專利名稱：：黃酮苷類化合物在制備治療瘧疾的藥物中應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及藥物，具體涉一種黃酮苷類化合物在制備治療瘧疾的藥物中應用，尤其是一種黃酮苷類化合物在制備治療由瘧原蟲引起的瘧疾的藥物中應用。
背景技術：
：瘧疾是地球上發(fā)生最頻繁的寄生蟲病，是由按蚊進行傳播、具有潛在致命危險的疾病。每年全球有5億左右的瘧疾病例，導致超過100萬人死亡，絕大部分發(fā)生在非洲。世界衛(wèi)生組織指出，瘧疾平均每30秒殺死一個5歲以下的兒童。通常，瘧疾由瘧原蟲引起，帶有瘧原蟲的雌按蚊叮咬人體后，將瘧原蟲注入人體，經1020天會發(fā)生典型的瘧疾臨床癥狀，可分為四期發(fā)冷期、發(fā)熱期、出汗期和間歇期。瘧疾的反復發(fā)作后，病人會出現(xiàn)貧血、肝脾腫大，甚至出現(xiàn)腦型、超高熱型、厥冷型和胃腸型等兇險癥狀，嚴重的會危及生命。由于已有抗瘧藥物的耐藥性不斷增加，瘧疾的發(fā)病率日益增加，亟待具有新型治療作用的抗瘧藥物的發(fā)現(xiàn)。紅細胞內期的瘧原蟲在其酸性食物泡內水解宿主的血紅蛋白以獲得自身生命所需的能量和氨基酸。生物學研究表明，在瘧原蟲的食物泡內包涵一系列的水解酶，如天冬氨酸蛋白酶(plasm印sins)，半胱氨酸蛋白酶(falcipains)，和金屬蛋白酶(falcilysins)。這些酶已成為瘧疾化學治療的潛在的靶標。半胱氨酸蛋白酶是分子量約為21000-30000的蛋白質，在pH4_6.5時具有最高水解活性，它的活性部位具有半胱氨酸殘基。瘧原蟲的半胱氨酸蛋白酶屬于木瓜蛋白酶家族。已知的瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶有四個亞型，falcipain-l(瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶-l)，falcipain-2A(瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶-2A)，falcipain-2B(瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶-2B)，falcipain-3(癥原蟲半胱氨酸蛋白酶-3)。其中，F(xiàn)alcipain1是第一個表達得到的癥原蟲半胱氨酸蛋白酶，生物學研究表明，它對瘧原蟲的無性生殖階段并無影響，但能顯著的影響卵囊的功能。Falcipain-2A，falcipain-2B具有97%的同源性，僅在氨基酸序列的7位有所不同。通過寡核苷酸探針的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，falcipain-2BmRNA的表達水平比falcipain-2A低。然而falcipain-2A和falcipain-2B在癥原蟲營養(yǎng)體晚期其表達的時間依賴性和峰值極為相似，這表明兩種不同的亞型具有相似的生物學功能。Falcipain-3與falcipain-2在催化域有66.6%的同源性，但是它們表達的階段有所不同。Falcipain-2在營養(yǎng)體階段表達達到最高峰，而falcipain-3在更為成熟的瘧原蟲階段表達達到高峰。在這幾種亞型中，對于falcipain-2的研究最多，因此其抑制劑的開發(fā)亦受到更為廣泛的關注。中醫(yī)中藥治療瘧疾已有很長的歷史，比如在《素問*剌虐論》中就提出了用針灸預防治療瘧疾，在中草藥方面，除了聞名世界的青蒿外，威靈仙、水蜈蚣、鴉膽子、常山、鵝不食草、檳榔、翻白草、石龍芮等也在民間用來治療瘧疾。從中藥青蒿中發(fā)現(xiàn)的活性化合物青蒿素用于治療瘧疾取得了很好的效果，廣泛用于臨床，為中草藥治療瘧疾開辟了一條新的道路。本發(fā)明人通過多年的基礎研究積累了2000多種，并建立了天然產物庫，通過對庫中化合物進行篩選，發(fā)現(xiàn)了抗瘧作用的黃酮類化合物。
發(fā)明內容本發(fā)明所要解決的技術問題在于從中藥黃酮類化合物中尋找具有抗虐活性的化合物。本發(fā)明提供了一種黃酮苷類化合物在制備治療瘧疾的藥物中應用。本發(fā)明所述的黃酮苷類化合物，具有以下結構通式之一種<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(B)式中&為香豆?；⒎词较愣辊；蚩Х弱；?；R2為香豆酰基、反式香豆?；?、咖啡?；驗闅洹＿@兩類黃酮苷類化合物分布在植物界的許多種植物中，可以從植物中分離得到，也可以用化學合成的方式獲得。所述的黃酮類化合物為Ste,alustrosideA、Ste,alustrosideD、銀椴苷、山奈酚3-0-13-(6"-咖啡?；咸堰拎擒?或山奈酚3-(2，4-di-E-p-香豆?；罄钐擒?。本發(fā)明所述的黃酮類化合物銀椴苷與Falcipain-2蛋白酶結合活性測定結果證明銀椴苷與FP-2蛋白有明顯的結合，結果顯示5個黃酮苷類化合物對falcipain-2酶均具有抑制作用，均有較好的體外抗瘧原蟲活性。顯示這5個化合物具有抗瘧疾作用，可用于制備治療瘧疾的藥物組合物。本發(fā)明另一目的是提供一組以所述黃酮苷類化合物為活性成分，用于治療由瘧原蟲引起的瘧疾的藥物組合物。本發(fā)明所述的藥物組合物含有治療有效量的黃酮類化合物為活性成分，以及含有一種或多種藥學上可接受的載體。其中活性成分在藥物組合物中的重量為5-95%。所述藥學上可接受的載體是指藥學領域常規(guī)的藥物載體，例如稀釋劑、賦形劑如水燈；填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如明膠、聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如碳酸鈣、碳酸氫鈉；吸收促進劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣、聚乙二醇等、另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。本發(fā)明化合物可以組合物的形式通過口服、鼻吸入、直腸或腸胃外給藥的方式施用于需要這種治療的患者。用于口服時，可將其職稱常規(guī)的固體制劑如片劑、顆粒劑、膠囊等或制成液體制劑如水或油懸浮劑、糖漿等；用于腸胃外給藥時，可將其制成注射用的溶液、水貨油性懸浮劑等。本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學領域的常規(guī)生產方法制備。例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。圖1陽性對照與FP-2蛋白相互作用的傳感圖圖2銀椴苷與FP-2蛋白相互作用的傳感圖圖l和圖2表示化合物與FP-2結合的動力學曲線圖，其中各條線由上到下代表的化合物濃度依次為1X10—5M、5X10—6M、2.5X10—6M、1.25X10—6M、6.25X10—7M、3.125X10—7M和0。具體實施例方式實施例1:Ste,alustrosideA、D的制備長苞冷杉干燥的地上部分22kg粉碎成粗粉，用200L的80%乙醇回流提取3次，每次3小時，合并提取液，減壓濃縮成25L稠浸膏。浸膏加10L水稀釋后分別以氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，收集各萃取部分，分別濃縮成浸膏。其中乙酸乙酯萃取部分的浸膏300g，以甲醇溶解過濾后進行硅膠柱色譜，以氯仿-甲醇梯度洗脫(io:ii:iov/V)，用薄層色譜檢查洗脫流分，具有相同單一斑點的流分合并，濃縮，得流分1-10，其中第1流分經進一步硅膠色譜純化，得到黃色無定形粉末，結構鑒定為StenopalustrosideD，共58mg，第2流分經進一步硅膠色譜純化，得到另一個黃色無定形粉末，結構鑒定為StenopalustrosideA，共76mg。StenopalustrosideA的結構如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>D的結構如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>實施例2:銀椴苷的制備取干燥蜀葵花5kg，用90%乙醇回流提取2次，每次2h，然后用50%乙醇回流提取2次，每次lh。提取液合并，減壓濃縮，浸膏加適量水，分別用石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇依次萃取。醋酸乙酯萃取部分50g經硅膠柱色譜分離，氯仿一甲醇(1:11:5V/V)系統(tǒng)梯度洗脫，反復常壓及減壓硅膠柱色譜分離，凝膠S印hadexLH—20柱純化，得到8個流分，其中第2流分濃縮干燥后為成黃色粉末狀，經結構鑒定為銀椴苷，共53mg。銀椴苷的結構式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>實施例3:山奈酚3-0-13-(6"-咖啡?；咸堰拎擒?的制備西藏冷杉干燥的地上部分10kg粉碎成粗粉，用150L的75X乙醇回流提取2次，每次3小時，合并提取液，減壓濃縮成15L稠浸膏。浸膏加8L水稀釋后分別以石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，收集各萃取部分分別濃縮成浸膏。其中氯仿萃取部分的浸膏1638，以甲醇溶解過濾后進行硅膠柱色譜，以氯仿-甲醇(1:11:5V/V)梯度洗脫，用薄層色譜檢查洗脫流分，具有相同單一斑點的流分合并，濃縮，得流分l-14，其中第8流分經進一步硅膠色譜純化，得到黃色無定形粉末，結構鑒定為山奈酚3-0-13-(6"-咖啡酰基葡萄吡喃糖苷)，共86mg。山奈酚3-0-13-(6"_咖啡?；咸堰拎擒?的結構式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>實施例4:山奈酚3-(2，4-di-E_p-香豆?；罄钐擒?西藏冷杉干燥的地上部分10kg粉碎成粗粉，用150L的75%乙醇回流提取2次，每次3小時，合并提取液，減壓濃縮成15L稠浸膏。浸膏加8L水稀釋后分別以石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，收集各萃取部分并濃縮成浸膏。其中乙酸乙酯萃取部分的浸膏109g，以甲醇溶解過濾后進行硅膠柱色譜，以氯仿-甲醇(i:ii:10V/v)梯度洗脫，用薄層色譜檢查洗脫流分，具有相同單一斑點的流分合并，濃縮，得流分l-6，其中第5流分濃縮干燥后得到黃色無定形粉末，結構鑒定為山奈酚3-(2，4-di-E-p-香豆?；罄钐擒?，共38mg。山奈酚3-(2，4-di-E_p-香豆?；罄钐擒?的結構式如下實施例5本發(fā)明化合物銀椴苷與Falcipain-2蛋白酶結合活性測定Falcipain-2蛋白酶與銀椴苷結合活性的篩選和動力學常數(shù)的測定基于SPR(表面等離子共振)原理，使用的儀器是Biacore3000(BiacoreAB，Uppsala，Sweden)。(1)Falcipain-2質粒(pQE30-Fa12)的構建根據Falcipain-2cDNA序列設計引物，正向和反向引物分另U為5，CGTGGATCCCAAATGAATTATGAAG3，和5，ATATGTCGACTTATTCAATTAATGGAATG3，，包含BamHI和SalI酶切位點，通過PCR擴增Falcipain-2片段，將酶切后的PCR產物和表達載體pQE30連接后鑒定正確，轉化入大腸桿菌M15(Qiagen)進行表達。(2)Falcipain-2(FP-2)蛋白的表達與純化將構建好的質粒pQE30-Fa12轉入大腸桿菌M15中得到表達工程菌，將工程菌培養(yǎng)于含100g/mL氨芐青霉素和50g/mL卡那霉素的10mLLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L)。然后按1:100轉接入1L含氨芐青霉素和卡那霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，37°CT，220轉/分培養(yǎng)。當0D600達到約0.8時，加入IPTG至終濃度0.5mM，同時將溫度降到25t:培養(yǎng)12小時進行蛋白的誘導表達。4000轉/分離心30分鐘收集菌體，收集好后放于-8(TC超低溫冰箱保存過夜。將菌體用20mL的緩沖液1(20mMTris-Cl，O.5MNaCl，and10mM咪唑，pH8.0)懸起，將懸浮液冰浴上超聲波破碎(300W，工作30分鐘，一次5秒，中間間隔10秒)。破碎后得到的細胞勻漿在4°C，以10000轉/分離心30分鐘，棄上清，用20mL的緩沖液2(6M胍HCl20mMTris_Cl250mMNaCl20mM咪唑，pH8.0)溶解沉淀，室溫下溫和攪拌1小時，10000轉/分離心30min，并將上清上樣到用綁定緩沖液(Bindingbuffer)2(6MguanidineHCl，20mMTris-Cl，250mMNaCl，pH8.0)平衡好的Ni"-NTA柱上，先后用沖洗緩沖液1(8M尿素，20mMTris-Cl，500mMNaClpH8.0)和沖洗緩沖液2(8M尿素，20mMTris-Cl，30mM咪唑)各30ml洗去非特異性結合的雜蛋白，再用洗脫緩沖液(8M尿素，20MmTris-Cl，1M咪唑)10ml洗去目的蛋白，用SDS-PAGE檢測蛋白的分子量和純度。(3)FP-2包涵體蛋白的復性將純化得到的蛋白加入10mMDTT，37。C下溫浴45分鐘后，將蛋白溶液稀釋到10g/ml進行透析(透析液100mMTris-Cl，lmMEDTA，20%甘油，250mML-精氨酸，lmM谷胱甘肽，lmM氧化型谷胱甘肽(GSSG)，pH8.0)過夜。將透析好的蛋白濃縮即可用作酶抑制活性的測定。(4)FP-2蛋白的偶聯(lián)徹底清洗Biacore3000機器后，用PBS緩沖液(10mM4_羥基哌嗪乙磺酸，150mMNaCl，3mMEDTAand0.005%(v/v)表面活性劑P20，pH7.4)平衡機器至基線平穩(wěn)。0.2MN-乙基-N'_二甲基氨丙基碳二亞胺和50mMMN-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)1:1混和，以5iiL/min進樣7分鐘以活化芯片表面。FP-2蛋白用10mM乙酸鈉，pH4.2，稀釋至終濃度為69iig/ml，以5iiL/min流速進樣。最后，用1M鹽酸乙醇胺，pH8.5以5yL/min流速進樣7分鐘，封閉芯片表面，最終FP-2蛋白的偶聯(lián)量為9300RU左右。(5)化合物篩選底物Z-Phe-Arg-pNAHC1(BachemAG)作為陽性對照。銀椴苷(實施例2制得)用100%匿SO溶解，母液濃度為10mM。用HBS-EP緩沖液稀釋化合物，至終濃度為1PM和10iiM，DMSO的終濃度為0.1%。根據銀椴苷與芯片上FP-2蛋白的結合的RU(ResponseUnit，共振單位)值，判斷化合物是否具有結合活性。有結合活性的化合物可進行詳細的動力學實驗。結果證明銀椴苷與FP-2蛋白有明顯的結合。[OOM](6)動力學測定銀椴苷用工作緩沖液HBS-EP(含O.1%匿SO)，分別配成不同的濃度梯度，以30iU/min進樣lmin，解離2min，然后用相同緩沖液穩(wěn)定2min。得到銀椴苷與FP-2蛋白相互作用的傳感圖，再用Biacore分析軟件中的l:1(Langmuir)結合模型或穩(wěn)態(tài)模型進行擬合，得到確切的動力學和熱力學常數(shù)。⑥試驗結果表1陽性對照和銀椴苷與FP-2蛋白結合常數(shù)的測試結果。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例6本發(fā)明化合物對falcipain-2蛋白酶百分抑制活性的測定(1)Falcipain-2(FP-2)蛋白的表達與純化和FP-2包涵體蛋白的復性參見實施例5(2)本發(fā)明化合物對FP-2酶抑制活性的測定在197iiL的100mMNaOAc，10mMDTT，pH5.5的buffer體系中加入FP-2蛋白(終濃度10g/ml)和溶于匿SO的待測化合物(實施例1-4制得)溶液，分別為StenopalustrosideA、StenopalustrosideD、銀椴苷、山奈酚3-0-P-(6"-咖啡?；咸堰拎擒?、山奈酚3-(2，4-di-E-p-香豆酰基鼠李糖苷)的溶液，終濃度10M和0M(陰性對照)，室溫下孵育30min后用MDSpectraMaxM5酶標儀于excitation(激發(fā)波長)355nm;emission(發(fā)射波長)460nm處連續(xù)測15min內的RFU值，計算出反應速率Km，以下列公式得出待測化合物在IOM下百分抑制率，計算公式為(對照組Km值-實驗組Km值)/對照組Km值X100%(3)化合物活性測試結果表2.黃酮苷類化合物對falcipain-2抑制率數(shù)據<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例7本發(fā)明化合物對falcipain-2蛋白酶半數(shù)有效抑制濃度(IC5。)的測定選取10M抑制率在50%以上的化合物測IC5。，選擇實施例1-4制得StenopalustrosideA、銀椴苷、山奈酚3_0_P-(6"-咖啡?；咸堰拎擒?的溶液，實驗方法和體系如實施例6。根據化合物在不同濃度下FP-2酶活的反應速率Km，計算化合物在不同濃度下對FP-2酶活的抑制率，使用Sigmoidal公式用origin軟件進行擬合得到化合物的ICs。值，結果見表3。表3.黃酮苷類化合物對falcipain-2酶活抑制IC5。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結果顯示上述黃酮苷類化合物對falcipain-2酶均具有抑制作用，提示上述化合物具有抗瘧疾作用。實施例7黃酮苷類化合物體外抗瘧活性測定抗癥活性可以通過測量癥原蟲LDH活性來確定(Jain，M.;Khan，S.I.;Tekwani，B丄；Jacob，M.R.;Singh，S.;Singh，P.P.;Jain，R.Synthesis,antimalarial,antileishmanial，andantimicrobialactivitiesofsome8_quinolinamineanalogues.Bioorg.Med.Chem.2005，13，4458-4466.)。在含10iiL連續(xù)稀釋測試樣本的96孔板的每個孔中加入感染了D6orW2株P.falciparum的紅細胞混懸液(200iiL，在RPMI1640培養(yǎng)集中加入10%人血清和601g/mL阿米卡星，使瘧原蟲血癥達到2%，紅細胞壓積達到2%)，然后用90%N2，5%02，and5%C02組成的混合氣體沖洗板，在培育房內培育72小時，溫度保持在37°C。LDH活性用MalstatTM試劑(FlowInc.，Portland,OR)測定，測定程序參照Makler禾口Hinrichs的程序(M.T.MaklerandD.J.Hinrichs,MeasurementofthelactatedehydrogenaseactivityofPlasmodiumfalciparumasanassessmentofparasitemia.J.Am.J.Trop.Med.Hyg.1993,48(2):205-210)。即將20iiL培育的混合物同100iiLheMalstat試劑混合，在室溫下培育30分鐘.然后加入20微升NBT/PES的混合物(NBT/PES比例為1:1)(Sig腿，St.Louis，MO)，在黑暗條件下培育1小時。之后，加入100iiL5%醋酸溶液終止這一反應，并用650nm來檢測板.藥物對照組中加入青蒿素和氯喹。從劑量-效應曲線中計算出IC5。。測定化合物抗瘧活性的選擇性指標時，也要測定他們在體外對哺乳動物細胞的毒性.測試在96孔組織培養(yǎng)板中進行(J.Mustafa,S.I.Khan，G.Ma，L.A.WalkerandI.A.Khan，SynthesisandAnticancerActivitiesofFattyAcidAnalogsofPodophyllotoxin.Lipids.2004，39(2):167-172.)。在96孔板中以25，000個/孔的密度種植非洲綠猴腎異倍體細胞并培育24小時.加入不同濃度的(實施例l-4制得化合物)樣品，分別為StenopalustrosideA、StenopalustrosideD、銀椴苷、山奈酚3-0-13-(6"-咖啡?；咸堰拎擒?、山奈酚3-(2，4-di-E-p-香豆?；罄钐擒?的DMS0溶液，濃度依次為528.8ng/ml、1586.4ng/ml、4760g/ml，繼續(xù)培育48小時。利用NeutralRedassay方法測定存活細胞數(shù)，從劑量-效應曲線中計算出IC5。.用阿霉素作為陽性對照藥物。黃酮苷類化合物的對D6和W2的IC5。值如下表菌輸cm，2StenopatetrosideA跳6StenopalustosMeD68,4165銀機苷'123106山奈鼢3-0-P-(6"-咖啡酰基葡萄吡喃糖卄)55.891.3山奈鼢3-a4-di-E-p-香.W?；髠€糖苷.)45.1術鍾P^爾、"土《26,4160胃筒M<26,4《26,4結果顯示，5個黃酮苷類化合物均有較好的體外抗瘧原蟲活性。權利要求一種黃酮苷類化合物在制備治療瘧疾的藥物中應用，其特征在于所述黃酮苷類化合物具有以下結構通式之一種式中R1為香豆?；?、反式香豆?；蚩Х弱；籖2為香豆?；?、反式香豆酰基、咖啡?；驗闅洹?.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述的黃酮苷類化合物從植物中提取或化學合成得到。3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述的藥物為治療由瘧原蟲引起的瘧疾的藥物。4.一種治療瘧疾的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物含有如權利要求l中所述的黃酮苷類化合物活性成分和藥學上可以接受的載體。5.根據權利要求3所述的藥物組合物，其特征在于活性成分在藥物組合物中的重量含量為5-95%。全文摘要本發(fā)明提供了一種黃酮苷類化合物在制備治療瘧疾的藥物中應用，尤其是在制備治療由瘧原蟲引起的瘧疾的藥物中應用。所述黃酮苷類化合物具有以下結構通式之一種式中R1為香豆?；?、反式香豆?；蚩Х弱；?；R2為香豆?；?、反式香豆酰基、咖啡?；驗闅?。試驗表明，該黃酮苷類化合物與FP-2蛋白有明顯的結合明顯的作用。因此，可用于制備治療瘧疾的藥物組合物。它含有黃酮苷類化合物活性成分和藥學上可以接受的載體，活性成分在藥物組合物中的重量含量為0.1-99.5％。藥物劑型可以是片劑、顆粒劑、膠囊、水或油懸浮劑、糖漿、注射液、或懸浮劑等。文檔編號A61K31/7048GK101693037SQ20091019747公開日2010年4月14日申請日期2009年10月21日優(yōu)先權日2009年10月21日發(fā)明者單磊,盧偉強,張衛(wèi)東,張壽德,李洪林,王立言,蘇娟,陳瞳,黃瑾申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學;華東理工大學;