專利名稱：銀杏內(nèi)酯b的一種新用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及銀杏內(nèi)酯B的一種新用途。
技術背景
一、銀杏內(nèi)酯B的化學特征和藥理作用
1、銀杏內(nèi)酯B的一般特性
銀杏內(nèi)酯(ginkgolides)是從銀杏中提取得到的一種萜類內(nèi)酯類化合物，包括銀 杏內(nèi)酯A、B、C、J、K、L和M，銀杏內(nèi)酯是血小板活化因子(platelet activating factor， PAF)抑制劑，其中，銀杏內(nèi)酯B(ginkg0lideB，GB,銀杏內(nèi)酯B的化學結構式如圖1 所示)是銀杏內(nèi)酯中藥理活性最強的一種(van Beek TA.Ginkgolides and bilobalide their physical, chromatographic and spectroscopic properties.Bioorg Med Chem, 2005, 13(17) 5001-12.Vogensen SB, Stromgaard K, Shindou H, et al.Preparation of7_substituted ginkgolide derivatives potent platelet activating factor (PAF) receptorantagonists.J Med Chem, 2003，46(4) 601-8.)。研究表明，銀杏內(nèi)酯B具有抗炎、抗氧化、抗過敏、 神經(jīng)保護等作用(Xia SH, Fang DC.Pharmacological action andmechanisms of ginkgolide B.Chin Med J, 2007，120(10) 922—8.)。
2、銀杏內(nèi)酯B的抗炎作用
許多研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯B具有抗炎作用，機體炎癥反應與炎癥因子如 TNF- α , IL-U IL_6、IL_8等密切相關。其中，IL_8是最主要的炎癥因子，對中 性粒細胞有明顯趨化和功能活化作用。研究發(fā)現(xiàn)(Mao YJ，Wang L, Wang WJ.Effect of ginkgolideB on the function of rat aorta smooth cells and U937 cells stimulated by oxLDL. YaoXue Xue Bao, 2006，41(1) 36-40.), 0X-LDL (氧化型 LDL)可誘導 U937 細胞分泌 炎癥趨化因子如MCP-1、IL-8等，銀杏內(nèi)酯B能夠抑制此過程，其機制可能與抑制PAF 受體相關。另外，4-羥基壬烯醛能夠刺激支氣管上皮細胞IL-8的表達，銀杏內(nèi)酯B能 夠通過抑制 ERK I-AP 1 信號通路減少 IL-8 (Yu L, Xiong LH, Ran PX.The mechanism of inhibition by ginkgolide B on interleukin-8 production induced by4_hydroxynonenal in bronchial epithelial cells.zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi, 2008，31(5) 372-7.)。
TNF-ci是一種單核因子，主要由單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，LPS(脂多糖)是 較強的刺激劑。銀杏內(nèi)酯B能夠抑制LPS誘導的小鼠腹膜巨噬細胞TNF-α產(chǎn)生，并 能抑制LPS (脂多糖)誘導的大鼠胸膜多形核白細胞NF-KB激活(Nie ZG，Peng SY, Wang WJ.Effects of ginkgolide B on lipopolysaccharide-induced TNFalpha productionin mouse peritoneal macrophages and NF-kappaB activation in rat pleuralpolymorphonuclear leukocytes. Acta Pharmacol Sin(Chin), 2004，39(6) 415-8.)。銀杏內(nèi)酯 B 能夠抑制慢性炎癥性肉 芽腫模型小鼠血清、U937細胞中IL-I β和TNF表達，并顯著抑制慢性炎癥性肉芽腫模 型小鼠的血管生成(Ou-Yang XY，Wang WJ, LiaoWH, et al.Inhibitory effect of ginkgolide B on angiogenesis in chronic inflammation.Yao Xue Xue Bao, 2005, 40(4) 311—5.)。
此外，研究還發(fā)現(xiàn)(PengSY，Zhang FY, Ou-Yang XY, et al.Effect of ginkgolide Bon the platelet-activating factor induced changes of chemotaxis and cytoskeleton oftnacrophages.Acta Pharmacol Sin (Chin), 2006，41(2) 156-60.),在 Ca2+存在的條件 下，銀杏內(nèi)酯B可抑制PAF誘導的鼠類腹膜巨噬細胞中F-aCtin(絲狀肌動蛋白)聚合， 從而抑制腹膜巨噬細胞的趨化，發(fā)揮其抗炎作用。銀杏內(nèi)酯B能夠誘導PMN(人體多形 核白細胞)中一系列信號變化，如酪氨酸磷酸化、磷脂酶D活化、鈣瞬變、p38活化等， 可能與 PMN 防御有關(Lenoir M, Muntaner O, Pedruzzi Ε, et al.Ginkgolide B stimulates signaling events in neutrophils and primes defense activities.Biochem Biophys Res Commun, 2005，335(4) 1149-54.)。
3、銀杏內(nèi)酯B的抗氧化作用
在神經(jīng)細胞氧化損傷模型中，不同濃度的銀杏內(nèi)酯B均可提高H2O2損傷的 神經(jīng)細胞存活率(Wu XM, Chen HS, Jing SY, et al.Effects of ginkgolides against injury ofiieurocytes induced by H202 and expression of immediate early genes.Chin J ClinPhamacol Ther，2003，8(4) 401-4.)。在乙醇誘導的Hep G2細胞氧化損傷中，低濃度(5-25 μ Μ) 的銀杏內(nèi)酯B能夠抑制細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生并抑制細胞凋亡，但高濃度(50-100 μ Μ)的 銀杏內(nèi)酯B作用相反，提示應選用合適的劑量(Chiffl WH, HsuuwYD.Dosage effects of ginkgolide B on ethanol-induced cell death in human hepatomaG2 cells.Ann N Y Acad Sci， 2007，1095 388-98.)。
4、銀杏內(nèi)酯B的抗過敏作用
銀杏內(nèi)酯B與抗氧化劑ASX(類胡蘿卜素蝦青素)聯(lián)用能夠抑制T細胞激活，優(yōu) 于西替利嗪(CTZ)與氮卓斯汀(AZE)聯(lián)用，提示可用于哮喘癥新藥開發(fā)(MahmoudFF， Haines DD, Abul HT, et al.In vitro effects of astaxanthin combined with ginkgolideB on T lymphocyte activation in peripheral blood mononuclear cells from asthmaticsubjects.J PharmacolSci, 2004，94(2) 1四_36.)。
5、銀杏內(nèi)酯B的血管保護作用
銀杏內(nèi)酯對大鼠短暫性及永久性局灶性大腦中動脈阻塞模型及小鼠不完全性腦 缺血模型均具有保護作用(Xu JP，Sun LS，Yang XM.Protective effects of ginkgolideon cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.Chin J Integr Tradit West Med IntensiveCrit Care, 2003，10 (1) 31-3.Wu XF, Wang QJ, Lou FC.Protective effect of ginkgolideson rat focal brain ischemia.J China Pharm Univ, 2001，32 (2) 141-5.)。銀杏內(nèi)酯 B 可以選擇性抑 制血管平滑肌細胞內(nèi)鈣增加，并能非選擇性減輕血管加壓素作用(Wang Y，YuYQ, Xu JG.Inhibition of intracellular calcium elevation and blunting of vasopressorresponse due to serotonin by ginkgolide B.Planta Med, 2002，68 (6) 501-4.)。銀杏內(nèi)酯 B 還可增加缺 血-再灌注大鼠的左心功能與Bcl-2表達、減少梗阻面積與乳酸脫氫酶釋放，從而發(fā)揮 ^、臟保護作用(Hao Y, SunY, Xu C， et al.Improvement of ContractileFunction in Isolated Cardiomyocytes From Ischemia-Reperfusion Rats by Ginkgolide BPretreatment.J Cardiovasc Pharmacol, 2009，doi 10.1097/FJC.0b013e3181a91410.)。但研究發(fā)現(xiàn)(Jihye KIM, Qun Li, Cindy X FANG, et al.Paradoxical effects of ginkgolide Bon cardiomyocyte contractile function in normal and high-glucose environments.ActaPharmacologica Sinica，2006,27(5) 536-42.),不同濃度的銀杏內(nèi)酯B作用不同。在高糖05.5mmol/L葡萄糖)培養(yǎng) 環(huán)境中，心肌肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶表達顯著增加，0.5-1.0 μ g/mL銀杏內(nèi)酯B可以減少心 肌肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶表達。在低糖(5.5mm0l/L葡萄糖)培養(yǎng)環(huán)境中，2.0 μ g/mL銀杏 內(nèi)酯B可以增加心肌肌質(zhì)網(wǎng)Ca-ATP酶表達。在高糖培養(yǎng)環(huán)境中，兩種濃度的銀杏內(nèi)酯 B均能抑制Na+-Ca2+交換器(NCX)表達。
6、銀杏內(nèi)酯B的神經(jīng)保護作用
β-淀粉樣多肽可通過AC-cAMP-PKA信號通路激活高電壓依賴的鈣離 子通道，使內(nèi)鈣增加誘導鈣超載導致神經(jīng)毒性，銀杏內(nèi)酯B能夠抑制β-淀粉樣 多肽誘導的鈣超載，發(fā)揮神經(jīng)保護作用(Chen L，Liu CJ, Tang M，et al.Action of beta-amyloidpeptide (1-40) on I (HVA) and its modulation by ginkgolide B.Acta Physiol Sin(Chin), 2006，58(1) 14-20.)。銀杏內(nèi)酯還可通過減輕β -淀粉樣蛋白相關肽對膽 堿能傳遞的抑制效應而產(chǎn)生抗遺忘作用(Lee TF，Chen CF, Wang LC.Effect of ginkgolides onbeta-amyloid-suppressed acetylocholine release from rat hippocampal slices.PhytotherRes， 2004，18(7) 556-60.)。研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯B能夠通過抑制細胞內(nèi)鈣增加、上調(diào)鈣 結合蛋白1^8尺1111^，保護6-羥基多巴(6-hydroxydopamine，6-OHDA)作用的PC 12 細胞(Meng H, Li C, FengL, et al.Effects of Ginkgolide B on 6-OHDA-inducedapoptosis and calcium over load in cultured PC 12.Int J Dev Neurosci, 2007, 25 (8) 509—14.)。在 局部腦缺血星形細胞膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)表達增加，銀杏內(nèi)酯B能夠通過抑制 GFAP 表達而發(fā)揮神經(jīng)保護作用(Zhang JG，Li SQ, Wng SR，et al.The effect of ginkgolide B on astrocyte GFAP expression after the focal cerebralischemia.Sichuan Da Xue Xue BaoYi Xue Ban, 2007，38(2) 284-6，301.)。在大鼠海馬神經(jīng)末梢，銀杏內(nèi)酯B能夠激活PKA， 通過作用于電壓依賴性N、P/Q型Ca2+通道促進Ca2+進入，從而促進谷氨酸釋放。同 時證明銀杏內(nèi)酯B能夠促進Ca2+載體介導的谷氨酸釋放，提示銀杏內(nèi)酯B可直接作用于 Ca2+ 下游的分泌器官(Wang SJ, ChenHH.Ginkgolide B, a constituent of Ginkgo biloba, facilitates glutamate exocytosis fromrat hippocampal nerve terminals.Eur J Pharmacol, 2005, 514(2-3) 141-9.)。
NO既是機體內(nèi)源性活性介質(zhì)，也是一種內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)，在許多病理和生理過 程中 NO 具有雙重作用。研究發(fā)現(xiàn)(Xu Y，Tao YX.Involvement ofthe NMDAreceptor/nitric oxide signal pathway in platelet-activating factor-induced neurotoxicity.Neuroreport.2004, 15(2) 263-6.)，銀杏內(nèi)酯B抑制長期暴露于PAF的神經(jīng)元中NO合成酶活性，減少過量 的NO的神經(jīng)毒性。銀杏內(nèi)酯還可時間-劑量依賴性抑制LPS、IFN- α、TNF- α、IL-I 及IL-2誘導的星狀細胞瘤和SK-N-SH人神經(jīng)母細胞瘤中NO產(chǎn)生，從而抑制NO神經(jīng) 毒性作用(Zhao HW, Li XY.Ginkgolide A, B, and huperzine Ainhibit nitric oxide-induced neurotoxicity.Int Immunopharmacol, 2002，2(11) 1551-6.)。神經(jīng)遞質(zhì) L_Glu 可導致 培養(yǎng)的大鼠小腦神經(jīng)元大量死亡，預先給予EGb761或銀杏內(nèi)酯可明顯降低Glu的神 經(jīng)毒性(Chandrasekaran K, Mehrabian Z, Spinnewyn B, et al .Neuroprotective effects of bilobalide，a component of Ginkgo biloba extract (EGb 761) in global brain ischemia and in excitotoxicity-induced neuronal death.Pharmacopsychiatry, 2003, 36 (Suppll) S89-94.)。
研究發(fā)現(xiàn)(BateC，Salmona M，Williams A.Ginkgolide B inhibits theneurotoxicityof prions or amyloid-betal-42.J Neuroinflammation, 2004, 1(1) 4.), PAF Jr 抗劑銀杏內(nèi)酯B還可能用于阿爾茨海默爾病或朊病毒病治療。神經(jīng)干細胞(NSCs)和單細 胞克隆神經(jīng)球可被銀杏內(nèi)酯B誘導分化為神經(jīng)元(Jin GH, Huang Z，Tan XF, et al.Effects of Ginkgolide on the development of NOS and AChE positive neurons in theembryonic basal forebrain.Cell Biol Int, 2006，30(6) 500-4.)。銀杏內(nèi)酯 B 可促進神經(jīng)干細胞(NSCs)分 化為 GFAP 陽性的星形膠質(zhì)細胞(Yoshida H, Imaizumi T, Tanji K, et al.Platelet-activating factor enhances the expression of nerve growth factor in normalhuman astrocytes under hypoxia. Brain Res Mol Brain Res, 2005，133(1) 95-101.)。
7、銀杏內(nèi)酯B潛在毒性作用
銀杏內(nèi)酯B僅有一些微弱的副作用，包括呃逆、頭痛、嗜睡、虛弱等(Guinot P.Clinical experience with platelet-activating factor antagonists.Past, present and nearfuture. Clin Rev Allergy 1994 ； 12 397-417.Brown SL, Jala VR, Raghuwanshi SK, et al.Activation and regulation of platelet-activating factor receptor role of G (i) and G (q) inreceptor-mediated chemotactic, cytotoxic, and cross-regulatory signals.J Immunol, 2006, 177(5) 3242-9.)。銀杏內(nèi)酯B體外可抑制胚胎干細胞增殖與胚泡發(fā)育，體內(nèi)導致胚 胎發(fā)育損傷(Chan WH.Ginkgolide B induces apoptosis and developmental injury inmouse embryonic stem cells and blastocysts.Hum Reprod, 2006, 21 (11) 2985—95.)。
二、常染色體顯性遺傳多囊腎病發(fā)病機制和治療進展
常染色體顯性遺傳多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD)是一種常見的單基因遺傳疾病，在國外的發(fā)病率高達1/1000-1/400，占我國終 末期腎衰竭病因的第4位。目前，已發(fā)現(xiàn)三個基因與ADPKD發(fā)病有關，其中PKDl基因 (polycystic kidney disease 1)定位于染色體16pl3.3，該基因的突變約占ADPKD的85% ； PKD2基因定位于甸21-23，該基因的突變約占ADPKD的15% ； PKD3基因的突變僅發(fā) 現(xiàn)數(shù)個家系，尚未定位。ADPKD病變以雙腎多發(fā)性進行性囊泡為主要特征，引起腎功能 改變，終末期導致腎衰，常伴有肝、脾、胰等器官囊性病變以及心腦血管病變。目前， 除應用腎移植和透析治療終末期腎衰，尚無特效療法阻止囊泡的發(fā)生和生長。因此，延 緩ADPKD發(fā)病、甚至逆轉(zhuǎn)ADPKD的病程是國內(nèi)外該領域的研究熱點。
PKDl基因與PKD2基因編碼的蛋白分別稱為多囊蛋白l(polycystin_l，PCl)禾口 多囊蛋白2(p0lyCyStin-2，PC2)。其中，PCl是腎小管上皮細胞膜受體，主要亞細胞定 位于腎上皮細胞纖毛、緊密連接部、粘著連接、橋粒、粘著斑等；PC2具有鈣離子通道 的作用，主要亞細胞定位于纖毛、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、中心體等。在腎小管上皮細胞纖毛處，PCl 與PC2相互作用組成功能復合體，PCl可感知腎小管腔內(nèi)液體對纖毛的機械刺激，并將 信號傳遞給PC2，PC2介導Ca2+內(nèi)流，Ca2+內(nèi)流進一步引起細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的釋放，維 持胞內(nèi)Ca2+濃度至正常水平。Ca2+水平正常的細胞內(nèi)，Ca2+能夠通過抑制腺苷酸環(huán)化酶 6來抑制cAMP的生成，同時還可以激活磷酸二酯酶(PDE)而降解cAMP，因此，細胞內(nèi) Ca2+能夠負向調(diào)節(jié)細胞內(nèi)cAMP的濃度。當PKDl基因或PKD2基因發(fā)生突變時，細胞內(nèi) Ca2+濃度降低，Ca2+負向調(diào)節(jié)cAMP的作用減弱，細胞內(nèi)cAMP濃度增高。增高的細胞 內(nèi)cAMP活化蛋白激酶A (PKA)，PKA可以激活Ras/Raf/MEK/ERK信號通路而促進囊 泡上皮細胞的增殖；PKA還可以激活囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)因子(CFTR)促進氯離子分泌至囊腔，提高囊泡內(nèi)滲透壓，引起鈉和水繼發(fā)性向囊泡內(nèi)轉(zhuǎn)運而促進囊液的分泌， 最終導致多囊腎的病理學改變。另有研究表明，PCl在PC2的參與下可作用于蛋白質(zhì)酪 氨酸激酶(JAK2)，通過信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子1 6TAT1)上調(diào)p21waf基因的表達，P21 可抑制細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)而使Gl期延長，從而抑制細胞增殖[51]。PCl還 可以在PC2的參與下作用于JAK2，通過信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3 6TAT3)促進肝細胞 生長因子(HGF)介導的腎小管分化。當PKDl基因或PKD2基因發(fā)生突變時，p21waf 基因的表達減少，細胞增殖增加，同時腎小管分化減少，促進多囊腎的發(fā)生。PCl可 通過與結節(jié)性硬化癥(TSC^)基因和mTOR形成復合物而抑制mTOR的活性，從而調(diào)節(jié) mTOR信號通路。在ADPKD中，PCl的缺失會導致mTOR信號通路的異常激活，使細 胞過度增殖(Bhunia AK，Piontek K, BolettaA, et al.PKDlinduces p21 (wafl) and regulation of the cell cycle via direct activation of the JAK-STATsignaling pathway in a process requiring PKD2.Cell, 2002，109(2) 157-68.)。在正常的腎小管上皮細胞中，PCl參與β-連環(huán) 素(i3_cate:dn)和E-鈣粘附分子(E_cadherin)形成復合物的過程，維持細胞連接；PCl 還可以上調(diào)糖原合成酶激酶3 β (GSK3i3)活性促進i^-catente的降解，從而保持細胞質(zhì) 內(nèi) β -catenin 濃度的較低水平(MostovKE.mTOR is out of control in polycystic kidney disease. Proc Natl Acad Sci USA, 2006，103 (14) 5247-8.)。在 ADPKD 中，PCl 的缺失可以 使細胞連接損傷、胞質(zhì)內(nèi)P-catedn濃度升高，同時Wnt信號通路異常激活，Wnt通過 Dishevelled蛋白拮抗β -catenin降解復合物(APC/Ax:in)的形成而阻斷β -catenin降解也 可使P-catedn在細胞質(zhì)內(nèi)聚集，經(jīng)轉(zhuǎn)錄入核促進細胞過度增殖。因此根據(jù)多囊腎的發(fā)病 機制，可以通過抑制囊泡上皮細胞增殖和囊液分泌等方法來篩選治療ADPKD的藥物(見 圖2)。
目前，治療ADPKD的研究仍處于探索階段，治療策略主要是根據(jù)其發(fā)病機制集 中在抗細胞增殖、抑制囊液分泌、調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+濃度和減輕繼發(fā)病變等方面。下面從這 幾個方面進行闡述
1、抗細胞增殖
ADPKD囊泡上皮細胞的增殖可能涉及多種生長因子，如表皮生長因子 (epidermal growth factor, EGF)能夠刺激囊泡上皮細胞的增殖，其機制與表皮生長因 子受體 Erb B/EGFR (epidermal growth factor receptor)、Src、MEK 促分裂原活化蛋白 激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase)等的酪氨酸激酶活性密切相關。因 此，酪氨酸激酶抑制劑在ADPKD的治療中具有很大的潛力。如Wilson等研究發(fā)現(xiàn) Erb B2抑制劑可以恢復多囊腎囊泡細胞的正常結構并改善其功能(BocaM，D' Amato L, Distefano G， et al.Polycystin-1 induces cell migration by regulatingphosphatidylinositol 3-kinase-dependent cytoskeletal rearrangements andGSK3beta-dependent cell cell mechanical adhesion.Mol Biol Cell, 2007，18(10) : 4050-61.)。另有研究發(fā)現(xiàn)，Src 抑制劑可以 修復多囊腎腎臟的異常上皮細胞(Wilson SJ, Amsler K，Hyink DP，et al.Inhibition of HER-2 (neu/ErbB2) restores normal functionand structure to polycystic kidney disease (PKD) epithelia.Biochim Biophys Acta, 2006, I762 (7) : M7-55.)。MEK 抑制劑能夠抑制 pcy 多囊腎小鼠的囊泡細胞增殖，延緩其腎功衰竭Sweeney WE Jr, von Vigier RO, Frost P, Avner ED.Src inhibitionameliorates polycystic kidney disease.J Am Soc Nephrol, 2008,19(7) 1331-41.)。其他如雷帕霉素(Omori S，Hida M，F(xiàn)ujita H, et al.Extracellular signal-regulated kinaseinhibition slows disease progression in mice with polycystic kidney disease.J Am SocNephrol, 2006，17(6) 1604-14.)、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制 劑(Berthier CC， Wahl PR, Le Hir Μ, et al.Sirolimus ameliorates the enhanced expression ofmetalloproteinases in a rat model of autosomal dominant polycystic kidney disease.Nephrol Dial Transplant, 2008，23(3) 880-9.)、細胞凋亡蛋白酶抑制劑(Bukanov NO，Smith LA, Klinger KW, et al.Long-lasting arrest of murine polycystic kidney diseasewith CDK inhibitorroscovitine.Nature, 2006，444(7121) 949-52.)等也可以通過影響細胞增殖而起 到治療ADPKD的作用。
2、抑制囊液分泌
囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductanceregulator, CFTR)是一種cAMP激活的ATP門控性氯離子通道，在腎上皮細 胞頂膜表達。在ADPKD發(fā)病機制中，血管加壓素等可激活腺苷酸環(huán)化酶，使胞內(nèi)cAMP 濃度增加、PKA被激活；PKA可激活位于囊泡上皮細胞頂膜的CFTR使氯離子分泌至囊 腔，提高囊泡內(nèi)滲透壓，引起鈉和水繼發(fā)性向囊泡內(nèi)轉(zhuǎn)運，并在囊泡內(nèi)蓄積，而囊液的 蓄積導致了囊泡上皮細胞代償性增生。因此，抑制CFTR可以有效地治療ADPKD。許 多研究表明，CFTR過度表達在多囊腎發(fā)病中起著非常重要的作用。犬腎細胞(MDCK 細胞)PKD模型、體外胚胎腎模型和PKD小鼠模型均證實CFTR抑制劑顯著抑制囊泡在 體外和體內(nèi)的形成和生長(Tao Y, Kim J, Faubel S, et al.Caspase inhibition reduces tubular apoptosis and proliferation and slows diseaseprogression in polycystic kidney disease.PNAS， 2005，102(19) 6954-9.) ο 其他如血管加壓素 1V2 受體(1V2R)拮抗劑(Yang B，Sonawane ND, Zhao D, et al.Small-moleculeCFTR inhibitors slow cyst growth in polycystic kidney disease.J Am Soc Nephrol, 2008，19(7) 1300-10.)、生長抑素類似物(Wang X，Wu Y, Ward C J，et al.Vasopressindirectly regulates cyst growth in polycystic kidney disease.J.Am Soc Nephrol, 2008，19(1) 102-8.)等也可以通過調(diào)節(jié)囊液分泌而用來治療ADPKD。
3、調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+濃度
ADPKD發(fā)病中，PKDl基因或PKD2基因發(fā)生突變，細胞內(nèi)Ca2+濃度降低，低 水平細胞內(nèi)Ca2+通過影響細胞內(nèi)與細胞分化生長、基因表達和細胞膜蛋白功能調(diào)控相關 的信號傳導通路，引起囊泡形成、囊泡上皮細胞異常增殖和囊泡液體過度分泌，繼而導 致多囊腎病理學改變?？蛇\用Ca2+通道激動劑、Ca2+載體(Ruggenenti P，RemuzziA, Ondei P, et al.Safety and efficacy of long-acting somatostatin treatment inautosomal-dominant polycystic kidney disease.Kidney Int, 2005，68(1) 206-16.)、PDE 激動劑(Yamaguchi Τ, Hempson SJ, Reif GA, et al.Calcium restores a normalproliferation phenotype in human polycystic kidney disease epithelial cells.J Am SocNephrol, 2006, 17(1) 178-87.)等通過 上調(diào)胞內(nèi)Ca2+濃度來治療ADPKD。另外，Crews小組發(fā)現(xiàn)，雷公藤內(nèi)酯可以通過促進 PC2介導的細胞內(nèi)Ca2+的釋放和促進P21的表達(P21是CDK的抑制物)從而發(fā)揮抑制 細胞增殖的作用，此過程不依賴PCl的表達，提示雷公藤內(nèi)酯可用于治療ADPKD (Cheng J，Grande JP.Cyclic nucleotidephosphodiesterase (PDE) inhibitors novel therapeutic agents for progressive renaldisease.Exp Biol Med, 2007, 232(1) 38-51.)。
4、減輕繼發(fā)病變
ADPKD囊泡的生長與組織的重建需要基質(zhì)的降解與重組，由于金屬蛋白酶能夠 降解基質(zhì)，使囊泡容易在組織中增大，并使周圍組織重構，因此可運用金屬蛋白酶抑制 齊U來治療 ADPKD (Leuenroth SJ, Okuhara D, Shotwell JD, et al.Triptolide is atraditional Chinese medicine-derived inhibitor of polycystic kidney disease.PNAS，2007, 104(11) 4389-94.)。一些降糖降脂藥也可通過調(diào)節(jié)基質(zhì)積聚而緩解ADPKD癥狀(Nakamura T, Ushiyama C， Suzuki S, et al.Elevation of serum levels ofmetalloproteinase-1， tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and type IV collagen, andplasma levels of metalloproteinase-9 in polycystic kidney disease.Am J Nephrol, 2000, 20(1) 32_6.Muto S, Aiba A, Saito Y, et al.Pioglitazone improves the phenotype andmolecular defects of a targeted Pkdl mutant.Hum Mol Genet, 2002，11(15) 1731-42.)。ADPKD發(fā)病過程往往伴隨著組織重構和血管增 生，而血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是主要的促血管生成因子，研究發(fā)現(xiàn)，應用VEGF抑 制劑可抑制Han:SPRD大鼠(Cy/+)囊泡的形成與生長(YuanZZ，XuCG, Gao CF，Mei CL.Effect of lovastatin onproliferation and extracellular matrix secretion in cyst-lining epithelial cells of autosomaldominant polycystic kidney disease.Acad J Sec Mil Med Univ, 2006, 27(1) 111-2.)。ADPKD患者腎囊泡的形成與擴大可激活腎素-血管緊張素-醛固酮 系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS),使血管硬化而導致高血壓、左心室 肥厚。動物實驗已證實，應用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin-convertingenzyme inhibitors, ACEI)或血管緊張素受體阻斷劑(angiotens:in receptor blocker, ARB)控制血 壓可能延緩多囊腎腎功能衰竭，但一些臨床研究未證實其作用(Tao Y，KimJ, YinY, et al.VEGF receptor inhibition slows the progression ofpolycystic kidneydisease.Kidney Int, 2007，72(11) 1358-66.)。
根據(jù)ADPKD的發(fā)病機制與治療策略，篩選囊泡形成和生長抑制劑，研發(fā)治療 ADPKD的新藥物是目前該領域的研究熱點。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供銀杏內(nèi)酯B的一種新用途。
本發(fā)明所提供的銀杏內(nèi)酯B的新用途具體為
1)以銀杏內(nèi)酯B為活性成分的預防和/或治療常染色體顯性遺傳多囊腎病的藥 物；
2)銀杏內(nèi)酯B在制備預防和/或治療常染色體顯性遺傳多囊腎病的藥物中的應 用；
3)以銀杏內(nèi)酯B為活性成分的抑制囊泡形成和/或生長的藥物；
4)銀杏內(nèi)酯B在制備抑制囊泡形成和/或生長的藥物中的應用。
上述新用途中，所述細胞為犬腎細胞或小鼠胚胎腎細胞。
上述預防和/或治療常染色體顯性遺傳多囊腎病的藥物可通過注射或口服的方 式導入機體。
所述預防和/或治療常染色體顯性遺傳多囊腎病的藥物的用量一般為 20-100mg/ 人 / 天(注射)或 200-1000mg/ 人 / 天(口服)。
本發(fā)明應用MDCK囊泡模型篩選得到抑制囊泡形成和生長的銀杏內(nèi)酯B，通過 MTT法確定該化合物的毒性和對正常細胞生長分化的影響；用MDCK小管生成實驗研 究銀杏內(nèi)酯B對腎上皮細胞分化的影響；通過體外胚胎腎模型確定銀杏內(nèi)酯B的整體腎 內(nèi)藥理活性；為開發(fā)預防和/或治療常染色體顯性遺傳多囊腎病的特效藥物提供實驗數(shù) 據(jù)。實驗結果表明，銀杏內(nèi)酯B對MDCK囊泡形成和生長具有明顯的抑制作用，且其作 用呈劑量效應關系；銀杏內(nèi)酯B對MDCK細胞無細胞毒性作用，說明銀杏內(nèi)酯B抑制囊 泡的作用與其細胞毒性無關；銀杏內(nèi)酯B不明顯誘導MDCK細胞凋亡，證實銀杏內(nèi)酯B 抑制囊泡的作用與其促進細胞凋亡無關；銀杏內(nèi)酯B能夠促進MDCK細胞或囊泡形成小 管樣結構，作用呈劑量效應關系；而且銀杏內(nèi)酯B對胚胎腎囊泡生長也具有抑制作用。


圖1為銀杏內(nèi)酯B的化學結構式
圖2為ADPKD的發(fā)病機制
圖3為MDCK囊泡與細胞集落
圖4為銀杏內(nèi)酯B對MDCK囊泡形成的抑制作用
圖5為銀杏內(nèi)酯B對囊泡生長的抑制作用
圖6為銀杏內(nèi)酯B對囊泡生長的抑制作用曲線
圖7為銀杏內(nèi)酯B對囊泡生長的可逆性抑制作用曲線
圖8為MTT法檢測銀杏內(nèi)酯B對MDCK細胞的細胞毒性
圖9為銀杏內(nèi)酯B對MDCK細胞凋亡的誘導作用圖片
圖10為銀杏內(nèi)酯B對MDCK細胞凋亡的誘導作用
圖11為銀杏內(nèi)酯B對MDCK小管生成的促進作用
圖12為銀杏內(nèi)酯B對囊泡形成小管樣結構的促進作用
圖13為銀杏內(nèi)酯B對囊泡形成小管樣結構的促進作用圖片
圖14為銀杏內(nèi)酯B對MDCK細胞信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)節(jié)作用
圖15為小鼠胚胎腎囊泡模型示意圖
圖16為小鼠胚胎腎囊泡的形成過程
圖17為銀杏內(nèi)酯B對胚胎腎囊泡生長的抑制作用
圖18為銀杏內(nèi)酯B抑制小鼠胚胎腎囊泡發(fā)展的劑量效應具體實施方式
下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物 材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
實施例1、銀杏內(nèi)酯B對MDCK囊泡形成和生長的抑制作用
一、銀杏內(nèi)酯B能夠抑制囊泡的形成，作用呈劑量效應關系
1、囊泡形成抑制實驗
犬腎細胞(MDCK)在三維基質(zhì)膠中培養(yǎng)時受cAMP刺激形成囊泡，并可持續(xù) 生長。forskoHn是腺苷酸環(huán)化酶的激活劑，腺苷酸環(huán)化酶可介導cAMP的生成，因此 forskoKn可促進MDCK囊泡形成和生長，其囊泡特性與多囊腎囊泡的特性相似，是篩選評價化合物治療多囊腎藥理活性的最佳體外模型。
將MDCK細胞(購自美國ATCC公司，商品目錄號CCL-34)分別培養(yǎng)于 含有ΙΟμΜ forskolin(佛司可林，購自Sigma公司，貨號F6886)和濃度分別為0M、 12.5 X IO-8M > 5Χ1(Γμ和2X10_6M的銀杏內(nèi)酯B(購自Sigma公司，商品目錄號G6910) 的三維基質(zhì)膠(Purecol Collagen,購自 hiamed Biomaterials Fremont 公司，貨號 5409)中， 每孔大約400個細胞，培養(yǎng)4-5天后，在僅含有10 μ M forskolin的孔中形成MDCK細胞 的囊泡模型。每個劑量重復3個孔。培養(yǎng)第6天時計數(shù)圓形囊泡(直徑大于50 μ m)和 非囊泡細胞的集落，計算囊泡占總細胞集落(囊泡和非囊泡集落)的百分率。實驗設三次 重復，結果表明，囊泡占總細胞集落的百分率為33.82士0.93%。囊泡與非囊泡細胞的形 態(tài)如圖3所示。其中，control表示該孔中加入不含forskoKn的培養(yǎng)液，forskoKn表示該 孔中加入含10 μ M forskolin的培養(yǎng)液。銀杏內(nèi)酯B對MDCK囊泡形成的抑制作用如圖4 所示。從圖4中可以看出，銀杏內(nèi)酯B可以明顯減少forskoKn誘導的MDCK囊泡數(shù)目， 且抑制作用呈劑量效應關系(圖中黑色部分)，但銀杏內(nèi)酯B不影響總集落數(shù)(包括囊泡 和非囊泡集落，圖中白色和黑色部分的總和)。以上結果說明，銀杏內(nèi)酯B對MDCK囊 泡形成具有明顯的抑制作用，但沒有細胞毒性。
2、囊泡生長抑制實驗
將MDCK細胞培養(yǎng)于含有10 μ M forskolin的三維基質(zhì)膠中，培養(yǎng)4_5天后即 可形成直徑為50-100 μ m的圓形囊泡；然后再在細胞培養(yǎng)板中加入終濃度分別為0M、 1.25Χ1(ΓΜ、5X IO-7M和2X IO-6M的銀杏內(nèi)酯B繼續(xù)培養(yǎng)。每日換新鮮的含有銀杏內(nèi) 酯B和forskolin的培養(yǎng)液，隔天跟蹤照相各個囊泡并測量囊泡直徑以評價銀杏內(nèi)酯B抑 制囊泡生長的效果，共觀察8-12天。每個劑量重復3個孔，每孔計數(shù)10個以上囊泡， 作囊泡生長曲線。實驗設三次重復，銀杏內(nèi)酯B對囊泡生長的抑制作用如圖5所示。其 中，第一排表示第4-12天用僅含forskoKn的培養(yǎng)液培養(yǎng)，第二排表示第4_12天用含有銀 杏內(nèi)酯B和forskoKn的培養(yǎng)液培養(yǎng)，第三排表示第4_7天用含有銀杏內(nèi)酯B和forskolin 的培養(yǎng)液培養(yǎng)，第8-12天只用含forskoHn的培養(yǎng)液培養(yǎng)。銀杏內(nèi)酯B對囊泡生長的抑制 作用曲線如圖6所示。結果表明，MDCK細胞在含有10 μ M forskolin的三維基質(zhì)膠中培 養(yǎng)4天后即可形成圓形囊泡，且囊泡呈進展性生長(見圖5第一排細胞)，從圖6中可以 看出，銀杏內(nèi)酯B能夠明顯抑制囊泡生長。
二、銀杏內(nèi)酯B能夠可逆地抑制囊泡的生長，作用呈劑量效應關系
將MDCK細胞培養(yǎng)于含有10 μ M forskolin的三維基質(zhì)膠中，培養(yǎng)4天后即可形 成圓形的囊泡；從第4天開始在細胞培養(yǎng)板中加入終濃度為1.25X10_7M的銀杏內(nèi)酯B繼 續(xù)培養(yǎng)，每日換新鮮的含有銀杏內(nèi)酯B和forskoKn的培養(yǎng)液；到第8天時，在細胞培養(yǎng) 板中只加入終濃度為10 μ M的forskoKn，而不加入銀杏內(nèi)酯B，直至第12天。每天測 量囊泡直徑，實驗設三次重復，銀杏內(nèi)酯B可逆性抑制囊泡生長的情況如圖7所示。其 中，實心球曲線表示同時加入終濃度為10μ M的forskoKn和銀杏內(nèi)酯B，空心球曲線表 示只加入終濃度為10 μ M的forskoKn而沒加入銀杏內(nèi)酯B。結果表明，去掉銀杏內(nèi)酯B 后，囊泡可恢復生長，說明銀杏內(nèi)酯B并未損傷囊泡上皮細胞，表明銀杏內(nèi)酯B對囊泡 生長的抑制作用是可逆的。
實施例2、銀杏內(nèi)酯B的細胞毒性、對細胞生長與分化的影響
1、通過MTT法確定銀杏內(nèi)酯B的細胞毒性
將對數(shù)期的MDCK細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔含有4X IO3個細胞， 每孔給予200 μ 1 MDCK細胞培養(yǎng)液(由DMEM培養(yǎng)基(購自美國Invitrogen公司，商品 目錄號12100-046)和F12培養(yǎng)基(購自美國Invitrogen公司，商品目錄號21700-075)等 體積混合而成)，置于37°C的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)M小時。然后在細胞培養(yǎng)板中加入 終濃度分別為1 X 1(T4M、1 X 1(Γ5Μ、1 X IO-6M和1 X IO-7M的銀杏內(nèi)酯B 20 μ 1，繼續(xù)培 養(yǎng)M小時。除去上清，加入200 μ 1 MDCK細胞培養(yǎng)液和20 μ 1濃度為5mg/ml的MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3小時。除去上清，每孔加入150 μ 1 二甲基亞砜，置搖床上100轉(zhuǎn)/分 振蕩ΙΟη ι，使結晶物充分溶解。酶標儀檢測各孔OD值(檢測波長為492nm)，設置調(diào) 零孔(培養(yǎng)基、MTT和二甲基亞砜)和對照孔(細胞、相同濃度的銀杏內(nèi)酯B的溶解介 質(zhì)、培養(yǎng)基、MTT和二甲基亞砜)，每組設定5個復孔。按照下述公式計算抑制率抑 制率=[(對照孔-調(diào)零孔)-(給藥孔-調(diào)零孔)]/ (對照孔-調(diào)零孔)X 100 %。實驗設 三次重復，加入銀杏內(nèi)酯B后細胞的MTT結果如圖8所示。其中，control表示用不含 銀杏內(nèi)酯B的培養(yǎng)液培養(yǎng)。結果表明，IXlO-5M以下濃度的銀杏內(nèi)酯B對MDCK細胞 無細胞毒性作用，說明銀杏內(nèi)酯B抑制囊泡的作用與其細胞毒性無關。
2、Tunel試劑盒(購自Roche公司，貨號11684795910)確定銀杏內(nèi)酯B對細胞 凋亡的影響
將MDCK細胞培養(yǎng)于由等體積的DMEM培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基組成的培養(yǎng)液中， 當細胞密度達到30-50%時分別加入濃度為1.25X10_7M、5X1(TM、2X10_6M的銀杏內(nèi) 酯B，繼續(xù)培養(yǎng)48小時；倒去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞一次，然后在15-25°C的條件 下，用體積百分含量為4%的多聚甲醛(固定液)固定細胞60分鐘。再用PBS洗滌一 次，加入含有0.1%體積百分含量Triton X-100的0.1%質(zhì)量百分含量的檸檬酸鈉劑(透 化液)，冰上)孵育2分鐘。除去透化液，銀杏內(nèi)酯B處理的實驗組、陽性對照 組分別加入50 μ 1 TUNEL檢測液，陰性對照組加入50 μ 1熒光標記液(Label solution)， 在潮濕的環(huán)境中，37°C避光孵育60分鐘。用PBS洗滌3次，用抗熒光淬滅封片液(購 自Beyotime，貨號P0126)封片后熒光顯微鏡下觀察、計數(shù)、照相。在光學顯微鏡下， 凋亡細胞的細胞核被染成棕黃色，可見細胞核形態(tài)呈碎點狀。在熒光顯微鏡下，選擇 450-500nm的激發(fā)波長和515-565nm的發(fā)射波長，凋亡細胞顯示綠色熒光。隨機選取5 個高倍視野，統(tǒng)計各組(實驗組、陽性對照組和陰性對照組)的凋亡細胞數(shù)并做統(tǒng)計分 析。實驗設三次重復，銀杏內(nèi)酯B對MDCK細胞凋亡的誘導作用如圖9和圖10所示。 圖9和圖10中，control表示陰性對照組細胞的凋亡情況，gentamycin表示陽性對照組細 胞的凋亡情況，銀杏內(nèi)酯B表示加入銀杏內(nèi)酯B的實驗組細胞的凋亡情況。結果表明， 銀杏內(nèi)酯B不明顯誘導MDCK細胞凋亡，證實銀杏內(nèi)酯B抑制囊泡的作用與其促進細胞 凋亡無關。
3、MDCK小管生成實驗證實銀杏內(nèi)酯B能夠促進MDCK形成小管樣結構，作用呈劑量效應關系
將MDCK細胞在分別含有1.25 Χ1(Γ7Μ、5 X IO-7M> 2 X 10_6M的銀杏內(nèi)酯B禾口 3T3成纖維細胞培養(yǎng)液(用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(購自美國Invitrogen公司， 商品目錄號12100-046，培養(yǎng)3T3成纖維細胞3日，所得培養(yǎng)液即為3T3成纖維細胞培養(yǎng)液)的三維基質(zhì)膠中培養(yǎng)15天，每日換新鮮的含有銀杏內(nèi)酯B和3T3成纖維細胞培養(yǎng)液 的培養(yǎng)液并照相，每孔跟蹤10個以上小管，通過小管計數(shù)來評價銀杏內(nèi)酯B對MDCK細 胞分化的影響。實驗設三次重復，銀杏內(nèi)酯B對MDCK小管生成的促進作用如圖11所 示。其中，control表示用不含銀杏內(nèi)酯B的3T3成纖維細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)MDCK細胞15 天。結果表明，銀杏內(nèi)酯B能夠促進MDCK細胞形成小管樣結構，作用呈劑量效應關 系。
4、MDCK小管生成實驗證實銀杏內(nèi)酯B能夠促進囊泡形成小管樣結構，作用呈 劑量效應關系
將MDCK細胞培養(yǎng)于含有10 μ M forskoKn的三維基質(zhì)膠中，培養(yǎng)4天后即 可形成直徑為50-100μιη的圓形囊泡；停止加forskoKn，換成分別含有1.25X 10_7M、5X IO-7M, 2X IO-6M銀杏內(nèi)酯B的HGF或3T3成纖維細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每日換新鮮 的含有銀杏內(nèi)酯B的HGF或3T3成纖維細胞培養(yǎng)液。MDCK囊泡在3T3成纖維細胞培 養(yǎng)液中出芽、突觸、成索和成管，類似于腎臟上皮細胞小管生成過程。15天后，統(tǒng)計所 形成的小管個數(shù)和小管的長度。實驗設三次重復，銀杏內(nèi)酯B對囊泡形成小管樣結構的 促進作用如圖12和13所示。圖12中，control表示用不含銀杏內(nèi)酯B的3T3成纖維細 胞培養(yǎng)液培養(yǎng)4天的MDCK囊泡15天。結果表明，銀杏內(nèi)酯B能夠促進囊泡形成小管 樣結構，作用呈劑量效應關系。
5、銀杏內(nèi)酯B的作用靶點和機制
利用Western印跡技術，檢測銀杏內(nèi)酯B對囊泡上皮細胞信號轉(zhuǎn)導通路的影響。 具體實驗過程如下
將MDCK細胞培養(yǎng)至70%細胞密度，換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)M小時，然后分別 加入含10 μ M forskolin的培養(yǎng)液，同時分別給予銀杏內(nèi)酯B，使其在培養(yǎng)基中的終濃度 分別為0M、1.25X IO-7M> 5X IO-7M和2X 1(Γ6Μ，同時以不含forskolin的培養(yǎng)液培養(yǎng)的 MDCK細胞作為control組，上述各組均刺激ΜΟη ι。
提取上述各組細胞的總蛋白，用Bradford法作蛋白定量。SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn) 膜，加相應一抗(p-ERK，sc7383、ERK2, sc-153、B_raf，sc-166、Raf-I, sc-227 和 β -actin, sc47778，上述各抗體均購自美國Santa Craz Biotechnology公司)和二抗(購自 美國Amersham公司，商品目錄號NA9!34VS)。用ECL PLUS (購自美國GE Healthcare公 司，商品目錄號ALSZR004-096412)化學發(fā)光，顯影、定影。通過檢測B_raf、Raf-I和 p-ERK蛋白水平發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B對Ras-B-Raf-MEK-ERK信號通路的影響。在ADPKD 中，B-raf表達增加、Raf-I表達減少，而銀杏內(nèi)酯B可以下調(diào)B_raf，上調(diào)Raf-I，并可 抑制p-ERK磷酸化，結果如圖14所示。
實施例3、通過體外胚胎腎模型確定銀杏內(nèi)酯B對胚胎腎囊泡生長的抑制作用
第1天下午將6周齡ICR小鼠(購自北京大學醫(yī)學部實驗動物中心)按照1 1 的數(shù)量進行雌雄同籠交配，第2天早上觀察雌鼠是否有陰栓，若有陰栓澤表示雌鼠已懷 孕半日，將沒有陰栓的小鼠先分籠，下午再合籠，第二日再觀察；將懷孕雌鼠繼續(xù)單獨 喂養(yǎng)13天，第13天取胚胎腎用tnmswell板培養(yǎng)。
取上述13.5天的小鼠胚胎腎在100 μ m的8-Br-cAMP (購自Sigma公司，貨號 B-1381)作用下，在腎組織中形成多發(fā)性、進行性生長的腎囊泡，可作為評價銀杏內(nèi)酯B預防和/或治療ADPKD的體外整體器官模型。同時以不用8-Br-cAMP處理的小鼠胚 胎腎作為對照。胚胎腎囊泡模型的示意圖如圖15所示。小鼠胚胎腎的囊泡形成過程如 圖16所示。其中，control表示沒有用8-Br_cAMP處理的胚胎腎，8-Br_cAMP表示用 100 μ m的8-Br-cAMP處理過的胚胎腎。
將上述形成囊泡的胚胎腎分別用濃度為1.25X10_7M、5X10_7M、2X10_6M的銀 杏內(nèi)酯B處理，實驗設三次重復，銀杏內(nèi)酯B對胚胎腎囊泡生長的抑制作用如圖17和18 所示。圖17中，control表示未用8-Br-cAMP和銀杏內(nèi)酯B處理的胚胎腎；8-Br-cAMP 表示只用8-Br-cAMP處理，而未用銀杏內(nèi)酯B處理的胚胎腎；銀杏內(nèi)酯B 1.25X 10_7、 銀杏內(nèi)酯B 5X 10_7、銀杏內(nèi)酯B 2X 10_6分別表示同時用8-Br-cAMP和相應濃度的銀杏 內(nèi)酯B處理的胚胎腎。
結果表明，銀杏內(nèi)酯B能夠抑制8-Br-cAMP誘導的13.5天的小鼠胚胎腎組織內(nèi) 的囊泡形成，且抑制作用隨銀杏內(nèi)酯B濃度的增加而增強。
權利要求
1.以銀杏內(nèi)酯B為活性成分的預防和/或治療常染色體顯性遺傳多囊腎病的藥物。
2.銀杏內(nèi)酯B在制備預防和/或治療常染色體顯性遺傳多囊腎病的藥物中的應用。
3.以銀杏內(nèi)酯B為活性成分的抑制細胞形成囊泡和/或抑制囊泡生長的藥物。
4.銀杏內(nèi)酯B在制備抑制細胞形成囊泡和/或抑制囊泡生長的藥物中的應用。
5.根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于所述細胞為犬腎細胞或小鼠胚胎腎細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了銀杏內(nèi)酯B在制備預防和/或治療常染色體顯性遺傳多囊腎病的藥物中的應用。本發(fā)明應用MDCK囊泡模型篩選發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B抑制囊泡形成和生長，實驗結果表明，銀杏內(nèi)酯B對MDCK囊泡形成和生長具有明顯的抑制作用，且其作用呈劑量效應關系；銀杏內(nèi)酯B對MDCK細胞無細胞毒性作用，說明銀杏內(nèi)酯B抑制囊泡的作用與其細胞毒性無關；銀杏內(nèi)酯B不明顯誘導MDCK細胞凋亡，證實銀杏內(nèi)酯B抑制囊泡的作用與其促進細胞凋亡無關；銀杏內(nèi)酯B能夠促進MDCK細胞或囊泡形成小管樣結構，作用呈劑量效應關系；而且銀杏內(nèi)酯B對胚胎腎囊泡生長也具有抑制作用。銀杏內(nèi)酯B為開發(fā)預防和/或治療常染色體顯性遺傳多囊腎病的特效藥物提供實驗數(shù)據(jù)。
文檔編號A61K31/365GK102018702SQ200910092750
公開日2011年4月20日 申請日期2009年9月16日 優(yōu)先權日2009年9月16日
發(fā)明者周虹, 楊寶學, 雷天落, 高晉生 申請人:北京大學