專利名稱：：一種麥冬提取物及其制備方法與降糖應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及麥冬提取技術(shù)及其在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：麥冬為百合科植物麥冬O;fe'o;70go"y'a;w"/c^(Thimb.)Ker-Gawl.的干燥塊根，具有養(yǎng)陰生津、潤肺清心功效。藥理及臨床試驗(yàn)研究表明，從麥冬中提取得到的粗多糖能有效的降低實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠的血糖水平，降低n型糖尿病患者空腹血糖和餐后2h血糖水平，改善胰島素抵抗?，F(xiàn)有技術(shù)對麥冬粗多糖的純化，一般是選用干燥麥冬為原料，釆用"水提醇沉"法制得其粗提物，然后用三氯甲烷—正丁醇沉淀蛋白質(zhì)，最后用雙氧水脫色。中間涉及的化學(xué)反應(yīng)較多，步驟繁瑣，存在著周期長、成本高、收率低、穩(wěn)定性差等問題，嚴(yán)重影響制劑的品質(zhì)。凝膠分離技術(shù)是利用不同分子量的物質(zhì)在凝膠內(nèi)運(yùn)動的軌跡不同而將其分離的，具有操作簡便，所需設(shè)備簡單，分離效果較好，重復(fù)性高，分離條件緩和等特點(diǎn)，可以提高產(chǎn)品品質(zhì)和得率、簡化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)成本等。目前葡聚糖凝膠應(yīng)用最廣，在中藥提取物特別是粗多糖提取物的除雜、純化和分離等方面顯示出廣闊的應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種提取麥冬的新方法及其提取物在制備降糖藥物中的應(yīng)用。上述發(fā)明是通過如下方式來實(shí)現(xiàn)的取麥冬藥材，煎煮13次，每次加水520倍量，每次煎煮30120分鐘，過濾，合并水煎液；濃縮至密度為1.051.35g/ml后加乙醇至含醇量為5080%(體積百分比v/v)，放置過夜后收集沉淀，沉淀用葡聚糖凝膠柱進(jìn)行分離純化，真空冷凍干燥得到白色疏松絮狀結(jié)晶，即麥冬提取物。所制備得到的麥冬提取物中含糖量達(dá)9098%(以果糖計(jì))，分子量范圍為500-2000。所制備得到的麥冬提取物體外能夠抑制消化道內(nèi)a-葡萄糖苷酶的活性。所制備得到的麥冬提取物能夠降低高血糖模型大鼠的血糖。所制備得到的麥冬提取物能夠降低小腸絨毛細(xì)胞對葡萄糖的吸收。所制備得到的麥冬提取物能提高脂肪細(xì)胞對葡萄糖的攝取能力。所制備得到的麥冬提取物能夠保護(hù)鏈脲佐菌素?fù)p傷的卩胰島細(xì)胞。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明利用葡聚糖凝膠分離技術(shù)將麥冬經(jīng)水提醇沉后所得的沉淀物進(jìn)行純化，并將純化后的物質(zhì)用于制備治療糖尿病藥物。動物試驗(yàn)證明，本工藝制得的麥冬提取物具有顯著的降血糖作用，通過體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明，該提取物的降糖作用機(jī)制在于抑制消化道內(nèi)(X-葡萄糖苷酶的活性、降低小腸絨毛對葡萄糖的吸收、增強(qiáng)脂肪細(xì)胞對葡萄糖的吸收能力，以及對胰島細(xì)胞保護(hù)作用。具體實(shí)施例方式以下通過具體實(shí)施例和試驗(yàn)例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1:取麥冬藥材200克，加水煎煮提取l次，加水20倍量，煎煮2小時，水煎液濃縮至密度為1.05g/ml，加入乙醇至含醇量為80%，放置過夜，沉淀經(jīng)過濾干燥后得到淡黃色粗品。將該粗品溶于水中，用葡聚糖SephadexG-75柱進(jìn)行純化，水洗脫；硫酸-蒽酮法檢測洗脫液，收集呈陽性反應(yīng)部分，冷凍干燥得到白色疏松絮狀結(jié)晶，即麥冬提取物，經(jīng)分析該提取物含糖量為90%(以果糖計(jì))，分子量范圍為500-2000。實(shí)施例2:取麥冬藥材200克，加水煎煮提取l次，加水10倍量，煎煮2小時，水煎煮提取液濃縮至密度為1.18g/ml，加入乙醇至含醇量為50%，放置過夜，沉淀經(jīng)過濾干燥后得到淡黃色粗品。將該粗品溶于水中，用葡聚糖SephadexG-50柱進(jìn)行純化，水洗脫；硫酸-蒽酮法檢測洗脫液，收集呈陽性反應(yīng)部分，冷凍干燥得到白色疏松絮狀結(jié)晶，即麥冬提取物，經(jīng)分析該提取物含糖量為96%(以果糖計(jì))，分子量范圍為500-2000。實(shí)施例3:取麥冬藥材200克，加水煎煮提取2次，加水5倍量，煎煮2小時，合并2次水煎煮提取液，濃縮至密度為1.08g/ml，加入乙醇至含醇量為60%，放置過夜，沉淀經(jīng)過濾干燥后得到淡黃色粗品。將該粗品溶于水中，用葡聚糖SephadexG-35柱進(jìn)行純化，水洗脫；硫酸-蒽酮法檢測洗脫液，收集呈陽性反應(yīng)部分，冷凍干燥得到白色疏松絮狀結(jié)晶，即麥冬提取物，經(jīng)分析該提取物含糖量為94%(以果糖計(jì))，分子量范圍為500-2000。實(shí)施例4:取麥冬藥材200克，加水煎煮提取2次，加水20倍量，煎煮0.5小時，合并2次水煎煮提取液，濃縮至密度為1.35g/ml，加入乙醇至含醇量為80%，放置過夜，沉淀經(jīng)過濾干燥后得到淡黃色粗品。將該粗品溶于水中，用葡聚糖SephadexG-50柱進(jìn)行純化，用水洗脫；硫酸-蒽酮法檢測洗脫液，收集呈陽性反應(yīng)部分，冷凍干燥得到白色疏松絮狀結(jié)晶，即麥冬提取物，經(jīng)分析該提取物含糖量為97%(以果糖計(jì))，分子量范圍為500-2000。實(shí)施例5:取麥冬藥材200克，加水煎煮提取2次，每次加水10倍量，每次煎煮l小時，合并2次水煎煮提取液，濃縮至密度為1.24g/ml，加入乙醇至含醇量為70%，放置過夜，沉淀經(jīng)過濾干燥后得到淡黃色粗品。將該粗品溶于水中，用葡聚糖SephadexG-75柱進(jìn)行純化,用水洗脫；硫酸-蒽酮法檢測洗脫液，收集呈陽性反應(yīng)部分，冷凍干燥得到白色疏松絮狀結(jié)晶，即麥冬提取物，經(jīng)分析該提取物含糖量為92%(以果糖計(jì))，分子量范圍為500-2000。實(shí)施例6:取麥冬藥材200克，加水煎煮提取3次，每次加水5倍量，每次煎煮1.5小時，合并3次水煎煮提取液，濃縮至密度為L12g/ml，加入乙醇至含醇量為50%,放置過夜，沉淀經(jīng)過濾干燥后得到淡黃色粗品。將該粗品溶于水中，用葡聚糖SephadexG-35柱進(jìn)行純化，用水洗脫；硫酸-蒽酮法檢測洗脫液，收集呈陽性反應(yīng)部分，冷凍干燥得到白色疏松絮狀結(jié)晶，即麥冬提取物，經(jīng)分析該提取物含糖量為91%(以果糖計(jì))，分子量范圍為500-2000。實(shí)施例7:取麥冬藥材200克，加水煎煮提取3次，每次加水8倍量，每次煎煮l小時，合并3次水煎煮提取液，濃縮至密度為1.27g/ml，加入乙醇至含醇量為60%，放置過夜，沉淀經(jīng)過濾干燥后得到淡黃色粗品。將該粗品溶于水中，用葡聚糖SephadexG-75柱進(jìn)行純化，用水洗脫；硫酸-蒽酮法檢測洗脫液，收集呈陽性反應(yīng)部分，冷凍干燥得到白色疏松絮狀結(jié)晶，即麥冬提取物，經(jīng)分析該提取物含糖量為95%(以果糖計(jì))，分子量范圍為500-2000。實(shí)施例8:取麥冬藥材200克，加水煎煮提取3次，每次加水20倍量，每次煎煮0.5小時，合并3次水煎煮提取液，濃縮至密度為L31g/ml，加入乙醇至含醇量為70%，放置過夜，沉淀經(jīng)過濾干燥后得到淡黃色粗品。將該粗品溶于水中，用葡聚糖SephadexG-50柱進(jìn)行純化，用水洗脫；硫酸-蒽酮法檢測洗脫液，收集呈陽性反應(yīng)部分，冷凍干燥得到白色疏松絮狀結(jié)晶，即麥冬提取物，經(jīng)分析該提取物含糖量為96%(以果糖計(jì))，分子量范圍為500-2000。實(shí)施例9:麥冬提取物對cx-葡萄糖苷酶活性的體外抑制作用取67mmol/L的磷酸鉀緩沖液(pH6.8)6ml、3mmol/L的谷胱甘肽溶液0.2ml、0.04mg/ml的a-D-葡萄糖苷酶溶液0.3ml，37。C溫孵10min后，加入0.01mol/L的吡喃葡萄糖苷(PNPG)溶液0.5ml，作用20min后，用0.1mol/LNa2C03溶液10ml終止反應(yīng)，在400nm波長下測定各組樣品的吸光度。麥冬提取物(見實(shí)施例2、4、7)用酸鉀緩沖液配制成不同濃度的供試液。抑制率(％)=(八對照-A樣品)/(A對照-A空白)><100%實(shí)驗(yàn)顯示，240mg/ml的麥冬提取物能使a-葡萄糖苷酶活性的降低76.58%。實(shí)施例10:麥冬提取物對高血糖模型大鼠的降糖作用1)動物分組健康Wistar大鼠(SPF級)，雄性，體重180-220g(由廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，自由飲水進(jìn)食，隨機(jī)分為正常對照組和造模組，造模組按如下方法建立模型，造模成功后再將模型組動物隨機(jī)分為模型對照組、陽性藥物組、受試藥物高、中、低劑量組，連續(xù)給藥1周。2)大鼠模型制備正常組大鼠每天灌胃普通飲用水，高脂組大鼠每天早晚灌胃自制脂肪乳(1ml/100gBW)。連續(xù)灌胃脂肪乳2周后，動物禁食不禁水24h，空白對照組10只尾靜脈注射生理鹽水，其余大鼠均尾靜脈注射30mg/kgBW鏈脲佐菌素溶液(臨用前配制)。給藥48h后，禁食不禁水12h，每隔3小時眼眶靜脈叢取血，按照血糖測定試劑盒操作測定空腹血糖值，連續(xù)測定3次，空腹血糖值216.7mmoI/L的為造模成功大鼠。3)血糖測定末次給藥后，動物禁食12h、不禁水，眼眶靜脈叢取血，按照試劑盒的方法分別測定血糖值。釆用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，分析并比較各組血糖值及給藥前后血糖值的變化情況。結(jié)果見表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注*p<0.05vs模型組**p〈0.Olvs〗莫型組Ap<0.05vs同組給藥前AAp<0.01vs同組給藥前實(shí)施例11:麥冬提取物對小腸刷狀緣膜囊(BBMV)攝取葡萄糖的影響1)小腸刷狀緣膜囊的制取家兔處死后，迅速取出胃幽門至回盲結(jié)合處之間的小腸段,放入冰凍的154mmol/LKCl中清洗lh。放入-80"C環(huán)境中進(jìn)行保存。一周之后取出小腸段，剪成小碎段在200mlBuffer1(10mmol/LD-甘露醇，2mmol/LTris，pH7.1)溶液中震動lmin。過濾除去結(jié)締組織和肌肉組織，濾液用Buffer1定容至300ml。加入0.61gMgCl2并緩慢攪拌，在4。C，3800xg下離心15min。收集上清液，在4。C，43000xg下離心30min。棄去上清液，用5mlBuffer2(100mmol/LD-甘露醇，0.1mmol/LMgS04，2mmol/LTris，pH7.4)懸浮沉淀物。4°C，43000xg下離心40min。棄去上清液，用lmlBuffer3(300mmol/LD-甘露醇，0.1mmol/LMgS04,10mmol/LTris，pH7.4)懸浮沉淀物，溶液用用帶25號針頭的注射器緩慢反復(fù)抽打5次，形成BBMV。之后分裝放置于液氮中迅速冷凍(0.26ml/分裝管)，然后放入-80'C環(huán)境中保存。2)BBMV葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)用0.44mlBuffer3重新懸浮BBMV;實(shí)驗(yàn)前將麥冬提取物(見實(shí)施例l、3，5)配制至相應(yīng)的濃度。取50jalBBMV溶液、30^1麥冬提取物供試液和10^1radioactiveglucose溶液(2pCi/ml3H-2-GD，0.4mmol/L葡萄糖，400mmol/LNaSCN，400薩ol/L甘露醇，40mmol/LHEPES-Tris，pH7.4)，在室溫條件下混合反應(yīng)60s后，加入冰凍的stop-washBuffer(200mmol/LNaCl，10mmol/LHEPES-Tris，250pmol/L根皮苷)終止反應(yīng)；反應(yīng)液用0.45pm的硝基纖維膜過濾，則BBMV被截留在膜上；用lml冰凍的stop-washBuffer反復(fù)清洗硝基纖維膜5次后，采用閃爍計(jì)數(shù)法測定BBMV中的放射性強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以藥物組的放射性強(qiáng)度占空白組的百分比表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4.5mg/ml的麥冬提取物能使小腸刷狀緣膜囊對葡萄糖的吸收減少39.96%。實(shí)施例12:麥冬提取物對3T3-L1脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖的影響1)3T3-L1細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)將3T3-L1細(xì)胞用含10%小牛血清的高糖DMEM在37°C、5%C02的條件下培養(yǎng),細(xì)胞狀態(tài)良好時接種于24孔培養(yǎng)板。待細(xì)胞生長至融合2d后,加含0.5mM異丁基-3-甲基黃嘌呤(IBMX)、0.5pM地塞米松(DEX)、5pM胰島素和10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)3d。換以含5pM胰島素的10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)液再培養(yǎng)2d,隨后以含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2d換1次培養(yǎng)液。誘導(dǎo)分化8-12d的3T3-L1細(xì)胞90%以上呈脂肪細(xì)胞表型，即可用于實(shí)驗(yàn)。2)脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖實(shí)驗(yàn)3T3-L1脂肪細(xì)胞在24孔培養(yǎng)板中用無糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)2h后，分為對照組(不加藥)、麥冬提取物(見實(shí)施例2、7、8)組、陽性藥物組(胰島素)，加上含相應(yīng)藥物的無糖DMEM培養(yǎng)基，在37'C下培養(yǎng)30min。棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞2次。加入含2pCi/ml3H-2-GD和O.lmmol/L2-DG的無糖DMEM培養(yǎng)基300^1，在37。C下作用15min。每孔加入lml冰凍的含2-DG(10mmol/L)的PBS溶液終止反應(yīng)，并用此溶液清洗2次。每孔加入0.5mol/L的NaOH溶液20(^1，充分震蕩使細(xì)胞破碎裂解后，再加入0.5mol/L的HCl溶液200pl中和。每孔取出300pl的細(xì)胞裂解液，利用閃爍計(jì)數(shù)法測定其中的放射強(qiáng)度以確定3H-2-GD的攝取量。每孔再取出100pl的細(xì)胞裂解液，測定其中蛋白質(zhì)的含量，并將之作為一個參數(shù)來修正經(jīng)閃爍計(jì)數(shù)法測定的3H-2-GD的攝取量。實(shí)驗(yàn)顯示，6mg/ml的麥冬提取物能使3T3-L1脂肪細(xì)胞對葡萄糖的攝取能力提高46.23%。實(shí)施例13:麥冬提取物對鏈脲佐菌素致NIT-L1胰島細(xì)胞損傷的保護(hù)作用本實(shí)驗(yàn)用鏈脲佐菌素(STZ)作用于NIT-L1胰島細(xì)胞，可引起細(xì)胞損傷。取生長良好的對數(shù)期NIT細(xì)胞接種于96孔板中，在37'C含5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，按實(shí)驗(yàn)分為5組，空白組、STZ模型組(8mmol/L),麥冬提取物(見實(shí)施例1、4、6)高、中和低劑量組。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每培養(yǎng)孔分別加入20^15mg/ml的MTT溶液，4h后棄去培養(yǎng)基，每孔各加入DMSO150ul，492nm下測定各孔的吸光度，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。細(xì)胞生長抑制率(％)=(A空白-A給藥)/A空白><100%實(shí)驗(yàn)顯示，2mg/ml的麥冬提取物，能較顯著地提高鏈脲佐菌素?fù)p傷后的NIT-L1胰島細(xì)胞活性。實(shí)施例14:麥冬提取物口服制劑的制備普通片劑按實(shí)施例l制得的麥冬提取物200g，可壓性淀粉200g，置于粉碎機(jī)中粉碎，細(xì)粉過80目篩。再加入硬脂酸鎂一滑石粉8g，微粉硅膠4g，攪拌均勻后粉末直接壓片，即得咀嚼片按實(shí)施例5制得的麥冬提取物200g，甘露醇100g，微晶纖維素100g，置于粉碎機(jī)中粉碎，過80目篩。再加入4g硬脂酸鎂、4g微粉硅膠、4g甜橙香精粉末和40g聚維酮粉末，攪拌均勻后粉末直接壓片，即得。顆粒劑先將輔料分別粉碎過100目篩，按實(shí)施例2制得的麥冬提取物200g，羧甲基淀粉鈉100g，微粉硅膠150g，微粉纖維素400g混合均勻，加淀粉100g制成軟材，過20目篩，烘干，過20目篩整粒，即得?？诜喊磳?shí)施例7制得的麥冬提取物200g，山梨酸鉀0.2§，檸檬香精0.5g，加水至1L，滅菌、分裝。權(quán)利要求1.一種麥冬提取物的制備方法，其特征在于包括如下步驟取麥冬藥材，煎煮1～3次，每次加水5～20倍量，每次煎煮30～120分鐘，過濾，合并水煎液；濃縮至密度為1.05～1.35g/ml后加乙醇至含醇量為體積百分比50～80％，放置過夜后收集沉淀，沉淀用葡聚糖凝膠柱進(jìn)行分離純化，真空冷凍干燥得到白色疏松絮狀結(jié)晶，即麥冬提取物。2.權(quán)利要求1所述制備方法得到的麥冬提取物。3.權(quán)利要求2所述麥冬提取物在制備降糖藥物中的應(yīng)用。4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物的劑型為口服制劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種麥冬提取物及其制備方法與降糖應(yīng)用。取麥冬藥材，煎煮1～3次，每次加水5～20倍量，每次煎煮30～120分鐘，過濾，合并水煎液；濃縮至密度為1.05～1.35g/ml后加乙醇至含醇量為體積百分比50～80％，放置過夜后收集沉淀，沉淀用葡聚糖凝膠柱進(jìn)行分離純化，真空冷凍干燥得到白色疏松絮狀結(jié)晶，即麥冬提取物，其含糖量達(dá)到90～98％(以果糖計(jì))，分子量范圍為500-2000。經(jīng)動物試驗(yàn)證明該麥冬提取物具有顯著的降血糖作用，通過體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制，結(jié)果表明該提取物能通過抑制消化道內(nèi)α-葡萄糖苷酶的活性、降低小腸絨毛對葡萄糖的吸收、以及對胰島細(xì)胞保護(hù)作用來降低血糖，提示該提取物可以用于開發(fā)治療II型糖尿病的藥物。文檔編號A61P3/10GK101559166SQ20091003976公開日2009年10月21日申請日期2009年5月26日優(yōu)先權(quán)日2009年5月26日發(fā)明者丁林偉,馮國培,劉碧珊,楊翠平,梁秉中,王永剛,蘇薇薇,許定舟申請人:中山大學(xué)