專利名稱：一種雞新城疫特異性轉移因子的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及免疫學領域，具體地，本發(fā)明涉及一種雞新城疫特異性轉移因子的制
備方法。
背景技術：
轉移因子(transfer factor, TF)是T淋巴細胞釋放的一種能夠轉移致敏信息的 物質，它能夠特異地將供體的細胞免疫信息轉移給受體，從而增強受體的免疫功能。TF自 50年代發(fā)現(xiàn)至今，國內(nèi)外學者都對其進行了大量研究，并于1979年將其引入到獸醫(yī)免疫和 臨床治療中，目前其在國外已成為一種應用廣泛的增強免疫制劑。 由于轉移因子無種屬特異性，因此臨床上轉移因子的來源較為廣泛，人類臨床上 常見的有人轉移因子、豬轉移因子、牛轉移因子、羊轉移因子、鵝、猴轉移因子等?，F(xiàn)階段畜 禽上常見的有牛轉移因子、豬轉移因子，雞轉移因子。肉雞脾臟為加工過程中的廢物，因此 有著極廣的應用開發(fā)前景，已成為轉移因子研究的熱點。 轉移因子為分子量小于10000，具有生物活性的非均一性的小分子混合物，其內(nèi)含 物包括游離氨基酸(16-18種)，核酸，多肽及K、Na、Ca、Mg、Za等金屬元素。各種TF內(nèi)的理 化特性，組成成分差異不大，但含量有較大羞異。以S印hadexG-255進行柱層析，一般哺乳 動物脾臟小分子活性物質提取物可得到3-6個峰，雞脾臟小分子活性物質提取液層析后可 得到3個組分，其中組分1的多肽含量高，組分2、組分3中核苷酸含量高。水解人，豬，牛的 TF可得到18種氮基酸，其中谷氨酰胺含量最高，精氨酸和天門冬氨酸次之。雞脾臟小分子 活性物質提取液的活性組分中甘氨酸、絲氪酸、谷氨酸含量較高，有研究報道G-25柱層析 各組分均含有甘氨酸、絲氨酸，且各組分免疫活性的強弱與這兩種氨基酸的濃度呈正相關。
從免疫學上，TF可分為特異性轉移因子和非特異性轉移因子兩大類。特異性轉移 因子系采用某種特定病原感染或免疫人群、動物后再提取含該抗原特異活性的轉移因子。 目前臨床已經(jīng)應用有乙型肝炎病毒特異轉移因子、各種腫瘤特異轉移因子、流行性出血熱 病毒轉移因子、布氏菌轉移因子、皰疹病毒轉移因子、乙型腦炎轉移因子，結核菌轉移因子 等。非特異性轉移因子是指用自然人群或動物白細胞提取的具有多種免疫活性的轉移因 子，可非特異性調節(jié)機體的免疫機能，從而提高機體的抵抗力或疫苗的免疫效果。
楊樹皮類脂(Poplar Bark Lipid,PBL)是從楊樹皮中提取的一種橙黃色脂溶性物 質，富含大量的多糖、有機酸、甾醇、磷脂、甙類及維生素等物質。多糖類具有促胸腺體液反 應、剌激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，提高機體特異性免疫反應能力；有機酸具有增強機體免疫功能的作 用，能夠剌激和促進單核吞噬細胞功能，對抗免疫抑制對免疫器官的抑制作用；甙類能夠加 速抗體的產(chǎn)生、促進淋巴細胞轉化和增強網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能等作用。這些物質在動物體內(nèi) 協(xié)調統(tǒng)一，大大提高動物體的免疫機能。 作為楊樹皮的提取物，楊樹皮類脂與大多數(shù)的中草藥一樣，也存在著雙向性，當使 用劑量過大時，不但不能起到正向促進作用，相反免疫器官會出現(xiàn)免疫抑制作用，因此，合 適的劑量是發(fā)揮楊樹皮類脂免疫增強作用的關鍵所在。
脾臟作為最重要的外周免疫器官，其發(fā)育的狀況、淋巴細胞發(fā)育程度、分化成熟程 度將直接影響到制備轉移因子的質量。適量的楊樹皮類脂對脾臟發(fā)育具有明顯的促進作 用。由于楊樹皮類脂成分中含有大量的必需氨基酸、微量元素、維生素等，這些營養(yǎng)物質正 是轉移因子中不可或缺的組分，通過飼喂適量的楊樹皮類脂，可以很好的促進脾臟等免疫 器官的發(fā)育，剌激并促進各淋巴細胞的分裂與增值，使脾臟各活性組分具有較強的生物學 活性，從而整體提高轉移因子的質量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種雞新城疫特異性轉移因子。
根據(jù)本發(fā)明的雞新城疫特異性轉移因子的制備方法，包括以下步驟 1)用楊樹皮類脂飼喂健康雞，用量為每只雞每天O. 8 1. 0g，飼喂20 30天后，
對飼喂楊樹皮類脂的健康雞進行新城疫滅活疫苗強化免疫，獲取脾臟； 2)將強化免疫新城疫的健康雞脾臟洗凈，經(jīng)破碎、凍融、過濾，獲得雞新城疫特異 性轉移因子。 根據(jù)本發(fā)明的雞新城疫特異性轉移因子的制備方法，其中，對飼喂楊樹皮類脂的 健康雞進行新城疫滅活疫苗強化免疫的過程如下 首次免疫每只雞注射0. 5ml弱毒疫苗，14d后進行第二次免疫，每只雞注射1. Oml 油乳劑滅活苗，21d時進行第3次免疫，每只雞注射1. Oml油乳劑滅活苗，28d時進行第四次 免疫，每只雞肌肉注射lml油乳劑滅活苗。 根據(jù)本發(fā)明一具體實施例的雞新城疫特異性轉移因子的制備方法包括以下步 驟 1)利用楊樹皮類脂(購自山東省莒縣林產(chǎn)化工廠)飼喂健康雞，用量為每只雞每 天O. 8 l.Og，每天一次； 2) —個月后對飼喂楊樹皮類脂的雞強化免疫法氏囊滅活疫苗，每周一次，連續(xù)三 次； 3)第三次免疫后一周，獲取脾臟； 4)將強化免疫新城疫的健康雞脾臟用滅菌生理鹽水洗凈；
5)在無菌條件下，剔除被膜、脂肪和大的血管 6)剪碎剩余脾臟，加入等量PBS緩沖液，用高壓均質機將上述混合物通過破碎壓
力為15MPa，剪切壓力為45MPa乳化，破碎溫度要求在l(TC左右，進行細胞破碎； 7)破碎液反復動融三次后，4°C 5000轉/分離心5分鐘，收集上清； 8)利用超濾裝置選取分子量5000的濾包進行過濾，收集濾液； 9)校正濾液pH值至6. 5-7. 5，用0. 22 ii m的濾器加壓過濾，濾液加入0. 01 %的硫
柳汞防腐處理，無菌分裝，安全檢驗(無菌檢驗、安全檢驗根據(jù)2008版農(nóng)業(yè)部獸用生物制品
質量標準進行)合格后備用。 根據(jù)本發(fā)明的制備雞新城疫特異性轉移因子的方法，利用楊樹皮類脂的免疫增強 功能先顯著提高健康雞脾臟的免疫功能，再利用機體對疫苗注射產(chǎn)生的特殊免疫應答使注 射過楊樹皮類脂的雞產(chǎn)生特異性轉移因子。通過本發(fā)明的方法制備的雞新城疫特異轉移因 子不僅具有增強機體特異性、非特異性免疫應答，提高機體免疫系統(tǒng)清除異物的能力，還具
4有降低機體免疫應答的強度，減輕由于超敏反應而造成的組織病理損傷，對于雞新城疫病 的免疫治療有較好的應用前景。
具體實施例方式
實施例1雞新城疫特異性轉移因子的制備 利用楊樹皮類脂(購自山東省莒縣林產(chǎn)化工廠)飼喂健康雞，每只雞每天0. 8g每 天一次；一個月后對飼喂楊樹皮類脂的雞強化免疫新城疫滅活疫苗(購自齊魯動物保健品 廠)，每周一次，連續(xù)三次。 第三次免疫后一周，獲取脾臟。將強化免疫新城疫的健康雞脾臟用滅菌生理鹽 水反復洗凈，在無菌條件下，剔除被膜、脂肪和大的血管，剪碎剩余脾臟，加入等量PBS緩 沖液，用高壓均質機將上述混合物通過破碎壓力為15MPa，剪切壓力為45MPa，控制溫度在 l(TC左右進行細胞破碎。將破碎液反復動融三次后，4°C 5000轉/分離心5分鐘，收集上清。
利用超濾裝置選取分子量5000的濾包進行過濾，收集濾液。校正濾液pH值至 6. 5-7. 5，用0. 22 ii m的濾器加壓過濾，濾液加入0. 01 %的硫柳汞防腐處理，無菌分裝，安全 檢驗(無菌檢驗、安全檢驗根據(jù)2008版農(nóng)業(yè)部獸用生物制品質量標準進行)合格后備用。
利用本發(fā)明制備的雞新城疫特異性轉移因子給7日齡雛雞飲用，每只0. lml，同時 免疫新城活疫苗，7天以后測血清抗體，比不使用楊樹皮類脂制備的轉移因子的雞只抗體高 1-2個滴度。 利用本發(fā)明制備的雞新城疫特異性轉移因子給發(fā)生新城疫的病雞飲用，每只 0. 2ml，可大大降低病雞的死亡率，與不使用用楊樹皮類脂制備的轉移因子的病雞相比，死 亡率可降低30-40%。 實施例2雞新城疫特異性轉移因子的制備 除楊樹皮類脂飼喂量為每只雞每天1. Og外，其余步驟同實施例1。
利用本發(fā)明制備的雞新城疫特異性轉移因子給7日齡雛雞飲用，每只0. lml，同時 免疫新城活疫苗，7天以后測血清抗體，比不使用轉移因子的雞只抗體高2-3個滴度。
利用本發(fā)明制備的雞新城疫特異性轉移因子給發(fā)生新城疫的病雞飲用，每只 0. 2ml，可大大降低病雞的死亡率，與不使用楊樹皮類脂制備的轉移因子的病雞相比，死亡 率可降低30-40%。 實施例3雞新城疫特異性轉移因子的制備 除楊樹皮類脂飼喂量為每只雞每天0.9g外，其余步驟同實施例1。
利用本發(fā)明制備的雞新城疫特異性轉移因子給7日齡雛雞飲用，每只0. lml，同時 免疫新城活疫苗，7天以后測血清抗體，比不使用楊樹皮類脂制備的轉移因子的雞只抗體高 1-2個滴度。 利用本發(fā)明制備的雞新城疫特異性轉移因子給發(fā)生新城疫的病雞飲用，每只 0. 2ml，可大大降低病雞的死亡率，與不使用楊樹皮類脂制備的轉移因子的病雞相比，死亡 率可降低5-10%。
對比實施例1 除楊樹皮類脂飼喂量為每只雞每天O. 5g外，其余步驟同實施例1。 利用這個方案制備的雞新城疫特異性轉移因子給7日齡雛雞飲用，每只0. lml，同
5時免疫新城活疫苗，7天以后測血清抗體，與不使用楊樹皮類脂制備的轉移因子的雞只抗體 相比無明顯增高。 利用該對比實施例1制備的雞新城疫特異性轉移因子給發(fā)生新城疫的病雞飲用， 每只0. 2ml，與不使用楊樹皮類脂制備的轉移因子的病雞相比，死亡率未見有明顯降低。
對比實施例2 除楊樹皮類脂飼喂量為每只雞每天1. 2g外，其余步驟同實施例2。 利用該對比實施例2制備的雞新城疫特異性轉移因子給7日齡雛雞飲用，每只
0. lml，同時免疫新城活疫苗，7天以后測血清抗體，與不使用楊樹皮類脂制備的轉移因子的
雞只抗體相比無明顯增高。 利用這個方案制備的雞新城疫特異性轉移因子給發(fā)生新城疫的病雞飲用，每只 0. 2ml，與不使用楊樹皮類脂制備的轉移因子的病雞相比，死亡率未見有明顯降低。
權利要求
一種雞新城疫特異性轉移因子的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟1)用楊樹皮類脂飼喂健康雞，用量為每只雞每天0.8～1.0g，飼喂20～30天后，對飼喂楊樹皮類脂的健康雞進行新城疫滅活疫苗強化免疫，獲取脾臟；2)將強化免疫新城疫的健康雞脾臟洗凈，經(jīng)破碎、凍融、過濾，獲得雞新城疫特異性轉移因子。
2. 根據(jù)權利要求1所述雞新城疫特異性轉移因子的制備方法，其特征在于，對飼喂楊 樹皮類脂的健康雞進行新城疫滅活疫苗強化免疫的過程如下首次免疫每只雞注射0. 5ml弱毒疫苗，14d后進行第二次免疫，每只雞注射1. Oml油乳 劑滅活苗，21d時進行第3次免疫，每只雞注射1. Oml油乳劑滅活苗，28d時進行第四次免 疫，每只雞肌肉注射1. Oml油乳劑滅活苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫學領域，具體地，本發(fā)明涉及一種雞新城疫特異性轉移因子的制備方法，包括以下步驟1)用楊樹皮類脂飼喂健康雞，用量為每只雞每天0.8～1.0g，飼喂20～30天后，對飼喂楊樹皮類脂的健康雞進行新城疫滅活疫苗強化免疫，獲取脾臟；2)將強化免疫新城疫的健康雞脾臟洗凈，經(jīng)破碎、凍融、過濾，獲得雞新城疫特異性轉移因子。通過本發(fā)明的方法制備的雞新城疫特異轉移因子不僅具有增強機體特異性、非特異性免疫應答，提高機體免疫系統(tǒng)清除異物的能力，還具有降低機體免疫應答的強度，減輕由于超敏反應而造成的組織病理損傷，對于雞新城疫病的免疫治療有較好的應用前景。
文檔編號A61K35/28GK101721427SQ20091023771
公開日2010年6月9日 申請日期2009年11月13日 優(yōu)先權日2009年11月13日
發(fā)明者丁軍濤, 孔義波, 張興曉, 李忠杰, 王穎, 郭 東 申請人:煙臺綠葉動物保健品有限公司