專利名稱：藁本內(nèi)酯在制備防治老年癡呆病癥組合物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藁本內(nèi)酯(Ligustilide)的新醫(yī)藥用途，具體講是在用于制備防 治老年癡呆病癥組合物包括藥物和/或保健性食用組合物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
老年期癡呆是嚴(yán)重威脅老年人健康的一種常見病和多發(fā)病，患者在意識清醒狀態(tài) 下出現(xiàn)持久全面的智能減退，表現(xiàn)為記憶、理解、計算、判斷、定向、語言、抽象思維、自我控 制等能力障礙，導(dǎo)致患者獨(dú)立生活和工作能力喪失。老年期癡呆系慢性進(jìn)行性大腦結(jié)構(gòu)器 質(zhì)性損傷引起的高級大腦功能障礙的一組癥候群，其病因目前尚未完全闡明。研究表明β 淀粉樣肽(Αβ)在大腦記憶和認(rèn)知有關(guān)區(qū)域形成的淀粉樣物質(zhì)沉積是構(gòu)成老年癡呆患者 大腦神經(jīng)性病變斑塊并導(dǎo)致一系列神經(jīng)功能受損的主要病理特征，而氧化損傷、炎癥及凋 亡反應(yīng)是該病發(fā)生發(fā)展的重要發(fā)病機(jī)制。目前治療老年期癡呆的主要策略是改善認(rèn)知功能 障礙以提高病人的生活能力。國內(nèi)外用于老年期癡呆治療的藥物主要包括膽堿能制劑、興 奮性氨基酸和肽類遞質(zhì)(如一葉秋堿、蛇床子等)、Αβ纖維形成和沉積的干擾物質(zhì)(如丹 酚酸B、大黃素等)、抗氧化劑(如丹酚酸類化合物、茶多酚、銀杏提取物等)、微循環(huán)改善物 質(zhì)(如丹參酮和丹參素、川芎嗪和阿魏酸等)、鈣拮抗劑(如芹菜甲素、小蘗堿等)等。但 大量研究發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有藥物大多存在長期治療效果欠佳、不良反應(yīng)較大、難以透過血腦屏障、 不易吸收或?qū)夏昶诎V呆復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制缺乏特異性和整合的干預(yù)作用等原因，嚴(yán)重影響 這些藥物對老年癡呆的臨床防治效果。隨著社會人口進(jìn)入老齡化的進(jìn)程，癡呆患者逐年增 多，加之本病的患病率和致殘率高、病程長、治療和護(hù)理開支大等原因，給患者、家庭和社會 都帶來巨大的負(fù)擔(dān)和影響。因此，基于國際上老年期癡呆發(fā)病分子機(jī)制研究的最新進(jìn)展，積 極研究多靶點(diǎn)干預(yù)老年期癡呆主要發(fā)病機(jī)制的新型藥物具有重大意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述情況，本發(fā)明將提供一種經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)對老年癡呆病癥的防治具有顯著效 果的組合物。本發(fā)明所說的對老年癡呆病癥具有防治作用的組合物，是以藁本內(nèi)酯作為有效成 分，與藥學(xué)和/或食品中可以接受的一種或多種固體或液體形式的其它成分或輔助成分共 同組成，是將已知藥用成分藁本內(nèi)酯在作為防治老年癡呆病癥的治療藥物和/或輔助性治 療組合物(包括功能性食品)中的一種應(yīng)用。藁本內(nèi)酯(Ligustilide)是一種不溶于水的油性物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)如式(I)所示。 藁本內(nèi)酯目前可以由含有該成分的常用中藥，如當(dāng)歸、川芎、茶芎等植物中提取得 到，也可以由合成方式人工制備得到，如公開號CN 1552702AXN 1084851A和CN 1778799A 等中國專利文獻(xiàn)，及其它相關(guān)文獻(xiàn)(如胡長鷹，丁宵霖等當(dāng)歸中藁本內(nèi)酯的提取、分離與 結(jié)構(gòu)鑒定)在《無錫經(jīng)工大學(xué)學(xué)報》2003，9 69中的報道，都有合成方式制備藁本內(nèi)酯的相 關(guān)報道。由于藁本內(nèi)酯在許多天然植物/藥物中都存在，且多為順式結(jié)構(gòu)形式，因此在本發(fā) 明所說的組合物中，作為有效成分使用的藁本內(nèi)酯，以采用來源更為豐富的天然存在形式 的藁本內(nèi)酯更為有利目前對藁苯內(nèi)酯的研究和應(yīng)用，多是針對其在心腦血管方面的作用和功效，如公 開號CN 1732921A,CN 1748676A、CN1857534A等中國專利文獻(xiàn)都涉及了以藁本內(nèi)酯作為預(yù) 防和治療缺血性腦梗塞等腦缺血性疾病的藥物，CN1543859A中報道了將藁本內(nèi)酯用于防治 動脈粥樣硬化的用途等。本發(fā)明所說組合物的應(yīng)用方式，可以作為老年癡呆病癥治療藥物使用的適當(dāng)?shù)氖?用形式和劑量形式的藥物組合物。由于本發(fā)明涉及的只是將目前已經(jīng)作為藥物成分使用 的藁本內(nèi)酯在防治老年癡呆病癥這一新領(lǐng)域方面進(jìn)行擴(kuò)展的應(yīng)用方式，因此在作為藥物使 用時，目前作為藥物成分使用的藁本內(nèi)酯的各種制劑形式和/或應(yīng)用方式，同樣都適用于 本發(fā)明所說的組合物。例如，藁本內(nèi)酯為油狀液體且不穩(wěn)定，根據(jù)上述的使用劑量需要， 制藥領(lǐng)域的技術(shù)人員通過選擇適當(dāng)?shù)妮o料成分制成符合藥品和保健品穩(wěn)定性要求的各種 口服制劑。例如，可以按照公開號CN1732922A報道的方式制備成軟膠囊制劑；或是按照 CN1732923A報道的方式通過環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物進(jìn)行包合后，進(jìn)一步制備成包括多種口 服型制劑和輸液、水針、粉針等注射型制劑在內(nèi)的多種可供使用的藥物形式。除作為治療藥物外，本發(fā)明的上述組合物也可以是作為配合治療、或是作為預(yù)防 老年癡呆病癥使用的保健性食用組合物。作為治療藥物和/或保健性食用組合物的上述組合物，為進(jìn)一步提高其對老年 癡呆病癥的防治效果，在上述所說有效藥物成分藁本內(nèi)酯的基礎(chǔ)上，還可以在目前已知對 老年癡呆病癥有確切療效作用的中藥單體及其它有效成分，包括如乙酰膽堿酯酶抑制劑 (如石杉堿類化合物等)、興奮性氨基酸和肽類遞質(zhì)成分(如一葉秋堿、蛇床子等)、Αβ 纖維形成和沉積的干擾成分(如丹酚酸B、大黃素等)、抗氧化劑成分(如丹酚酸類化合 物、茶多酚、銀杏提取物等)、微循環(huán)改善成分(如丹參酮和丹參素、川芎嗪和阿魏酸等)、 鈣拮抗劑(如芹菜甲素、小蘗堿等)等成分中，根據(jù)需要，以占有效成分總重量10% 40%的方式選擇其中的一種或多種，作為輔助性有效成分，組成復(fù)方形式的有效成分使用。本發(fā)明上述組合物在用于預(yù)防和治療老年癡呆病癥時，對有效成分藁本內(nèi)酯具體 用量(給藥劑量)的確定，需取決于多種因素，包括使用對象的年齡、體重、個體差異、疾病
4的嚴(yán)重程度，以及相應(yīng)臨床治療上的個體化實(shí)施方案等，因此可根據(jù)實(shí)際的治療和需要進(jìn) 行調(diào)整。試驗(yàn)顯示，一般情況下每天的適宜用量(劑量)范圍可在0. 1 500mg/kg體重范 圍內(nèi)，根據(jù)臨床治療的實(shí)施方案可以采用每天一次性或分為多次等不同方式使用。除可單 獨(dú)服用上述的組合物外，也可與其他治療藥物合并使用，并在合理的范圍內(nèi)調(diào)整用量。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，采用Αβ淀粉肽誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y損傷，測定了氧 化、凋亡和炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)，藁本內(nèi)酯對A β淀粉肽誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y損 傷有保護(hù)作用，并與藁本內(nèi)酯的抗氧化、抗凋亡和抗炎作用相關(guān)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，首先通過建立Wi star大鼠雙側(cè)側(cè)腦室腦立體定位注射A β淀粉肽造 成記憶障礙模型，用Morris水迷宮檢測藁本內(nèi)酯對動物近記憶和空間功能的影響，結(jié)果表 明藁本內(nèi)酯對癡呆大鼠記憶力和空間定向力、近記憶和空間位置功能缺損有明顯的改善作 用；同時，該模型的病理學(xué)結(jié)果還顯示，腦立體定位注射Aβ淀粉肽造成癡呆的大鼠前額葉 區(qū)層和海馬CAl區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞缺失明顯，有明顯核固縮現(xiàn)象、濃染；海馬神經(jīng)元數(shù)目有所減 少，缺失現(xiàn)象明顯。經(jīng)藁本內(nèi)酯治療后，明顯改善大鼠前額葉皮層神經(jīng)元的損傷，使神經(jīng)元 細(xì)胞形態(tài)基本正常；海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷情況明顯改善，細(xì)胞形態(tài)基本正常，排列整齊，無 明顯核固縮現(xiàn)象，說明藁本內(nèi)酯對于Αβ淀粉肽引起的神經(jīng)元退行性病變具有防治作用。由于老年癡呆疾病是一類以進(jìn)行性記憶力減退為主要特點(diǎn)的大腦退行性疾病，并 且與年齡的增長關(guān)系最為密切，因而是老齡人群的常見疾病之一。此外，還由于老年癡呆疾 病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要包括遺傳因素(如APP、apoE、PsU Ps2等基因突變)、異常過度磷 酸化的tau蛋白引起的細(xì)胞骨架改變、腦內(nèi)乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)代謝障礙、淀粉前體蛋白 代謝失調(diào)引起細(xì)胞外老年斑的形成、細(xì)胞內(nèi)鈣代謝紊亂、免疫炎癥反應(yīng)、自由基損傷學(xué)說和 神經(jīng)細(xì)胞凋亡等發(fā)病機(jī)制，因此，僅就上述A β淀粉肽造成老年癡呆大鼠模型尚不足以完 全模擬和證明臨床老年癡呆疾病的過程。在遺傳性快速老化小鼠(SAM)由日本京都大學(xué)竹田教授培育成功，包括SAMP和抗 快速老化的R系(SAMR)的基礎(chǔ)上，其中SAMP8亞系具有典型的癡呆特征和腦部病理變化， 該動物中樞學(xué)習(xí)記憶功能隨年齡增長進(jìn)行性快速衰退，是目前國內(nèi)外公認(rèn)的研究老年癡呆 的遺傳性動物模型，而SAMRl則表現(xiàn)為正常衰老，可作為SAMP8的正常對照。因此在證明了 藁本內(nèi)酯對Αβ淀粉肽造成的記憶障礙模型具有改善作用的基礎(chǔ)上，本發(fā)明又進(jìn)一步應(yīng)用 快速老化癡呆SAMP8小鼠模型，采用Y型迷宮及跳臺行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測藁本內(nèi)酯對動物學(xué)習(xí) 記憶功能的影響。這些進(jìn)一步的深入試驗(yàn)結(jié)果可充分表明，藁本內(nèi)酯對癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶 功能障礙有明顯的改善作用，進(jìn)一步證實(shí)了藁本內(nèi)酯對老年癡呆疾病具有的防治作用。以下通過由附圖所示實(shí)施例的具體實(shí)施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的 詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。在不脫離本發(fā)明 上述技術(shù)思想情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識和慣用手段做出的各種替換或變更，均應(yīng) 包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。


圖1為顯示藁本內(nèi)酯保護(hù)Αβ淀粉肽誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的結(jié)果圖。圖2為顯示藁本內(nèi)酯抑制Αβ淀粉肽誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的結(jié)果圖。圖3為顯示藁本內(nèi)酯對Αβ淀粉肽誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體途徑凋亡蛋白表達(dá)的影響的結(jié)果圖。圖4為顯示藁本內(nèi)酯對Αβ淀粉肽誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞表達(dá)炎性相關(guān)蛋白 TNF-α，C0X-2的影響的結(jié)果圖。圖5為顯示藁本內(nèi)酯對腦立體定位注射Αβ淀粉肽大鼠水迷宮學(xué)習(xí)記憶的影響的 結(jié)果圖Α(η = 10)。圖6為顯示藁本內(nèi)酯對腦立體定位注射Αβ淀粉肽大鼠水迷宮學(xué)習(xí)記憶的影響的 結(jié)果圖B(η = 10)。圖7為顯示藁本內(nèi)酯對腦立體定位注射Αβ淀粉肽大鼠水迷宮學(xué)習(xí)記憶的影響的 結(jié)果圖C(n = 10)。圖8為顯示藁本內(nèi)酯對腦立體定位注射Αβ淀粉肽大鼠水迷宮學(xué)習(xí)記憶的影響的 結(jié)果圖D(η = 10)。圖9為顯示藁本內(nèi)酯對腦立體定位注射Αβ淀粉肽大鼠腦前額葉皮層區(qū)及海馬 CAl區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞影響的結(jié)果圖。圖10為顯示藁本內(nèi)酯對腦立體定位注射Αβ淀粉肽大鼠腦前額葉皮層區(qū)病變蛋 白ΑΡΡ、Αβ和Tau表達(dá)的影響的結(jié)果圖。圖11為顯示藁本內(nèi)酯對腦立體定位注射Αβ淀粉肽大鼠海馬CAl區(qū)病變蛋白 APP, A β和Tau表達(dá)的影響的結(jié)果圖。圖12為顯示藁本內(nèi)酯對腦立體定位注射Αβ淀粉肽大鼠腦前額葉皮層區(qū)和海馬 CAl區(qū)炎性蛋白TNF-α和NF-κ B表達(dá)的影響的結(jié)果圖。圖13為顯示藁本內(nèi)酯對SAMP8快速老齡化小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的影響的結(jié)果 圖 Α(η = 12)。圖14為顯示藁本內(nèi)酯對SAMP8快速老齡化小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的影響的結(jié)果 圖 C(n = 12)。其中，相關(guān)柱狀圖中標(biāo)注有*或**的含義是*表示與模型組比較有顯著性差異P < 0. 05 ；**表示與模型組比較有非常顯著性差異P < 0. 01。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1藁本內(nèi)酯(Ligustilide，LIG)保護(hù)A β淀粉肽誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷細(xì)胞培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞株購自美國ATCC。SH-SY5Y細(xì)胞用 高糖 DMEM 完全培養(yǎng)基〔含 10% (V/V)FBS,1% (V/V)NEAA, 100U/ml 青霉素，100 μ g/ml 鏈霉 素〕，在37°C，5% CO2，飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2-3天更換一次培養(yǎng)基，4-6天傳
代一次。取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，用于不同實(shí)驗(yàn)。 試劑和藥品N_2supplement 美國Gibco公司 非必需氨基酸(NEAA) 美國Sigma公司 A β (25-35) 美國Sigma公司 TNF-α多克隆抗體 美國CST公司Cox2多克隆抗體 美國CST公司
其余試劑均為市售分析純。儀器ESCO 二級生物安全柜Leica DMIL HC熒光倒置顯微鏡SHELLAB 2323-2C02 細(xì)胞培養(yǎng)箱
新加坡ESCO科技有限公司 德國萊卡儀器有限公司 美國Shellab公司ELGA PureLab Ultra/Classic 純水系統(tǒng) 英國 ELGA LabWater 公司分組與給藥①空白對照組只用含0. 1 % DMSO的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，不加 A β (25-35)及 LIG 干預(yù)。②Αβ (25-35)損傷組以 Αβ (25-35)作用于 SH-SY5Y 細(xì)胞。 1^16干預(yù)組丄16孵育5^￥5￥細(xì)胞后，再給予六3 (25_35)，根據(jù)濃度梯度，LIG 干預(yù)組又分為5. 0,2. 5,1. 0,0. 1 μ g/ml四個濃度組。A β (25-35)溶液的配制用無菌蒸餾水配制ImM/l A β (25-35)溶液，經(jīng)PBS稀釋成不同濃度后，參照文獻(xiàn) 方法于37°C老化14天后備用。細(xì)胞活力檢測用MTT法檢測細(xì)胞存活率。取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞，用DMEM完全培養(yǎng) 基配成單細(xì)胞溶液，以1. 2X IO4個細(xì)胞/cm2細(xì)胞懸液的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 中，每孔100μ 1，將接種后的細(xì)胞培養(yǎng)板放入37°C，5% C02，飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)。①接種24h后，更換含有N-2的無血清培養(yǎng)基，同時每孔加入DMEM完全培養(yǎng)基其中含 有0.1%01^0，2處后，加入不同濃度的六3 (25-35)作用24h，觀察不同濃度Aβ (25-35) 對細(xì)胞存活率的影響；②接種2處后，換液，加入5.0、2.5、1.0、0.1118/1111 LIG，空白對 照組和Αβ (25-35)損傷組加入DMEM完全培養(yǎng)基其中含有0. DMS0，孵育24h后，加 入Αβ (25-35) (50uM)作用24h后，加入MTT溶液10 μ 1/孔，37°C繼續(xù)孵育4h后，吸去上 清液，每孔加入DMSO 150 μ 1溶解紫色結(jié)晶，在570nm波長下用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值 (OD570nm)，按下式計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組(OD57tlnm) /空白對照組(OD57tlnm) X 100 %ROS 檢測DCFH-DA是迄今為止最常用、最靈敏的細(xì)胞內(nèi)ROS探針，本身沒有熒光的DCFH-DA 可穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化生成DCHL在活性氧存在的條件下，DCFH被氧化生 成熒光物質(zhì)DCF，綠色熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平成正比。本實(shí)驗(yàn)參照Hong andjo印h方 法并有所改進(jìn)，3^￥5￥細(xì)胞接種2411后，換液，加入5.0、2.5、1.0、0.1“8/1111 LIG，空白對 照組和A β (25-35)損傷組加入DMEM完全培養(yǎng)基(DMS0終濃度為0. 1 % )，孵育24h后，加入 Αβ (25-35) (5011] )作用311后，加入1(^]\1 DCFH-DA，37°C避光孵育30min。移出含有DCFH-DA 的溶液，PBS洗滌，每孔熒光強(qiáng)度用酶標(biāo)儀檢測(激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長520nm)。免疫印跡分析取蛋白樣品20-40 μ g，與5X上樣緩沖液4 1體積混合，95°C加熱5min使蛋白 變性。將處理后的蛋白樣品慢慢加入加樣孔中，并在其中一個泳道加5μ 1預(yù)染蛋白分子 量Marker。80V恒壓電泳，當(dāng)?shù)鞍讟悠酚局翝饪s膠與分離膠交界處時，改為100V恒壓電泳。待溴酚藍(lán)線泳至距膠邊緣處時，停止電泳。參照分子量Marker，切下分離膠所需部分，浸入 轉(zhuǎn)膜液備用。取下PVDF膜，標(biāo)記承載蛋白的一面，浸于TBST中，洗膜3次，每次5min。將 PVDF膜浸于5%脫脂奶粉中，室溫封閉2h。將PVDF膜浸于TBST中，洗膜3次，每次lOmin。 取出PVDF膜，浸入用TBST稀釋的一抗(GAPDH抗體1 5000稀釋；Bax，TNF- α，Cox-2抗 體1 1000稀釋；Bc 1-2抗體1 1000稀釋；細(xì)胞色素c抗體1 500)，室溫孵育Ih。將 PVDF膜浸于TBST中，洗膜3次，每次lOmin。加入各抗體對應(yīng)的辣根酶標(biāo)記的二抗，Bax用 山羊抗兔IgG，β-actin，Bcl-2，細(xì)胞色素c用山羊抗小鼠IgG。二抗以1 2000的TBST 稀釋。室溫孵育2h。將PVDF膜浸于TBST中，洗膜3次，每次lOmin?；瘜W(xué)發(fā)光，顯影，定影。 條帶分析，使用Image Pro-Plus軟件分析目的條帶灰度值，各樣本以GAPDH內(nèi)參校正，比較 各組蛋白表達(dá)差異。統(tǒng)計分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以Mean士SD表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS11. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比 較采用單因素方差分析LSD法，以P < 0. 05為顯著性差異。結(jié)果分析細(xì)胞存活率采用MTT法檢測。SH-SY5Y細(xì)胞與不同濃度A β (25-35) (1 200uM) 孵育24h后，細(xì)胞存活率隨著A β (25-35)濃度增加而減少。IuM A β (25-35)導(dǎo)致15. 93% 細(xì)胞損傷，隨著Αβ (25-35)濃度增加，細(xì)胞損傷增加，當(dāng)Αβ (25-35)濃度為50uM、100uM、 200uM時，SH-SY5Y細(xì)胞損傷百分率分別為53. 74%, 73. 49%和86. 74%。根據(jù)損傷百分率， 選擇濃度為50uM Aβ (25-35)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。LIG(0. 1、1· 0、2· 5、5· 0 μ g/ml)治療后，能劑 量依賴性的減少SH-SY5Y細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞存活率，見圖1?；钚匝踉贏 β (25-35)介導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程中有著重要作用。通過DCF熒光探針 測定胞內(nèi)ROS水平可以評價LIG在Αβ (25-35)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激中的作用，圖2結(jié)果 表明，3^￥5丫細(xì)胞暴露在4 0 (25-35) (50uM)中3h后，胞內(nèi)ROS水平明顯增加，不同濃度 LIG(0. 1,1. 0,2. 5,5.0 μ g/ml)干預(yù)后，劑量依賴性地緩解胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的增加，其中2. 5 和5. 0yg/ml LIG作用顯著。Aβ (25-35)通過激活線粒體Caspase途徑誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。在凋亡通路 中，細(xì)胞色素c從線粒體釋放至細(xì)胞漿，結(jié)合凋亡誘導(dǎo)因子Apaf-I后啟動Caspase級聯(lián)反 應(yīng)。Bcl-2家族蛋白是以Bcl-2為代表的一組凋亡調(diào)節(jié)蛋白，作為線粒體的膜相關(guān)蛋白， Bcl-2通過抑制Bax的表達(dá)、細(xì)胞色素C釋放、procaspase3激活而發(fā)揮抑制凋亡的作用。 凋亡級聯(lián)反應(yīng)早期，細(xì)胞存活很大程度上依賴于Bcl-2家族中促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的 平衡狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Αβ (25-35)明顯上調(diào)Bax和胞漿細(xì)胞色素c的表達(dá)，同時下調(diào) Bcl-2蛋白水平，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但是濃度為0. 1,1.0,2. 5,5.0 μ g/ml的LIG能夠顯著抑制 Αβ (25-35)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程，降低Bax和胞漿細(xì)胞色素c的表達(dá)，且上調(diào)Bcl-2蛋白水 平，見圖3 (a為bax表達(dá)示意圖；b為bcl-2表達(dá)示意圖；c為細(xì)胞色素c表達(dá)示意圖)。SH-SY5Y細(xì)胞能產(chǎn)生腫瘤壞死因子(TNF- α )并釋放到細(xì)胞培養(yǎng)液。TNF- α是主要 的致炎細(xì)胞因子之一，是機(jī)體炎癥應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子。TNF也能使C0X-2表達(dá)上調(diào)，使自 由基生成增多，加重炎癥損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)Αβ (25-35)作用后，SH-SY5Y細(xì)胞表達(dá) TNF-α明顯增加，LIG能明顯下調(diào)TNF-α蛋白表達(dá)。A β誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞表達(dá)C0X-2，經(jīng) Aβ (25-35)作用后，SH-SY5Y細(xì)胞表達(dá)C0X-2明顯增加，LIG能明顯下調(diào)C0X-2蛋白表達(dá)，見圖4(圖a為TNF-α表達(dá)示意圖；圖b為C0X-2表達(dá)示意圖)。實(shí)施例2藁本內(nèi)酯對腦立體定位注射A β淀粉肽所致大鼠記憶功能障礙的影響動物雄性Wistar大鼠，體重300 350克，SPF級，由四川省醫(yī)學(xué)院科學(xué)院實(shí)驗(yàn) 動物研究所購買。室溫保持在25°C左后，自由進(jìn)食和飲水。試劑和藥品所用藁本內(nèi)酯化學(xué)純度> 98%，3%吐溫-80配制；其余試劑均為市售分析純。儀器Morris水迷宮，記錄儀等A β (25-35)溶液的配制用無菌生理鹽水配制A β (25-35)溶液(5mM/l)，參照文獻(xiàn)方法于37°C老化7天后腦立體定位注射Αβ淀粉肽所致大鼠記憶功能障礙的模型建立實(shí)驗(yàn)大鼠用戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉后，立體定位儀固定頭部，顱頂區(qū) 備皮，常規(guī)消毒手術(shù)區(qū)皮膚。沿顱頂中線作約2mm切口，分離骨膜使頭骨暴露，于前囟 向后0. 8mm,中線左右旁開各1. 5mm,用牙科鉆鉆開顱骨，垂直進(jìn)微量進(jìn)樣器針3. 8mm,將 IOulA β (50nmol)溶液緩慢注入，注射時間為5分鐘，留針5分鐘，以保證溶液充分彌散，然 后緩慢撤針，之后用青霉素粉消毒，縫合切口皮膚。假手術(shù)組手術(shù)操作完全相同，注射相同 體積的生理鹽水。分組與給藥動物隨機(jī)分為三組，假手術(shù)組、模型對照組和LIG(40mg/kg) 口服治療組，每組10 只。手術(shù)前所有動物均進(jìn)行水迷宮的訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)(5天)，訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)結(jié)束后即實(shí)行手術(shù)。手術(shù) 后七天開始進(jìn)行水迷宮的測驗(yàn)(7天)，分為隱匿平臺(3天)、探索平臺(1天)和新平臺(3 天)實(shí)驗(yàn)。從手術(shù)的當(dāng)天即開始給藥，直至水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束，共給藥兩周，模型對照組給予 相同劑量的溶劑(3%吐溫80)。在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，均在實(shí)驗(yàn)前1小時給藥。水迷宮實(shí)驗(yàn)本發(fā)明用Morris水迷宮檢測大鼠近記憶和空間位置的記憶力，用腦立體定位注 射Αβ淀粉肽所致大鼠記憶功能障礙的模型模擬臨床上的老年癡呆。Morris水迷宮主要由 一金屬柱形水池(池高60cm，直徑120cm)及安全島(高20cm，直徑IOcm的平臺)組成。預(yù) 先在水池中注入清水，然后加入新鮮奶粉水溶液(奶粉先用少量熱水溶解成白色均勻溶液 后，加入水池內(nèi)，邊加邊攪拌)，使池水成為不透明的乳白色，水面高出平臺15cm，這樣動物 不能通過聽、視和嗅覺到達(dá)平臺，以便檢測動物對空間位置的敏銳性。水溫保持在23士 1°C， 水池分為4個象限(東、南、西、北)，平臺置與西南象限的中心。手術(shù)前的水迷宮訓(xùn)練實(shí)驗(yàn) 連續(xù)進(jìn)行5天，均為隱匿平臺實(shí)驗(yàn)(即水面高出平臺，平臺不可見)每只大鼠1天接受2次 訓(xùn)練尋找平臺，兩次分別從東北象限、西北象限的中點(diǎn)，頭朝向池壁入水。兩次訓(xùn)練間隔10 分鐘。記錄大鼠找到平臺的時間(潛伏期)，并將兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行平均。如果大鼠在60 秒內(nèi)未找到平臺，則潛伏期按60秒計算。無論大鼠在60秒內(nèi)找到平臺與否，大鼠都要在平 臺上停留10秒。第一次實(shí)驗(yàn)開始前先將大鼠放在平臺上適應(yīng)10秒。手術(shù)后水迷宮實(shí)驗(yàn)連 續(xù)進(jìn)行7天，1-3天為隱匿平臺實(shí)驗(yàn)，方法與前所述相同，記錄大鼠找到平臺的時間(潛伏 期)；第4天為探索平臺實(shí)驗(yàn)(即移去平臺)，大鼠入水點(diǎn)位置不變，記錄大鼠在原平臺位置
9所在象限的停留時間及穿越次數(shù)；5-7天為新平臺實(shí)驗(yàn)(即平臺位置改變，放置在東北象限 的中心)，大鼠入水點(diǎn)位置不變，記錄大鼠找到平臺的時間(潛伏期)。統(tǒng)計分析所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Mean士SD表示。水迷宮實(shí)驗(yàn)中各組的潛伏期差異比較采用重 復(fù)測定的雙因素方差分析(Two-way AV0NA)。水迷宮平臺探索實(shí)驗(yàn)采用單因素方差分析。 組織病理學(xué)分析采用單因素的方差分析(One-way AVONA) (SPSS11. 0軟件)。組間差異采用 post hoc LSD檢驗(yàn)。P < 0. 05為有顯著性差異。在水迷宮實(shí)驗(yàn)中，學(xué)習(xí)和保留實(shí)驗(yàn)經(jīng)常被用于評價癡呆大鼠的空間記憶能力。在 手術(shù)前5天的訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)中，各組間沒有顯著性差異。經(jīng)過5天的訓(xùn)練，各組的游泳成績均 提高，搜索策略也逐步從邊緣式和隨機(jī)式轉(zhuǎn)向趨向式和直線式，潛伏期平均下降60%左右。 手術(shù)后的水迷宮實(shí)驗(yàn)從手術(shù)后七天開始，分為隱匿平臺實(shí)驗(yàn)、探索平臺實(shí)驗(yàn)和新平臺實(shí)驗(yàn)。 隱匿平臺實(shí)驗(yàn)中，模型組的潛伏期與手術(shù)前相比大大延長了，潛伏期從18. 2秒(手術(shù)前的 第五天)延長至27. 5秒(手術(shù)后的第三天)。搜索策略也轉(zhuǎn)為隨機(jī)式和邊緣式，表現(xiàn)出記 憶能力的損傷。LIG組和假手術(shù)組搜索策略仍為趨向式后和直線式(第三天潛伏期分別為 6. 55秒和7. 4秒)與手術(shù)前(第五天潛伏期分別為16. 8秒和16. 2秒)相比，繼續(xù)縮短。 而LIG和假手術(shù)組與模型組比較，潛伏期差異明顯(P<0.01)，見圖5。說明經(jīng)LIG(40mg/ kg)治療的大鼠已接近正常水平。在3天的隱匿平臺實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行平臺探索實(shí)驗(yàn)，將平臺 撤去以測試大鼠是否已經(jīng)形成對平臺的空間記憶。假手術(shù)組和LIG給藥組在目標(biāo)象限的停 留時間和穿越次數(shù)都大于模型對照組，組間比較除假手術(shù)組在穿越次數(shù)上與模型組無顯著 性差異外，其余比較均具有顯著性差異(P<0.01)，見圖6和圖7。在新平臺實(shí)驗(yàn)中，假手 術(shù)組和LIG治療組與模型對照組比較，潛伏期縮短明顯(P <0.01)，見圖8。說明動物通過 學(xué)習(xí)掌握了一定的尋找平臺的策略。證實(shí)LK^iAii淀粉肽片段損傷大鼠的近記憶和空間 位置功能缺損有明顯改善作用。實(shí)施例3藁本內(nèi)酯對腦立體定位注射A β淀粉肽所致大鼠神經(jīng)元損傷的影響動物雄性Wistar大鼠，體重300 350克，SPF級，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動 物研究所購買。室溫保持在25°C左后，自由進(jìn)食和飲水。試劑和藥品所用藁本內(nèi)酯化學(xué)純度> 98%，3%吐溫-80配制；其余試劑均為市售分析純。A β (25-35)溶液的配制用無菌生理鹽水配制A β (25-35)溶液(5mM/l)，參照文獻(xiàn)方法于37°C老化7天后腦立體定位注射A β淀粉肽所致大鼠記憶功能障礙的模型建立實(shí)驗(yàn)大鼠用戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉后，立體定位儀固定頭部，顱頂區(qū) 備皮，常規(guī)消毒手術(shù)區(qū)皮膚。沿顱頂中線作約2mm切口，分離骨膜使頭骨暴露，于前囟 向后0. 8mm,中線左右旁開各1. 5mm，用牙科鉆鉆開顱骨，垂直進(jìn)微量進(jìn)樣器針3. 8mm,將 IOulA β (50nmol)溶液緩慢注入，注射時間為5分鐘，留針5分鐘，以保證溶液充分彌散，然 后緩慢撤針，之后用青霉素粉消毒，縫合切口皮膚。假手術(shù)組手術(shù)操作完全相同，注射相同 體積的生理鹽水。
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分組與給藥動物隨機(jī)分為三組，假手術(shù)組、模型對照組和LIG(40mg/kg) 口服治療組，每組10 只。從手術(shù)的當(dāng)天即開始給藥，共給藥兩周，模型對照組給予相同劑量的溶劑(3%吐溫 80)。結(jié)果見圖9 :HE染色后，觀察到假手術(shù)組和LIG治療組在海馬和皮層均沒有出現(xiàn)異 常變化，皮質(zhì)結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)細(xì)胞排列有序，層次清晰，細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整、胞漿豐富、 核仁清晰。但模型對照組在注射A β (25-35)兩周后，海馬和皮層都出現(xiàn)了不同程度的神經(jīng) 元退行性改變，可見神經(jīng)元細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞排列散亂，組織水腫、著色變淺，細(xì)胞體積輕 度縮小，胞膜與周圍分界明顯，細(xì)胞核多固縮為三角形，結(jié)構(gòu)及核仁消失，空泡現(xiàn)象嚴(yán)重。說 明LIG給藥組(40mg/kg)治療后能明顯改善Αβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞損傷。實(shí)施例4藁本內(nèi)酯對腦立體定位注射Aβ淀粉肽所致大鼠前額葉皮層區(qū)和海馬CAl區(qū)Αβ 淀粉肽相關(guān)病變蛋白ΑΡΡ、A β和Tau及炎性蛋白TNF- α和NF- κ B表達(dá)的影響動物雄性Wistar大鼠，體重300 350克，SPF級，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動 物研究所購買。室溫保持在25°C左后，自由進(jìn)食和飲水。試劑和藥品所用藁本內(nèi)酯化學(xué)純度> 98%，3%吐溫-80配制；A β 1-42、β-APP 兔抗體、Phospho-tau(pSer202)兔抗體、NF-κ Bp65 兔抗體、 TNF-α兔抗體由武漢博士德生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供；其余試劑均為市售分析純。A β (25-35)溶液的配制用無菌生理鹽水配制A β (25-35)溶液(5mM/l)，參照文獻(xiàn)方法于37°C老化7天后腦立體定位注射Αβ淀粉肽所致大鼠記憶功能障礙的模型建立實(shí)驗(yàn)大鼠用戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉后，立體定位儀固定頭部，顱頂區(qū) 備皮，常規(guī)消毒手術(shù)區(qū)皮膚。沿顱頂中線作約2mm切口，分離骨膜使頭骨暴露，于前囟 向后0. 8mm,中線左右旁開各1. 5mm，用牙科鉆鉆開顱骨，垂直進(jìn)微量進(jìn)樣器針3. 8mm,將 IOulA β (50nmol)溶液緩慢注入，注射時間為5分鐘，留針5分鐘，以保證溶液充分彌散，然 后緩慢撤針，之后用青霉素粉消毒，縫合切口皮膚。假手術(shù)組手術(shù)操作完全相同，注射相同 體積的生理鹽水。分組與給藥動物隨機(jī)分為三組，假手術(shù)組、模型對照組和LIG(40mg/kg) 口服治療組，每組10 只。從手術(shù)的當(dāng)天即開始給藥，共給藥兩周，模型對照組給予相同劑量的溶劑(3%吐溫 80)。結(jié)果見圖10和圖11 通過免疫組化的方法評價大鼠皮層和海馬區(qū)的ΑΡΡ、Αβ和 磷酸化Tau蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示在假手術(shù)組，這三種蛋白的表達(dá)都非常微弱，而模型對照 組的表達(dá)明顯增強(qiáng)，陽性細(xì)胞數(shù)數(shù)量多，著色深，并且分布較密集。LIG(40mg/kg)能明顯抑 制蛋白的表達(dá)，陽性細(xì)胞數(shù)量減少，著色較淺，結(jié)果見圖12 通過免疫組化的方法評價大鼠 皮層和海馬區(qū)的NFk β、TNF-α、蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示在假手術(shù)組，這兩種蛋白的表達(dá)都 非常微弱(而模型對照組的表達(dá)明顯增強(qiáng)，陽性細(xì)胞數(shù)數(shù)量多，著色深，并且分布較密集。LIG(40mg/kg)能明顯抑制蛋白的表達(dá)，陽性細(xì)胞數(shù)量減少，著色較淺。實(shí)施例5藁本內(nèi)酯對快速老化癡呆SAMP8小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用動物SPF級10月齡雄性SAMP8快速老化小鼠48只，體重30g左右；10月齡SAMRl 抗老化小鼠12只，均由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。室溫保持在25°C左后，自由進(jìn) 食和飲水。試劑和藥品所用藁本內(nèi)酯化學(xué)純度>99%，臨用前3%吐溫-80配制；其余試劑均為市售分析純。儀器和試劑跳臺儀，由中國科學(xué)院藥物研究所提供。Y型迷宮刺激器，由江蘇省張家港市青松生物醫(yī)學(xué)儀器廠提供。分組與給藥動物共分為五組，SAMP8小鼠隨機(jī)分為模型組、LIG低劑量組(10mg/kg)、LIG中劑 量組(20mg/kg)、LIG高劑量組(40mg/kg)，SAMRl小鼠作為正常對照組，每組12只。灌胃給 藥，1天1次，共給藥8周，模型組與正常組灌胃給予等等體積空白溶劑(3%吐溫80)。小鼠行為學(xué)測試跳臺實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)時將小鼠放入跳臺實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)，接通電源，小鼠遭到電擊后跳上平臺，多數(shù)小鼠 可能再次跳回銅柵，受電擊后又跳上平臺，記錄5min內(nèi)小鼠雙足同時接觸銅柵即受電擊的 次數(shù)，記為錯誤次數(shù)，作為訓(xùn)練成績。24h后重復(fù)實(shí)驗(yàn)，為記憶保持測驗(yàn)。測驗(yàn)時記錄5min 內(nèi)小鼠的錯誤次數(shù)，作為跳臺測試成績。Y型迷宮實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)裝置為1個由不透明塑料板制成的Y型迷路箱，將其與可調(diào)變壓器相連，電壓 為36V。通過電擊控制器，可使由3條支臂末端長18cm段相互圍成的區(qū)域，交替作為起步區(qū) 或安全區(qū)。訓(xùn)練時將小鼠放入起步區(qū)，操縱電擊控制器，小鼠遭到電擊后，若直接逃至安全 區(qū)為正確反應(yīng)，否則為錯誤反應(yīng)。訓(xùn)練小鼠10次，于24h后進(jìn)行相同測試，記錄10次中正 確反應(yīng)次數(shù)，作為迷宮測試成績。統(tǒng)計分析所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Mean士SD表示。分析采用單因素的方差分析(One-way AV0NA) (SPSS11.0軟件)。組間差異采用post hoc LSD檢驗(yàn)。P < 0. 05為有顯著性差異。小鼠跳臺實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖13，SAMRl組錯誤次數(shù)明顯低于模型組(P < 0. 01)，LIG高 劑量組與模型組比較有顯著性差異(P < 0. 05)而LIG中、低劑量組與模型組比較有減少的 趨勢但無統(tǒng)計學(xué)差異。小鼠Y型迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖14，與模型組比較，SAMRl組和LIG高、中劑量組正確 次數(shù)均有顯著性差異(P < 0.01)，低劑量組小鼠成績也有所提高，但無顯著性差異。上述體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、整體動物水平、組織病理學(xué)的研究結(jié)果表明，藁本內(nèi)酯能夠非 常明顯的改善Αβ淀粉肽誘導(dǎo)的5^￥5￥細(xì)胞損傷；明顯改善々0淀粉肽所致大鼠的近記 憶和空間位置功能障礙和立體定位注射Aβ淀粉肽引起的神經(jīng)元退行性病變，對立體定位注射Αβ淀粉肽引起的癡呆具有治療作用；明顯的改善SAMP8快速老化小鼠的學(xué)習(xí)記憶功 能障礙，具有抗老年癡呆病癥的治療作用。從而，可制備成用于預(yù)防與治療老年癡呆病癥的 藥物和/或保健性的食用組合。
權(quán)利要求
藁本內(nèi)酯在制備防治老年癡呆病癥組合物中的應(yīng)用，其特征是以藁本內(nèi)酯作為有效成分，與藥學(xué)中可以接受的輔助成分共同組成。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是所說的藁本內(nèi)酯為順式藁本內(nèi)酯。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是所說的有效成分中還可包括有占有效成分總重 量10% 40%的乙酰膽堿酯酶抑制劑、興奮性氨基酸和肽類遞質(zhì)成分、Αβ纖維形成和沉 積干擾成分、抗氧化劑、微循環(huán)改善成分、鈣拮抗劑中的至少一種。
4.如權(quán)利要求1至3之一所述的應(yīng)用，其特征是所說的組合物為藥物制劑。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征是所說的組合物為口服藥物制劑。
6.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征是所說的藥物制劑組合物為適宜每天用量為 0. 1 500mg/kg體重的制劑形式。
7.如權(quán)利要求1至3之一所述的應(yīng)用，其特征是所說的組合物為保健性食品組合物。
全文摘要
藁本內(nèi)酯在制備防治老年癡呆病癥組合物中的應(yīng)用，以藁本內(nèi)酯作為有效成分，與藥學(xué)和/或食品中可以接受的其它成分或輔助成分共同組成，需要時有效成分中還可以包括有占總重量10％～40％的乙酰膽堿酯酶抑制劑、興奮性氨基酸和肽類遞質(zhì)成分、Aβ纖維形成和沉積干擾成分、抗氧化劑、微循環(huán)改善成分、鈣拮抗劑中的至少一種。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該組合物通過藁本內(nèi)酯對Aβ淀粉肽片段誘導(dǎo)的氧化、凋亡和炎癥反應(yīng)所致?lián)p傷及老齡化神經(jīng)元退行性病變的保護(hù)作用，可明顯改善由Aβ淀粉肽片段及老齡化神經(jīng)元退行性病變引起的學(xué)習(xí)記憶下降的效果，可以作為藥物和/或保健性食用組合物形式使用。
文檔編號A61P25/28GK101904838SQ20091005950
公開日2010年12月8日 申請日期2009年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月4日
發(fā)明者余彥, 張夢雪, 曠喜, 杜俊蓉, 汪程遠(yuǎn), 王競, 陳婭姝 申請人:四川大學(xué)