專利名稱：：一種杠板歸有效成分總黃硐的提取方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種杠板歸有效成分總黃硐的提取方法，本發(fā)明還涉及杠板歸有效成分總黃硐制備治療抗皰疹病毒藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：杠板歸系蓼科植物杠板歸PolygonumperfoliatumL.的全草，始載于《萬病回春》謂"四五月生至九月見霜即無，葉尖青如犁頭樣，藤有小刺，子圓如珠，生青熟黑"。多生于陰濕草地，路邊，河岸的草叢或灌叢中，在我國南北各地均有分布。杠板歸為民間較廣泛使用的草藥，具有清熱解毒，祛濕除痹，殺蟲止瘍等功效，但對其抗病毒的活性成分還未見相關(guān)研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的要解決的技術(shù)問題是要提供一種從杠板歸中提取其有效成分總黃硐的方法，本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是杠板歸有效成分總黃硐在制備治療抗皰疹病毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種杠板歸有效成分總黃硐的提取方法，取杠板歸并按固液比為1:25分別加入濃度為75%的250ml，在8CTC的恒溫水浴鍋中回流提取3小時，得到杠板歸有效成分總黃酮。杠板歸有效成分總黃硐在制備治療抗皰疹病毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的杠板歸有效成分總黃硐的提取方法中是采用可見光分光光度法在波長為500rim處測定杠板歸總黃酮的含量，通過單因素和正交試驗確定了最佳提取工藝的條件。隨著提取溫度的提高，黃酮的提取率呈上升趨勢。但考慮到提取溫度過高會對提取液中的黃酮類化合物的活性造成破壞，溫度過低則不利于有效物質(zhì)的溶出，影響生產(chǎn)效率，因此將提取溫度確定為8(TC。隨著乙醇濃度的提高，黃酮的提取率呈上升趨勢，但大于75%后隨著濃度的進(jìn)一步升高，黃酮提取率反而有所下降，通過單因素和正交試驗確定了最佳提取工藝的條件為以75%的乙醇溶液為溶劑，固液比為l:25，在80。C下回流3h，提取率最高，總黃酮提取率為7.589%。本發(fā)明對杠板歸有效成分總黃硐在制備治療抗皰疹病毒藥物中的應(yīng)用進(jìn)行了研究，認(rèn)為杠板歸主要通過抑制病毒增殖途徑發(fā)揮抗HSV-1作用，杠板歸總提物在抑制病毒增殖(TI=27.58)和直接殺傷(TI=13.36)上作用明顯，正丁醇部位(總黃酮)在抑制病毒增殖(TI=8.8)上作用明顯，有直接殺傷病毒的作用。溶質(zhì)對病毒無作用。得到杠板歸主要通過抑制病毒增殖和直接殺傷病毒的途徑發(fā)揮抗HSV-1作用，其主要活性成分庫杠板歸總黃酮的結(jié)論。圖1是溶劑10。/。DMS0對細(xì)胞的毒性作用，溶劑的半數(shù)毒性濃度為0.226ug/ml。圖2是G2藥物對細(xì)胞的毒性作用，正丁醇部位(G2)的半數(shù)毒性濃度為0.00297rag/ml。圖3是G3藥物對細(xì)胞的毒性作用，乙酸乙酯部位(G3)半數(shù)毒性濃度為0.00104mg/ml。圖4是G4藥物對細(xì)胞的毒性作用，總提部位(G4)半數(shù)毒性濃度為0.00187mg/ml。具體實施例方式一、提取制備工藝的研究1.1儀器shb-m循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠(RE52-05);UV-2100紫外分光光度儀(上海尤尼柯公司)。1.2試藥杠板歸藥材于采自湖北宜昌市郊區(qū)，經(jīng)鑒定為PolygonumperfoliatumL.的干燥全草。藥材原植物采集后洗凈，自然風(fēng)干，切碎后備用。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC純度98%);醫(yī)用乙醇(純度〉95%);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。2方法與結(jié)果2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品4.7mg，置25mL容量瓶中，加60%乙醇溶解并稀釋到刻度，配制成濃度為0.188mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。精密量取配制好的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分別裝入25mL容量瓶中，不足6ml的用60%乙醇補(bǔ)足，加5%亞硝酸鈉lmL，放置6min后加入10%硝酸鋁溶液lmL，放置6min，再加入4%氫氧化鈉溶液10mL，加蒸熘水至刻度，搖勻，放置15min，在500nm波長處進(jìn)行比色測定，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度(C)為橫坐標(biāo)作線性回歸，得方程為A=13.333C-0.004(r=0.9997)。2.2樣品含量測定將杠板歸(10g)粉碎，按實驗條件進(jìn)行提取，抽濾，合并濾液，減壓回收乙醇至無醇味，加適量水稀釋，用石油醚(609(TC)萃取，棄去石油醚層，抽濾，即得樣品液。精密量取樣品濃縮液0.lmL，置于25mL容量瓶中加60%乙醇溶解補(bǔ)足至6.Oml，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法測定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，得其含量。2.3單因素提取工藝研究2.3.1乙醇濃度對提取效果的影響由于乙醇對天然藥材細(xì)胞具有穿透能力，對許多成分溶解性能好，能抑制酶的催化作用，及它的無毒特性，本研究采用乙醇為提取溶劑。精確稱取5份杠板歸各10g，分別加入濃度為40%、60%、75%、90。/。的乙醇200ml，料液比為1:20，在80。C的恒溫水浴鍋中回流提取2次(2h/次)，過濾冷卻，分別取2.5ml提取液，置25ml容量瓶中，按照總黃酮的測定方法進(jìn)行黃酮類化合物的測定。重復(fù)3次。試驗結(jié)果表明，75%乙醇為最佳乙醇濃度，詳見表l。表l乙醇濃度對提取率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>15、1:20、1:25、1:30分別加入濃度為75%的乙醇100、150、200、250、300ml，在80。C的恒溫水浴鍋中回流提取2次(2h/次)，過濾冷卻，分別取2.5ml提取液，置25ml容量瓶中，按照總黃酮的測定方法進(jìn)行黃酮類化合物的測定。重復(fù)3次。試驗結(jié)果表明，隨著固液比的升高，提取率也隨之增大，固液比為1:20時黃酮提取率增加緩慢。詳見表2。表2料液比對提取率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2.3.3提取時間對提取效果的影響精確稱取5份杠板歸各10g，分別加入濃度為75y。的乙醇200ml，固液比為l:20，在80。C的恒溫水浴鍋中分別提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h，過濾冷卻，分別取2.5ml提取液，置25ml容量瓶中，按照總黃酮的測定方法進(jìn)行黃酮類化合物的測定。重復(fù)3次。試驗結(jié)果表明，隨著提取時間的延長，黃酮類物質(zhì)的提取率不斷上升。詳見表3。表3提取時間對提取率的影響水平提取時間(h)總黃酮Jl(mg)11.0551.7221.5580.6332.0632.7842.5645.232.3.4溫度對提取效果的影響精確稱取5份杠板歸各10g，分別加入濃度為75%的乙醇200ml，固液比為1:20，分別在40、50、60、70、80。C的恒溫水浴鍋中回流提取2次(2h/次)，過濾冷卻，分別取2.5ml提取液，置25ml容量瓶中，按照總黃酮的測定方法進(jìn)行黃酮類化合物的測定。重復(fù)3次。試驗結(jié)果表明，提取溫度以8(TC較好。詳見表4。表4提取溫度對提取率的影響水平提取溫度(°c)總黃酮量(mg)140583.75250597.44360603.58470632.462.4正交試驗為了確定在提取過程中各因素的影響大小，實驗對影響因素較大的乙醇濃度(A)、提取時間(B)、料液比(D)三因素進(jìn)行正交試驗和方差分析。詳見表5，表6，表7。表5實驗因素水平表水平乙醇濃度(A)提取時間(B)空白(C)料液比(D)1機(jī)1.51:15260%2.01:20375%2.51:25表6L"34)正交實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表6可以看出，在影響提取率的4個因素(乙醇濃度、料液比、空白、提取時間)中，乙醇濃度的影響最大，其影響總黃酮提取率的大小次序先后為乙醇濃度〉提取時間〉料液比，取乙醇為提取劑的杠板歸總黃酮的優(yōu)化工藝參數(shù)為乙醇濃度75%、固液比為1:25，在8CTC下回流3h.在這個最佳條件下試驗，總黃酮提取率為7.589%。由表7的方差分析結(jié)果表明，乙醇濃度(因子A)對杠板歸總黃酮的提取率的影響達(dá)到極顯著水平，乙醇濃度在75%時，提取效果最好，增大或減小乙醇濃度，提取率都減??；提取時間(因子B)對提取的影響達(dá)次顯著水平，增加提取時間，有利于杠板歸總黃酮的溶出，但提取時間過長，不僅破壞有效物質(zhì)結(jié)構(gòu)，且降低工作效率，增加了成本。料液比(因子D)對提取的影響不大。2.5驗證實驗分別稱取同批的杠板歸粗粉10克5份，按上述優(yōu)化后的制備工藝對杠板歸進(jìn)行提取，結(jié)果見表8，可見優(yōu)化后的提取工藝總黃酮含量提取率均較穩(wěn)定。表8優(yōu)化工藝總黃酮含量實驗號_總黃酮量(mg)_RSD1788.692796.033803.460.2%4801.325799,42本發(fā)明對杠板歸有效活性成分總黃酮的提取工藝進(jìn)行研究，采用可見光分光光度法在波長為500nm處測定杠板歸總黃酮的含量，通過單因素和正交試驗確定了最佳提取工藝的條件。在實驗中，隨著提取溫度的提高，黃酮的提取率呈上升趨勢。但考慮到提取溫度過高會對提取液中的黃酮類化合物的活性造成破壞，溫度過低則不利于有效物質(zhì)的溶出，影響生產(chǎn)效率，因此將提取溫度確定為8(TC。隨著乙醇濃度的提高，黃酮的提取率呈上升趨勢，但大于75%后隨著濃度的進(jìn)一步升高，黃酮提取率反而有所下降，乙醇濃度為60%80%時提取率高于其他濃度時的提取率。通過單因素和正交試驗確定了最佳提取工藝的條件為以75%的乙醇溶液為溶劑，固液比為l:25，在80。C下回流3h，提取率最高。確定了影響因素的依次為乙醇濃度、提取時間、固液比。二、杠板歸有效成分總黃硐在制備治療抗皰疹病毒藥物中的應(yīng)用本發(fā)明采用體外試驗，研究了歸板歸的主要提取成分的抗病毒活性.方法如下1)藥物對H印-2細(xì)胞的毒性作用藥物細(xì)胞毒性測定將H印-2細(xì)胞懸液稀釋成8Xl07mL，接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200uL，置37。C、5%C02、100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，分別在各孔中加入各供試品液，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)33h。觀察細(xì)胞病變(CPE)情況，并以MTT法檢測細(xì)胞存活率。每一藥物濃度重復(fù)4L另設(shè)正常細(xì)胞對照。細(xì)胞存活率(％)=(實驗孔^/對照孔^)X100%.從圖1可以看是溶劑10%DMSO對細(xì)胞的毒性作用，溶劑的半數(shù)毒性濃度為0.226ug/mlo圖2中，正丁醇部位(G2)的半數(shù)毒性濃度為0.00297mg/ml。圖3中，乙酸乙酯部位(G3)半數(shù)毒性濃度為0.00104mg/ml。圖4中，總提部位(G4)半數(shù)毒性濃度為0,00187mg/ml。2)藥效學(xué)實驗藥物對HSV-1的直接滅活作用將不同質(zhì)量濃度供試品液與100TCID5。/0.1mL的HSV-1等體積混合，37'C作用90min后，以此病毒藥物混合液感染H印-2細(xì)胞。37°C、5%0)2吸附90min，洗滌，加細(xì)胞維持液置37°C、5%002培養(yǎng)。每日觀察CPE,72h后以MTT法檢測病毒抑制率。采用治療指數(shù)(treatmentindex,TI)作為評價指標(biāo)來衡量藥物對病毒的抑制效力。每一藥物濃度重復(fù)4L，同時設(shè)置正常細(xì)胞對照、藥物對照及病毒對照，結(jié)果見表9。統(tǒng)計學(xué)處理用excell軟件線性回歸法計算藥物半數(shù)毒性濃度TCs。和半數(shù)有效濃度IC5。，得到藥物治療指數(shù)(TreatmentIndex,TI=TC5。/IC50).表9藥物對HSV-1的直接殺傷作用(將藥物與病毒等體積混合后感染細(xì)胞)藥物IC50TI溶質(zhì)0.2271G20.0009513.123G30.0006691.555G40.0001413.36溶質(zhì)為IOWMSO藥物對HSV-1生物合成的抑制作用:以100TCID5。/0.1/mLHSV-1感染細(xì)胞，吸附90min后洗滌，加入不同濃度供試液，培養(yǎng)與檢査同上，結(jié)果見表10。表IO、藥物對HSV-1增殖的抑制作用(將病毒感染細(xì)胞后加藥物)藥物IC50TI溶質(zhì)——G20.0003378.8G30.0019770.526G40.000064827.58藥物對HSV-1侵入細(xì)胞的阻斷作用:用藥物預(yù)先處理細(xì)胞90min，洗滌后以100TCIDM/0.lmL的HSV-1攻擊，37°C、5%(1)2吸附90min后洗滌，培養(yǎng)與檢查方法同上，結(jié)果見表ll。表11藥物抗HSV-1吸附的作用(用藥物預(yù)先處理細(xì)胞再加病毒攻擊)藥物ic50TI溶質(zhì)0.2251G20.004770.623G30.000961.083G40.00230.818采用治療指數(shù)(treatmentindex,TI)作為評價指標(biāo)來衡量藥物對病毒的抑制效力。根據(jù)TI〈1為有毒無效，11=2為有效有毒，TI〉2為有效低毒結(jié)合高效低毒TI〉6，有效3<TI<6;低效TI<3，TI值越高，藥物的治療安全效果就越好來看，G4藥物在抑制病毒增殖和直接殺傷上作用明顯，G2在抑制病毒增殖上有作用。溶質(zhì)對病毒無作用。初步推斷杠板歸主要通過抑制病毒增殖途徑發(fā)揮抗HSV-1作用.杠板歸總提物在抑制病毒增殖(TI=27.58)和直接殺傷(TI=13.36)上作用明顯，正丁醇部位(總黃酮)在抑制病毒增殖(TP8.8)上作用明顯,有直接殺傷病毒的作用。溶質(zhì)對病毒無作用。初步推斷杠板歸主要通過抑制病毒增殖和直接殺傷病毒的途徑發(fā)揮抗HSV-1作用，其主要活性成分庫杠板歸總黃酮。權(quán)利要求1、一種杠板歸有效成分總黃硐的提取方法，其特征在于取杠板歸并按固液比為1∶25分別加入濃度為75％的250ml，在80℃的恒溫水浴鍋中回流提取3小時，得到杠板歸有效成分總黃酮。2、杠板歸有效成分總黃硐在制備治療抗皰疹病毒藥物中的應(yīng)用。全文摘要一種杠板歸有效成分總黃硐的提取方法，取杠板歸并按固液比為1∶25分別加入濃度為75％的250ml，在80℃的恒溫水浴鍋中回流提取3小時，得到杠板歸有效成分總黃酮。本發(fā)明將杠板歸有效成分總黃硐應(yīng)用于制備治療抗皰疹病毒藥物中，認(rèn)為杠板歸主要通過抑制病毒增殖途徑發(fā)揮抗HSV-1作用，杠板歸總提物在抑制病毒增殖(TI＝27.58)和直接殺傷(TI＝13.36)上作用明顯，正丁醇部位(總黃酮)在抑制病毒增殖(TI＝8.8)上作用明顯，有直接殺傷病毒的作用。溶質(zhì)對病毒無作用。杠板歸主要通過抑制病毒增殖和直接殺傷病毒的途徑發(fā)揮抗HSV-1作用，其主要活性成分庫杠板歸總黃酮。文檔編號A61P31/22GK101596238SQ20091006278公開日2009年12月9日申請日期2009年6月16日優(yōu)先權(quán)日2009年6月16日發(fā)明者何毓敏,周志勇,張長城,丁袁,黃鶴飛申請人:三峽大學(xué)