專利名稱：：黃連解毒湯活性部位的提取方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種中藥復(fù)方黃連解毒湯活性部位的提取方法及其在制備抗血管性癡呆藥物中的應(yīng)用，屬于中藥復(fù)方活性部位提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
。二
背景技術(shù)：
：隨著世界人口的老齡化，老年癡呆成為威脅老人晚年生活的主要疾病之一，研究對(duì)于此病的治療藥物具有重要作用。老年癡呆分為血管性癡呆(vasculardisease,VD)和老年'性癡呆(alzheimerdisease,AD)兩大類。為了尋找治療老年癡呆的藥物,世界各國(guó)學(xué)者都在努力尋找抗老年癡呆的新藥和新的治療方法。目前已經(jīng)有多種治療藥物，如乙酰膽堿酯酶抑制劑它克林、毒扁豆堿、加蘭他敏、齊多哌啶、石杉?jí)A曱等，此類藥物能夠增強(qiáng)AD病人的認(rèn)知能力，但因其具有中樞或外周系統(tǒng)副作用而使其應(yīng)用受到限制。近年來(lái)，以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，探討老年癡呆的病因病機(jī)，采用辨證論治、辨證與辨病相結(jié)合、專方專藥等方法，開(kāi)展中醫(yī)藥治療老年癡呆的相關(guān)研究，取得了滿意的進(jìn)展。對(duì)于VD病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)大體趨于一致，認(rèn)為該病病位在腦，與腎關(guān)系密切，且涉及心、肝、脾等臟腑。病性屬以虛為本，以實(shí)為標(biāo)。由于臟腑虛衰，陰精虧空，不能上充于腦，復(fù)加痰濁淤血等毒血內(nèi)生，使虛、痰、瘀互結(jié)于上，損傷腦絡(luò)而元神失聰。根據(jù)現(xiàn)代中醫(yī)"毒損腦絡(luò)"學(xué)說(shuō)，清熱解毒中藥用于防治老年癡呆成為一條有意義的、新的重要途徑。黃連解毒湯作為清熱解毒的經(jīng)典方，已在國(guó)內(nèi)外臨床用于治療腦血管障礙后遺癥，但目前該復(fù)方制劑的質(zhì)量和科技含量仍亟待提高。三、
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明提供了一種利用膜與樹(shù)脂聯(lián)用技術(shù)從中藥經(jīng)典復(fù)方黃連解毒湯中提取有效部位的方法及其在制備治療血管性癡呆藥物中的應(yīng)用。技術(shù)方案本發(fā)明的技術(shù)解決方案為一種黃連解毒湯活性部位的提取方法，步驟為a.按質(zhì)量比為9:6:6:9稱取黃連(RMzomaCoptidis)、黃茶(RadixScutellariae)、黃柏(CortexPhellodendriChinensis)、梔子(FructusGardeniae)四種原料；b.將四種原料混合均勻，加水煎煮2-3次，每次煎煮l-2小時(shí)，過(guò)濾，合并各次的煎煮液，放冷至室溫后離心，取藥液；收集沉淀，得沉淀物I;c.將上述離心所得的藥液通過(guò)無(wú)機(jī)陶瓷膜進(jìn)行微濾，收集得到微濾液；d.將上述微濾液過(guò)AB-8大孔吸附樹(shù)脂柱，乙醇洗脫，收集洗脫液，洗脫液在60-70。C下減壓濃縮回收乙醇，得浸膏II;e.沉淀物I減壓烘干后，以乙醇索氏提取，提取液在60-70。C下減壓濃縮回收乙醇，得浸膏III;f.將浸膏n與浸膏ni合并，混合均勻，干燥得黃連解毒湯干浸膏，即為黃連解毒湯活性部位，該活性部位按質(zhì)量百分含量計(jì)含有以下主要成分鹽酸小檗堿10-15%、黃茶香15-20%、梔子普10-15%。其中，步驟b中各次加水量為:第1次加水量為四種原料總質(zhì)量的10倍，第2次或第3次加水量各為四種原料總質(zhì)量的8倍；步驟c所述的無(wú)機(jī)陶瓷膜為0.2pm的A1203陶資膜；步驟d中的洗脫步驟所用的乙醇的體積百分濃度為60-80%,所述洗脫液減壓濃縮至密度為1.02-1.10;步驟e中的索氏提取所用的乙醇的體積百分濃度為60-80%,所述提取液減壓濃縮至密度為1.02-1.10;步驟f中的干燥步驟為低于80。C溫度下減壓干燥。按照上述方法提取的黃連解毒湯活性部位在制備抗血管性癡呆藥物中的應(yīng)用按照上述方法提取的黃連解毒湯活性部位與藥學(xué)上可接受的載體混合，制成片劑、膠嚢劑或顆粒劑。其中，片劑的制備方法為黃連解毒湯干浸膏10-12份質(zhì)量份，加入輔料硬脂酸鎂0.03~0.06份質(zhì)量份，微晶纖維素0.0010.003份質(zhì)量份，淀粉2~4份質(zhì)量份，糊精12份質(zhì)量份，混勻，制粒，壓片，質(zhì)檢，分裝，制成片劑。膠嚢劑的制備方法為黃連解毒湯干浸膏13~15份質(zhì)量份，加入輔料淀粉24份質(zhì)量份，糊精12份質(zhì)量份，混勻，制粒，裝膠嚢，質(zhì)檢，制成膠嚢劑。顆粒劑的制備方法為黃連解毒湯干浸膏35份質(zhì)量份，加入輔料淀粉13份質(zhì)量份，混勻，制粒，分裝，質(zhì)檢，制成顆粒劑。有益效果本項(xiàng)發(fā)明提供了一種中藥復(fù)方黃連解毒湯的有效部位的提取方法及其在制備治療血管性癡呆藥物中的應(yīng)用。在本發(fā)明中，我們根據(jù)現(xiàn)代中醫(yī)"毒損腦絡(luò)"學(xué)說(shuō)，從清熱解毒經(jīng)典方黃連解毒湯中分離得到用于制備治療血管性癡呆藥物的活性成分，并在此基礎(chǔ)上研制中藥復(fù)方新制劑。黃連解毒湯在傳統(tǒng)的水煎煮提取時(shí)產(chǎn)生大量的沉淀，如果簡(jiǎn)單地將沉淀作為雜質(zhì)去除，沉淀中存在的大量有效成分小檗堿、黃芩苷等也將被作為雜質(zhì)去除，造成原料浪費(fèi)和提取物的藥效降低，因此，本發(fā)明在沉淀離心步驟后進(jìn)行了醇提取處理，不僅保留了大量的有效成分，而且去除了沉淀中大分子蛋白質(zhì)、淀粉和細(xì)^t的藥渣、泥沙等無(wú)效成分，合理地利用了沉淀中的藥效成分。同時(shí)，本發(fā)明亦考慮到黃連解毒湯的傳統(tǒng)水煎煮提取得膏率在25%左右，如果制成片劑、膠嚢、顆粒劑等現(xiàn)代用藥劑型，由于提取物所含的大量無(wú)效雜質(zhì)，其最終產(chǎn)品臨床服用量大，病人適宜性較差；并且產(chǎn)品的吸濕性較強(qiáng)，不易保存；運(yùn)用現(xiàn)代分析技術(shù)，如高效液相色譜法、薄層色譜法檢查對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行有效成分的定量測(cè)定和定性鑒別時(shí)，需要大量的前處理工作，造成檢測(cè)結(jié)果偏差較大?？紤]到上述原因?qū)S連解毒湯在臨床應(yīng)用上造成的限制，本發(fā)明人在前期大量實(shí)驗(yàn)工作的基礎(chǔ)上，采用膜微濾、大孔樹(shù)脂吸附等工業(yè)化的分離精制技術(shù)來(lái)提取復(fù)方黃連解毒湯的有效部位，突出效果表現(xiàn)在①大大降低了制劑的得膏率，最大限度地保留了有效成分，盡可能地去除了水煎液中的大量高分子無(wú)效成分，如蛋白質(zhì)、淀粉、樹(shù)脂、鞣質(zhì)等，以及許多微粒、亞微粒、絮狀物等雜質(zhì)，提高了原料藥中有效成分的轉(zhuǎn)移率及制劑中有效成分的純度。試驗(yàn)表明，采用膜與樹(shù)脂聯(lián)用的方法，小檗堿、梔子苷轉(zhuǎn)移率可達(dá)85%，黃茶苷轉(zhuǎn)移率可達(dá)80%。②提取過(guò)程中以膜微濾技術(shù)取代傳統(tǒng)的醇沉淀去除大分子雜質(zhì)的流程，大大縮短了生產(chǎn)時(shí)間、降低了生產(chǎn)成本、節(jié)約了能源。③提取過(guò)程采用目前已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的膜微濾、大孔樹(shù)脂吸附技術(shù)，便于由實(shí)驗(yàn)室技術(shù)轉(zhuǎn)化為大生產(chǎn)工藝。④本方法制得的藥物組合物純度高，其得膏率在6%左右，便于制成片劑、膠囊、顆粒劑等現(xiàn)代用藥劑型，產(chǎn)品臨床服用量小，病人適宜性較強(qiáng)。⑤本方法制得的藥物組合物及其制劑，可運(yùn)用現(xiàn)代分析技術(shù)高效液相色譜法、薄層色諳法等進(jìn)行有效成分的定量測(cè)定和定性鑒別，方法可靠，精確度高。因此，本發(fā)明制得的藥物組合物及其制劑服用量小，療效顯著，毒副作用小，對(duì)提高中醫(yī)藥治療老年癡呆的水平及加快中藥現(xiàn)代化與產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，有著極其重要的意義。同時(shí)，本發(fā)明所涉及的中藥材藥源豐富、價(jià)格低廉、服用方便、無(wú)明顯毒副作用，在國(guó)內(nèi)外有廣闊的市場(chǎng)和良好的開(kāi)發(fā)前景，推廣應(yīng)用后將會(huì)取得顯著的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。五具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:黃連解毒湯膠嚢的制備取黃連、黃芩、黃柏、梔子，按照9:6:6:9質(zhì)量比投料6000克，混合均勻，加水煎煮2次，第一次加水60升，煎煮1.5小時(shí)，第二次加水48升，煎煮1.5小時(shí)，過(guò)濾，合并兩次的煎煮液；放冷至室溫后入管式離心機(jī)，以6000r/min的轉(zhuǎn)速高速分離，取藥液，同時(shí)收集沉淀I備用；離心所得藥液過(guò)0.2nm的Al203陶瓷膜進(jìn)行微濾，收集得微濾液；微濾液上AB-8大孔吸附樹(shù)脂柱，樹(shù)脂量為2.5倍藥材量，蒸餾水6倍柱體積沖洗后，以體積百分濃度為70%的乙醇洗脫，收集洗脫液，在607(TC下減壓濃縮回收乙醇，減壓濃縮至相對(duì)密度1.02-1.10,得浸膏II備用；沉淀物I減壓烘干后，以體積百分濃度為70%的乙醇索氏提取，提取液在6070。C下減壓濃縮回收乙醇，減壓濃縮至相對(duì)密度1.02-1.10,得浸膏III;合并浸膏II和III，混合均勻，低溫(低于80。C)減壓千燥得黃連解毒湯干浸膏，即為要提取的黃連解毒湯活性部位。上述黃連解毒湯干浸膏340克，加入淀粉90克，糊精30克，混勾，制粒，裝0號(hào)膠嚢，每粒0.4克制成膠嚢劑。實(shí)施例2:黃連解毒湯片劑的制備方法取黃連、黃芩、黃柏、梔子，按照9:6:6:9重量份投料6000克，混合均勻，加水煎煮2次，第一次加水60升，煎煮1.5小時(shí)，第二次加水48升，煎煮1.5小時(shí)，過(guò)濾，合并兩次的煎煮液；放冷至室溫后入管式離心機(jī)，以6000r/min的轉(zhuǎn)速高速分離，取藥液，同時(shí)收集沉淀I備用；離心所得藥液過(guò)0.2itimAl203陶瓷膜進(jìn)行微濾，收集得微濾液；微濾液上AB-8大孔吸附樹(shù)脂柱，樹(shù)脂量為2.5倍藥材量，蒸餾水6倍柱體積沖洗后，以體積百分濃度為60%的乙醇洗脫，收集洗脫液，在6070。C下減壓濃縮回收乙醇，減壓濃縮至相對(duì)密度1.02-1.10,得浸膏II備用；沉淀物I減壓烘干后，以體積百分濃度為60%的乙醇索氏提取，提取液在6070。C下減壓濃縮回收乙醇，減壓濃縮至相對(duì)密度1.02-1.10，得浸膏III;合并浸膏II和III，混合均勻，低溫(低于80。C)減壓千燥得黃連解毒湯干浸膏，即為要提取的黃連解毒湯活性部位。上述黃連解毒湯干浸膏350克，加入淀粉80克、糊精25克；再加入質(zhì)量為干浸膏質(zhì)量0.5%的硬脂酸鎂、質(zhì)量為干浸膏質(zhì)量0.01%的微晶纖維素，混勻，制粒，按每片0.4克壓制成片劑。實(shí)施例3:黃連解毒湯顆粒劑的制備方法取黃連、黃茶、黃柏、梔子，按照9:6:6:9質(zhì)量比投料6000克，混合均勻，加水煎煮3次，第一次加水60升，煎煮1.5小時(shí)，第二和第三次各加水48升，每次煎煮1.5小時(shí)，過(guò)濾，合并三次的煎煮液；it冷至室溫后入管式離心機(jī)，以6000r/min6的轉(zhuǎn)速高速分離，取藥液，同時(shí)收集沉淀I備用；離心所得藥液過(guò)0.2pmA1203陶瓷膜進(jìn)行微濾，得微濾液；微濾液上AB-8大孔吸附樹(shù)脂柱，樹(shù)脂量為2.5倍藥材量，蒸餾水6倍柱體積沖洗后，以體積百分濃度為80%的乙醇洗脫，收集洗脫液，在6(K70。C下減壓濃縮回收乙醇，減壓濃縮至相對(duì)密度1.02-1.10,得浸膏II備用；沉淀I減壓烘干后，以體積百分濃度為80%的乙醇索氏提取，提取液在6070。C下減壓濃縮回收乙醇，減壓濃縮至相對(duì)密度1.02-1.10，得浸膏III;將浸膏n和in合并，混合均勻后，低溫(低于8o。c)減壓干燥得黃連解毒湯干浸膏，即為要提取的黃連解毒湯活性部位。上述黃連解毒湯干浸膏350克，加入淀粉卯克，混勻，制粒，制成顆粒劑。實(shí)施例4黃連解毒湯干浸膏中三種成分的結(jié)構(gòu)鑒定取黃連解毒湯干浸膏100克，用硅膠(0.063~0.200mm)柱層析分離，二氯曱烷-曱醇(100:0~100:20)梯度洗脫，每份0.05體積份，共收集1000份。其中二氯甲烷-甲醇100:5洗脫部分合并后，經(jīng)SephadexLH-20柱層析(甲醇-水1:1)純化后，重結(jié)晶得小檗堿；二氯曱烷-曱醇100:IO洗脫部分合并后，再經(jīng)硅膠C0.0630.200mm)柱層析分離，二氯甲烷-曱醇(100:5~100:15)梯度洗脫，每份0.05體積份，共收集200份，其中二氯曱烷-甲醇100:8洗脫部分合并后，經(jīng)SephadexLH-20柱層析(曱醇-水1:1)純化后，重結(jié)晶得梔子苷；二氯甲烷-甲醇100:15洗脫部分合并后，再經(jīng)硅膠(0.063~0.200mm)柱層析分離，二氯甲烷-曱醇UOO:10100:18)梯度洗脫，每份0.05體積份，共收集400份，其中二氯曱烷-曱醇100:13洗脫部分合并后，經(jīng)SephadexLH-20柱層析(曱醇-水1:1)純化后，重結(jié)晶得黃茶苦。上述3個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)經(jīng)理化常數(shù)測(cè)定及波譜學(xué)方法予以確定。其理化性質(zhì)及波譜學(xué)數(shù)據(jù)如下小檗堿(berberine),橙黃色針晶，分子式C2oH18N04,分子量336，mpl45146。C，溶于曱醇、熱水中。與砩化鉍鉀試劑反應(yīng)生成紅色沉淀。^NMR(400MHz，DMS0-d6)譜數(shù)據(jù)59.90(1H,s,H-7)，8.97(1H，s，H-14),8.20(1H,d，7=9Hz,H陽(yáng)9)，8.01(1H,d,J-9Hz，H-10),8.00(1H,s，H-4),7.09(1H,s,H隱l),6.18(2H,t，-CH2-)，4.94(2H,t,H-16),4.09(3H，s,OCH3-19),4.07(3H,s，OCH3-20),3.21(2H,t,H-17).13CNMR(100MHz，DMS0-d6)鐠數(shù)據(jù)8105.5(C-l),150.0(C-2),147.9(C隱3),108.6(C國(guó)4),121.5(C-5),137.6(C-6)，126.8(C-7),133.2(C國(guó)8),123.7(C-9),120.5(010),143.8(C-11)，150.5(C-12),120.3(C-13),145.7(C-14),62.0(C-16)，26.5(C-17),130.9(C-18)，57.3(C-19),55.4(C-20),102.3(C-21).梔子苷(geniposide),白色粉末，分子式(3171124010,分子量388,mpl58159。C，溶于曱醇，Molish反應(yīng)陽(yáng)性。IRVmaxKBfcm":3450(-OH)，1710(C=O),1640(C=C).LHNMR(400MHz，DMSO-d6)譜數(shù)據(jù)S7.34(1H,s,H-3),5.65(1H,br.s,H-7)，5.05(1H，d，《/=6.8Hz,H-l),4.61(1H,d，^8.0Hz,H-l'),4.05(2H,q,H-10),3.54(3H,s，H-12).13CNMR(100MHz，DMSO-d6)錯(cuò)數(shù)據(jù)S98.4(C-1),155.0(C-3)，110.9(C-4),37.8(C-5),34.3(C-6),125.5(C-7),144.0(C-8),45.7(C-9),59.2(C-10),166.8(C-11)，51.0(C-12)，99.2(C-1'),73.1(C-2'),77.2(C-3')，69.8(C-4')，76.5(C-5')，60.8(C-6').黃芩苷(baicalin)，黃色粉末，分子式CmHwOh,分子量446,mp221222'C,溶于曱醇中。鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽(yáng)性，Molish反應(yīng)陽(yáng)性。IRVma/B、m":3560(-OH),1720(C=O),1655，1600,1565(苯環(huán))，1060，905,820,800.^NMR(400MHz，DMSO-d6)鐠數(shù)據(jù)S7.03(1H，s,H-8)，6.65(1H,d，J^1.5Hz，H-3),5.79(1H,d,J:7.5Hz,H-5"),楊(1H,d，J=9.7Hz,H-l"),7.19~7.27(3H,m,H-2',4'，6'),7.60~7.62(2H,m，H-3'，5').13CNMR(100MHz，DMSO-d6)譜數(shù)據(jù)S151.0(C-2),103.7(C-3)，170.6(C-4)，146.4(C-5)，130.1(C-6),162.7(C國(guó)7),93.7(C-8),148.5(C-9),105,7(C隱10)，131,0(C-r)，125,1(C-2'，6')，127.7(C-3',5')，130.4(C陽(yáng)4'),100.4(C-l'')，72.7(C-2'')，75.9(C-3''),70.2(C-4''),75.7(C-5''),181.7(C-6'實(shí)施例5:黃連解毒湯干浸骨中三種成分的含量測(cè)定1、儀器與藥材1.1儀器Agilent1100液相色鐠(Agilent1100四元泵；DAD檢測(cè)器；自動(dòng)進(jìn)樣器；Agilent1100LC色譜工作站)；色譜柱KromasilC18柱(4.6x250mm,5nm)(江蘇漢邦公司)；電子天平AEL-40SM十萬(wàn)分之一電子天平(ShimadzuLibror);流動(dòng)相乙腈、曱醇為色譜純(江蘇漢邦公司)；水為純凈水其余試劑均為分析純。1.2藥材均購(gòu)自南京市藥材公司，黃柏批號(hào)050926,黃茶批號(hào)051015,黃連批號(hào)050926，梔子批號(hào)041106。1.3對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品與生物制品檢定所，供含量測(cè)定用。鹽酸小檗堿批號(hào)110713-200208,黃芩苷批號(hào)110715-200212,梔子苷批號(hào)110749—200511。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1目標(biāo)成分檢測(cè)方法鹽酸小檗堿、黃芩苷、梔子苷3種成分HPLC檢測(cè)方法如下流動(dòng)相A相乙腈，B相0.5%(體積百分比)三乙胺+磷酸調(diào)PH3.1;梯度洗脫，流速1.0ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)238nm、265nm、280nm。T(min)A(體積百分比)B(體積"g^比)20158540208050307055_^_^_2.2目標(biāo)成分檢測(cè)方法表1黃連解毒湯干浸膏九批樣品數(shù)據(jù)樣品號(hào)藥材質(zhì)量干浸膏主要成分質(zhì)量百分含量(％)(kg)質(zhì)量(g)得率(％)鹽酸小檗堿黃芩苷梔子苦16.0336.05.6012.1116.1412.6126,0346.45.7712.0416,0713.0136.0345.05.7512.0916.0112.69412.0675.65.6310.3214.8610,2512.0678.35.6510.4615.2110.20612.0680.05.6710.1715.3310.35718.01028.35.7114.2220.1015.03818.01011.05.6214.8719.8914.39918.01025.85.7015.0520.4115.04平均值5.6812.3717.1112.62實(shí)施例6:黃連解毒湯干浸骨對(duì)實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)損傷的PC-12細(xì)胞保護(hù)作用的初步研究神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NerveGrowthFactor,NGF)是一種由118個(gè)氨基酸組成的堿性蛋白質(zhì)，對(duì)中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)均有營(yíng)養(yǎng)活性。NGF的主要生理作用是促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，使感覺(jué)神經(jīng)節(jié)和交感神經(jīng)節(jié)數(shù)目增加、體積增大、神經(jīng)纖維延長(zhǎng)；保護(hù)并修復(fù)受損神經(jīng)元，在神經(jīng)系統(tǒng)損傷后起到營(yíng)養(yǎng)和修復(fù)作用，尤其對(duì)9膽堿能神經(jīng)元的生長(zhǎng)和修復(fù)具有重要意義。老年癡呆癥包括血管性癡呆和老年性癡呆，是一種慢性進(jìn)行型退化疾病。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，NGF能防止軸突損傷的基底前腦膽堿能神經(jīng)元變性、死亡，并能改善老年動(dòng)物的膽堿能功能。因此，人們希望能應(yīng)用NGF來(lái)治療老年癡呆癥。盡管NGF存在于自然界，如蛇毒、小鼠頜下腺和牛精嚢腺等，但由于其分子量較大，不能透過(guò)大腦屏障，因此沒(méi)有直接的治療作用。近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)可以透過(guò)大腦屏障的某些小分子化合物能促進(jìn)腦內(nèi)NGF的生物合成，故稱之為NGF促進(jìn)劑。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，許多天然小分子化合物具有NGF誘導(dǎo)活性，因此，通過(guò)高通量篩選，從天然產(chǎn)物，特別是中草藥中尋找外源性NGF誘導(dǎo)劑，作為新藥開(kāi)發(fā)的前體物，成為研究治療老年癡呆癥新藥的一條捷徑。PC12(大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞)具有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特征，運(yùn)用PC12細(xì)胞體外模型試驗(yàn)，檢測(cè)單體化合物的NGF誘導(dǎo)活性，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生理及神經(jīng)藥理研究。1、實(shí)驗(yàn)材料1.1動(dòng)物SD大鼠，雄性，體重(250士20)g，南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK-(蘇)2002-0012。1.2試劑與儀器小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物公司；噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自AMRESCO公司，批號(hào)DZ0793;RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司；胰蛋白酶購(gòu)自GIBCO公司；96孔培養(yǎng)板購(gòu)自COSTA公司；氯化鐘、過(guò)氧化氫、連二亞硫酸鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PBS實(shí)驗(yàn)室自制。低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；萊卡倒置顯微鏡(萊卡公司)；電子天平(北京塞多利斯天平有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(北京東霞科學(xué)儀器廠)；酶標(biāo)儀(AD公司，SPECTRAMAX190);精密移液器(吉爾森公司)；全自動(dòng)高壓滅菌鍋(日本SANYO公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；5%(:02培養(yǎng)箱(Forma公司)。PC12細(xì)胞林由南京中醫(yī)藥大學(xué)陸茵教授惠贈(zèng)。以高糖DMEM培養(yǎng)液，內(nèi)含10。/。小牛血清0.10583mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素，pH7.2培養(yǎng)。2、實(shí)驗(yàn)方法2.1含藥血清的制備按照每人每日臨床用量的三倍量給大鼠灌胃(8.1g生藥/kg),正常對(duì)照組給予同等體積的生理鹽水，連續(xù)5d，第5d灌胃后2h(灌藥前禁食12h,不禁水)10%7^合氯醛腹腔注射麻醉，頸動(dòng)脈取血，剪開(kāi)頸部皮膚，鈍性分離至肌層，暴露一側(cè)頸動(dòng)脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端。近心端一側(cè)打一活結(jié)，動(dòng)脈夾夾閉近心端。眼科剪做"V"接口，插入動(dòng)脈插管并固定，打開(kāi)動(dòng)脈夾，將血引流至一次性塑料管中。將血液放置37。C水浴鍋溫育30min,待血液完全凝固且有血清析出時(shí)，用一干凈的細(xì)鐵絲撥動(dòng)血凝塊，2000r/min,10min，將血清收集于干凈的離心管中。然后56。C、30min水浴滅活，在超凈臺(tái)上用0.22)nm微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝，置于-2(TC水箱保存。2.2PC-12細(xì)胞培養(yǎng)將復(fù)蘇后的PC12細(xì)胞接種于75ml培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)液為含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，待37。C、5%0)2飽和濕度下長(zhǎng)成單層后，加入0.25%胰蛋白酶于37°C消化，接種于涂有多聚賴氨酸的96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞密度為lxl()S細(xì)胞/ml置于37°C、5。/。C02下繼續(xù)培養(yǎng)24h后，觀察黃連解毒湯各組合分離部位含藥血清對(duì)PC12細(xì)胞損傷模型的影響。2.3MTT法測(cè)定細(xì)胞活力于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4h加入終濃度為0.5g/L的MTT，37°C、5。/。C02下作用4h后棄去上清液，每孔加入100pLDMSO,置振蕩器上振蕩10min使結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定ODs7o值，觀察細(xì)胞活力，進(jìn)行？檢驗(yàn)，并計(jì)算含藥血清對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)率=(含藥血清組OD57o-模型組OD57o)/(正常組OD57Q-模型組OD57o)xlOO%。2.4黃連解毒湯干浸膏含藥血清對(duì)過(guò)氧化氫(11202)誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞損傷的影響取長(zhǎng)滿單層PC12細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液，用PBS液洗滌2次，加入無(wú)血清DMEM,每孔加入終濃度200[imol/L的過(guò)氧化氫造模，然后加入10%含藥血清。37°C、5%<:02培養(yǎng)箱作用3h，棄去培養(yǎng)液用PBS液洗滌2次，加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)24h。在造模過(guò)程中及造模后，均加入相應(yīng)濃度的藥物血清。MTT法觀察細(xì)胞活力。2.5黃連解毒湯干浸膏含藥血清對(duì)氯化鉀(KC1)誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞損傷的影響取長(zhǎng)滿單層PC12細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液，用PBS液洗滌2次，加入無(wú)血清DMEM，每孔加入終濃度800mmol/L的KC1造模，然后加入10%含藥血清。37°C、5%(302培養(yǎng)箱作用15min,棄去培養(yǎng)液用PBS液洗滌2次，加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)24h。在造模過(guò)程中及造模后，均加入相應(yīng)濃度的藥物血清。MTT法觀察細(xì)胞活力。2.6黃連解毒湯干浸膏含藥血清對(duì)連二亞硫酸鈉(Na2S204)誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞損傷的影響取長(zhǎng)滿單層PC12細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液，用PBS液洗滌2次，加入無(wú)血清DMEM,每孔加入終濃度8mmol/L的Na2S204造模，然后加入10%含藥血清。37°C、5。/。C02培養(yǎng)箱作用3h,棄去培養(yǎng)液用PBS液洗、滌2次，加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)24h。在造模過(guò)程中及造模后，均加入相應(yīng)濃度的藥物血清。MTT法觀察細(xì)胞活力。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1黃連解毒湯干浸骨含藥血清對(duì)11202誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞損傷的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注與沖莫型組比較，*戶<0.05，**戶<0.01。表3黃連解毒湯干浸骨含藥血清對(duì)Na2S204誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞損傷的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注與才莫型組比豐i,*尸<0,05,**尸<0.01。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)論三種損傷細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，全方原液及黃連解毒湯干浸膏含藥血清對(duì)三種損傷模型均有保護(hù)作用。權(quán)利要求1、一種黃連解毒湯活性部位的提取方法，其特征在于步驟為a.按質(zhì)量比為9∶6∶6∶9稱取黃連、黃芩、黃柏、梔子四種原料b.將四種原料混合均勻，加水煎煮2-3次，每次煎煮1-2小時(shí)，過(guò)濾，合并各次的煎煮液，放冷至室溫后離心，取藥液；收集沉淀，得沉淀物I；c.將上述離心所得的藥液通過(guò)無(wú)機(jī)陶瓷膜進(jìn)行微濾，收集得到微濾液；d.將上述微濾液過(guò)AB-8大孔吸附樹(shù)脂柱，乙醇洗脫，收集洗脫液，洗脫液在60-70℃下減壓濃縮回收乙醇，得浸膏II；e.沉淀物I減壓烘干后，以乙醇索氏提取，提取液在60-70℃下減壓濃縮回收乙醇，得浸膏III；f.將浸膏II與浸膏III合并，混合均勻，干燥得黃連解毒湯干浸膏，即為黃連解毒湯活性部位，該活性部位按質(zhì)量百分含量計(jì)含有以下主要成分鹽酸小檗堿10-15％、黃芩苷15-20％、梔子苷10-15％。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃連解毒湯活性部位的提取方法，其特征是步驟b中各次加水量為第1次加水量為四種原料總質(zhì)量的10倍，第2次或第3次加水量各為四種原料總質(zhì)量的8倍。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃連解毒湯活性部位的提取方法，其特征是步驟c所述的無(wú)機(jī)陶瓷膜為0.2nm的A1203陶瓷膜。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃連解毒湯活性部位的提取方法，其特征是步驟d中的洗脫步驟所用的乙醇的體積百分濃度為60-80%，所述洗脫液減壓濃縮至密度為1.02-1.10。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃連解毒湯活性部位的提取方法，其特征是步驟e中的索氏提取所用的乙醇的體積百分濃度為60-80%,所述提取液減壓濃縮至密度為1.02-1.10。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃連解毒湯活性部位的提取方法，其特征是步驟f中的干燥方法為低于80。C溫度下減壓干燥。7、根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法提取的黃連解毒湯活性部位在制備抗血管性癡呆藥物中的應(yīng)用。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征是所述黃連解毒湯活性部位與藥學(xué)上可接受的載體混合，制成片劑、膠嚢劑或顆粒劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種中藥復(fù)方黃連解毒湯活性部位的提取方法及其在制備抗血管性癡呆藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明所公開(kāi)的提取方法采用了膜微濾、大孔樹(shù)脂吸附等工業(yè)化的分離精制技術(shù)，大大降低了制劑的得膏率，最大限度地保留了有效成分，提高了原料藥中有效成分的轉(zhuǎn)移率及制劑中有效成分的純度，所提取的活性部位包括3類已知的化學(xué)成分，分別是生物堿類、黃酮苷類和環(huán)烯醚萜苷類，該活性部位具有抗血管性癡呆的作用。文檔編號(hào)A61K36/756GK101455750SQ200910028029公開(kāi)日2009年6月17日申請(qǐng)日期2009年1月5日優(yōu)先權(quán)日2009年1月5日發(fā)明者付廷明,唐于平,朱華旭,潘林梅,郭立瑋,山黃申請(qǐng)人:南京中醫(yī)藥大學(xué)