專利名稱：編碼兔肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的cDNA及其表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼細(xì)胞生長(zhǎng)因子的cDNA，尤其涉及編碼兔肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的cDNA 及其表達(dá)載體和應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)是繼血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因 子(FGF)之后成為心臟病基因治療中新的研究熱點(diǎn)。HGF最初從大鼠血漿和血小板中分 離得到，是一種分泌型肝素親和糖蛋白，又稱為擴(kuò)散因子(Scatter factor, SF) 。 1984年， Nakamira等從部分肝切除大鼠的血清中分離到一種能刺激原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞生長(zhǎng)和合成 的肝源性因子，并首次將它正式命名為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF) 。 1989年，Nakamura成功地克 隆出人和大鼠HGF的cDNA，并推導(dǎo)出它們?nèi)康陌被嵝蛄校l(fā)現(xiàn)二者結(jié)構(gòu)相同，為同一物 質(zhì)。HGF是一種具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，如促細(xì)胞分裂劑、促細(xì)胞運(yùn)動(dòng)劑和促形態(tài) 形成劑等作用。它可以促進(jìn)肝細(xì)胞及多種內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞的分裂、分化及形態(tài)發(fā)生，參 與肝臟及其他重要組織器官損傷后的修復(fù)和生理?xiàng)l件下死亡細(xì)胞的再生。它具有抗凋亡特 性，抗纖維化作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)，在腫瘤轉(zhuǎn)移及損傷修復(fù)中起著重要作用。HGF的受 體是c-Met受體，隨著對(duì)HGF/c Met系統(tǒng)研究的深入，現(xiàn)已知c-Met主要在各種上皮細(xì)胞中 表達(dá)，而其配體HGF則在間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。這種相互配對(duì)表達(dá)的關(guān)系說(shuō)明HGF/c-Met系統(tǒng) 在上皮與間質(zhì)的相互作用中具有重要的生物學(xué)意義，如HGF/c-Met系統(tǒng)可促進(jìn)胎盤和胚胎 的發(fā)育，調(diào)節(jié)肺、腎和乳腺等器官的發(fā)育和結(jié)構(gòu)的形成，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉的發(fā)育，調(diào)節(jié) 造血干細(xì)胞的增殖和分化,促進(jìn)新生血管的形成等。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)HGF還是一種心肌營(yíng)養(yǎng) 因子,在心肌梗死中起著重要作用，并且血中HGF水平與高血壓的發(fā)生、發(fā)展及其嚴(yán)重程度 有關(guān)。HGF在某些方面要優(yōu)于VEGF。 HGF作為另--種內(nèi)皮細(xì)胞特異性的生長(zhǎng)因子，其血管生 成作用和抗纖維化及心肌保護(hù)作用都顯示出巨大潛力，在血流動(dòng)力學(xué)研究中與VEGF比較， 二者對(duì)平均動(dòng)脈壓、心率、心臟功能及紅細(xì)胞壓積等方面的影響有相似之處,但其副作用較 后者小,且副作用持續(xù)時(shí)間較后者短，顯示出比VEGF更大的優(yōu)越性,并且VEGF基因有使膜 通透性亢進(jìn)的不良反應(yīng)，而HGF則無(wú)此現(xiàn)象。 基因治療是近10余年來(lái)廣泛研究并取得一定進(jìn)展的治療心肌梗死的新方法。經(jīng) 過(guò)大量的臨床前研究和臨床試驗(yàn)，血管生成基因治療己經(jīng)成為治療冠心病和外周血管病很 有潛力的治療方法。HGF是一種多功能細(xì)胞因子，HGF具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生的作用， 臨床上可用于防止冠狀動(dòng)脈血管術(shù)后狹窄及防止和治療動(dòng)脈硬化，具有抗纖維化作用而用 于治療心肌梗死。Nakamura等發(fā)現(xiàn)體外HGF可促進(jìn)人大動(dòng)脈及大鼠冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞 具有促有絲分裂且不引起血管平滑肌細(xì)胞增殖作用。通過(guò)導(dǎo)入外源性的細(xì)胞生長(zhǎng)因子或基 因，即所謂的"基因搭橋〃 ，可改善缺血區(qū)的供血，從而保護(hù)殘存心肌,改善心功能。
本發(fā)明人擬應(yīng)用已有建立兔慢性心肌缺血模型的實(shí)驗(yàn)方法的基礎(chǔ)，研究利用HGF 促進(jìn)治療心肌梗死的新方法。盡管來(lái)源于人或鼠的HGF在兔的組織器官上呈現(xiàn)一定的交叉 活性,但使用同種來(lái)源的兔HGF可以達(dá)到最高活性，產(chǎn)生最小的可能副作用，是用于兔模型
3的最佳選擇。通過(guò)GenBank和文獻(xiàn)查閱，已有人、鼠、貓、狗、豬、馬等HGF序列記錄,但沒(méi)有 兔HGF的序列。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供編碼兔肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的cDNA。 本發(fā)明的目的之二是提供含有上述編碼兔肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的cDNA的表達(dá)載體。
本發(fā)明的目的之三是將上述編碼兔肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的cDNA用于制備成促進(jìn)細(xì)胞 生長(zhǎng)的藥物。 本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的 本發(fā)明人首先根據(jù)人和小鼠HGF的核酸序列，找出其保守區(qū)，以此設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用 5， MCE法,擴(kuò)增和克隆了未知的兔HGF cDNA的5'片段。對(duì)該片段進(jìn)行核酸序列測(cè)定后， 以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了兔HGF的3'MCE引物，擴(kuò)增和克隆了剩下的HGF c:[)NA的3'片段。最后 將克隆的5'和3' cDNA片段連接，測(cè)序獲得了兩種全長(zhǎng)的兔HGF cDNA序列，分別命名為兔 HGF-1 (2299bp) (SEQ ID NO :1)和兔HGF-2 (2320bp) (SEQID NO :2)。 兔HGF-2的cDNA在第854位堿基處有一 21堿基片段的插入，使推導(dǎo)的HGF-2氨 基酸序列在285位殘基處較HGF-1多7個(gè)氨基酸。利用核酸分析軟件DNAStar，將兔HGF的 測(cè)序結(jié)果與已知的人HGF(2187bp) [GI :2171032]和鼠HGF(2189bp) [GI :220437]序列進(jìn)行 了同源性分析。將兔HGF-1和人HGF的核酸序列進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，二者同源性為89. 3% ，其 推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為91.4%。此外，兔HGF-1和鼠HGF核酸序列同源性為86. 8 % ， 推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為92. ()% 。將兔HGF-2和人HGF的核酸序列進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，二 者同源性為89. 1%，其推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為90. 9%。此外，兔HGF-2和鼠HGF核酸 序列同源性為86. 6%，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為91. 6%。特別需指出的是推導(dǎo)的兔HGF 在其C末端較人和小鼠HGFC末端分別多出36個(gè)氨基酸殘基，但其生物學(xué)意義尚不明確。
為檢測(cè)本發(fā)明所克隆的兔HGF cDM表達(dá)蛋白H:GF的生物學(xué)活性，本發(fā)明首先將兔 HGF cDNA克隆至真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3. 1 ，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒pMBHGF-2并轉(zhuǎn)化哺乳 動(dòng)物細(xì)胞COS-7進(jìn)行表達(dá)。用山羊抗人HGF抗體，對(duì)轉(zhuǎn)化后COS-7細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光 實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染兔HGF表達(dá)質(zhì)粒pMBHGF-2的細(xì)胞出現(xiàn)大量熒光標(biāo)記的細(xì)胞，即表達(dá) 兔HGF的細(xì)胞，而空載體對(duì)照細(xì)胞則無(wú)熒光顯示(圖1)。 在間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明兔HGF蛋白在COS-7細(xì)胞中表達(dá)后，本發(fā)明利用MTT實(shí) 驗(yàn)檢測(cè)兔HGF的促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)活性。活細(xì)胞線粒體可將可溶性微黃色MTT還原成水不溶性 紫色結(jié)晶，其結(jié)晶生成量與活細(xì)胞的增長(zhǎng)成正比。應(yīng)用MTT法比較了通過(guò)轉(zhuǎn)染HGF表達(dá)質(zhì)粒 pRAfM;F-2和轉(zhuǎn)染對(duì)照pd)NA3. 1空載體COS-7細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，檢測(cè)兔HGF的促進(jìn)細(xì)胞生 長(zhǎng)活性。3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，表達(dá)兔HGF蛋白細(xì)胞的MTT平均值是對(duì)照細(xì)胞的128%， 差異極其顯著(P值< 0. 01，結(jié)果見(jiàn)圖2)，明確顯示本發(fā)明所表達(dá)的重組兔HGF具有促進(jìn)細(xì) 胞生長(zhǎng)的生物學(xué)活性。
圖1轉(zhuǎn)染兔HGF的COS-7細(xì)胞用抗HGF血清進(jìn)行間接免疫熒光結(jié)果；A)轉(zhuǎn)染 pMBHGF-2的間接免疫熒光陽(yáng)性COS-7細(xì)胞。B)轉(zhuǎn)染pcDNA 3. 1 (+)空載體質(zhì)粒的COS-7陰性對(duì)照細(xì)胞。 圖2兔HGF的促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)活性的MTT測(cè)定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。 說(shuō)明下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件,如《分子克 隆實(shí)驗(yàn)室指南》(New York :Cold Spring HarborLaboratory Press, 2001)中所述的條件 進(jìn)行。 實(shí)施例1兔肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子d)NA的分離、克隆
l材料和方法
1. 1材料
1. 1. 1主要試劑 Trizol試劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、pM〕18-T載體及3' -Full Race core set試劑盒購(gòu)于TakaRa公司，DNA純化試劑盒購(gòu)于OMEGA公司，提取質(zhì)粒試劑盒購(gòu)于 Tiangen公司。
1. 1. 2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康日本大耳白兔，雌性2只，體重分別為2. 2Kg、3. 8Kg，雄性1只，體重2. 5Kg。由
黑龍江省哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物中心提供。 1. 2試驗(yàn)方法 1. 2. 1急性肝損傷模型制備 有研究顯示肝毒劑損傷后大鼠血漿中HGF水平顯著升高，為此，本發(fā)明也選用了 四氯化碳制備兔急性肝細(xì)胞損傷模型。四氯化碳損傷將50%0:14與豆油1 : l體積混合， 按2. 5ml/kgbw計(jì)算，經(jīng)鼻胃管詞喂，造成兔急性肝損傷，損傷時(shí)間為24h，造成兔急性肝細(xì) 胞損傷模型。在本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)24h后,將兔造成氣體栓塞致死后取肝臟組織,用解剖剪剪成 小塊，放入液氮中保存。
1. 2. 2RT-PCR 將液氮中保存的兔肝組織用Trizol試劑進(jìn)行總RNA的提取并逆轉(zhuǎn)錄到cDNA。
1.2. 3引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank公布的人H:GF c廳序列[gi :2171032]、人:HGF mRNA序列[gi : 184031]及鼠HGF mRNA序列[gi :220437]用計(jì)算機(jī)軟件01igo6. 0設(shè)計(jì)引物如下，引物由 Invitrogen公司合成。 上游引物(U》5' -ATGATGTGGGTGACCAAACT-3';
上游引物(U2) :5' -ATATCCCGACAAGGGCTTTGA-3';
上游引物(U3) :5' -CGCCAGCCCGTCCAGCAGCACC-3';
下游引物(L》5' -GGGAGCAGTAGCCAACTCGGA-3';
下游引物(L2) :5' -GTATTTCAAACTAACCATCCA-3';
5
下游引物(L3) :5' -CACGACCAGGAACAATGAC-3';
1. 2. 4PCR 1. 2. 4. 1套式PCR :外套PCR :總反應(yīng)體系25 u l,其中cDNA模板2. 5ul,外套上下 游引物各().5ul， rTaq (). 25ul。 PCR反應(yīng)條件94。C預(yù)變性5rain， 95。C變性30s， 52。C退火 lmin，72。C延伸lmin，共循環(huán)30次，最后72。C聚合延伸10min。內(nèi)套PCR :總反應(yīng)體系25" 1， 其中外套PCR產(chǎn)物作為內(nèi)套PCR反應(yīng)的模板2. 5ul，內(nèi)套上下游引物各O. 5ul，rTaq0. 25ul， 內(nèi)外套PCR反應(yīng)條件相同。將U2、 L3作為外套PCR上下游引物，U2、 L2作為內(nèi)套PCR上下游 引物，進(jìn)行套式PCR反應(yīng)，將內(nèi)套PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得目的片斷M1() 將U3、 k作為外套PCR上下游引物，Up k作為內(nèi)套PCR上下游引物，進(jìn)行套式PCR反應(yīng)，將 內(nèi)套PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得目的片斷M2。將目的片斷M:l 、M2用DNA純 化試劑盒進(jìn)行回收，定量,分裝，-2(TC貯存。將純化后的目的片斷MpM2分別與pMD18-T載 體進(jìn)行連接，純化后的目的片斷4. 5u:[,連接酶5ul ， pM:D18-T載體0. 5ul放入16。C水浴中5h 進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH-5 a中，將轉(zhuǎn)化的受體菌涂布于含50mg/L 氨芐青霉素(Amp)的LB瓊脂平板，37t:培養(yǎng)14 16h。從平板上隨機(jī)挑取菌落，接種于含 Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩過(guò)夜培養(yǎng),然后提取質(zhì)粒，Bamll I和Sal I進(jìn)行雙酶切，酶 切產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。將酶切初步鑒定正確的菌液進(jìn)行正反測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站 上的人和鼠的HGF基因進(jìn)行序列比對(duì)，利用DNA Star軟件進(jìn)行序列分析，并與人及鼠HGF的 同源性分析，驗(yàn)證序列的正確性。Mt和M2兩個(gè)序列有部分序列是相同的，可以應(yīng)用DNAStar 軟件進(jìn)行拼結(jié)成一段更長(zhǎng)的序列M3。
1. 2. 4. 2重組PCR 利用已獲得的目的基因片斷經(jīng)過(guò)DNA純化后的MpM2作為模板,進(jìn)行重組PCR。上 游引物為L(zhǎng)V，設(shè)計(jì)R游引物(L。) 5' -GTATTTCAAACTAACCATCCA-3'，引物由Invitrogen公 司合成。PCR :總反應(yīng)體系25 l，其中模板Mi為各4ul,上游引物Up下游引物L(fēng)。各0. 5ul， rTaq (). 25u:l., PCR反應(yīng)條件94 °C預(yù)變性5min， 95 °C變性3()s， 55 °C退火lrain， 72 °C延伸 2min，共循環(huán)30次，最后72t;聚合延伸10min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)， 獲得目的片斷M3。將純化后的目的片斷M3與pMD18-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化，涂板，37。C培養(yǎng) 14 16h，挑取菌落，37。C振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。提取質(zhì)粒，37。C,BamH I和Sal I進(jìn)行雙酶切，酶 切產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定。將酶切初步鑒定正確的菌液進(jìn)行正反測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與Mi和^的 拼結(jié)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證。 1. 2. 53' -MCE PCR :根據(jù)已獲得的兔HGF 5' -RACE的部分序列設(shè)計(jì)內(nèi)外套PCR 上游引物如下 上游弓| 物(W》5 ' -GGGACAAGAACATGGAAGA-3 '， 上游引物(N》 5' -TGTGCCTTGGGATTATTGT-3',引物由Invitrogen公司合成。RT-PCR :總反應(yīng)體系10ul : 總RNA 2. 0ul，5XM-MLV Buffer 2ul， dNTP lul， RNase Inhibitor 0. 25ul，3 ' -RACE Adaptor lul，ReverseTranscriptase M-MLV 0.25ul,RNase Free dH20 3. 5ul，混勻后放入 42"C水浴中6()min， 7(廣C水浴中15rain滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。3' -RACE PCR :外套PCR :總反應(yīng)體系 50u 1，其中反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液3ul， 1XcDNADilution Buffer II 7ul，3' -RACE Outer primer 2ul，上游引物W:l2ul， 10XLAPCR Buffer II 7ul， LA Taq 0. 25ul， dH20 28. 75ul， PCR反應(yīng) 條件參數(shù)94。C預(yù)變性5min， 95。C變性45s， 58。C退火30s, 72。C延伸1min30s,共循環(huán)32次，最后72"C再延伸10min。 PCR產(chǎn)物作為內(nèi)套PCR反應(yīng)的模板。內(nèi)套PCR :總反應(yīng)體系50ul， 其中外套PCR產(chǎn)物作為內(nèi)套PCR反應(yīng)的模板2ul，dNTP 8ul，3' -RACE Inner primer 2ul， 上游引物Ni 2ul，10XLAPCR Buffer II 9ul， LA Taq 0. 5ul, dH2026. 5ul，內(nèi)外套PCR反應(yīng) 條件相同。將內(nèi)套PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得目的片斷^。將目的片斷 M4用DNA純化試劑盒進(jìn)行回收,定量，分裝，-2(TC貯存。將目的片斷M4與pMD18_T載體進(jìn) 行連接，轉(zhuǎn)化，涂板，37t:培養(yǎng)14 16h，挑取菌落，37t:震蕩過(guò)夜培養(yǎng)。提取質(zhì)粒，BamH I 37 °C單酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定。 1. 2. 6兔HGF PCR片段的克隆利用已獲得的目的基因片斷M3和M4經(jīng)過(guò)DNA純 化后作為模板，進(jìn)行重組PCR獲得兔HGF的全長(zhǎng)基因序列。并按照pcDNA3. 1(+)載體 的要求在上F游引物5'端加上酶切位點(diǎn)，便于后續(xù)定向克隆及表達(dá)。設(shè)計(jì)帶有酶切位 點(diǎn)的引物，上游引物(U4) :5' -GCGGATCCATAATGGTGTGGGGGACCAAAC-3',下游引物(L4): 5' -GCGTCTAGATTATGGCTGTGG CACCTTATACG-3' ， U4和L4的5'端分別引入BamH I和Xba I酶切位點(diǎn)，引物由Invitrogen公司合成。PCR :總反應(yīng)體系25u 1，其中模板MJ. 5ul， M41. 5ul， rTaq 0. 25ul， PCR反應(yīng)條件94。C預(yù)變性5min，95。C變性30s，53。C退火40s，72。C 延伸2min30s,共循環(huán)10次，再加入上游引物U4 0. 5ul,下游引物L(fēng)4 0. 5ul，95。C變性30s， 48。C退火4()s，72。C延伸2min3()s，共循環(huán)30次，最后72。C再延伸l()rain，4。C結(jié)束反應(yīng)。將 PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得兔HGF帶有酶切位點(diǎn)的全部序列片斷。將目的 片斷用DNA純化試劑盒進(jìn)行回收。將目的片斷與pMD18-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化，涂板，37°C 培養(yǎng)14 化h，挑取菌落,3rC震蕩過(guò)夜培養(yǎng)。提取質(zhì)粒，BamIl I 37。C單酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)
行電泳鑒定。 2、試驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)測(cè)序獲得了兩種全長(zhǎng)的兔HGF cDNA序列，分別命名為兔HGF-l(2299bp) (SEQ ID NO :1)和兔HGF-2 (2320bp) (SEQ ID NO :2)。兔HGF-2的cDNA在第854位堿基處有一 21 堿基片段的插入，使推導(dǎo)的HGF-2氨基酸序列在285位殘基處較HGF-1多7個(gè)氨基酸。利 用核酸分析軟件DNASt.ar，將兔HGF的測(cè)序結(jié)果與已知的人HGF(2187bp) [GI :217腦]和 鼠HGF(2189bp) [GI :220437]序列進(jìn)行同源性分析。將兔HGF-1和人HGF的核酸序列進(jìn)行 比較后發(fā)現(xiàn)，二者同源性為89. 3%,其推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為91. 4%。此外,兔HGF-1 和鼠HGF核酸序列同源性為86. 8 %,推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為92. 0 % 。將兔HGF-2和 人HGF的核酸序列進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn),二者同源性為89. 1%，其推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為
90. 9% 。此外，兔HGF-2和鼠HGF核酸序列同源性為86. 6% ，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為
91. 6%。特別需指出的是推導(dǎo)的兔HGF在其C末端較人和小鼠HGFC末端分別多出36個(gè)氨 基酸殘基,但其生物學(xué)意義尚不明確。 試驗(yàn)例1兔HGF cDNA表達(dá)蛋白HGF的生物學(xué)活性試驗(yàn) 為檢測(cè)本發(fā)明實(shí)施例1所克隆的兔HGF cDNA表達(dá)蛋白HGF的生物學(xué)活性，將實(shí) 施例1所克隆的兔HGF-2cDNA克隆至真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3. 1，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒 pRA朋GF-2并轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞COS-7進(jìn)行表達(dá)。用山羊抗人HGF抗體，對(duì)轉(zhuǎn)化后COS-7細(xì) 胞進(jìn)行間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染兔HGF表達(dá)質(zhì)粒pRABHGF-2的細(xì)胞出現(xiàn)大量熒 光標(biāo)記的細(xì)胞，即表達(dá)兔HGF的細(xì)胞，而空載體對(duì)照細(xì)胞則無(wú)熒光顯示(圖1)。
在間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明兔HGF蛋白在COS—7細(xì)胞中表達(dá)后，本發(fā)明利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兔HGF-2的促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)活性?；罴?xì)胞線粒體可將可溶性微黃色MTT還原成水不溶 性紫色結(jié)晶，其結(jié)晶生成量與活細(xì)胞的增長(zhǎng)成正比。應(yīng)用MTT法，本發(fā)明比較了通過(guò)轉(zhuǎn)染 HGF表達(dá)質(zhì)粒pMBHGF-2和轉(zhuǎn)染對(duì)照pcDNA3. 1空載體COS-7細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，檢測(cè)兔HGF-2 的促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)活性。3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，表達(dá)兔HGF蛋白細(xì)胞的MTT平均值是對(duì)照 細(xì)胞的128% ，差異極其顯著(p值< 0. 01，結(jié)果見(jiàn)圖2)，明確顯示所表達(dá)的重組兔HGF具有 促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的生物學(xué)活性。 通過(guò)比較不同的HGF的cDNA克隆后發(fā)現(xiàn)，存在多種HGF mRNA的轉(zhuǎn)錄本，經(jīng)過(guò)不同 的拼接，導(dǎo)致了不同的HGF的變種(俞水亮，楊復(fù)華.肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的分子生物學(xué)研究， 生物工程學(xué)報(bào)，2002 ;18(1))。例如人HGF是由 一條含有728個(gè)氨基酸的單鏈前體蛋白裂 解而來(lái)的異質(zhì)二聚體，單鏈HGF和異質(zhì)二聚體形式具有相等的生物活性(張武.肝細(xì)胞生 長(zhǎng)因子研究進(jìn)展.免疫學(xué)雜志，2001 ;17(3))。 FLPSS分子是pro-HGF的自然變種，因在其編 碼區(qū)缺失15bp，故在Kringle 1區(qū)缺失了 5AA，為723AA的單分子形式。但這一缺失不影響 其分泌后的加工，仍可被酶切為少5AA的雙鏈HGF形式。與全長(zhǎng)的pro-HGF分子比較，F(xiàn)LPSS 分子存在數(shù)量少，與肝素的親和力略有降低，其它性質(zhì)基本一致(俞水亮，楊復(fù)華.肝細(xì)胞 生長(zhǎng)因子的分子生物學(xué)研究，生物工程學(xué)報(bào)，2002 ; 18 (1))。通過(guò)DNAStar軟件對(duì)genbank 中公布的鼠HGF ra廳序歹ij (G]: :170172521, G]: :220766, GI :220437)的比較發(fā)現(xiàn)，鼠HGF mRNA(GI : 170172521 ，GI :220766)兩個(gè)序列里含有FLPSS分子，鼠HGF mRNA(GI :220437)的 序列也存在了 FLPSS分子的缺失?？偨Y(jié)比較已報(bào)道的不同的哺乳動(dòng)物的HGF，雖然它們均 有促進(jìn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的功能,但在來(lái)源、分子量和性質(zhì)等方面有較大差異(羅運(yùn)權(quán)，吳 孟超.肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子.新消化病學(xué)雜志，1997 ;5(3) :198-199)。兔HGF-1 (2299bp)編碼 了 762AA，兔HGF-2 (2320bp)編碼了 769AA。兔HGF-1和兔HGF-2都缺失了 FLPSS分子。兔 HGF-2的cDNA在第854位堿基處有一 21堿基片段(GAAGCCGTTATTTTGCAAGAG)的插入，使推 導(dǎo)的兔HGF-2氨基酸序列在285位殘基處較兔HGF-1多7個(gè)氨基酸(GSRYFAR)，其余位置的 核甘酸和氨基酸是一致的，但這并沒(méi)有影響兔HGF-1和兔HGF-2最大開(kāi)放讀碼框的位置的 變化。通過(guò)Gene Runner分析表明在兔HGF-2氨基酸序列的285位置到292位置附近并不 存在特殊的蛋白質(zhì)功能基序，因此推斷兔HGF-2和兔HGF-1 二者編碼蛋白質(zhì)的活性是相似 或者相同的。因此，兔HGF-1和兔HGF-2基因序列是兩種極為相似的變種。
序列表 〈110〉中國(guó)農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所 〈120〉編碼兔肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的cDNA及其表達(dá)載體和應(yīng)用
〈130>KLPI06078
〈16()>2 〈170>PatentIn version 3. 1 〈210>1 〈211〉2299 〈212>DNA 〈213〉palaeolaus 〈400〉 1 atgatgtggg ggaccaaact tgtgccagtc ctgctgctgc agcaggtcct gctgcatctc 60
ctgctgctgcccatcgccatcccctacgcaaaatacactt120catgaatttacttatcaaagaagacccatt3ctg朋gate180tgtgcc&mcaga;tgtett&ig240cttccattcacttgcaaggcctttg'tttttcctctggttt300cctt.tcaat.ag'catgtccaggtcatgaatttgacctct.at360actacattagaaactgcatct朋ggg朋C3420gtgtctattaCt肌gflgtggca;tcfuigtgtcagccctggagttccatga;t480cacagctetcaactactgtcg'aaatcctcg'tgggga卿El540gggggaccgtggtgtttcac3cga3gtctgt.gacat.tcct600caatgttcag^gttg3￡itgtatgacctgcgttetcgaggccccatggat.660C3C!:lCElg股ltttgtcagcgctgggacca;tcCCggC￡lC￡i￡l￡l720ttcttgcccgcga^ia_gggctttg'atgataattattgccgcaatcctgat780ggcaagccgaggccatggtgttatactcttgaccctgacaccccctgggagtactgtgca840￡tt.t.33￡l￡lt.gtgtgctcacagtettatga^tgacactg￡itgtccctetgga朋c朋cgg朋■tgC￡lttC￡l￡lg3ggttax^ggataccatttgg￡l￡ltgg￡l￡ltt960ccttgtcagcgttg'ggattcccagtatcctcaccag'catgacataactcccgaaaatttc102033gtgC朋ggacctecgagacgaaatccag3t.gggg'Ctg3gtcaccctgg1080tgttt.caccactgacccaaacatccgagttggttactgctcccaaattcc1140gtgtcaagtgctatcttgggfittctetgggc股itttatcc1200ctggactgacgtgttcaatg'a^itgga^iga<cttgcatcgc1260cacaccttctggg^CC3g3tgctegteagattactg'ccggaatcccgac1320gatgatgcccacggaccctg gtgttacaca gggaatcctc ttgtgccttgggattettgt1380cctcttgctcgttgtg朋ggtgatectacc cccfic朋teg tg肌tttagaccatcctgta1440gtatcttgtac c aaaac aaagcaattgcga gttgtcaatg g'g'attccaac1500gt.ggg￡ltgg￡ltggttegtttg皿3tec3g3 ^te朋cate tctgcggaggatcattgate1560gggttcttecggcaagacaa tgtttccctt ctcgaaataaagacttg^g1620gEittecg股igcctggctggg aattcficg&it gtccticggaa gfiggtg&itg&ig皿gcgcaag1680caggtgctgaacg'tctcgca gctggtgtac g'g'g'cccgaag gatctgatctg'g'ttttectg1740朋gcttgcgagacctgctgtcctggatgat tttgttegca cgattgacttaccteattet1800ggatgcatcattcctgagaa gactgcttgc agtgtttetg gttggggctecaccggattg1860atcaactctgacggtctett ,acgagttgca cfitctctate ttatgggg&m1920agtcagcaccBtc^iggaaa 8g'tgnctctg皿gg皿tctg ^詔tetgtgc1980朋g3ttggatcaggaccttg tg'3gggggat tetggtggcc cacttgtttg2040tggttcttgg agtcattgtt cccggtcgtg gatgtgcceittccaaatcgt2100cctggtatcttcgtccgagtggcfitettet gc^mgtgg3 tecfic朋朋ttatattaacg2160tateaggtgccacag'ccata actgangtaa g'caagcctga agcgtccatcaatamgctt2220tctttcacat.g3gg'3tgtc3 gagtecgtgg皿tte^gtg tcactc3c^caaccttgag22802299〈210〉2
〈211〉2320〈212>靈〈213〉palaeolaus〈4()()〉2atgatgtgggggaccaaacttgtgccagtcctgctgctgcccatcgccatcccctacgcac&itg朋ttte朋朋gtc&igc朋&lg&lCg<taaaactaaaaa_aiitgaiica_ca_gca_ga_ccaiicttccattcacttgcaaggcct.t.t.gt.t.t.t.t.cctttcaatagcatgtccagtgg敏g腳aaactgcatcgtgtctattacte卿gtggcatcaagtgtcacagctatcgcggtaa8g8cctacaggaagggggaccgtggtgtttcacaagcaatccgic朋tgttcag朋gttg朋tgtetgacctgcca_ca_ca_gaatca_ggcaiiga_tttgtcagcgcttcttgcccgcgacaagggcggc朋gccgaggccatggtgttatactcttgtggaagccgttattttgcagtccctatggaaacaacggaatgcattcaaaateccatttggaatggaattccttgtcaggamtaactcccgaaaatttcaagtgc朋ggatggggctgagtcaccctggtgtttcacctcccaaattccanaHtgtga_cg'tg'tcaagtaattctatgggcaatttatc朋c3tggaagacttgcatcgccacaccttcaattectgccCgfltgfltgCCcttgtgccttgg'gattettgtcctcttgctgtg皿tttagaccatcctgtagtetcttgtgggattcc朋tgtgggatggatctgcgg《gfltCflttg<aaaggaaagctctcg'aaataaagax:ttgaii卿ggtgatgag皿gcgcaagc郷tgctgggatctgatctggttttactg皿gcttgcgacgfittgacttggfitgcatcggttggggctacaccg'gattgatcaactctcagtcagcacgaaatatgtgCtgg￡igC￡lg￡lccacttgttt
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10
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權(quán)利要求
編碼兔肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的cDNA，其特征在于其核苷酸序列為SEQ ID NO1所示。
2. 由權(quán)利要求1的cDNA所編碼的兔肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
3. 含有權(quán)利要求1所述cDNA的表達(dá)載體。
4. 含有權(quán)利要求3所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
5. 權(quán)利要求1所述d)NA在制備促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物中的用途。
6. 編碼兔肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的cDNA,其特征在于其核苷酸序列為SEQ ID N0:2所示。
7. 由權(quán)利要求6的cDNA所編碼的兔肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
8. 含有權(quán)利要求6所述cDNA的表達(dá)載體。
9. 按照權(quán)利要求8的表達(dá)載體，其特征在于所述的表達(dá)載體是重組表達(dá)質(zhì)粒 pRABHGF-2。
10. 含有權(quán)利要求8或9所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
11. 權(quán)利要求6所述cDNA在制備促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了編碼兔肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的cDNA及其表達(dá)載體和應(yīng)用。本發(fā)明應(yīng)用5’RACE法和3’RACE分別擴(kuò)增和克隆了未知的兔HGF cDNA的5’片段和3’片段，最后將克隆的5’和3’cDNA片段連接，測(cè)序獲得了兩種全長(zhǎng)的兔HGF cDNA序列，分別命名為兔HGF-1(SEQ ID NO1)和兔HGF-2(SEQ ID NO2)。MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明所表達(dá)的重組兔肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子具有顯著的促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的生物學(xué)活性。
文檔編號(hào)A61P9/10GK101701219SQ20091021233
公開(kāi)日2010年5月5日 申請(qǐng)日期2009年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月6日
發(fā)明者呂健, 周建華, 姚虹, 梁兆光, 王雪峰, 郭宏, 郭巍, 韓金霞 申請(qǐng)人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué);中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所