專利名稱：：一種皮膚組織工程種子細(xì)胞的擴增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種組織工程種子細(xì)胞的培養(yǎng)方法，具體地說涉及一種用于構(gòu)建組織工程皮膚或直接應(yīng)用于燒傷及慢性潰瘍的治療的種子細(xì)胞培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：在燒傷及慢性潰傷口的治療中，組織工程的方法一直扮演著重要的角色。正常傷口愈合的過程中，表皮細(xì)胞起著重要的作用，因此在創(chuàng)傷愈合過程中利用合適的方法將表皮細(xì)胞遞呈到傷口處，是促進(jìn)創(chuàng)傷愈合及誘導(dǎo)局部皮膚再生的重要方法。在組織工程中使用的方法中有培養(yǎng)的表皮細(xì)胞膜片、表皮細(xì)胞懸液、以及使用表皮細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞等與支架材料復(fù)合的組織工程皮膚等方法。1975年liheinwald和Green0heinwaldJG,GreenH:Serialcultivationofstrainsofhumanepidermalkeratinocytes:theformationofkeratinizingcoloniesfromsinglecells.Cell1975,6(3):331-343.)利用3T3成纖維細(xì)胞作為滋養(yǎng)層，建立了表皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)后，1981年，O'Connor等應(yīng)用此方法在體外培養(yǎng)出適于移植的人自體表皮細(xì)胞膜片，成功地修復(fù)2例燒傷后的肉芽創(chuàng)面。隨后Limat等取自體毛囊外根鞘細(xì)胞(含毛囊干細(xì)胞)體外培養(yǎng)后移植到小腿潰瘍創(chuàng)面，80%的患者在23周內(nèi)創(chuàng)面由與周邊皮膚相似的新生表皮覆蓋。此后許多國家都有使用表皮細(xì)胞膜片治療燒傷創(chuàng)面及慢性潰瘍性傷口的成功報道，2008年基于表皮細(xì)胞膜片的產(chǎn)品Epicel通過了美國FDA的批準(zhǔn)用于燒傷創(chuàng)面的治療。這些表皮膜片使用成功的案例都說明表皮細(xì)胞在皮膚缺損的治療中具有非常重要的作用，但是由于細(xì)胞膜片的缺乏真皮基質(zhì)，傷口愈合質(zhì)量不佳。使用表皮細(xì)胞懸液的方法也是在組織工程中常用的治療燒傷及慢性潰瘍的方法，這種表皮細(xì)胞懸液可以是通過取自體的小塊皮膚，經(jīng)過胰酶消化后為經(jīng)過進(jìn)一步培養(yǎng)的表皮細(xì)胞懸液，具有代表性的商品是ReCell，GravanteG(GravanteG，DiFedeMC，AracoA,GrimaldiΜ,DeAngelisB,ArpinoA,CervelliV,MontoneA:ArandomizedtrialcomparingReCellsystemofepidermalcellsdeliveryversusclassicskingraftsforthetreatmentofdeeppartialthicknessburns.Burns2007,33(8):966-972.)使用經(jīng)過ReCell處理的表皮細(xì)胞懸液對燒傷創(chuàng)面進(jìn)行治療，并與自體皮片移植作為對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表皮細(xì)胞懸液的窗口愈合速度不及自體皮片移植，但取皮處沒有留下術(shù)后疼痛，總體的皮膚植入情況兩組相似。另一種產(chǎn)品CellSpray則是將表皮細(xì)胞進(jìn)行一段時間的擴增，一般為五天的時間，在將擴增后的表皮細(xì)胞懸液噴灑于創(chuàng)面，用于燒傷的治療。SchlabeJ(SchlabeJ,JohnenC,SchwartlanderR,MoserV,HartmannB,GerlachJC,KuntscherMVJsolationandcultureofdifferentepidermalanddermalcelltypesfromhumanscalpsuitableforthedevelopmentofatherapeuticalcellspray.Burns2008,34(3):376-384.)將培養(yǎng)的表皮細(xì)胞膜片消化成單細(xì)胞懸液對燒傷創(chuàng)面進(jìn)行治療，也收到了良好的效果。這種細(xì)胞懸液用于治療燒傷創(chuàng)面的成功進(jìn)一步表明了角質(zhì)細(xì)胞在傷口愈合中的關(guān)鍵作用。表皮細(xì)胞向創(chuàng)面遞呈的另一種方法是所謂的組織工程皮膚的構(gòu)建方法，這種方法考慮了皮膚的天然結(jié)構(gòu)一真皮的因素，利用真皮支架材料復(fù)合表皮細(xì)胞及成成纖維細(xì)胞等，制成含細(xì)胞的組織工程皮膚，此處所用的細(xì)胞則被稱為組織工程皮膚種子細(xì)胞。此類組織工程皮膚中具有代表性的產(chǎn)品有OrCel和Apligraf，這種組織工程皮膚有兩層下層為混合有成纖維細(xì)胞的凝膠層，上層為表皮細(xì)胞層，經(jīng)過一段時間的浸沒式培養(yǎng)后改為氣液界面培養(yǎng)，可以促進(jìn)上層的表皮細(xì)胞復(fù)層化。其它的構(gòu)建方法是將角質(zhì)細(xì)胞復(fù)合于預(yù)先制備的真皮支架上，再進(jìn)行浸沒及氣液界面的培養(yǎng)，如HorchRE(HorchRE,BannaschH，StarkGB:Culturedhumankeratinocytesasasinglecellsuspensioninfibringluecombinedwithpreserveddermalgraftsenhanceskinreconstitutioninathymicmicefull-thicknesswounds.EuropeanJournalofPlasticSurgery1999，22(5-6):237-243.)報道了將無血清法培養(yǎng)的角質(zhì)細(xì)胞與纖維蛋白膠混合與脫細(xì)胞真皮支架復(fù)合用于治療裸鼠全層皮膚缺損的治療并取得了良好的效果。BarmaschiKBarmaschH,UnterbergΤ,FohnΜ,WeyandB,HorchRE,StarkGBCulturedkeratinocytesinfibrinwithdecellulariseddermiscloseporcinefull-thicknesswoundsinasinglestep.Burns2008,34(7):1015-1021.)用類似的方法一次性治愈了豬的全層皮膚缺損的傷口，與先前的使用真皮支架antegra)先覆蓋傷口，等傷口肉芽組織形成后再進(jìn)行二次植皮或移植表皮細(xì)胞膜片的方法相比，這種方法具有更好的應(yīng)用價值。其它的遞呈方法還包括將表皮細(xì)胞與微球復(fù)合的遞呈方法，最近GustafsonCJ(GustafsonCJ,BirgissonA，JunkerJ，HussF，SalemarkL，JohnsonH，KratzG!Employinghumankeratinocytesculturedonmacroporousgelatinspherestotreatfullthickness-wounds:aninvivostudyonathymicrats.Burns2007,33(6):726-735.)使用多孔明膠微球作為表皮細(xì)胞的遞呈方式，治愈了裸鼠的全層皮膚缺損的傷口；LiuJY(LiuJY,HafnerJ,DragievaG,SeifertB,BurgG!Autologousculturedkeratinocytesonporcinegelatinmicrobeadseffectivelyhealchronicvenouslegulcers.WoundRepairRegen2004,12(2):148-156.)則使用了商業(yè)化的Cultisper明膠微球攜帶角質(zhì)細(xì)胞對小腿的慢性潰瘍進(jìn)行了治療，取得了良好的效果。用于組織工程皮膚構(gòu)建及大面積燒傷治療的表皮細(xì)胞的培養(yǎng)一直是一個難題，原因在于表皮細(xì)胞在體外的培養(yǎng)過程中生長緩慢而且很容易分化而失去增殖的能力，尤其是在無血清培養(yǎng)中更是如此，在含有血清及滋養(yǎng)層細(xì)胞的表皮細(xì)胞膜片培養(yǎng)方式中，表皮可以獲得較快的生長速度及倍增次數(shù)，表明血清及滋養(yǎng)層細(xì)胞在表皮細(xì)胞的增殖及控制分化方面的重要作用，血清中含有對細(xì)胞生長有重要作用的多種營養(yǎng)因子，可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，但單獨加入血清又可以促使表皮細(xì)胞的終末分化，其中，血清中的鈣離子是促使表皮細(xì)胞分化的一個重要因素，而加入滋養(yǎng)層細(xì)胞以后，不僅可以控制表皮細(xì)胞的分化，而且還可以促進(jìn)表皮細(xì)胞的貼壁。在基于明膠微球的創(chuàng)面治療中，以往的方法是將明膠微球直接涂敷于創(chuàng)面，然后用敷料覆蓋，此方法可明顯造成涂布的細(xì)胞不均勻，而且直接的敷料覆蓋也可造成表皮細(xì)胞的損傷。同時，與細(xì)胞的遞呈相比，表皮細(xì)胞的體外擴增要困難的多，表皮細(xì)胞在體外的生長比較緩慢，尤其是在無血清及滋養(yǎng)細(xì)胞的條件下，其生長周期更慢，一般需要3周以上；而且傳代次數(shù)較少，一般的表皮細(xì)胞無血清培養(yǎng)僅能傳代35次，在對大面積燒傷的創(chuàng)面進(jìn)行治療時，由于皮源的缺乏及創(chuàng)面覆蓋的急迫性，可移植的表皮細(xì)胞的來源問題也就成了最為重要的問題。表皮細(xì)胞屬于貼壁依賴性細(xì)胞，基于表皮細(xì)胞膜片的培養(yǎng)方法由于需要對表皮細(xì)胞進(jìn)行不斷地消化、傳代，使其培養(yǎng)過程中存在細(xì)胞的丟失及培養(yǎng)周期的延長。在使用生物反應(yīng)器的方法對其進(jìn)行擴增時需要結(jié)合微載體培養(yǎng)技術(shù)，但是由于表皮細(xì)胞屬于終末分化的細(xì)胞，而在使用微載體培養(yǎng)表皮細(xì)胞時，由于表皮細(xì)胞的貼壁能力較低，抗剪切能力差及培養(yǎng)過程中很快終末分化等因素，使得擴增的結(jié)果并不令人滿意。而目前的角質(zhì)細(xì)胞的遞呈方法多為噴霧、涂抹的方法，沒有考慮與能促進(jìn)創(chuàng)面愈合的材料結(jié)合。
發(fā)明內(nèi)容為了解決上述的存在的技術(shù)缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種組織工程中所用的表皮細(xì)胞擴增的方法。該方法表皮細(xì)胞能獲得最大速度的增殖，培養(yǎng)后的表皮細(xì)胞微載體復(fù)合物可用作構(gòu)建組織工程皮膚的種子細(xì)胞，也可直接遞呈于創(chuàng)面，可以加快創(chuàng)面的愈合。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明的皮膚組織工程種子細(xì)胞的擴增方法，該方法包括以下的步驟①在生物反應(yīng)器加入0.52g大孔微載體，水化及滅菌后加入培養(yǎng)基50IOOml成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基，加入成纖維細(xì)胞1XIO610XIO6個進(jìn)行培養(yǎng)；②待成纖維細(xì)胞貼附于微載體上后生長接近微載體表面積的50%時，抑制成纖維細(xì)胞的增殖，靜置后傾去培養(yǎng)液；③將上述得到的載體無菌無鈣鎂PBS沖洗后，加入表皮細(xì)胞培養(yǎng)基50IOOml及1XIO610XIO6個表皮細(xì)胞，繼續(xù)攪拌培養(yǎng)，直至細(xì)胞長滿載體，即可獲得皮膚組織工程種子細(xì)胞。作為優(yōu)選，所述的表皮細(xì)胞為角質(zhì)細(xì)胞，同時含有黑素細(xì)胞及表皮內(nèi)所含其它細(xì)胞的混合；優(yōu)選的為表皮干細(xì)胞。作為一種獲取方法，所述的表皮細(xì)胞的獲取方法如下①選取小塊健康皮膚，置于4°C的無菌PBS液中，用含有青霉素及鏈霉素PBS液反復(fù)沖洗后，剪除皮下脂肪組織，將皮膚置于碘伏或7075%重量百分比濃度的酒精中消毒后，無鈣、鎂的PBS沖洗三遍，在無菌的培養(yǎng)皿中將皮膚切成小塊，再置入0.5%重量百分比濃度中性蛋白酶中，4°C過夜；②將經(jīng)中性蛋白酶消化的皮膚置于培養(yǎng)皿中，加PBS以防止干燥，將表皮自真皮分離，37°C下將表皮置入0.25%重量百分比濃度胰酶和0.02%重量百分比濃度EDTA的混合液中消化15min，并不時搖動；③加入與胰酶等體積的含10%重量百分比FCS的DMEM液終止消化，離心，重懸細(xì)胞，用細(xì)胞篩網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，即可得到表皮細(xì)胞。作為優(yōu)選，所述的成纖維細(xì)胞為人成纖維細(xì)胞或者經(jīng)過增殖抑制的小鼠3T3細(xì)胞。作為優(yōu)選，所述的成纖維細(xì)胞的獲取方法采用上述的方法獲取的真皮，通過0.05%膠原酶I37°C消化4h，獲得成纖維細(xì)胞。作為優(yōu)選，所述的健康皮膚選自患者自身健康皮膚或異體健康皮膚。作為再優(yōu)選，患者自身健康皮膚選用創(chuàng)面附近的皮膚，異體健康皮膚選用包皮環(huán)切術(shù)的包皮或整形術(shù)后余下的皮膚。作為優(yōu)選，所述的微載體為商品化的可降解大孔微載體，或者是使用可生物降解的材料，通過乳化-凝聚等方法并加用致孔劑制備的可生物降解的微載體。作為優(yōu)選，抑制成纖維細(xì)胞的增殖的方法選用加入絲裂霉素CIOX10_6/L或者通過亞致死量的Gamma輻照。作為優(yōu)選，表皮細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM/F12重量比為31的溶液，培養(yǎng)基中還包括以下的成份本發(fā)明具有臨床應(yīng)用的表皮細(xì)胞膜片培養(yǎng)方法的優(yōu)點，即使用含血清的培養(yǎng)基，并使用滋養(yǎng)層細(xì)胞，有利于表皮細(xì)胞生長，但在細(xì)胞擴增的過程中使用了微載體，使得培養(yǎng)面積大大增加，使培養(yǎng)的細(xì)胞量及功能都能明顯增加；其次，本發(fā)明還結(jié)合了大孔微載體及生物反應(yīng)器培養(yǎng)的優(yōu)勢，其中大孔的微載體可以使細(xì)胞長入至載體的內(nèi)部，使細(xì)胞在攪拌時受到的剪切力較少，調(diào)整絲裂霉素C的用量還可以使載體內(nèi)部少量成纖維細(xì)胞的仍具有增殖能力，不僅對表皮細(xì)胞的生長不造成影響，還可以加速表皮的生長，而且在培養(yǎng)的過程中不需要再次消化，減少了細(xì)胞的損傷；再次，因為明膠是變性的膠原，攜帶有細(xì)胞的明膠微載體構(gòu)成了一個真皮再生單位，可以直接用作組織工程皮膚構(gòu)建的種子細(xì)胞，尤其可以直接用于燒傷創(chuàng)面及慢性潰瘍的治療，效果優(yōu)于表皮細(xì)胞懸液及表皮細(xì)胞膜片。具體實施例方式下面對本發(fā)明的具體實施方式做一個詳細(xì)的說明。1.表皮細(xì)胞的分離及培養(yǎng)優(yōu)選患者自身的一小塊健康皮膚；也可以是來源于異體的健康皮膚，如包皮環(huán)切術(shù)的包皮，整形術(shù)后余下的皮膚等。在用于治療慢性潰瘍性創(chuàng)面時，優(yōu)選使用創(chuàng)面附近的皮膚，以獲得更好的效果；如使用包皮，優(yōu)選年齡在210歲之間的小兒包皮環(huán)切術(shù)后的包皮。取下后的皮膚需立即置于4°C的無菌PBS液中，用含有青霉素及鏈霉素PBS液反復(fù)沖洗后，剪除皮下脂肪組織，將皮膚置于碘伏或7075%酒精中消毒后，無鈣、鎂PBS沖洗三遍，在無菌的培養(yǎng)皿中將皮膚切成小塊，約5mmX5mm，再置入0.5%中性蛋白酶中，4°C過夜。將經(jīng)中性蛋白酶消化的皮膚置于培養(yǎng)皿中，加少量的PBS以防止干燥，用無菌鑷子將表皮自真皮分離，37°C下將表皮置入0.25%胰酶/0.02%EDTA(1lv/v)中消化15min,并不時搖動；加與胰酶等體積的DMEM液(含10%FCS)終止消化，666g離心5min，重懸細(xì)胞，用細(xì)胞篩網(wǎng)(40200目)過濾細(xì)胞懸液，計數(shù)及用臺盼藍(lán)判斷細(xì)胞活力，即可得到表皮細(xì)胞。其真皮層可通過0.05%膠原酶I37°C消化4h，獲得真皮成纖維細(xì)胞。2.表皮細(xì)胞的擴增使用可降解的明膠制備的大孔微載體，并選擇合適的生物反應(yīng)器，優(yōu)選旋轉(zhuǎn)瓶，也可以是其它動力的生物反應(yīng)器，在旋轉(zhuǎn)瓶加入0.5至2g微載體，水化及滅菌后加入培養(yǎng)基50IOOml成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM+1015%FCS)，加入成纖維細(xì)胞1IOXIO6進(jìn)行培養(yǎng)，待成纖維細(xì)胞貼附于微載體上后生長接近微載體表面積的50%時，加入絲裂霉素CFCS1020%重量百分比霍亂毒素10-1Qmol/L三碘甲狀腺原氨酸2X10_7mOl/L青霉素100IU/ml兩性霉素B0.25ug/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白5ug/ml氫化考的松5ng/mL胰島素5ng/mL腺嘌呤1.8Xl(T4mol/L鏈霉素100IU/mlhEGF10ng/ml谷氨酸5ug/ml。10X10_6/L過夜，靜置后傾去含有絲裂霉素C的培養(yǎng)液，無菌無鈣鎂PBS沖洗兩遍后，加入表皮細(xì)胞培養(yǎng)基50100mlO^heinwald和Green)及表皮細(xì)胞(110XIO6個)，繼續(xù)攪拌培養(yǎng)，開始的攪拌速度要慢，逐漸增加攪拌的速度，培養(yǎng)5天左右換液一次，直至細(xì)胞長滿載體或應(yīng)用(1015天)，這種培養(yǎng)方式比單純的大孔明膠微載體培養(yǎng)的細(xì)胞量可以提高25倍，足以滿足用于構(gòu)建組織工程皮膚及用于燒傷及慢性潰瘍治療的要求。本實施例的表皮細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM/F12重量比為31的溶液，培養(yǎng)基中還包括以下的成份FCS15%重量百分比霍亂毒素10-1(lmOl/L三碘甲狀腺原氨酸2XKTmol/L青霉素100IU/兩性霉素B0.轉(zhuǎn)鐵蛋白5ug/ml25ug/mlml氫化考的松5ng/mL胰島素5ng/mL腺嘌呤1.8Xl(T4mol/L鏈霉素100IU/mlhEGF10ng/ml谷氨酸5ug/ml。權(quán)利要求1.一種皮膚組織工程種子細(xì)胞的擴增方法，其特征在于該方法包括以下的步驟①在生物反應(yīng)器加入0.52g大孔微載體，水化及滅菌后加入培養(yǎng)基50IOOml成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基，加入成纖維細(xì)胞IXIO6IOXIO6個進(jìn)行培養(yǎng)；②待成纖維細(xì)胞貼附于微載體上后生長接近微載體表面積的50%時，抑制成纖維細(xì)胞的增殖，靜置后傾去培養(yǎng)液；③將上述得到的載體無菌無鈣鎂PBS沖洗后，加入表皮細(xì)胞培養(yǎng)基50IOOml及1XIO610XIO6個表皮細(xì)胞，繼續(xù)攪拌培養(yǎng)，直至細(xì)胞長滿載體，即可獲得皮膚組織工程種子細(xì)胞。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種皮膚組織工程種子細(xì)胞的擴增方法，其特征在于表皮細(xì)胞為角質(zhì)細(xì)胞，同時含有黑素細(xì)胞及表皮內(nèi)所含其它細(xì)胞的混合；優(yōu)選的為表皮干細(xì)胞。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種皮膚組織工程種子細(xì)胞的擴增方法，其特征在于表皮細(xì)胞的獲取方法如下①選取小塊健康皮膚，置于4°C的無菌PBS液中，用含有青霉素及鏈霉素PBS液反復(fù)沖洗后，剪除皮下脂肪組織，將皮膚置于碘伏或7075%重量百分比濃度的酒精中消毒后，無鈣、鎂的PBS沖洗三遍，在無菌的培養(yǎng)皿中將皮膚切成小塊，再置入0.5%重量百分比濃度中性蛋白酶中，4°C過夜；②將經(jīng)中性蛋白酶消化的皮膚置于培養(yǎng)皿中，加PBS以防止干燥，將表皮自真皮分離，37°C下將表皮置入0.25%重量百分比濃度胰酶和0.02%重量百分比濃度EDTA的混合液中消化15min，并不時搖動；③加入與胰酶等體積的含10%重量百分比FCS的DMEM液終止消化，離心，重懸細(xì)胞，用細(xì)胞篩網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，即可得到表皮細(xì)胞。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種皮膚組織工程種子細(xì)胞的擴增方法，其特征在于成纖維細(xì)胞為人成纖維細(xì)胞或者經(jīng)過增殖抑制的小鼠3T3細(xì)胞。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種皮膚組織工程種子細(xì)胞的擴增方法，其特征在于成纖維細(xì)胞的獲取方法采用權(quán)利要求3所述的方法獲取的真皮，通過0.05%膠原酶I37°C消化4h，獲得成纖維細(xì)胞。6.根據(jù)權(quán)利要求3或5所述的一種皮膚組織工程種子細(xì)胞的擴增方法，其特征在于健康皮膚選自患者自身健康皮膚或異體健康皮膚。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種皮膚組織工程種子細(xì)胞的擴增方法，其特征在于患者自身健康皮膚選用創(chuàng)面附近的皮膚，異體健康皮膚選用包皮環(huán)切術(shù)的包皮或整形術(shù)后余下的皮膚。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種皮膚組織工程種子細(xì)胞的擴增方法，其特征在于微載體為商品化的可降解大孔微載體，或者是使用可生物降解的材料，通過乳化-凝聚等方法并加用致孔劑制備的可生物降解的微載體。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種皮膚組織工程種子細(xì)胞的擴增方法，其特征在于抑制成纖維細(xì)胞的增殖的方法選用加入絲裂霉素CIOX10_6/L或者通過亞致死量的Gamma輻照。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種皮膚組織工程種子細(xì)胞的擴增方法，其特征在于表皮細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM/F12重量比為31的溶液，培養(yǎng)基中還包括以下的成份FCS1020%重量百分比氫化考的松5ng/mL霍亂毒素10_1(lmOl/L胰島素5ng/mL三碘甲狀腺原氨酸2X10_7mOl/L腺嘌呤1.8X10-4mol/L青霉素100IU/ml鏈霉素100IU/ml兩性霉素B0.25ug/mlhEGF10ng/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白5ug/ml谷氨酸5ug/ml。全文摘要本發(fā)明涉及一種組織工程種子細(xì)胞的培養(yǎng)方法。皮膚組織工程種子細(xì)胞的擴增方法，該方法包括以下的步驟①在生物反應(yīng)器加入大孔微載體，水化及滅菌后加入培養(yǎng)基50～100ml成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基，加入成纖維細(xì)胞個進(jìn)行培養(yǎng)；②待成纖維細(xì)胞貼附于微載體上后生長接近微載體表面積的50％時，抑制成纖維細(xì)胞的增殖，靜置后傾去培養(yǎng)液；③將上述得到的載體無菌無鈣鎂PBS沖洗后，加入表皮細(xì)胞培養(yǎng)基及表皮細(xì)胞，繼續(xù)攪拌培養(yǎng)，直至細(xì)胞長滿載體，即可獲得皮膚組織工程種子細(xì)胞。本發(fā)明培養(yǎng)的細(xì)胞量及功能都能明顯增加，減少了細(xì)胞的損傷，細(xì)胞可以直接用作組織工程皮膚構(gòu)建的種子細(xì)胞，效果優(yōu)于表皮細(xì)胞懸液及表皮細(xì)胞膜片。文檔編號A61P17/02GK102086451SQ200910155159公開日2011年6月8日申請日期2009年12月7日優(yōu)先權(quán)日2009年12月7日發(fā)明者于瑋潔,孫華鳳,有傳剛,王新剛,胡信雷,胡行,韓春茂申請人:韓春茂