專利名稱：：一種雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗佐劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種免疫佐劑，具體涉及一種專門針對雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗的免疫佐劑，及其制備方法。
背景技術(shù)：
：傳統(tǒng)免疫佐劑是通過富集免疫原(如鋁膠)、緩釋免疫原(如油乳劑)、激活單核吞噬細(xì)胞遞呈抗原(如卡介苗、細(xì)菌脂多糖)以及多種綜合作用(如不完全弗氏佐劑和完全弗氏佐劑)來實現(xiàn)對免疫原的強化免疫和改變免疫途徑的佐劑作用。動物機體在免疫原的剌激下主要發(fā)生哪類免疫反應(yīng)，主要取決于免疫佐劑激發(fā)哪一類輔助T細(xì)胞(Th)。Thl主要誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，它通過分泌IL-2、IFN-Y、TNF-b剌激T細(xì)胞發(fā)揮免疫反應(yīng)；Th2主要誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，它通過分泌IL-4、IL-5、IL-10剌激B細(xì)胞發(fā)揮免疫反應(yīng)，產(chǎn)生高水平的循環(huán)和分泌型抗體。鋁膠型疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)90X以上為Th2型，主要產(chǎn)生IgGl禾PIgA;卡介苗和細(xì)菌脂多糖型疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)為Thl型占主導(dǎo)地位。Morein首次提出免疫剌激復(fù)合物(ISCOM)，它是一個全新的免疫佐劑，由皂苷、膽固醇、磷脂等構(gòu)成的直徑為30-40nm的球形籠狀顆粒(CoxJC，SjolanderA，BarrIg.ISCOMsandothersaponinbasedadjuvants[J].AdvDragDeivRev，1998，32(3):247-271)。這種佐劑的特征在于通過皂苷高效地將免疫原遞呈給單核巨噬細(xì)胞，為免疫應(yīng)答奠定了強大的基礎(chǔ)。近年來，中藥免疫佐劑也層出不窮，比如蜂膠免疫佐劑、人參皂苷佐劑(ZL02110578.2)、當(dāng)歸多糖-內(nèi)酯復(fù)合免疫佐劑(ZL94115186.7)等等，它們都是利用中藥有效成分激活機體免疫來實現(xiàn)免疫佐劑作用的。但是，上述這些現(xiàn)有的免疫佐劑效果還不夠理想，一方面是由于這些免疫佐劑在同類疫苗中具有普適性，因而其作用基理缺乏對具體疾病的針對性，不能夠充分地激活基體的免疫；另一方面，這些佐劑在免疫原的加工制作過程中往往不能有效地保護免疫原的生物活性。基于上述技術(shù)背景，我們將以中醫(yī)藥歸經(jīng)原理制成的特定中藥多糖、中藥皂苷添加到免疫原溶液中，不僅利用水化膜原理在免疫原表面形成水化膜，保護了免疫原活性蛋白的的三維立體構(gòu)象和生物活性，而且能夠更有針對性地激活機體對本類疾病的免疫功能。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種新的免疫佐劑，它利用中藥歸經(jīng)特性不僅能夠針對具體病原充分激活機體免疫，而且能夠更加有效的保護免疫原的生物活性。本發(fā)明的目的還在于提供所述免疫佐劑的制備方法。所述發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)提供一種雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗佐劑，由以下重量份的組分組成9.5份中藥多糖、0.5份中藥皂苷、30份吐溫-20。所述的中藥多糖和中藥皂苷均提取自以下重量份的中藥原料桔梗100半夏80黃芩80金銀花80連翹80麥冬65山豆根40甘草50赤芍80玄參60白芍80生地黃45板藍根90牡丹皮75黃連60由于新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感是以肺臟為主的五臟六腑功能失調(diào)的烈性急性混合傳染病，所以建立了以歸肺經(jīng)為主兼五臟六腑為輔的清熱解毒方劑。其中歸肺經(jīng)中藥包括桔梗、半夏、黃芩、金銀花、連翹、麥冬和山豆根；歸脾經(jīng)中藥包括甘草和赤芍；歸腎經(jīng)中藥包括玄參；歸肝經(jīng)中藥包括白芍和生地黃；歸心經(jīng)中藥包括板藍根、牡丹皮和黃連。所述中藥多糖是本發(fā)明免疫佐劑的主要成分，它在水溶液中使免疫原優(yōu)先水化，起到蛋白保護劑的作用；在動物體內(nèi)通過每種中藥多糖特有的歸經(jīng)方式增強免疫原的免疫效果，起到免疫佐劑作用。所述中藥皂苷是表面活性分子物質(zhì)，它們都有親水-親脂的雙親功能。中藥皂苷的蛋白保護性和免疫佐劑作用很強；也以特有的歸經(jīng)方式增強免疫原的免疫效果，起到免疫佐劑作用。吐溫-20為親水性較強的表面活性物質(zhì)，親水親脂平衡值(HLB)在15.0以上。它主要作用是平衡佐劑的HLB，保持佐劑具有良好的水溶性。本發(fā)明還提供所述免疫佐劑的制備方法，是將中藥多糖、中藥皂苷以及吐溫-20按照所述比例混合，勻漿即制成本發(fā)明所述的雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗佐劑。其中，中藥多糖和中藥皂苷的提取可以通過現(xiàn)有技術(shù)中的多種手段實現(xiàn)，例如可以按照以下方法提取中藥多糖的提取按比例取所述中藥原料，經(jīng)水煎、濃縮、乙醇沉淀、洗滌沉淀物，再通過濃縮并干燥，即制得所述的中藥多糖；或?qū)⑶耙环椒ㄖ械玫降乃鍧饪s液經(jīng)活性炭柱層析，然后用水-乙醇洗滌液洗滌，再濃縮并干燥，即制得所述的中藥多糖(盧艷花，中藥有效成分提取分離技術(shù)，化學(xué)工業(yè)出版社，2005年1月第1版，295-314)。中藥皂苷的提取按比例取所述中藥原料，用乙醇或甲醇提取，回收溶劑，取殘渣餅用水溶解或混懸制成水溶液，然后再做如下的雙向萃取和純化a、往制成的水溶液中加入石油醚或乙醚，將水溶液中的親脂物質(zhì)色素和油質(zhì)回收，把中藥皂苷留在水溶液中；b、往a步制得的水溶液中加入親水性較強的有機溶劑丁醇，溶液中親水性較強的物質(zhì)繼續(xù)留在水溶液中，中藥皂苷轉(zhuǎn)移到有機溶劑萃取液中，收集有機溶劑萃取液，減壓干燥，制得粗制的中藥皂苷；c、將b步制得的粗制中藥皂苷溶于乙醇或甲醇中，再逐漸滴加乙醚、丙酮或乙醚-丙酮(i:i體積比)的混合液，至中藥皂苷從溶液中析出為止，去析出的中藥皂苷干燥即可制得中藥皂苷(盧艷花，中藥有效成分提取分離技術(shù)，化學(xué)工業(yè)出版社，2005年l月第1版，172-194)。本發(fā)明還提供所述佐劑在制備雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗中的應(yīng)用，其中，所述佐劑在制備得到的疫苗中所占的體積比為2.0%7.0%。本發(fā)明所述的雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗佐劑由兩大部分組成，其中中藥多糖和中藥皂苷是核心，輔助部分為吐溫-20。中藥多糖、中藥皂苷既有免疫增強的作用又有免疫原保護劑的作用。本發(fā)明利用它們實現(xiàn)了中藥歸經(jīng)、免疫佐劑和免疫原保護劑合三為一的目的。本發(fā)明所述佐劑的重要特征也體現(xiàn)在對中藥歸經(jīng)理論的有針對性的運用上。中藥歸經(jīng)是指中醫(yī)臨床用藥時，中藥通過經(jīng)絡(luò)的傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)輸，到達病所，發(fā)揮其防治作用的中藥應(yīng)用理論?，F(xiàn)代的中西醫(yī)結(jié)合研究和臨床實踐逐步證實了中醫(yī)之肺為免疫屏障，脾促進免疫功能，腎為免疫治本，肝助免疫活動，心參與和調(diào)節(jié)免疫，將免疫的臟腑理論和西醫(yī)的免疫理論有機地溝通起來，正確地指導(dǎo)了中藥在免疫學(xué)中的科學(xué)實驗和臨床應(yīng)用。中藥歸經(jīng)是以五臟六腑為中心的藥理作用原理，使用不同歸經(jīng)的中藥可以從不同的角度激發(fā)和增強機體免疫功能。歸肺脾腎經(jīng)的中藥能夠強化非特異免疫和特異免疫，增強單核細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬能力，增強淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，剌激T細(xì)胞分化、發(fā)育、成熟并分泌IL-1、IL-2和IFN-Y等淋巴因子，剌激B細(xì)胞分化、發(fā)育、成熟并分泌IgM、IgG、IgA等抗體；歸肝心經(jīng)的中藥能夠調(diào)節(jié)免疫功能，通過神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫三大系統(tǒng)的信息分子(如神經(jīng)肽、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、淋巴因子、細(xì)胞因子等)糾正免疫功能的紊亂。具體講，肺主氣屬衛(wèi)，外合皮毛(素問'五臟生篇)，不僅對外邪有機械屏障作用，而且通過粘膜的特殊結(jié)構(gòu)以其生理生化功能在分泌液、溶菌酶、IgA等的參與下發(fā)揮非特異和特異免疫功能。肺主氣，不單指氣體交換，也包括中醫(yī)的正氣，即通過肺吞噬細(xì)胞的吞噬、補體Q、Ce的生成、干擾素的產(chǎn)生、識別和處理抗原，激發(fā)、調(diào)節(jié)、參與機體免疫；脾主運化，主統(tǒng)血，為生化之源，后天之本。"脾為之衛(wèi)"(素問.五癃津液別篇)。衛(wèi)氣的生成，元氣的充沛，正氣的強弱，都有賴于脾胃的供養(yǎng)，脾氣的健旺。衛(wèi)氣、元氣、正氣概括了機體的部分免疫功能，脾是免疫活動的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。從現(xiàn)代免疫學(xué)的角度來看，中醫(yī)之脾包括解剖學(xué)中的脾，也包括單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)、淋巴結(jié)、散在的淋巴組織。單核吞噬細(xì)胞不僅用非特異免疫功能，同時可以啟動特異免疫功能；脾、淋巴結(jié)、散在的淋巴組織它們都是B細(xì)胞、T細(xì)胞存在的主要場所，因而也是細(xì)胞免疫和體液免疫的主要場所。因此，脾是免疫的核心；腎為先天之本，生命之根。腎藏精，主骨，生精(素問.痿論篇)，對單核細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞等許多免疫細(xì)胞以及與免疫相關(guān)的細(xì)胞的分化、發(fā)育、成熟和功能的發(fā)揮有著重要的激發(fā)作用；肝主疏泄，調(diào)達一身之氣，使五臟六腑功能舒暢而不發(fā)生障礙，從而保證了機體的正常活動。中醫(yī)的肝包括了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的肝在內(nèi)，肝內(nèi)的吞噬細(xì)胞可以吞噬經(jīng)血液從消化道帶來的微生物等異物，處理并遞呈抗原決定簇與B細(xì)胞、T細(xì)胞，發(fā)動免疫反應(yīng)。肝氣不暢，神經(jīng)紊亂，內(nèi)分泌失調(diào)，削弱了機體的免疫力，因此肝是不可忽視的免疫環(huán)節(jié)；心主血脈，主神志(素問.靈蘭秘典篇)。這說明心可以通過血液組分、血流循環(huán)、血管內(nèi)皮、大腦皮層、部分植物神經(jīng)、長神經(jīng)叢等影響免疫功能。本發(fā)明運用上述中藥歸經(jīng)理論，選擇和配制了特定的中藥配方作為中藥多糖和中藥皂苷的來源，進一步強化了免疫佐劑對機體免疫功能的激發(fā)和調(diào)動。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的免疫佐劑具有以下有益效果1.具有免疫原保護劑作用本發(fā)明所述的佐劑是利用富含羥基的中藥多糖和親水親脂的中藥皂苷，構(gòu)建多維網(wǎng)絡(luò)空間氫鍵結(jié)構(gòu)，在免疫原表面形成假性水化膜，通過這種多維網(wǎng)絡(luò)空間氫鍵假性水化膜實現(xiàn)本發(fā)明佐劑對免疫原的保護作用。在這兩種必須材料中，中藥多糖好像鋼筋、水泥、磚瓦一樣，依免疫原以氫鍵(鍵能42KJ/mol)粘結(jié)在一起形成多維網(wǎng)絡(luò)空間，為免疫原搭建了大廈居所；中藥皂苷就像鉚釘一樣，親水基團以氫鍵和中藥多糖的羥基結(jié)合，親脂基團以疏水鍵和免疫原的疏水基團結(jié)合，將免疫原牢牢固定在中藥多糖多維網(wǎng)絡(luò)空間內(nèi)；這樣形成了穩(wěn)定、堅固的多維網(wǎng)絡(luò)空間氫鍵假性水化膜，更好地保護免疫原免受外界環(huán)境的破壞。當(dāng)免疫原在加工制作、貯用時，中藥多糖形成的多維網(wǎng)絡(luò)空間首先接受外界熱能而水并無序地運動起來，但是由于多維網(wǎng)絡(luò)空間的結(jié)構(gòu)特點，致使中藥多糖分子上的羥基在失水時能即刻與免疫原表面的氨基和羥基等直接形成氫鍵，導(dǎo)致了整個分子運動趨于零。這種多維網(wǎng)絡(luò)空間氫鍵假性水化膜鈍化了免疫原對外界熱能的感應(yīng)，減輕了免疫原分子內(nèi)部次生鍵的振動和肽鏈的延伸，保持了免疫原的三位構(gòu)象和生物活性。所以，本發(fā)明佐劑具有顯著的免疫原保護劑的效果。因此使用本發(fā)明的免疫佐劑可以使免疫原更加穩(wěn)定、更耐存儲和更易運輸。相關(guān)實驗如下1、使用本發(fā)明實施例4制備的雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗和常規(guī)油乳劑制備的雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗，置于37t:環(huán)境中，保存1月后，應(yīng)用到下一步的臨床試驗中。2、將30日齡SPF雞40只，每組10只，分成4組。1組為本發(fā)明實施例4制備的疫苗37t:處理實驗組，每只SPF雞皮下注射37t:處理的本發(fā)明實施例4制備的疫苗0.5ml;2組為常規(guī)油乳劑苗37t:處理實驗組，每只SPF雞皮下注射37°C處理的常規(guī)油乳劑苗0.5ml;3組為本發(fā)明實施例4制備的疫苗低溫保存實驗組，每只SPF雞皮下注射2-8t:保存本發(fā)明實施例4制備的疫苗0.5ml;4組為常規(guī)油乳劑苗低溫保存實驗組，每只SPF雞皮下注射2-8t:保存常規(guī)油乳劑苗0.5ml。28日后，分別采血，分離血清，測定HI抗體效價。結(jié)果見下表l.表l.本發(fā)明佐劑制備的疫苗與現(xiàn)有技術(shù)疫苗耐熱、耐儲存效果的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從上表可見，本實驗結(jié)果充分展示了本發(fā)明佐劑制備的雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗的耐熱特性。一方面，本發(fā)明佐劑制備的疫苗在置于37t:環(huán)境中保存l月后，仍然能對雞產(chǎn)生非常好的免疫效果，與低溫保存下的產(chǎn)品沒有明顯區(qū)別；而通過同樣方法處理過的常規(guī)油乳劑疫苗免疫雞后，雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感的四種HI抗體效價與低溫保存的相同產(chǎn)品相比出現(xiàn)大幅度下降，失去了免疫預(yù)防效果。另一方面，在2-『C低溫保存下，本發(fā)明佐劑制備的雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗免疫效果同樣明顯高出常規(guī)油乳劑雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗。從而說明了本發(fā)明佐劑對免疫原的保護作用和強化免疫功效。2.具有增強免疫的免疫佐劑作用本發(fā)明佐劑的主要成分是中藥提取物中藥多糖和中藥皂苷，依據(jù)前述的中藥歸經(jīng)理論，本發(fā)明免疫佐劑中的中藥多糖和重要皂苷能夠保護免疫器官、增加免疫器官重量、增強單核吞噬細(xì)胞功能、增強T細(xì)胞功能、增強B細(xì)胞功能、增強NK細(xì)胞功能、增加補體含量和增強補體活性、誘生IL-1、IL-2、IFN、CSF、TNF等細(xì)胞因子，有效地激發(fā)和調(diào)節(jié)免疫功能。所以，本發(fā)明佐劑必然體現(xiàn)出增強免疫的免疫佐劑特征。3.本發(fā)明佐劑具有中藥歸經(jīng)的特殊藥理作用本發(fā)明佐劑首先利用中藥多糖分子多維網(wǎng)絡(luò)空間繼承了傳統(tǒng)免疫佐劑富集和緩釋免疫原的特點，同時通過激活單核吞噬細(xì)胞實現(xiàn)類似弗氏佐劑的特點；其次也利用中藥皂苷遞呈免疫原的作用而繼承了免疫剌激復(fù)合物(ISCOM)的特點。但本發(fā)明佐劑不是簡單地繼承了已有免疫佐劑的藥理特點，而是在中醫(yī)經(jīng)絡(luò)理論的指導(dǎo)下，應(yīng)用中藥歸經(jīng)的臨床實踐，賦予佐劑顯著的中醫(yī)藥理作用特色，從不同的角度強化了免疫原的免疫性能有的從肺經(jīng)出發(fā)強化單核吞噬細(xì)胞的吞噬和遞呈抗原作用，有的從脾經(jīng)出發(fā)直接剌激T細(xì)胞和B細(xì)胞功能，有的從腎、肝、心經(jīng)出發(fā)通過各種神經(jīng)因子、激素因子和免疫因子在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫三大系統(tǒng)間調(diào)節(jié)免疫功能，有的應(yīng)用綜合歸經(jīng)原理全面調(diào)動機體的免疫功能。以上第2、3點的有益效果可以由以下實驗進一步證明使用本發(fā)明佐劑制備的雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗的臨床預(yù)防效果實驗受試雞情況受試雞群為即將開始產(chǎn)蛋的雞群，品種不受限制，飼養(yǎng)在曾經(jīng)流行過雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感感染的老疫區(qū)。疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)對實驗中死亡的病雞進行病理剖解診斷，確診標(biāo)準(zhǔn)1、雞新城疫以病雞腺胃乳頭出血、肌胃角質(zhì)膜下出血、小腸有島嶼狀出血壞死為主要特征，兼下列任意兩項或多項癥狀(1)、病雞雞冠紫紅發(fā)黑，體溫升高，呼吸困難，甩頭流鼻涕；(2)、歪脖點頭，翅下垂腿麻痹，拉黃綠色稀便；(3)、全身粘膜、漿膜出血，盲腸淋巴結(jié)出血，直腸出血；(4)、卵泡出血、變形，輸卵管、子宮出血。2、傳染性支氣管炎(1)、病雞張嘴呼吸，伸頸打噴嚏，氣管啰音；(2)、產(chǎn)蛋率下降，產(chǎn)軟蛋、畸形蛋，卵清稀薄；(3)、氣管粘膜水腫，存有透明粘液，氣管和支氣管交界處有干酪樣阻塞物；(4)、卵泡出血破裂，輸卵管及子宮水腫、出血，腎腫大有時呈花般腎。3、減蛋綜合征(1)、產(chǎn)蛋率下降，產(chǎn)軟蛋、無殼蛋及畸形蛋；(2)、卵泡發(fā)炎、變形、萎縮，輸卵管萎縮，子宮粘膜水腫。4、禽流感以病雞氣管充血、出血和腺胃乳頭化膿性出血、肌胃角質(zhì)膜下出血、腺胃和肌胃間出血為主要特征，兼下列任意兩項或多項癥狀(1)、病雞雞冠紫紅發(fā)黑，術(shù)益升高，呼吸困難，甩頭流鼻涕，臉腫，拉黃綠色稀便；(2)、全身粘膜、漿膜出血；(3)、卵泡變形易破裂，輸卵管內(nèi)有白色分泌物。[OO77]實驗及觀察方法在雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感感染的老疫區(qū)的雞場，將蛋雞群分為三組，即本發(fā)明實施例4制備的雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗免疫組(A)、常規(guī)雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗免疫組(B)和非免疫組(C)。在蛋雞開產(chǎn)28和14天時，A、B組分別使用相應(yīng)的疫苗進行免疫，C組注射生理鹽水，方法是疫苗組每雞肌肉注射0.5ml四聯(lián)滅活疫苗，生理鹽水組每只雞肌肉注射0.5ml生理鹽水。然后飼養(yǎng)100天，在整個飼養(yǎng)期間對發(fā)病雞行進跟蹤診斷，確定是否由雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征和禽流感引起，并統(tǒng)計病雞數(shù)，按以下方法計算出疫苗免疫保護率疫苗免疫保護率=(免疫數(shù)-發(fā)病數(shù))/免疫數(shù)X100%實驗結(jié)果實驗結(jié)束后統(tǒng)計實驗結(jié)果得知，本發(fā)明免疫佐劑制備的雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗免疫組(A)的免疫保護率88.36%，發(fā)病率11.64%;而常規(guī)雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗免疫組(B)的免疫保護率83.49%，發(fā)病率16.51%;生理鹽水組(C)的雞由雞新城疫、傳染性8支氣管炎、減蛋綜合征和禽流感引起發(fā)病，發(fā)病率93.58%。通過應(yīng)用生物統(tǒng)計學(xué)分別對三個實驗組的保護率進行兩兩t檢驗，充分表明它們相互之間都存在極顯著差異(u>2.58，p<0.01)，因此證明了本發(fā)明免疫佐劑制備的雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗的免疫保護效果優(yōu)于常規(guī)雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗。具體實驗結(jié)果見表2。表2.各實驗組的免疫保護效果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注表中"""均表示與同指標(biāo)的其他組數(shù)據(jù)比較具有高度顯著性差異。具體實施例方式下面通過具體實施例來進一步說明本發(fā)明的特征。實施例1.制取中藥多糖來源桔梗100公斤、半夏80公斤、黃芩80公斤、金銀花80公斤、連翹80公斤、麥冬65公斤、山豆根40公斤、甘草50公斤、赤芍80公斤、玄參60公斤、白芍80公斤、生地45公斤、板藍根90公斤、牡丹皮75公斤、黃連60公斤。制備a、將實施例1所述的中藥方劑原料切碎、洗凈后，用冷水浸泡2小時至藥心充分浸透，再加入原料重量的12倍的水，加熱至沸騰后在9(TC的情況下，在熱回流濃縮工藝下煎煮180分鐘同時濃縮得到濃縮藥液。b、將a制備的濃縮藥液，再通過10000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，棄去沉淀物，獲得上清液并經(jīng)負(fù)壓濃縮，使其形成干物質(zhì)為25%的濃縮藥液。c、將b的濃縮藥液加4-8倍的95%的乙醇，靜置過夜，棄去乙醇上清液，沉淀物水浴加熱除去乙醇或負(fù)壓蒸餾除去乙醇，然后加水溶解并通過100KD濾膜過濾，除去雜蛋白、內(nèi)毒素等大分子雜質(zhì)，收集濾過液再通過1KD納濾膜過濾，除去有機小分子和無機分子及離子等雜質(zhì)，被截留的物質(zhì)稀釋后逆向水流透析24小時；取出濃縮至少量體積，加5倍量99%乙醇沉淀，攪拌，靜置過夜，3000-5000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；沉淀物除去乙醇并經(jīng)過噴霧干燥，即為中藥多糖。實施例2.中藥皂苷的制備將實施例l所述的中藥方劑原料切碎、洗凈后，用乙醇或甲醇提取，回收溶劑，取殘渣餅用水溶解或混懸制成水溶液，然后再做雙向萃取和純化a、往水溶液中加入石油醚或乙醚，將水溶液中的親脂物質(zhì)色素和油質(zhì)回收，把中藥皂苷留在水溶液中；b、往a步制得的水溶液中加入親水性較強的有機溶劑丁醇，溶液中親水性較強的物質(zhì)繼續(xù)留在水溶液中，中藥皂苷轉(zhuǎn)移到有機溶劑萃取液中，收集有機溶劑萃取液，減壓干燥，制得粗制中藥皂苷；C、將b步制得的粗制中藥皂苷溶于乙醇或甲醇中，再逐漸滴加乙醚、丙酮或乙醚-丙酮(l:l)的混合液，至中藥皂苷從溶液中析出為止，去析出的中藥皂苷干燥即可制得中藥皂苷。實施例3.本發(fā)明的佐劑合成將實施例1中藥多糖、實施例2中藥皂苷以及市購?fù)聹?20按照本發(fā)明佐劑的特征組成和重量公斤數(shù)，即中藥多糖9.5公斤、中藥皂苷0.5公斤、吐溫-2030公斤混合，10000轉(zhuǎn)/分鐘高速切割勻漿，即制成本發(fā)明的雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗佐劑。實施例4.本發(fā)明佐劑在雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗制備中的應(yīng)用雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗系用雞新城疫病毒LaSota株、傳染性支氣管炎病毒M41株、禽流感H9N2亞型A/chicken/HenanPuyang/2/98(H9N2)株(即HP株)分別接種雞胚培養(yǎng)，減蛋綜合征病毒Z16株接種鴨胚培養(yǎng)，收集胚液，超濾濃縮，經(jīng)甲醛溶液滅活后，加入本發(fā)明的雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗佐劑和常規(guī)礦物油佐劑混合乳化制成。1毒種制造本品用的毒種為雞新城疫病毒LaSota株、傳染性支氣管炎病毒M41株、減蛋綜合征病毒Z16、禽流感病毒H9N2亞型A/chicken/HenanPuyang/2/98(H9N2)株(即HP株)；效檢用強毒為雞新城疫病毒北京株(CVCCAV1611株)、禽流感病毒H9N2亞型HP株。LaSota株、M41株和雞新城疫病毒北京株(CVCCAV1611株)由中國獸藥監(jiān)察所鑒定、保存和供應(yīng)；其余由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究所鑒定、保管和供應(yīng)。2疫苗制造及半成品檢驗2.1按照農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)《雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感(H9亞型)四聯(lián)滅活疫苗(LaSota株+M41株+Z16株+HP株)制造及檢驗試行規(guī)程》進行半成品生產(chǎn)及檢驗。2.2將檢驗合格的半成品進行濃縮，得到應(yīng)用本發(fā)明佐劑的雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗用毒液。2.3滅活及滅活檢驗將毒液進行滅活，按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行滅活檢驗，檢驗合格后備用。3雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗的制備3.1油相制備按體積份取94份注射用白油，和6份司本-80，混合后加熱，然后在得到的溶液中加入硬脂酸鋁2重量份(即按照2g/100ml的比例添加)，隨加隨攪拌至透明為止，高壓滅菌，冷卻后備用。3.2本發(fā)明的雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗佐劑水相制備取本發(fā)明實施例3合成的免疫佐劑412^(v/v^)，分別裝入4個罐中，滅菌，冷卻，再分別加入雞新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、減蛋綜合征病毒和禽流感H9N2亞型病毒的滅活胚液各9688^(v/v^)，充分振搖，直至本發(fā)明完全溶解，分別制成4種水相。3.3乳化按體積份計，取3.1步制備的油相3份置油相罐內(nèi)，開動電機慢速攪拌，同時分別徐徐加入3.2步制備的4種水相各1份，加完后再以10000r/min攪拌2-5分鐘，在終止攪拌前，再按照lg/100ml的比例加入硫柳汞溶液，使硫柳汞最終重量百分比濃度為0.01%。乳化后，取樣3-5ml，以3000r/min離心15分鐘，應(yīng)不分層。分別制成雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征和禽流感H9N2亞型4種單苗后，將4種單苗等體積在乳化罐內(nèi)充分混合，即制成四聯(lián)苗。3.4分裝定量分裝，加蓋密封。4成品檢驗4.1性狀外觀黃白色乳劑。劑型油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，應(yīng)呈油滴狀不擴散。穩(wěn)定性取疫苗10ml，裝于離心管中，以3000r/min離心15min，管底析出的水相應(yīng)不大于0.5ml。粘度用lml吸管(下口內(nèi)徑為1.2mm，上口內(nèi)徑為2.7mm)，吸取25"左右疫苗lml，令其垂直自然流出，記錄流出0.4ml所需時間，應(yīng)在8秒鐘以內(nèi)。4.2無菌檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應(yīng)無菌生長。4.3安全檢驗用1-2月齡SPF雞10只，每只肌肉或皮下注射疫苗lml，觀察14日，應(yīng)不出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部或全身反應(yīng)。4.4效力檢驗4.4.1雞新城疫部分采用血清學(xué)方法進行檢驗，結(jié)果不符合規(guī)定時，可采用免疫攻毒法進行檢驗。4.4丄1血清學(xué)方法用30-60日齡SPF雞15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20iU，另5只作對照。接種后21-28日，每只雞各采血，分離血清，進行HI抗體效價測定。免疫組HI抗體效價的幾何平均值應(yīng)不低于1:16，對照組HI抗體效價的幾何平均值應(yīng)不高于l:4。4.4丄2免疫攻毒法用30-60日齡SPF雞15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20iU，另5只作對照。接種后21-28日，每只雞分別肌肉注射雞新城疫病毒北京株強毒(CVCCAV1611株)105.0ELD50，觀察14日。對照組應(yīng)全部死亡，免疫組應(yīng)至少保護7只。4.4.2雞傳染性支氣管炎部分用14-42日齡齡SPF雞20只，各點眼接種雞傳染性支氣管炎活疫苗(H120株)1羽份，接種后21-28日分別采血，分離血清，同時再各接種本疫苗0.5ml，二次接種后21-28日再分別采血，分離血清。將兩次血清分別作HI抗體效價測定。二免血清HI抗體效價的幾何平均值(GMT)應(yīng)較首免血清HI抗體效價的幾何平均值高3倍以上。4.4.3雞減蛋綜合征部分用21-42日齡SPF雞10只，每只肌肉或皮下注射疫苗0.5ml，另取SPF雞IO只作對照。21-35日后，分別采血，分離血清，測定HI抗體效價。免疫雞HI抗體效價幾何平均滴度應(yīng)不低于1:128，對照雞HI抗體效價應(yīng)不高于1:4。4.4.4禽流感部分取2142日齡SPF雞15只，其中10只各頸部皮下注射疫苗0.3ml，另5只不接種，作為對照，21日后，分別采血，分離血清，用H9亞型HP株禽流感抗原測定HI抗體效價。免疫雞HI抗體幾何平均滴度應(yīng)不低于1:64，對照雞HI抗體效價應(yīng)不高于l:4。4.5甲醛、硫柳汞含量測定分別按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應(yīng)符合獸用生物制品通則規(guī)定。5作用與用途用于預(yù)防雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感，成年雞免疫期為4個月。6用法與用量頸部皮下或肌肉注射。開產(chǎn)前一個月左右種雞、蛋雞，每只0.5ml。權(quán)利要求一種雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗佐劑，其特征在于它由以下重量份的組分組成9.5份中藥多糖、0.5份中藥皂苷、30份吐溫-20；所述的中藥多糖和中藥皂苷均提取自以下重量份的中藥原料桔梗100半夏80黃芩80金銀花80連翹80麥冬65山豆根40甘草50赤芍80玄參60白芍80生地黃45板藍根90牡丹皮75黃連602.權(quán)利要求1所述的疫苗佐劑，其特征在于，所述的中藥多糖是按照以下方法提取的1)將所述中藥原料切碎、洗凈后，用冷水浸泡2小時至藥心充分浸透，再加入原料重量的12倍的水，加熱至沸騰后在9(TC的情況下，在熱回流濃縮工藝下煎煮180分鐘同時濃縮得到濃縮藥液；2)將步驟1)制備的濃縮藥液，再通過10000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，棄去沉淀物，獲得上清液并經(jīng)負(fù)壓濃縮，使其形成干物質(zhì)為25%的濃縮藥液；3)將步驟2)得到的濃縮藥液加4-8倍的95%的乙醇，靜置過夜，棄去乙醇上清液，沉淀物水浴加熱除去乙醇或負(fù)壓蒸餾除去乙醇，然后加水溶解并通過IOOKD濾膜過濾，除去雜蛋白、內(nèi)毒素等大分子雜質(zhì)，收集濾過液再通過1KD納濾膜過濾，除去有機小分子和無機分子及離子等雜質(zhì)，被截留的物質(zhì)稀釋后逆向水流透析24小時；取出濃縮至少量體積，加5倍量99%乙醇沉淀，攪拌，靜置過夜，3000-5000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；沉淀物除去乙醇并經(jīng)過噴霧干燥，即為中藥多糖。3.權(quán)利要求1所述的疫苗佐劑，其特征在于，所述的中藥皂苷是按照以下方法提取的按所述比例取所述中藥原料，用乙醇或甲醇提取，回收溶劑，取殘渣餅用水溶解或混懸制成水溶液，然后再做如下的雙向萃取和純化a、往水溶液中加入石油醚或乙醚，將水溶液中的親脂物質(zhì)色素和油質(zhì)回收，把中藥皂苷留在水溶液中；b、往a步制得的水溶液中加入親水性較強的有機溶劑丁醇，溶液中親水性較強的物質(zhì)繼續(xù)留在水溶液中，中藥皂苷轉(zhuǎn)移到有機溶劑萃取液中，收集有機溶劑萃取液，減壓干燥，制得粗制中藥皂苷；c、將b步制得的粗制中藥皂苷溶于乙醇或甲醇中，再逐漸滴加乙醚、丙酮或體積比為l:l的乙醚-丙酮混合液，至中藥皂苷從溶液中析出為止，將析出的中藥皂苷干燥即可制得所述的中藥皂苷。4.權(quán)利要求1所述的雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗佐劑的制備方法，包括以下步驟按照所述比例，將所述的中藥多糖、中藥皂苷以及吐溫-20混合勻漿，即制成本發(fā)明所述的雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗佐劑。5.權(quán)利要求1所述的疫苗佐劑在制備雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗中的應(yīng)用，其特征在于所述佐劑在制備得到的疫苗中所占的體積比為2.0%7.0%。全文摘要本發(fā)明提供一種雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感四聯(lián)滅活疫苗佐劑，它由以下重量份的組分組成9.5份中藥多糖、0.5份中藥皂苷、30份吐溫-20；所述的中藥多糖和中藥皂苷均提取自以下重量份的中藥原料桔梗100、半夏80、黃芩80、金銀花80、連翹80、麥冬65、山豆根40、甘草50、赤芍80、玄參60、白芍80、生地黃45、板藍根90、牡丹皮75、黃連60。本發(fā)明的疫苗佐劑在疫苗的加工、貯用過程中對免疫原具有顯著的保護作用，并能引導(dǎo)免疫原在特定的機體部位產(chǎn)生特定的免疫反應(yīng)，它實現(xiàn)了中藥歸經(jīng)、免疫佐劑和免疫原保護劑合三為一的目的。文檔編號A61P31/14GK101690810SQ20091018091公開日2010年4月7日申請日期2009年10月21日優(yōu)先權(quán)日2009年10月21日發(fā)明者張亞坤,張勇飛,李尚波,武潔梅,米宏有,胥桂華,苗玉和,蔣玉文,高英杰申請人:張勇飛;遼寧益康生物制品有限公司