因此得到一個結(jié)論當在相同的給藥方案中 與未修飾的rhGH相比，本文提供的綴合物具有優(yōu)良的藥效學(xué)作用”。WO-A 2006/102659 (Nektar)沒有描述可自動裂解的連接體_即簡單觀察到 PEG-rhGH綴合物在體內(nèi)被活化，盡管它們的體外活性顯著降低。脂肪萎縮的問題沒有 解決。為了實現(xiàn)將所需的性質(zhì)(降低脂肪萎縮和減少注射頻率)設(shè)計到hGH的PEG化 的綴合物中，一種解決方法是應(yīng)用前藥方法。前藥是在表現(xiàn)其藥理學(xué)作用前經(jīng)受生物轉(zhuǎn) 化的任何化合物。因此，前藥可以被視為是包含特別的無毒保護基的藥物，這些保護基 是以暫時(transient)的方式用于改變或消除母體分子中不希望的性質(zhì)。在這種情況下， 聚合物載體將暫時降低生長激素的活性，從而減少組織脂解作用的可能性。同時暫時綴 合至聚合物載體上將延長綴合物的半衰期，從而提供長效遞送的hGH。文獻中描述了很多大分子前藥，其中大分子載體是通過不穩(wěn)定的酯基連接至藥 物上的(例如 Y.Luo，MR Ziebell，GD Prestwich，"A HyaluronicAcid-Taxol Antitumor Bioconjugate Targeted to Cancer Cells (靶向癌細胞的透明質(zhì)酸-紫杉醇抗腫瘤生物綴合 物)”，Biomacromolecules 2000，1，208-218 ； J Cheng 等人，Synthesis of Linear， beta-Cyclodextrin BasedPolymers and Their Camptothecin Conjugates (基于線性 β -環(huán)糊精 的聚合物和它們的喜樹堿綴合物的合成)，Bioconjugate Chem.2003, 14，1007-1017 ； R.Bhatt 等人，Synthesis and in Vivo Antitumor Activity ofPoly (L-glutamic acid) Conjugates of 20 (S)-Campththecin(20 (S)-喜樹堿的聚(L_谷氨酸)綴合物的合成與體內(nèi)抗腫瘤活性)， J.Med.Chem.2003, 46，190-193 ； R.B.Greenwald, A.Pendri, C.D.Conover, H.Zhao, Y.H.Choe, A.Martinez, K.Shum, S.Guan, J.Med.Chem.，1999，42，3657-3667 ； B.Testa, J.M Mayer, Hydrolysis in Drag and Prodrug Metabolism (藥物和前藥代謝中的水 解)，Wiley-VCH, 2003，第8章)。在這些情況中，生物活性實體的綴合的官能團是羥 基或羧酸。特別是對于生物大分子但也對于小分子聚合物前藥，希望將大分子載體連接至 生物活性實體的氨基(即N-末端或蛋白質(zhì)的賴氨酸氨基)上。這將是一種情況，如果掩 蔽藥物生物活性需要綴合生物活性實體的某個氨基，例如位于受體結(jié)合中涉及的活性中 心或區(qū)域或表位的氨基。同時，在制備前藥的過程中，氨基可能是更具有化學(xué)選擇性并 且用作綴合載體和藥物的更好的柄，因為它們比羥基或酚基具有更大的親核性。對于可能包含大量不同反應(yīng)官能度的蛋白質(zhì)而言，這特別正確。在這種情況中，無選擇性的綴 合反應(yīng)引起不希望的產(chǎn)物混合物，其需要廣泛的表征或純化并且可能降低反應(yīng)產(chǎn)率和產(chǎn) 品的治療功效。前藥活化可以通過酶或非酶裂解載體和藥物分子間的不穩(wěn)定橋來實現(xiàn)，或兩者 的連續(xù)組合，即酶解步驟之后進行非酶重排。在WO-A 2005/099768中描述了含有自動裂解的連接體的PEG化的連接體分 子，用于大量的生物分子，包括促生長素(權(quán)利要求6)。在W0-A2005/099768中，所解 決的問題是患者間的變異性，以及當涉及酶解機理時，前藥活化的不可預(yù)知的作用(第 12頁，第17-30行)。該申請描述了作為一種解決方法的芳族連接體，其可以基于PEG。 該連接體-PEG以顯著降低藥物活性的方式與藥物結(jié)合。只有在釋放藥物時它才被活化， 其是通過水解開始的。水解速率可以以化學(xué)方法來控制。對于GH和相關(guān)問題、例如脂 肪萎縮沒有具體強調(diào)。綜上所述，以上提及的引文均沒有描述基于前藥綴合物來開發(fā)長效rhGH的方 法，所述的綴合物可以更少頻率地施用而不增加脂肪萎縮的頻率。因此，本發(fā)明的目的是提供前藥或包含所述前藥的藥物組合物，應(yīng)用與rhGH綴 合的PEG減少施用頻率而不顯著誘導(dǎo)脂肪萎縮。發(fā)明_既述因此，本發(fā)明提供了藥物組合物，該藥物組合物包含適合的藥物賦形劑并且還 包含人體內(nèi)臨床有效量的重組人生長激素rhGH PEG化的前藥綴合物，其中PEG通過自 身可水解的(自動裂解的)暫時連接體與rhGH連接；所述的前藥綴合物的特征在于(1)綴合物的GH活性小于不含PEG的天然生長激素的5% ；和(2)連接體自動水解速率是體內(nèi)半衰期為10小時至600小時的速率。性質(zhì)(1)確保前藥具有低的脂肪萎縮發(fā)病率，盡管具有顯著延長的體內(nèi)作用時 間。不受理論限制，本發(fā)明人認為如果前藥具有更高的GH活性，該產(chǎn)品將仍會以比目 前市售的rhGH產(chǎn)品更高的頻率誘導(dǎo)脂肪萎縮。性質(zhì)⑵確保rhGH(不含PEG)隨時間逐漸釋放，從而可以施用比人生長激素更 少頻率的rhGH藥物產(chǎn)品，例如僅每周一次或每月一次代替每天施用，而與rhGH相比仍 能保持全部功效。優(yōu)選的是，體內(nèi)半衰期比相應(yīng)的hGH PEG化的前藥綴合物的體外半衰期短至多 5倍，例如2、3、4或5倍。更優(yōu)選的是，體內(nèi)半衰期比相應(yīng)的hGH PEG化的前藥綴合 物的體外半衰期短至多3倍。最優(yōu)選的是，體內(nèi)半衰期比相應(yīng)的hGH PEG化的前藥綴合 物的體外半衰期短至多2倍或幾乎相同。本發(fā)明應(yīng)用于rhGH PEG化的前藥，特別是rhGH PEG化的載體前藥，包括級聯(lián)
載體前藥。前藥可以定義為本身沒有活性但是可預(yù)計轉(zhuǎn)化為活性代謝物的治療藥物(參見 B.Testa, J.M Mayer Hydrolysis in Drag and Prodrug Metabolism (藥物和前藥代謝中的水 解)，Wiley-VCH, 2003，第4頁)。在載體前藥系統(tǒng)中，當聚合物共價綴合至藥物分子 時，很多藥物是沒有活性的或表現(xiàn)出降低的生物活性。在這些情況中，應(yīng)用藥物和載體 間暫時的連接，在這種方式中，藥物在體內(nèi)從聚合物載體上釋放以恢復(fù)其生物活性。如果需要緩慢或可控釋放藥物，與釋放的藥物相比，降低生物活性的前藥具有優(yōu)勢。在該 情況中，可以施用相對大量的前藥而沒有伴隨的副作用和過量給藥的風(fēng)險。藥物釋放是 隨時間發(fā)生的，從而減少重復(fù)且頻繁施用藥物的需要。在聚合物載體的前藥中，生物活性部分通常是通過載體部分和藥物分子的官能 團之間形成的不穩(wěn)定的橋連接到聚合物載體部分的。載體前藥的裂解產(chǎn)生增加生物活 性的分子實體(藥物)和至少一種副產(chǎn)物，載體。該副產(chǎn)物可以是生物惰性的(例如 PEG)。裂解后，生物活性實體將露出至少一個之前綴合而掩蔽或保護的官能團，并且該 基團的存在典型地有助于生物活性。GH活性可以應(yīng)用本領(lǐng)域已知的方法來測量。在這個方面，強調(diào)實施例1。基于 這樣一個事實可用于本發(fā)明的某些暫時連接體可以具有小于3000小時的體外半衰期， 各自GH活性測量是通過測量包含替代暫時連接體的永久連接體的各自PEG綴合物的GH 活性來間接進行的。其可以如WO 2006102659第74頁第0240段描述的那樣進行，本 文描述的rhGH和綴合物的生物活性將應(yīng)用NB2-II大鼠淋巴瘤細胞增殖分析進行體外評 價。簡而言之，將衍生自大鼠淋巴瘤的NB2-II細胞與rhGH溫育，其引起rhGH分子與 細胞表面的受體結(jié)合。受體結(jié)合誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)，從而引起細胞增殖。分析結(jié)果是基 于測定的蛋白質(zhì)濃度和未修飾的rhGH的100%生物活性。優(yōu)選的是，對于測量GH活性，應(yīng)用實施例24中描述的方案。體外半衰期可以應(yīng)用本領(lǐng)域已知的方法來測量。在這個方面，強調(diào)實施例2。因此，本發(fā)明的第二方面涉及臨床有效量的包含第一方面的rhGHPEG化的前藥 的藥物組合物，其用于治療人GH相關(guān)疾病的方法中。第二方面可以選擇性地描述為治療人GH相關(guān)疾病的方法，該方法包括給人施用 臨床有效量的包含第一方面的rhGH PEG化的前藥的藥物組合物。在一種情況中，其中與天然的人GH相比，前藥的剩余活性(對于暫時PEG綴 合的rhGH的情況)被顯著降低，脂解作用可能不會發(fā)生，甚至在延長暴露時。本文描述稱為rhGH PEG化的前藥的化合物是綴合物，其與人GH相比具有顯著 降低的剩余活性。為了顯示治療有用的活性，rhGH必須從前藥綴合物中釋放，對于這一 點，本文描述的前藥需要經(jīng)歷活化步驟(例如1，6-釋放機理)，本文稱為自動裂解，將 PEG基團從藥物中裂解。1，6-釋放機理在WO-A 2005/099768中有很好的描述。不受理論的限制，本發(fā)明人認為本文公開的暫時PEG化的rhGH綴合物顯著減少 了脂肪萎縮，因為在PEG通過可自動裂解的連接體逐漸裂解之前，PEG化的rhGH綴合 物具有低活性。這可以確保前藥不會比人GH或上述的其它永久PEG化的rhGH化合物 更頻繁地誘導(dǎo)脂肪萎縮。本發(fā)明潛在的問題也是通過包含適合的藥物賦形劑并且還包含式(AA)的人生長 激素ChGH)的前藥綴合物的藥物組合物來解決的hGH-NH-La-S° (AA)其中hGH-NH 表示 hGH 殘基；La表示官能團，其是通過自動裂解誘導(dǎo)基團Ga而自身可水解的(可自動裂解)； 并且
S°是聚合物鏈，其分子量為至少5kDa并且包含至少第一個分支結(jié)構(gòu)BS1，至少 第一個分支結(jié)構(gòu)BS1包含至少第二條分子量為至少4kDa的聚合物鏈S1，其中S°、BS1、 S1中至少一個進一步包含自動裂解誘導(dǎo)基團G%并且其中分支結(jié)構(gòu)BS1進一步包含至少 第三條分子量為至少4kDa的聚合物鏈S2，或者S°、S1中至少一個包含至少第二個分支 結(jié)構(gòu)BS2，所述的BS2包含至少第三條分子量為至少4kDa的聚合物鏈S2，并且其中不含 hGH-NH的前藥綴合物的分子量為至少25kDa并且最大lOOOkDa、優(yōu)選至少25kDa并且 最大500kDa、甚至更優(yōu)選至少30kDa并且最大250kDa、甚至更優(yōu)選至少30kDa并且最 大120kDa、甚至更優(yōu)選至少40kDa并且最大lOOkDa、甚至更優(yōu)選至少40kDa并且最大 90kDa。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過提供具有某最小長度(如它們分子量所定義的)的至少3 條鏈的聚合物載體，本發(fā)明的前藥的剩余活性可以被有效地降低，從而與本文描述的暫 時連接體組合解決了提供hGH前藥的問題，其可以更少頻率地施用并且沒有增加脂肪萎 縮的風(fēng)險。因此，前藥應(yīng)當是水溶性的。對于至少雙_綴合的前藥，問題可以通過包含適合的藥物賦形劑并且還包含式 (AB)的人生長激素ChGH)的前藥綴合物的藥物組合物來解決hGH-(NH-L-S0)n (AB)其中η 是 2、3 或 4;優(yōu)選 2;
hGH (-NH) n 表示 hGH 殘基；L各自獨立地是永久官能團Lp或官能團ΙΛ其是通過自動裂解誘導(dǎo)基團Ga而自 身可水解的(可自動裂解)；并且S°各自獨立地是分子量為至少5kDa的聚合物鏈，其中S°任選是分支的，包含至 少第一個分支結(jié)構(gòu)BS1，至少第一個分支結(jié)構(gòu)BS1包含至少第二條分子量為至少4kDa的 聚合物鏈S1，其中S°、BS1、S1中至少一個進一步包含自動裂解誘導(dǎo)基團G%并且其中 不含hGH-NH的前藥綴合物的分子量為至少25kDa并且最大lOOOkDa、優(yōu)選至少25kDa 并且最大500kDa、甚至更優(yōu)選至少30kDa并且最大250kDa、甚至更優(yōu)選至少30kDa并且 最大120kDa、甚至更優(yōu)選至少40kDa并且最大lOOkDa、甚至更優(yōu)選至少40kDa并且最大 90kDa。本發(fā)明的另一方面是以上定義的前藥綴合物。本發(fā)明優(yōu)選的實施方案在下面僅通過實施例描述。定義在討論本發(fā)明詳述的實施方案之前，提供關(guān)于本發(fā)明主要方面的特別術(shù)語的定 義。通常，本文所用的所有特別的技術(shù)術(shù)語應(yīng)當被理解為技術(shù)人員將在本技術(shù)背景 中理解它們。rhGH或hGH或GH或hGH殘基指的是人生長激素。NH_hGH是hGH殘基， 其中-NH-hGH的-NH-表示hGH的氨基。本文的術(shù)語“活性”應(yīng)當被理解為生長激素或其綴合物當施用于哺乳動物、 例如在體內(nèi)模型中誘發(fā)生物學(xué)響應(yīng)或在實施例描述的體外模型中產(chǎn)生可測量的響應(yīng)的能力。在前藥系統(tǒng)中，測量的活性將具有兩個貢獻，一個來自釋放的游離藥物實體， 并且另一個來自仍未裂解的前藥綴合物。為了區(qū)分前藥綴合物的活性，本文的術(shù)語“剩 余活性”應(yīng)當被理解為可歸于前藥綴合物的測量的前藥活性的部分。本文的術(shù)語“自動裂解”應(yīng)當被理解為暫時連接體和藥物分子rhGH之間的鍵 在水性緩沖溶液中在pH 7.4和37°C的生理條件下限速的水解裂解。自動裂解不需要存在 酶。該自動裂解或自身水解是提供自動裂解誘導(dǎo)基團控制的，所述的基團是前藥分子的 部分。該自動裂解誘導(dǎo)基團可以以本身存在或者以掩蔽形式存在，以便在自身水解機制 啟動前需要暴露。連接體自動水解速率指的是hGH-PEG化的前藥在體內(nèi)的裂解速率。由于酶或 其它作用幾乎經(jīng)常引起前藥連接體體內(nèi)水解比體外進行更快，如果前藥的體內(nèi)半衰期比 相應(yīng)的hGH PEG化的前藥綴合物的體外半衰期短至多5倍，那么將其定義為hGH PEG前 藥以自動水解方式裂解。本文的術(shù)語“暫時連接”或“暫時連接體”應(yīng)當被理解為描述rhGH PEG化的 前藥中PEG和rhGH之間連接的不穩(wěn)定性。在這種暫時連接中，rhGH從相應(yīng)的前藥中 釋放，其體內(nèi)連接體半衰期為至多1200小時。本文的術(shù)語“綴合物”應(yīng)當被理解為共價鍵合至本文的藥物(人生長激素)的 一種或多種PEG分子。術(shù)語“暫時綴合物”指的是包含至少一個暫時連接的hGH PEG化的前藥。術(shù)語“永久綴合物”指的是hGH PEG化的綴合物或前藥，其中PEG聚合物是 通過具有體外半衰期為至少3000小時的連接結(jié)合到hGH上。體外半衰期或體外連接體半衰期是在pH 7.4和37°C的緩沖液中從hGH PEG化的 前藥中釋放50%的hGH。術(shù)語“體內(nèi)半衰期”或“體內(nèi)連接體半衰期”應(yīng)當被理解為在施用于人體后其 中50%的最初比例的生長激素從hGH PEG化的前藥中釋放的時間間隔，其是通過考慮如 實施例2中描述的化合物相應(yīng)的綴合物半衰期來計算的。術(shù)語“綴合物半衰期”應(yīng)當被理解為其中50%的以上定義的hGHPEG化的永久 綴合物從血液循環(huán)中清除的時間間隔。本文的術(shù)語“脂肪萎縮”應(yīng)當被理解為用于脂肪組織局部丟失的醫(yī)學(xué)術(shù)語。在 本文中，“脂肪萎縮”指的是注射部位脂肪萎縮，這意味著組織脂解發(fā)生在靠近注射部 位。本文的術(shù)語“前藥”應(yīng)當被理解為在顯示其全部藥理學(xué)作用前經(jīng)歷轉(zhuǎn)化的任 何化合物。IUPAC定義下給出了前體系統(tǒng)的分類(http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/ medchem，2004 年 3 月 8 日接入)前藥前藥是在顯示其藥理學(xué)作用前經(jīng)歷生物轉(zhuǎn)化的任何化合物。因此，前藥可以被 認為是包含特別的無毒保護基的藥物，所述保護基以暫時的方式用于改變或消除母體分 子中不希望的性質(zhì)。雙重前藥(或前_前藥)
雙重前藥是在體內(nèi)分兩步(酶和/或化學(xué)方式)轉(zhuǎn)化為活性物質(zhì)的生物無活性分子。載體連接的前藥(載體前藥)載體連接的前藥是包含給定的活性物質(zhì)與暫時載體基團的暫時連接的前藥，所 述的暫時載體基團產(chǎn)生改善的物理化學(xué)或藥物動力學(xué)性質(zhì)，并且其易于體內(nèi)消除，通常 是通過水解裂解。級聯(lián)前藥級聯(lián)前藥是其中載體基團的裂解僅在暴露活化基團后變成有效的前藥。生物轉(zhuǎn)化生物轉(zhuǎn)化是物質(zhì)通過活有機體或酶制劑的化學(xué)轉(zhuǎn)化。相應(yīng)地，級聯(lián)自動水解誘導(dǎo)基團僅在暴露某些自動水解誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)元件后變成有 作用。為了暴露自動水解誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)元件，需要一個或多個級聯(lián)暴露步驟。至少一個暴露 步驟可以基于生物轉(zhuǎn)化步驟。術(shù)語“包含人體內(nèi)臨床有效量的重組人生長激素(rhGH)PEG化的前藥的藥物組 合物”應(yīng)當被理解為在將藥物組合物施用于人后足夠高以在人體內(nèi)獲得所需臨床作用的 量，例如與治療GH相關(guān)疾病有關(guān)的所需的臨床作用。在本文中，技術(shù)人員通常能夠調(diào) 整所施用的重組人生長激素(rhGH)PEG化的前藥的量，以獲得所需的臨床作用。本文的術(shù)語“生理條件”應(yīng)當被理解為與人體的pH和溫度條件相同或相似的 任何體外或體內(nèi)條件。更特別的是，生理條件指的是在約pH 7.4 (pH 6.8至pH 7.8)和約 370C (35°C至 40°C )的條件。術(shù)語“連接體”頻繁地用于生物綴合領(lǐng)域的出版物中并且廣義地描述用于連接 兩個分子實體的化學(xué)結(jié)構(gòu)。這種連接可以是永久的或暫時的。暫時連接體是其中藥物與PEG分子的綴合是可逆的連接體。這意味著連接體的 裂解釋放天然和活化形式的藥物。對于載體前藥，特別是如果聚合物是永久與連接體結(jié) 合并且因此連接體相關(guān)的降解產(chǎn)物不是作為前藥裂解的結(jié)果而釋放的，在結(jié)構(gòu)上區(qū)分暫 時連接體單元和聚合物載體可能是困難的。如果連接體既是自動裂解誘導(dǎo)基團又是分支 單元，連接體的結(jié)構(gòu)特征甚至更加具有挑戰(zhàn)性。因此，在本發(fā)明的含義中，術(shù)語連接體 可以與官能團La和自動裂解誘導(dǎo)基團Ga的組合同義應(yīng)用。在其中載體是分支的PEG的 所述的載體前藥的情況中，優(yōu)選應(yīng)用基于La和Ga組合的結(jié)構(gòu)描述。在這種情況下，裂 解誘導(dǎo)基團Ga被認為是載體聚合物的部分。Ga的化學(xué)性質(zhì)的變化在很大程度上使相應(yīng)的 載體連接的前藥的自身裂解性質(zhì)得以設(shè)計。術(shù)語“永久連接體”指的是PEG通過形成脂族酰胺或脂族氨基甲酸酯而與 hGH-提供的伯氨基綴合。如果應(yīng)用常規(guī)的PEG化試劑，產(chǎn)生的綴合物通常對于水解是 非常穩(wěn)定的，并且對于前藥系統(tǒng)中的治療用途而言，酰胺或氨基甲酸酯鍵的裂解速率將 非常緩慢。但是，這種永久連接體綴合物用于研究前藥綴合物的治療用途，因為它們可 用于評價剩余活性。如果這種穩(wěn)定的連接被用于前藥方法中，在治療應(yīng)用的時間內(nèi)沒有酶催化，官 能團的裂解是不可能的。術(shù)語“水溶性前藥”指的是在生理條件下溶于水的前藥。典型的是，水溶性前藥將透射至少75%、更優(yōu)選至少95%的相同溶液在過濾后透射的光。按重量計，水溶性 聚合物優(yōu)選至少約35% (重量)溶于水，仍然更優(yōu)選至少約50% (重量)，仍然更優(yōu)選 至少約70% (重量)，仍然更優(yōu)選至少約85% (重量)，仍然更優(yōu)選至少約95% (重量) 或完全溶于水。本文所用的術(shù)語“PEG”或“PEG化殘基”用于例證以重復(fù)單元為特征的適合 的水溶性聚合物。適合的聚合物可以選自聚烷氧基聚合物、透明質(zhì)酸及其衍生物、聚乙 烯醇、聚％唑啉、聚酐、聚(原酸酯)、聚碳酸酯、聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸、聚丙烯 酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚有機磷腈、聚硅氧烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚氰 基丙烯酸酯和聚酯。PEG鏈可以包含相互連接的部分、聚合物部分和末端基團。在hGH PEG化的前藥的分支的單綴合物的情況中，臨界距離規(guī)定為連接的原子 所測量的PEG鏈S°與La的連接部位與第一個分支結(jié)構(gòu)BS1之間的最短距離。本文的術(shù)語“PEG載量”應(yīng)當被理解為包含連接至hGH的多個重復(fù)單元的聚合 物鏈的分子質(zhì)量的描述?？偟腜EG載量應(yīng)當被理解為在分子基礎(chǔ)上連接至hGH的所有 聚合物載體的總的分子質(zhì)量。發(fā)明詳述包含適合的藥物賦形劑的藥物組合物技術(shù)人員已知藥物組合物包含可藥用賦形劑和/或載體?！翱伤幱玫摹敝傅氖前ㄈ魏钨x形劑和/或添加劑，其不干擾活性成分的生物學(xué) 活性的功效并且其對于所施用的宿主是無毒的。在優(yōu)選的實施方案中，藥物組合物是皮下施用、肌內(nèi)施用或靜脈內(nèi)注射的組合 物。對于治療本文描述的相關(guān)障礙/疾病，這是優(yōu)選的施用途徑的實例。藥物組合物可以包含除本文描述的rhGH PEG化的前藥之外的其它活性成分。重組人生長激素(rhGH)由于重組人GH在序列上與天然人GH是相同的，本文的術(shù)語重組人生長激素 (rhGH)還涉及所謂的生物仿制藥(biogenerics)等同物。因此，術(shù)語rhGH和hGH在本 發(fā)明的含義中可以同義應(yīng)用。本文的術(shù)語“生物仿制藥”應(yīng)當被理解為仿制形式的生物藥物；應(yīng)用生物方 法，通常通過現(xiàn)代生物技術(shù)活動開發(fā)的分子。仿制化學(xué)藥物可以被定義為當與發(fā)明人產(chǎn) 品相比時，具有基本上類似活性、基本上化學(xué)等同于它們市售相似物、生物等價的、在 專利過期后通過簡短的程序獲得上市許可的那些分子。技術(shù)人員已知現(xiàn)在常規(guī)工作是制備例如較少氨基變化的感興趣的生物制品(本 文是GH)而不顯著影響生物制品的活性。除了重組人和生物仿制藥，術(shù)語重組人生長激素(rhGH)在本文還涉及所有可能 的rhGH多肽。在Pharmacia Corporation 的 WO_A 2005/079838 第 15 頁第 0043 段至且包括第 0053段中給出了可能的rhGH多肽的準確描述。本文所用的術(shù)語“hGH多肽或hGH蛋白質(zhì)”包括所有的hGH多肽，優(yōu)選來自哺 乳動物物種，更優(yōu)選來自人和鼠科動物物種，以及它們的變體、類似物、直向同源物、同系物和衍生物以及其片段，其特征在于促進生長期的生長和維持正常的身體組分、合 成代謝和脂質(zhì)代謝。術(shù)語“hGH多肽或蛋白質(zhì)”優(yōu)選表示具有A丄.Grigorian等人， ProteinScience(2005), 14，902-913中公開的序列的22kDa hGH多肽以及其變體、同系
物和衍生物，其顯示出基本上相同的生物活性(促進生長期的生長和維持正常的身體組 分、合成代謝和脂質(zhì)代謝)。更優(yōu)選的是，術(shù)語“hGH多肽或蛋白質(zhì)”指的是具有準確 的上述序列的多肽。hGH的衍生物特別包括hGH前藥綴合物，其包含永久連接的聚合物，例如 PEG,即本發(fā)明的前藥可以包含除一種或多種暫時連接體聚合物綴合物之外的進一步的 永久連接體聚合物綴合物。本文所用的術(shù)語“hGH多肽變體”指的是來自相同物種但是與參考hGH多肽 不同的多肽。通常，差別是有限的，以致參考和變體的氨基酸序列整體是非常相似的并 且在很多區(qū)域是相同的。優(yōu)選的是，hGH多肽至少70%、80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%或99%等同于參考hGH多肽，優(yōu)選hGH多肽具有A丄.Grigorian等人，Protein Science(2005), 14，902-913中所示的序列。由于多肽的氨基酸序列至少例如95% “等 同”于查詢的氨基酸序列，可預(yù)期的是主題多肽的氨基酸序列等同于查詢的序列，除 了主題多肽序列可能包括至多5個氨基酸改變(在查詢的氨基酸序列的每100個氨基酸 中)。參考序列的這些改變可能發(fā)生在參考氨基酸序列的氨基或羧基末端或這些末端位置 之間的任何地方，單獨散布在參考序列的殘基中或散布在參考序列的一個或多個鄰近基 團中。查詢的序列可以是參考序列的全部氨基酸序列或者本文描述的任何特別的片段。此類hGH多肽變體可以是天然存在的變體，例如天然存在的等位基因變體(其 是通過占據(jù)生物體的染色體的給定基因座的數(shù)個交替形式的hGH之一編碼的)，或同種 型(其是通過天然存在的源于單個初級轉(zhuǎn)錄物的剪接變體編碼的)?？蛇x擇的是，hGH 多肽變體可以是不確定是否天然存在并且可以用領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)制備的變體。本領(lǐng)域已知一個或多個氨基酸可以從生物活性肽或蛋白質(zhì)的N-末端或C-末 端刪除，而基本上不丟失生物功能(參見例如Ron等人，(1993)，BiolChem.， 2682984-2988，將該公開的全部內(nèi)容并入本文作為參考)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還認為hGH多肽的某些氨基酸序列可以是不同的而不顯著影響 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能。此類突變包括根據(jù)本領(lǐng)域已知的通用規(guī)則所選的缺失、插入、 倒位、重復(fù)和取代，以便對活性產(chǎn)生較小影響。例如，在Bowie等人(1990)，Science 247 1306-1310中提供了關(guān)于如何制備表型沉默氨基酸取代的指南，將其全部內(nèi)容并入 本文作為參考，其中作者指出了研究氨基酸序列對改變的耐受的兩種主要方法。第一種方法依賴進化過程，其中突變是被天然選擇接受的或拒絕的。第二種方 法應(yīng)用基因工程，在克隆的hGH的特別位置引入氨基酸改變并且選擇或篩選以鑒定維持 功能的序列。這些研究表明蛋白質(zhì)令人驚訝地耐受氨基酸取代。作者進一步指出氨基酸 改變在蛋白質(zhì)的某些位置可能是允許的。例如，大多數(shù)隱蔽的氨基酸殘基需要非極性側(cè) 鏈，但是表面?zhèn)孺湹囊恍┨卣魍ǔＪ潜Ｊ氐摹Ｔ谏衔牡腂owie等人(1990)以及其中引用 的參考文獻中描述了其它的此類表型沉默取代。典型地所見的保守取代是脂族氨基酸Ala、VaL Leu和Phe間的互相代替、殘基Ser和Thr的羥基互換、酸性殘基Asp和Glu的互換、酰胺殘基Aot和Gln之間的取代、 堿性殘基Lys和Arg的互換以及芳族殘基Phe、Tyr之間的代替。另外，下列氨基酸組通 常表示等價改變(l)Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gin、Asn> Ser、Thr ； (2)Cys、Ser、 Tyr、Thr ； (3) VaL lie、Leu、Met、Ala、Phe ； (4)Lys、Arg> His ； (5) Phe、Tyr、 Trp、His。術(shù)語hGH多肽還包括由hGH類似物、直向同源物和/或物種同系物編碼的所有 hGH多肽。本文所用的術(shù)語“hGH類似物”指的是不同的和不相關(guān)的有機體的hGH，其 在各自的有機體中表現(xiàn)出相同的功能，但是其不是源于有機體祖先共有的祖先結(jié)構(gòu)。代 替地，類似的hGH單獨出現(xiàn)，后來進化表現(xiàn)出相同的功能(或類似的功能)。換言之， 類似的hGH多肽是具有非常不同的氨基酸序列但是表現(xiàn)出相同的生物活性(即在促進生 長期的生長和維持正常的身體組分、合成代謝和脂質(zhì)代謝)的多肽。本文所用的術(shù)語
“hGH直向同源物”指的是兩種不同的物種內(nèi)的hGH，其序列通過祖先物種中共有的同 源hGH而互相關(guān)聯(lián)，但是其已經(jīng)進化變成互相不同。本文所用的術(shù)語“hGH同系物”指 的是不同有機體的hGH，其在各自的有機體內(nèi)表現(xiàn)出相同的功能，并且其源于有機體祖 先共有的祖先結(jié)構(gòu)。換言之，同系hGH多肽是具有非常相似的氨基酸序列的多肽，其表 現(xiàn)出相同的生物活性，即促進生長期的生長和維持正常的身體組分、合成代謝和脂質(zhì)代 謝。優(yōu)選的是，hGH多肽同系物可以定義為多肽表現(xiàn)出至少40%、50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%或99%等同于參考hGH多肽，優(yōu)選具有以上提及 的序列的hGH多肽。因此，hGH多肽可以是例如(i)其中一個或多個氨基酸殘基是用保守的或非保 守的氨基酸殘基(優(yōu)選保守的氨基酸殘基)取代的，并且這種取代的氨基酸殘基可能是或 可能不是由遺傳密碼編碼的；或Gi)其中一個或多個氨基酸殘基包含取代基；或Gii)其 中hGH多肽是與另一種化合物融合的，所述的化合物例如增加多肽半衰期的化合物(例 如聚乙二醇)；或(iv)其中另外的氨基酸是融合到以上形式的多肽上的，例如IgG Fc融 合區(qū)肽或者前導(dǎo)或分泌序列或者用于純化以上形式的多肽的序列或者蛋白質(zhì)序列。hGH多肽可以是單體或多聚體。多聚體可以是二聚體、三聚體、四聚體或包含 至少5個單體多肽單元的多聚體。多聚體還可以是同二聚體或異二聚體。多聚體可以是 疏水、親水、離子和/或共價聯(lián)合的結(jié)果，和/或可以是間接連接的，通過例如脂質(zhì)體形 成。在一個實例中，共價聯(lián)合是在包含hGH多肽或其片段的融合蛋白中所包含的異源序 列之間(參見例如美國專利號5,478,925，將該公開的全部內(nèi)容并入本文作為參考)。在 另一個實例中，hGH多肽或其片段是連接到一種或多個多肽上，所述的多肽可以是hGH 多肽或通過肽連接體形成的異源多肽，例如US.5,073,627中描述的那些(將其并入本文作 為參考)。制備多聚體hGH多肽的另一種方法涉及應(yīng)用融合到已知促進蛋白質(zhì)的多聚化的 亮氨酸拉鏈或異亮氨酸拉鏈多肽序列上的hGH多肽，其中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的技術(shù)包括WO 94/10308的教導(dǎo)。在另一個實例中，hGH多肽可以通過含有f^ag
多肽序列的融合hGH多肽中所含的F丨ag 多肽序列之間的相互作用而聯(lián)合。hGH多聚 體還可以應(yīng)用本領(lǐng)域已知的化學(xué)技術(shù)來產(chǎn)生，例如應(yīng)用連接分子交聯(lián)和本領(lǐng)域已知的連接體分子長度優(yōu)化技術(shù)(參見例如US 5,478,925)、本領(lǐng)域已知的在位于多聚體中包含的 所需的多肽序列內(nèi)的半胱氨酸殘基間形成一個或多個分子內(nèi)交聯(lián)的技術(shù)(參見例如US 5,478,925，將半胱氨酸或生物素添加到hGH多肽的C_末端或N_末端)，以及產(chǎn)生包含一 個或多個這些修飾的多肽的多聚體的技術(shù)(參見例如US 5,478,925)，或者產(chǎn)生包含hGH 多聚體的脂質(zhì)體的30種技術(shù)中的任何一種(參見例如美國專利號5,478,925)，將該公開的 全部內(nèi)容并入本文作為參考。本文所用的術(shù)語“hGH多肽片段”指的是包含hGH多肽的連續(xù)跨度的部分氨基 酸序列的任何肽或多肽，優(yōu)選具有以上提及的序列的多肽。rhGH PEG化的前藥_優(yōu)詵的PEG,聚合物鏈如上所述，本文描述的rhGH PEG化的前藥應(yīng)該具有相對低的活性。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，每個生長激素分子的總的PEG載量總計至少 25kDa。通常，總的PEG載量將小于lOOOkDa。優(yōu)選的是，PEG載量為至少25kDa并 且最大500kDa、甚至更優(yōu)選至少30kDa并且最大250kDa、甚至更優(yōu)選至少30kDa并且 最大120kDa、甚至更優(yōu)選至少40kDa并且最大lOOkDa、甚至更優(yōu)選至少40kDa并且最大 90kDa。PEG可以通過一個或多個錨定點與hGH連接。在一個錨定點的情況中，hGH PEG前藥單綴合物中的相應(yīng)PEG將是分支的并且包含至少3條鏈。在多于一個錨定點的 情況中，例如雙綴合物，hGHPEG前藥中的相應(yīng)PEG可以是分支的或線性的。雙綴合 物可以包含一個或兩個暫時連接，并且PEG可以是線性的或分支的或者包含一個線性鏈 和一個分支鏈的混合物。在這種情況中，雙綴合物包含一個暫時連接以及一個線性鏈和 一個分支鏈，暫時連接可以在其中任一鏈上。在這種情況中，應(yīng)用分支的PEG鏈，可以 存在一個或多個分支單元。分支的PEG是包含連接兩條或多條PEG鏈的分支點的PEG分子，從而與連接 生長激素的一個錨定點形成分子。其可以是兩條20kDa的PEG鏈，連接形成一條分支的 40kDa的PEG分子。在其中分子包含兩個或三個分支點的情況中，該分子分別表示具有 3和4個臂的PEG?？傊⑶以谝陨咸峒暗南拗苾?nèi)，PEG聚合物不限于特別的結(jié)構(gòu)并且可以是線性 的、分支的或多個臂的(例如叉狀PEG或與多元醇核連接的PEG)、樹枝狀的或含有可降 解的連接體。不受理論的限制，PEG載量旨在提供適合的分子質(zhì)量，從而獲得所需的相對低 的活性，并且不含有太高分子質(zhì)量的PEG，太高分子質(zhì)量的PEG可能導(dǎo)致其它問題。對天然人GH進行PEG化可以發(fā)生在數(shù)個賴氨酸基團上或者發(fā)生在N-末端胺 上(Fl)，如Clark等人(本文參考文獻2)的第21973頁表III所描述的。高度反應(yīng)性是 位點Fl和LYS-140。中度反應(yīng)位點是LYS-115、LYS-38和LYS-70。弱反應(yīng)性是位點 LYS-172、LYS-41、LYS-158 和 LYS-168。在更通用的術(shù)語中，在本文中與暫時連接體組合應(yīng)用的PEG可以通過適合選擇 所述的聚合物來降低脂肪萎縮的風(fēng)險。但是，本發(fā)明的原理還適用于除PEG之外的聚合 物。因此，術(shù)語PEG在本文中僅用作適合聚合物的實例。因此，在優(yōu)選的實施方案中，hGH PEG前藥是伯胺基團之一與聚合物鏈S°的可
23自動裂解的官能團La綴合的單綴合物。該聚合物鏈S°的分子量為至少5kDa并且包含至 少一個分支結(jié)構(gòu)BS1。分支結(jié)構(gòu)BS1包含第二個聚合物鏈S1，其分子量為至少4kDa。如上所述，需要至少第三個聚合物鏈S2，其分子量為至少4kDa。聚合物鏈S2可 以是BS1的部分或者可以是S°或S1的進一步的分支，從而引起進一步的分支結(jié)構(gòu)BS2， 其包含S2。在本發(fā)明的前藥綴合物中存在任選多于3條聚合物鏈，例如4、5、6、7或8 條。但是，每條進一步的聚合物鏈的分子量為至少4kDa。聚合物鏈的總數(shù)是受前藥綴 合物的總重量(最大IOOODa(不包含hGH-NH))限制。因此，本發(fā)明優(yōu)選的實施方案涉及組合物，其中分支結(jié)構(gòu)BS1、BS2中至少一個 包含進一步的第四條聚合物鏈S3，其分子量為至少4kDa，或者S°、S1、S2之一包含第三 個分支結(jié)構(gòu)BS3，其包含至少第四條聚合物鏈S3，其分子量為至少4kDa。分支結(jié)構(gòu)或聚合物鏈之一包含自動裂解誘導(dǎo)基團G%其是La的自動裂解所必需 的。任選的是，分支結(jié)構(gòu)之一用作基團G%從而分支結(jié)構(gòu)包含Ga(代替包含所述的 基團)，其也包括在術(shù)語“包括”中。前藥綴合物(AA)的制備通常產(chǎn)生綴合物的混合物，其中hGH的數(shù)個伯胺基團 綴合，引起不同的單綴合的、不同的雙綴合的、不同的三綴合的等前藥。相應(yīng)的單綴 合、雙綴合或三綴合的hGH PEG前藥可以通過本領(lǐng)域已知的標準方法來分離，例如柱色
；並妹絕 te広寸。在hGH PEG前藥的單綴合物中，至少三條聚合物鏈S°、S1、S2包含“聚合物 部分”，其特征在于一個或多個重復(fù)單元，這些重復(fù)單元可以是隨機的、嵌段的(block wise)或交替分布的。另外，至少三條聚合物鏈S°、S1、S2顯示末端基團，其典型的是 氫原子或具有1至6個碳原子的烷基，其可以是分支的或不分支的，例如甲基，特別是對 于基于PEG的聚合物鏈，弓丨起所謂的mPEG。需要指出的是，在至少三條聚合物鏈S°、S1、S2中的聚合物部分可以進一步含 有鏈樣取代基，其源于重復(fù)單元并且引起具有小于4kDa分子量的鏈，并且不認為該鏈是 聚合物鏈S°、S1、S2等。優(yōu)選的是，至少三條聚合物鏈S°、S1、S2具有小于IOOODa分 子量的取代基。S0的相關(guān)結(jié)構(gòu)特征是其臨界距離。臨界距離定義了連接的原子所測量的S°與 La的連接位點與第一個分支結(jié)構(gòu)BS1之間的最短距離。臨界距離的長度對剩余活性有影 響，如化合物33所討論的。臨界距離優(yōu)選小于50、更優(yōu)選小于20、最優(yōu)選小于10。至少三條聚合物鏈S°、S1、S2典型地各自含有互連部分。在至少一個互連部分 中存在Ga。對于除S°之外的聚合物鏈，互連部分是連接例如S1的聚合物部分與BS1以及 S2的聚合物部分與BS2的結(jié)構(gòu)元件。對于S°，互連部分是連接La和BS1的結(jié)構(gòu)元件。互連部分可以包括CV5tl烷基鏈，其是分支的或不分支的并且其任選被雜原子 或官能團間斷或終止，所述的雜原子或官能團選自-O-、-S-、N(R), C(O), C(O) N(R), N(R)C(O), 一個或多個碳環(huán)或雜環(huán)，其中R是氫或CV2tl烷基鏈，其任選被一個 或多個上述原子或基團間斷或終止，其進一步含有氫作為末端原子；并且其中碳環(huán)是苯 基、萘基、茚基、茚滿基、四氫化萘基、C3,環(huán)烷基；并且其中雜環(huán)是4至7元雜環(huán)基
24或9至11元雜二環(huán)基。“C3_1(l環(huán)烷基”或“C3_1(l環(huán)烷基環(huán)”表示含有3至10個碳原子的環(huán)烷基鏈， 其可以含有至少部分飽和的碳-碳雙鍵，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)己 烯基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、環(huán)壬基、環(huán)癸基。環(huán)烷基碳上的每個氫可以被取代基代替。術(shù) 語“C3_1(1環(huán)烷基”或“C3_1(1環(huán)烷基環(huán)”還包括橋連的二環(huán)，例如降冰片烷(norbonane) 或降冰片烯(norbonene)?！?至7元雜環(huán)基”或“4至7元雜環(huán)”表示含有4、5、6或7個環(huán)原子的環(huán)， 其可以含有至多最大數(shù)量的雙鍵(芳族或非芳族環(huán)，其是完全飽和的、部分飽和的或不 飽和的)，其中至少一個環(huán)原子至至多4個環(huán)原子被雜原子代替，所述的雜原子選自硫 (包括-S(O)-、-S(O)2-),氧和氮(包括=N(O)-)，并且其中環(huán)是通過碳或氮原子與分 子的其它部分連接的。4至7元雜環(huán)的實例是氮雜環(huán)丁烷、氧雜環(huán)丁烷、硫雜環(huán)丁烷、 呋喃、噻吩、吡咯、吡咯啉、咪唑、咪唑啉、吡唑、吡唑啉、唑、，悉唑啉、異％ 唑、異％唑啉、噻唑、噻唑啉、異噻唑、異噻唑啉、噻二唑、噻二唑啉、四氫呋喃、四 氫噻吩、吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、巧 1、唑烷、異^1、唑烷、噻唑烷、異噻唑烷、噻二唑 烷、環(huán)丁砜、吡喃、二氫吡喃、四氫吡喃、咪唑烷、吡啶、噠嗪、吡嗪、嘧啶、哌嗪、 哌啶、嗎啉、四唑、三唑、三唑烷、四唑烷、二氮雜環(huán)庚烷、氮雜革或高哌嗪?！?至11元雜二環(huán)基”或“9至11元雜二環(huán)”表示含有9至11個環(huán)原子的兩 個環(huán)的雜環(huán)系統(tǒng)，其中至少一個環(huán)原子被兩個環(huán)共享并且其可以包含至多最大數(shù)量的雙 鍵(芳族或非芳族環(huán)，其是完全飽和的、部分飽和的或不飽和的)，其中至少一個環(huán)原 子至至多6個環(huán)原子被雜原子代替，所述的雜原子選自硫(包括-S(O)-、-S(O)2-),氧 和氮(包括=N(O)-),并且其中環(huán)通過碳或氮原子與分子的其它部分連接。9至11元 雜二環(huán)的實例是吲哚、二氫吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并唑、苯并異&恩唑、苯 并噻唑、苯并異噻唑、苯并咪唑、苯并咪唑啉、喹啉、喹唑啉、二氫喹唑啉、喹啉、二 氫喹啉、四氫喹啉、十氫喹啉、異喹啉、十氫異喹啉、四氫異喹啉、二氫異喹啉、苯并 氮雜革、嘌呤或蝶啶。術(shù)語9至11元雜二環(huán)還包括兩個環(huán)的螺環(huán)結(jié)構(gòu)，例如1，4-二氧 雜-8-氮雜螺[4.5]癸烷，或者橋連的雜環(huán)，例如8-氮雜-二環(huán)[3.2.1]辛烷。碳環(huán)、雜環(huán)和雜二環(huán)可以被CV2tl烷基取代，任選被雜原子或官能團間斷或終 止，所述的雜原子或官能團選自-O-、-S-、N(R)、C(O)、C (O) N (R) > N(R)C(O), 其中R是氫或C1,烷基鏈，其任選被一個或多個上述原子或基團間斷或終止，其進一步 含有氫作為末端原子。至少三條鏈S°、S1、S2的聚合物部分形成鏈的主要部分，優(yōu)選至少90%的每條 鏈的分子量、更優(yōu)選至少95%、甚至更優(yōu)選至少97.5%、甚至更優(yōu)選至少99%。因此， 鏈的主要部分是由聚合物部分來表示的。優(yōu)選的是，至少三條鏈S°、S1、S2獨立地基于聚合物，所述的聚合物選自聚烷 氧基聚合物、透明質(zhì)酸及其衍生物、聚乙烯醇、聚P惡唑啉、聚酐、聚(原酸酯)、聚碳 酸酯、聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚有機 磷腈、聚硅氧烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚氰基丙烯酸酯和聚酯。優(yōu)選的是，至少三條鏈S°、S1、S2是基于相同的聚合物。優(yōu)選的是，至少三條
25鏈S°、S1、S2是基于聚烷氧基聚合物。甚至更優(yōu)選的是，至少三條鏈S°、S1、S2基于聚
乙二醇。相應(yīng)地，也適用于進一步的鏈S3、S4、S5等。鏈S°包含分支結(jié)構(gòu)BS1，從而S1與S°連接。對于S2的連接，可以應(yīng)用分支結(jié) 構(gòu)BS1或存在進一步的分支結(jié)構(gòu)BS2，其可以是S°或S1的部分。因此，當存在進一步的 鏈時，可以存在進一步的分支結(jié)構(gòu)。例如，在存在鏈S3的情況中，其可以與BS1、BS2 或分支結(jié)構(gòu)BS3連接。分支結(jié)構(gòu)BS3，如果存在，可以是S°、S1或S2的部分。通常，可以應(yīng)用允許分支的鏈的任何化學(xué)實體。優(yōu)選的是，分支結(jié)構(gòu)獨立地選 自至少3-倍取代的碳環(huán)、至少3-倍取代的雜環(huán)、叔碳原子、季碳原子和叔氮原子，其中 術(shù)語碳環(huán)和雜環(huán)如上面所定義的。rhGH PEG化的前藥-晳時連接體結(jié)構(gòu)，La、Ga在本領(lǐng)域的出版物中，自動裂解誘導(dǎo)基團有時被稱為連接體，以區(qū)分它們與載 體的結(jié)構(gòu)。但是，通常難以清楚地分離這些結(jié)構(gòu)特征。因此，在本發(fā)明的含義中，裂解 誘導(dǎo)基團Ga被認為是載體S的部分，所述的載體S包含至少S°、S1、S2、BS1和任選的 BS2。Ga化學(xué)性質(zhì)的變化在很大程度上使得相應(yīng)載體連接的前藥的自我裂解性質(zhì)得以設(shè) 計。如上面所討論的，PEG化的前藥，其中藥物是例如專利申請W0-A2005/099768 中描述的rhGH，并且具有釋放特征，其中其被描述為1，6裂解系統(tǒng)，而沒有產(chǎn)生有毒 的芳族化合物。在該文獻中，廣泛描述了很多相關(guān)的適合的暫時連接體結(jié)構(gòu)，以獲得感 興趣的相關(guān)釋放分布。其它暫時連接體結(jié)構(gòu)通常/廣泛描述于例如其它復(fù)雜生物系統(tǒng) GmbH 申請中，例如 WO-A 2005/034909、WO-A 2005/099768、WO-A 2006/003014 和 W0-A2006/136586 ο在例如WO-A 99/30727 (Enzon Inc)中廣泛描述了更多的暫時連接體結(jié)構(gòu)。為了解決本文討論的GH的問題，本發(fā)明已經(jīng)選擇了適合的優(yōu)選的暫時連接體結(jié) 構(gòu)，以獲得本文描述的rhGH PEG化的前藥的相關(guān)的功能性質(zhì)。基于本文詳述的優(yōu)選的 連接體結(jié)構(gòu)，在技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)可以制備其它適合的優(yōu)選的暫時連接體結(jié)構(gòu)，其 可以得到具有本文描述的相關(guān)功能性質(zhì)的rhGH PEG化的前藥。特別的是，可以選擇適合的暫時連接體結(jié)構(gòu)(其是可自身水解的(可自動裂解)) 摻入至s°。下面詳細描述本文所選的連接體結(jié)構(gòu)。理想的是，本發(fā)明的綴合物將具有一種或多種以下特征和/或優(yōu)于目前rhGH綴 合物或制劑的優(yōu)點可以易于以高產(chǎn)率合成、半衰期在優(yōu)選的范圍內(nèi)、可以純化以提供 均勻的綴合物組合物、在自動裂解后表現(xiàn)出活性，例如體外和體內(nèi)活性，并且具有優(yōu)于 未修飾的rhGH和先前描述的rhGH綴合物的藥效學(xué)作用并且不引起脂肪萎縮。本文描述 的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出本文所需的釋放性質(zhì)。通常，載體連接的前藥需要存在連接藥物和載體的可裂解的官能團。在缺乏自 動水解誘導(dǎo)基團的情況中，涉及藥物提供的氨基(例如脂族酰胺或氨基甲酸酯鍵La)的官 能團通常對于水解是非常穩(wěn)定的，并且酰胺鍵的裂解速率對于前藥系統(tǒng)中的治療用途將 非常緩慢。如果此類穩(wěn)定連接被用于載體連接的前藥中，在沒有生物轉(zhuǎn)化的治療應(yīng)用期間，官能團的裂解是不可能的。在這些情況中，連接體顯示出結(jié)構(gòu)基序，其作為底物被 相應(yīng)的內(nèi)源性酶識別。在這種情況中，官能鍵La的裂解涉及包含酶的復(fù)合物。實例是 肽連接體，其被內(nèi)源性蛋白酶識別并且酶解。酶的水平在個體間顯著不同，這導(dǎo)致通過酶裂解引起的前藥活化的生物學(xué)差 異。酶的水平還取決于施用部位而不同。例如已知在皮下注射的情況中，身體的某些區(qū) 域產(chǎn)生比其它區(qū)域更可預(yù)料的治療作用。這種高水平的患者間變異性是不希望的。另 外，對于這種酶-依賴的載體連接的前藥，難以建立體內(nèi)-體外藥物動力學(xué)性質(zhì)的對應(yīng)關(guān) 系。在缺乏可靠的體內(nèi)-體外對應(yīng)關(guān)系時，優(yōu)化釋放分布變成一項麻煩的工作。為了避免患者間和注射部位的變異性，需要應(yīng)用載體連接的前藥，其在治療應(yīng) 用時期內(nèi)表現(xiàn)出裂解動力學(xué)而無需額外的酶幫助裂解。特別是對于高分子量載體，特別 是對于分支的聚合物載體，對于酶由于空間位阻，獲得連接官能團La可能受到限制。因 此，需要設(shè)計表現(xiàn)自身裂解性質(zhì)的載體連接的前藥。自動裂解動力學(xué)可以例如通過在不含酶的緩沖溶液中記錄水解速率來體外測定。為了將水解不穩(wěn)定性引入到官能團L(例如酰胺或氨基甲酸酯)中，需要將結(jié)構(gòu) 化學(xué)組分設(shè)計到載體中，以發(fā)揮作用，例如作為接近官能團的鄰近基團。此類自動裂解 誘導(dǎo)化學(xué)結(jié)構(gòu)(其對前藥酰胺鍵的可裂解性產(chǎn)生控制)稱為自動裂解誘導(dǎo)基團Ga。自動 裂解誘導(dǎo)基團可以對給定的官能團La的水解速率具有很強的作用。優(yōu)選的La選自C (O)-O-和C(O) _，其與hGH的伯氨基一起形成氨基甲酸酯或 酰胺基團。因此，優(yōu)選本發(fā)明的組合物，其中La選自C(O)-O-和C(O)-，其與hGH的伯 氨基一起形成氨基甲酸酯或酰胺基團，產(chǎn)生式(AAl)或(AA2)hGH-NH-C (O) O-S0 (AAl)hGH-NH-C (O) -S0 (AA2)以下部分將列出多種結(jié)構(gòu)組分，其可以用作裂解誘導(dǎo)基團Ga?；鶊FGa表示自動裂解誘導(dǎo)基團。Ga可以以本身存在或者作為級聯(lián)自動裂解誘導(dǎo) 基團存在，其是暴露的以通過另外的水解或酶裂解步驟變得有效。如果Ga以本身存在， 其控制La的限速自動水解。Ga的實例A.J.Garman 等人(A.J.Garman，S.B.Kalindjan, FEBS Lett.1987, 223(2)， 361-3651987)將PEG5000-馬來酸酐用于組織型纖溶酶原激活物和尿激酶中氨基的可逆 修飾。PEG-uPA綴合物的功能酶的再生是在pH7.4緩沖液中溫育，通過裂解馬來酰胺酸 連接，一級動力學(xué)半衰期為6.1小時。單一的芳族部分可能意味著連接的氨基甲酸酯鍵的不穩(wěn)定性 (WO-AOl/47562)。例如，在前藥方法中應(yīng)用取代的或未取代的芴基甲基，使得氨基甲 酸酯連接對多種生物活性試劑不穩(wěn)定(Tsubery等人，J Biol Chem 279 (2004) 38118-24)。 在WO-A 2007/075534中兩條PEG鏈與芴基部分連接。因此，Ga是直接與氨基甲酸酯官能團La連接的芳族環(huán)或芴基甲基。因此，優(yōu)選本發(fā)明的組合物，其中Ga是直接與由La和hGH的伯氨基形成的氨基甲酸酯官能團連接的芳族環(huán)或芴基甲基?？蛇x擇的是，Ga的轉(zhuǎn)化可以誘導(dǎo)S°內(nèi)的分子重排，例如1，4或1，6-消除。該 重排使得La非常不穩(wěn)定以至于被誘導(dǎo)裂解。Ga的轉(zhuǎn)化是級聯(lián)機制中的限速步驟。理想 的是，暫時連接的裂解速率等同于給定的治療方案中藥物分子預(yù)期釋放速率。在這種基 于1，6-消除的級聯(lián)系統(tǒng)中，需要La的裂解在其不穩(wěn)定性被Ga的轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)后基本上是同 時發(fā)生的。另外，需要限速裂解動力學(xué)是在治療應(yīng)用期間進行，而無需另外的酶幫助， 從而避免以上討論的與大部分酶裂解相關(guān)的缺點。R.B.Greenwald, A.Pendri, C.D.Conover, H.Zhao, Y.H.Choe, A.Martinez, K.Shum, S.Guan, J.Med.Chem.，1999，42，3657-3667 和 PCT 專利申請 WO-A 99/30727 描述了合成含氨基小分子化合物(基于1，4-或1，6-芐基消除)的聚乙二醇前藥的方 法。在該方法中，藥物分子的氨基是通過氨基甲酸酯基團與PEG化的芐基部分連接的。 聚乙二醇通過酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或酰胺鍵與芐基連接。藥物分子中PEG的釋放是 通過自動水解和酶裂解的組合來發(fā)生的。在該方法中，釋放觸發(fā)掩蔽基團的裂解之后是 經(jīng)典的且快速的1，4-或1，6-芐基消除。該連接體系統(tǒng)還用于蛋白質(zhì)的可釋放的聚乙 二醇綴合物(S丄ee，R.B.Greenwald 等人.Bioconj.Chem.2001，12(2)，163-169)。將溶 菌酶用作模型蛋白，因為當PEG化發(fā)生在賴氨酸殘基的氨基時其失去其活性。多 種量的PEG連接體與蛋白質(zhì)綴合。PEG綴合物中天然蛋白質(zhì)的再生發(fā)生在大鼠血漿中 或發(fā)生在非生理的高pH緩沖液中。還參見F.M.H.DeGroot等人(WO_A 2002/083180和 W0-A2004/043493)和 D.Shabat 等人(WO-A 2004/019993)。因此，La是氨基甲酸酯官能團，所述基團的裂解是通過Ga的羥基或氨基經(jīng)S°的 1，4-或1，6-芐基消除來誘導(dǎo)的，其中Ga包含酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或酰胺鍵，其經(jīng) 歷限速轉(zhuǎn)化。事實上，Ga可以通過水解裂解。因此，優(yōu)選本發(fā)明的組合物，其中La與hGH的氨基一起形成氨基甲酸酯官能 團，所述基團的裂解是通過Ga的羥基或氨基經(jīng)S°的1，4-或1，6-芐基消除來誘導(dǎo)的， 其中Ga包含酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或酰胺鍵，其經(jīng)歷限速轉(zhuǎn)化。Ga可以包含由Ga組分激活的級聯(lián)裂解系統(tǒng)，其包括代表上述前體的結(jié)構(gòu)組合。 Ga的前體可以包含另外的暫時連接，例如酰胺、酯或氨基甲酸酯。前體的暫時連接(例 如氨基甲酸酯)對水解的穩(wěn)定性或敏感性可以由自動水解性質(zhì)控制或需要酶活性。Antczak 等人(Bioorg Med Chem 9 (2001) 2843-48)描述了一種試劑，對于含胺的 藥物分子，其形成了大分子級聯(lián)前藥系統(tǒng)的基礎(chǔ)。在該方法中，抗體用作載體，穩(wěn)定的 鍵將抗體與活化的基團連接，帶有可裂解的掩蔽基團。在除去酯連接的掩蔽基團后，La 裂解并且釋放藥物化合物。D.Shabat等人(Chem.Eur.3.2004，10，2626-2634)描述了基于扁桃酸活化基團的
聚合物前藥系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，掩蔽基團是通過氨基甲酸酯鍵與活化基團連接的。活化 基團通過酰胺鍵與聚丙烯酰胺聚合物永久綴合。通過催化抗體活化掩蔽基團后，掩蔽基 團通過環(huán)化裂解并且釋放藥物。藥物釋放后，活化基團仍然與聚丙烯酰胺聚合物連接。M.-R丄ee 等人(Angew.Chem.2004，116，1707-1710)描述了基于扁桃酸活化基 團和酯連接的掩蔽基團的類似前藥系統(tǒng)。但是，在這些連接中，1，6消除步驟仍然產(chǎn)生高活性芳族中間體。即使芳族部分與聚合物載體保持永久連接，也可能引起潛在毒性或免疫原性作用的副反應(yīng)。Greenwald等人在2000年公開了基于三甲基鎖合內(nèi)酯化作用的含氨基的前藥 的聚乙二醇藥物遞送系統(tǒng)(R.B.Greenwald 等人，J.Med.Chem.2000, 43(3)，457-487 ； WO-A 02/089789)。在該前藥系統(tǒng)中，取代的鄰-羥基苯基-二甲基丙酸通過酰胺鍵與 藥物分子的氨基偶聯(lián)。羥基通過酯、碳酸酯或氨基甲酸酯基團與PEG連接。藥物釋放 的速率確定步驟是內(nèi)酯化作用(釋放芳族內(nèi)酯副產(chǎn)物)的快速酰胺裂解后的這些官能團的 酶裂解。最近，R.B.Greenwald等人(Greenwald 等人，J.Med.Chem.2004，47，726-734) 描述了基于雙-(N-2-羥基乙基)對羥苯基甘氨酸酰胺(N-二(羥乙基)甘氨酸酰胺)連 接體的PEG前藥系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，兩個PEG分子與N-二(羥乙基)甘氨酸分子(其 與藥物分子的氨基偶聯(lián))連接。在前藥活化中第一個兩步是兩個PEG分子的酶裂解。所 述的PEG和N-二(羥乙基)甘氨酸之間不同的連接引起不同的前藥活化動力學(xué)。該系 統(tǒng)的主要缺點是與藥物分子綴合的N-二(羥乙基)甘氨酸的緩慢水解速率(在磷酸緩沖 液中t1/2 = 3小時)，這引起N-二(羥乙基)甘氨酸修飾的前藥中間體的釋放，與母體藥 物分子相比，這可能表現(xiàn)出不同的藥物動力學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)。更特別的是，對于S°，以下描述了具有特別間隔部分的優(yōu)選的基團La和Ga。根據(jù)WO-A 2005/099768，優(yōu)選的結(jié)構(gòu)選自通式⑴和(II)
權(quán)利要求
1.藥物組合物，該藥物組合物包含適合的藥物賦形劑并且還包含人體內(nèi)臨床有效量 的重組人生長激素(rhGH)PEG化的前藥綴合物，其中PEG通過自身可水解(自動裂解) 的暫時連接體與rhGH連接；所述的前藥綴合物的特征在于(1)綴合物的GH活性小于不含PEG的天然生長激素的5%；并且(2)連接體自動水解速率是體內(nèi)半衰期為10小時至600小時的速率。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中自動水解速率是體內(nèi)半衰期比相應(yīng)的hGHPEG化 的前藥綴合物的體外半衰期短至多5倍的速率。
3.權(quán)利要求2的藥物組合物，其中體內(nèi)半衰期比相應(yīng)的hGHPEG化的前藥綴合物的 體外半衰期短至多3倍。
4.權(quán)利要求2或3的藥物組合物，其中體內(nèi)半衰期比相應(yīng)的hGHPEG化的前藥綴合 物的體外半衰期短至多2倍或幾乎相同。
5.權(quán)利要求1至4中任意一項的藥物組合物，其中組合物是用于皮下施用、肌內(nèi)施用 或靜脈內(nèi)注射的組合物。
6.權(quán)利要求1至5中任意一項的藥物組合物，其中PEG化的前藥中每個生長激素分 子的總PEG載量總計至少25kDa。
7.前述權(quán)利要求中任意一項的藥物組合物，其中前藥綴合物具有化學(xué)結(jié)構(gòu)(A)其中HN-rhGH表示與暫時連接體連接的rhGH殘基；RU R2、R3、R4和R5獨立地選自氫、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁 基、叔丁基；PEG表示與暫時連接體連接的PEG化的殘基； η = 1或2 ；并且X選自Cl至C8烷基或者Cl至C12雜烷基。
8.權(quán)利要求7的藥物組合物，其中權(quán)利要求7的結(jié)構(gòu)(A)中的式⑴的部分結(jié)構(gòu)，其人選自
9.權(quán)利要求7的藥物組合物，其中權(quán)利要求7的結(jié)構(gòu)(A)中的式(II)的部分結(jié)構(gòu)，其是
10.權(quán)利要求7的藥物組合物，其中權(quán)利要求7的式(A)中的PEG-X是式III的 PEG-W
11.權(quán)利要求1至6中任意一項的藥物組合物，其中前藥綴合物結(jié)構(gòu)是
12.權(quán)利要求1至6中任意一項的藥物組合物，其中前藥綴合物結(jié)構(gòu)是
13.前述權(quán)利要求中任意一項的藥物組合物，其中連接體體內(nèi)自動裂解速率是體內(nèi)半 衰期為20至300小時的速率。
14.前述權(quán)利要求中任意一項的藥物組合物，其中連接體體內(nèi)自動裂解速率是體內(nèi)半 衰期為20至150小時的速率。
15.前述權(quán)利要求中任意一項的藥物組合物，其中連接體體內(nèi)自動裂解速率是體內(nèi)半 衰期為30至100小時的速率。
16.前述權(quán)利要求中任意一項的藥物組合物，其中連接體體內(nèi)自動裂解速率是體內(nèi)半 衰期為30至75小時的速率。
17.臨床有效量的權(quán)利要求1至16中任意一項的藥物組合物，其用于治療人GH相關(guān) 疾病的方法。
18.藥物組合物，該藥物組合物包含適合的藥物賦形劑并且還包含式(AA)的人生長 激素ChGH)的前藥綴合物hGH-NH-La-S° (AA)，其中hGH-NH表示hGH殘基；La表示官能團，其是通過自動裂解誘導(dǎo)基團Ga自身可水解的(可自動裂解)；并且S°是聚合物鏈，其分子量為至少5kDa并且包含至少第一個分支結(jié)構(gòu)BS1，至少第 一個分支結(jié)構(gòu)BS1包含至少第二條分子量為至少4kDa的聚合物鏈S1，其中S°、BS1、 S1中至少一個進一步包含自動裂解誘導(dǎo)基團G%并且其中分支結(jié)構(gòu)BS1進一步包含至少 第三條分子量為至少4kIDa的聚合物鏈S2，或者S°、S1中至少一個包含至少第二個分支 結(jié)構(gòu)BS2，所述的BS2包含至少第三條分子量為至少4kDa的聚合物鏈S2，并且其中不含 hGH-NH的前藥綴合物的分子量為至少25kDa并且最大lOOOkDa。
19.權(quán)利要求18的組合物，其中不含hGH-NH的前藥綴合物的分子量為至少30kDa 并且最大120kDa。
20.權(quán)利要求18或19的組合物，其中不含hGH-NH的前藥綴合物的分子量為至少 40kDa并且最大lOOkDa。
21.權(quán)利要求18至20中任意一項的組合物，其中不含hGH-NH的前藥綴合物的分子 量為至少40kDa并且最大90kDa。
22.權(quán)利要求18至21中任意一項的組合物，其中La選自C(O)-O-和C(O)_，其與 hGH的伯氨基一起形成氨基甲酸酯或酰胺基團，產(chǎn)生式(AAl)或(AA2)hGH-NH-C (O) O-S0 (AAl)，hGH-NH-C (O) -S0 (AA2)。
23.權(quán)利要求18至22中任意一項的組合物，其中La與hGH的氨基一起形成氨基甲 酸酯官能團，所述基團的裂解是通過Ga的羥基或氨基經(jīng)S°的1，4-或1，6芐基消除來 誘導(dǎo)的，其中Ga包括酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或酰胺鍵，其經(jīng)歷限速轉(zhuǎn)化。
24.權(quán)利要求18至21中任意一項的組合物，其中Ga是直接與La和hGH的伯氨基形 成的氨基甲酸酯官能團連接的芳族環(huán)或芴基甲基。
25.權(quán)利要求18至24中任意一項的組合物，其中分支結(jié)構(gòu)BS1、BS2中至少一個包含 進一步的第四條分子量為至少4kDa的聚合物鏈S3，或者S°、S1、S2之一包含第三個分支 結(jié)構(gòu)BS3，其包含至少第四條分子量為至少4kDa的聚合物鏈S3。
26.權(quán)利要求18至25中任意一項的組合物，其中至少三條鏈S°、S1、S2獨立地基于 聚合物，所述的聚合物選自聚烷氧基聚合物、透明質(zhì)酸及其衍生物、聚乙烯醇、聚巧1唑 啉、聚酐、聚(原酸酯)、聚碳酸酯、聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸 酯、聚甲基丙烯酸酯、聚有機磷腈、聚硅氧烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚氰基丙烯酸酯和聚 酯。
27.權(quán)利要求26的組合物，其中至少三條鏈S°、S1、S2基于聚烷氧基聚合物。
28.權(quán)利要求18至27中任意一項的組合物，其中正如連接原子所測量的，S°至La的 連接位點與第一個分支結(jié)構(gòu)BS1之間的最短距離小于50個原子。
29.權(quán)利要求28的組合物，其中最短距離小于20個原子。
30.權(quán)利要求18至29中任意一項的組合物，其中S°是式(AAAl)
31.權(quán)利要求30的組合物，其中Ga是OC(O)-R,并且R是權(quán)利要求6中所示的式 ⑴的部分結(jié)構(gòu)，其中Rl、R4、R5和η如權(quán)利要求7所定義的。
32.權(quán)利要求18至22和25至26中任意一項的組合物，其中La_S°由式(AAA2)表示
33.藥物組合物，該藥物組合物包含適合的藥物賦形劑并且還包含式(AB)的人生長 激素ChGH)的前藥綴合物hGH-(NH-L-S0)n (AB)，其中η是2、3或4 ；hGH (-NH) n 表示 hGH 殘基；L各自獨立地是永久官能團Lp或官能團ΙΛ其是通過自動裂解誘導(dǎo)基團Ga自身可水 解的(可自動裂解)；并且S°各自獨立地是分子量為至少5kDa的聚合物鏈，其中S°任選是分支的，包含至少第 一個分支結(jié)構(gòu)BS1，至少第一個分支結(jié)構(gòu)BS1包含至少第二條分子量為至少4kDa的聚合 物鏈S1，其中S°、BS1、S1中至少一個進一步包含自動裂解誘導(dǎo)基團G%并且其中不含 hGH-NH的前藥綴合物的分子量為至少25kDa并且最大lOOOkDa。
34.權(quán)利要求33的組合物，其中η是2。
35.權(quán)利要求18至34中任意一項所定義的前藥。
36.前藥，其選自
全文摘要
通過加入包含聚乙二醇的暫時連接體制備的化學(xué)修飾的人生長激素(rhGH)?；瘜W(xué)修飾的蛋白質(zhì)比未修飾的rhGH具有更長的rhGH活性持續(xù)期，從而能夠降低劑量和施用機會，并且修飾的rhGH不會引起脂肪萎縮。本發(fā)明還包括治療和/或預(yù)防其中應(yīng)用生長激素是有利的疾病或障礙的應(yīng)用方法。
文檔編號A61K47/48GK102014965SQ200980115469
公開日2011年4月13日 申請日期2009年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月29日
發(fā)明者拉斯姆森 G·諾斯科夫, H·拉烏, K·斯普羅格, S·金德曼, T·萊斯曼, T·韋格, U·赫澤爾 申請人:阿森迪斯藥物股份有限公司