專(zhuān)利名稱(chēng)：：hCRF及其衍生物在制備治療格林巴利綜合征藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及hCRF及其衍生物在制備治療格林巴利綜合征藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：格林巴利綜合征(Guillian-BarreSyndrome)又稱(chēng)急性特發(fā)性多祌經(jīng)炎或?qū)ΨQ(chēng)性多神經(jīng)根炎，是常見(jiàn)的脊神經(jīng)和周?chē)窠?jīng)的脫髓鞘疾病，1916年由Guillian和Barre兩位學(xué)者首先報(bào)告而得名，臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性上升性對(duì)稱(chēng)性麻痹、四肢軟癱以及不同程度的感覺(jué)障礙?；颊叱杉毙曰騺喖毙耘R床經(jīng)過(guò)，多數(shù)可完全恢復(fù)，少數(shù)嚴(yán)重者可引起致死性呼吸麻痹和雙側(cè)面癱。國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)格林巴利綜合征死亡率為14%-42%(白法毅，王維平，等.格林巴利綜合征綜合征1287倒分析(摘要).中華神經(jīng)精神科雜志.1992:(1):30.)。其中呼吸肌無(wú)力引起的通氣障礙性呼吸衰竭是格林巴利綜合征致死的主要原因。因此加強(qiáng)呼吸道管理，保證呼吸功能，降低死亡率是格林巴利綜合征治療的一個(gè)重要方面。目前認(rèn)為通過(guò)呼吸機(jī)輔助呼吸，并進(jìn)行呼吸道管理，保證呼吸通暢是最有效的治療措施，但是人工氣道建立后，呼吸道加濕加溫功能喪失，纖毛運(yùn)動(dòng)功能減弱，會(huì)造成分泌物排出不暢，引起呼吸道'痰液貯留、肺不張，也會(huì)增加呼吸道感染的機(jī)會(huì)，其中機(jī)械通氣相關(guān)性肺炎是呼吸機(jī)輔助呼吸中常見(jiàn)的引發(fā)肺部感染。同時(shí)因患者長(zhǎng)期活動(dòng)受限，機(jī)械通氣時(shí)，不能進(jìn)行交流，不能經(jīng)口進(jìn)食，導(dǎo)致病人產(chǎn)生焦慮和孤獨(dú)感，對(duì)機(jī)械通氣產(chǎn)生依賴(lài)，喪失對(duì)疾病治療的信心。hCRF即人促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子，是一種含41個(gè)氦基酸的多肽，其氨基酸序列為Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu-Ile-Ile-NH2。其在協(xié)同大腦和大腦周邊作用的整個(gè)應(yīng)激反應(yīng)方面起重要作用。在大腦中，CRF主要由丘腦下核旁室的小細(xì)胞性神經(jīng)元產(chǎn)生和分泌，CRF-含有的神經(jīng)元發(fā)射到正中隆起的毛細(xì)管入口區(qū)并刺激促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、e-內(nèi)啡肽和其它的來(lái)自腦垂體的阿黑皮素的分泌。隨后ACTH-誘導(dǎo)的糖類(lèi)腎上腺皮質(zhì)激素的釋放代表了在下丘腦-腦垂體-腎上腺軸(HPA)的最后階段，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌應(yīng)激反應(yīng)。除了它的神經(jīng)內(nèi)分泌作用，CRF也具有神經(jīng)傳導(dǎo)和神經(jīng)調(diào)節(jié)功能，引發(fā)生理學(xué)刺激、藥理學(xué)刺激和病理學(xué)刺激的自發(fā)反應(yīng)、行為反應(yīng)和免疫反應(yīng)。臨床研究表明，CRF分泌過(guò)多與多種疾病有關(guān)，如嚴(yán)重抑郁癥、焦慮相關(guān)的疾病、飲食紊亂和炎癥性紊亂。在Alzheimer疾病、癡呆、肥胖和許多內(nèi)分泌疾病中觀察到了低水平的CRF。因此，與高水平或低水平CRF有關(guān)的相反影響策略，提供了治療與異常CRF水平有關(guān)的疾病的藥物設(shè)計(jì)的根據(jù)?，F(xiàn)有技術(shù)中已有將hCRF用于腦水腫治療的研究，但尚未有將hCRF及其衍生物用于制備治療格林巴利綜合征藥物的研究和報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了hCRF及其衍生物在制藥中的一種新用途。本發(fā)明實(shí)質(zhì)上是hCRF及其衍生物在制備治療格林巴利綜合征藥物中的應(yīng)用。所述hCRF的有效劑量為1100iig/Kg體重，優(yōu)選210ug/kg.體重。所述衍生物為hCRF的天然氨基酸取代衍生物。所述衍生物為hCRF的非天然氨基酸取代衍生物。所述衍生物為hCRF的PEG化修飾衍生物。所述衍生物為hCRF的PLA化修飾衍生物。、上述衍生物通過(guò)對(duì)hCRF的取代和修飾可以增強(qiáng)hCRF療效，改善hCRF的生物利用度和藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征，這對(duì)本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。使用時(shí)，將hCRF及其衍生物制成注射劑注入動(dòng)物體內(nèi)即可。本申請(qǐng)的發(fā)明人經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，hCRF及其衍生物是非常高效的呼吸興奮藥，對(duì)格林巴利綜合征呼吸機(jī)能有明顯的改善作用。與使用呼吸機(jī)輔助呼吸的方法相比不僅可以保持和提高纖毛運(yùn)動(dòng)功能，減少分泌物排出不暢引起的呼吸道痰液貯留、肺不張，并降低增加呼吸道感染的機(jī)會(huì)。本發(fā)明通過(guò)利用hCRF及其衍生物對(duì)呼吸機(jī)能的調(diào)節(jié)作用所產(chǎn)生的呼吸興奮，從而改善格林巴利綜合征呼吸無(wú)力的癥狀，降低格林巴利綜合征死亡率，具有良好的應(yīng)用前景。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不限制本發(fā)明范圍。'實(shí)施例l:hCRF對(duì)兔呼吸作用的影響新西蘭大耳白兔20只，6-12月齡，體重3-4kg。隨機(jī)分為兩組，每組10只。對(duì)照組給予0.9%生理鹽水2ml，試驗(yàn)組靜脈注射hCRF4ng/kg。給藥前hCRF溶于2ral無(wú)菌生理鹽水中。用呼吸速率描記儀連續(xù)測(cè)定通氣量(呼吸頻率和潮氣量)。各組動(dòng)物呼吸達(dá)到穩(wěn)態(tài)后開(kāi)始測(cè)量呼吸頻率和潮氣量，測(cè)定期為40min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果釆用T檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析，P<0.05認(rèn)為差別4有顯著意義，結(jié)果如表l所示。表lhCRF對(duì)兔呼吸頻率和潮氣量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>*與對(duì)照組相比P〈0.01。由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)hCRF對(duì)新西蘭大耳白兔的呼吸功能尤其是潮氣量有明顯的刺激作用。實(shí)施例2:hCRF呼吸興奮作用的機(jī)理研究一家兔用烏拉坦麻醉，切斷迷走神經(jīng)，使之麻痹，進(jìn)行機(jī)械通氣。將hCRF通過(guò)注入其第四腦室。記錄其神經(jīng)元潮氣量nVt變化狀況。發(fā)現(xiàn)nVt增加，但對(duì)呼氣期持續(xù)時(shí)間沒(méi)有影響。采用顯微注射法將hCRF注入腦橋臂旁區(qū)腹側(cè)，記錄器呼氣狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)nVt及呼吸頻率均降低。用四氯吲哚胺阻斷祌經(jīng)節(jié)傳導(dǎo)后，hCRF的作用未收到顯著影響。以上結(jié)果表明，hCRP可能通過(guò)中樞神經(jīng)調(diào)節(jié)呼吸運(yùn)動(dòng)，起到呼吸興奮作用。實(shí)施例3:hCRF對(duì)格林巴利綜合征模型動(dòng)物的藥效學(xué)研究獵熊犬，8只，體重28-33kg，雌雄不拘。隨機(jī)分為兩組，每組4只。各組動(dòng)物按照5mg/kg劑量靜脈注射氯胺酮麻醉，皮下注射莞熊唾液分泌物2ml。用呼吸速率描記儀連續(xù)測(cè)定呼吸'頻率和潮氣量。用對(duì)照組給予0.996生理鹽水2ml，實(shí)驗(yàn)組給予5ug/kghCRF，給藥前hCRF溶于2ml無(wú)菌生理鹽水中。安慰劑及藥物均在皮下注射莞熊唾液分泌物后迅速給予，待獵熊犬-蘇醒后在第O、2、4、8、16、32天測(cè)量呼吸頻率和潮氣量。同時(shí)用肝素液濕潤(rùn)全部?jī)?nèi)壁的一次性注射器采集后肢動(dòng)脈血樣，立即將注射器針頭插入帶有肝素生理鹽水的一次性針頭帽里以隔絕空氣。血樣本用英國(guó)CIBACORNING238型血?dú)夥治鰞x測(cè)定動(dòng)脈血氧分壓(PaO)、動(dòng)脈血二氧化碳分壓(PaC02)，并觀察其觀察兔精神狀態(tài)、肢癱、腱反射、飲食、尿便失禁、體重等體征。記錄其呼吸頻率、潮氣量、死亡率，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果各組動(dòng)物皮下注射莞熊唾液分泌物后均出現(xiàn)精神萎糜、飲食差、四肢無(wú)力、雙后肢為著、腱反射減弱，并出現(xiàn)呼吸困難癥狀，對(duì)照組動(dòng)物死亡率為25%(1/4),實(shí)驗(yàn)組死亡率為0%。死亡原因均為呼吸衰竭。對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物呼吸頻率(次/分)分別為18±2vs23±5;潮氣量(ml)分別為321±4vs601±9。動(dòng)脈血氧分壓(mmHg)分別為20.03±2.62vs48.55士3.67;動(dòng)脈血二氧化碳分壓(mmHg)分別為45.32±1.26vs23.64±1.43.兩組動(dòng)物在-潮氣量、動(dòng)脈血氧分壓、動(dòng)脈血二氧化碳分壓上有顯著差異，表明hCRF可明顯提高格林巴利綜合征模型動(dòng)物的潮氣量和動(dòng)脈血氧分壓，而降低動(dòng)脈血二氧化碳分壓，有利于改善格林巴利綜合征的呼吸障礙。從而降低格林巴利綜合征的死亡率。表2hCRF對(duì)格林巴利綜合征模型動(dòng)物的藥效學(xué)研究死亡率呼吸頻率潮氣量動(dòng)脈血氧分動(dòng)脈血二氧化碳分壓壓對(duì)照組25%18±2321±420.03±2.62.45.32土1.26實(shí)驗(yàn)組0%23±5601±9*48.55±3.6723.64±1.43**與對(duì)照組相比P〈0.01實(shí)施例4:hCRF聚乙二醇化衍生物的制備I.Oml含20mghCRF的緩沖液，按lmolhCRF使用51mol聚乙二醇(10kDa)的比例加入聚乙二醇的丁醛，向混合物中加入10%(V/V)的氰基氫硼化鈉，室溫下攪拌4小時(shí)，用離子交換層析純化反應(yīng)混合物中的聚乙二醇化的hCRF。實(shí)施例5:hCRFPLA化衍生物的制備取0.5gPLA-COOH和30mghCRF,預(yù)先凍干2小時(shí)，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入50ml的圓底燒瓶中，用20ml氯仿溶解，再加入0.6ml吡啶和0.3ml苯氧基磷酸氯，室溫下磁力攪拌反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)完全后用1N鹽酸沖洗，每次用25ml，沖洗2次，減壓濃縮即得hCRFPLA化衍生物。實(shí)施例6:hCRF氨基酸取代衍生物的制備采用多肽合成儀，從C端(羧基端)向N端(氨基端)逐步合成，所用氨基酸為hCRF序列所含氨基酸及"甲基化氨基酸、Na-O環(huán)化氨基酸、d，a'-二烷基甘氨酸和a-氨基環(huán)烷羧酸、"-氨基酸、Na-甲基化氨基酸、a，e-不飽和氨基酸、e-和Y-氨基環(huán)烷羧酸、e，P-二甲基和e-甲基氨基酸、P-置換-2，3-亞甲基氨基酸、Glu-Glu、Lys-Lys、Ser-Gly-Ser中的一種或幾種，取代其原序列中的一種或幾種氮基酸，即可得到hCRF氨基酸取代衍生物。保護(hù)基采用Fmoc保護(hù)，以TFA脫保護(hù)。權(quán)利要求1.hCRF及其衍生物在制備治療格林巴利綜合征藥物中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述hCRF的有效劑量為1100ug/kg體重。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述hCRF的劑量為210ug/kg體重。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述衍生物為hCRF的天然氨基酸取代衍生物。5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述衍生物為hCRF的非天然氨基酸取代衍生物。6.根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述衍生物為hCRF的PEG化修飾衍生物。7.根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述衍生物為hCRF的PLA化修飾衍生物。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了hCRF及其衍生物在制藥中的一種新用途，即hCRF及其衍生物在制備治療格林巴利綜合征藥物中的應(yīng)用。其有效劑量為1～100μg/Kg體重，優(yōu)選2～10μg/kg體重。發(fā)明人經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，hCRF及其衍生物是非常高效的呼吸興奮藥，對(duì)格林巴利綜合征呼吸機(jī)能有明顯的改善作用。與使用呼吸機(jī)輔助呼吸的方法相比不僅可以保持和提高纖毛運(yùn)動(dòng)功能，減少分泌物排出不暢引起的呼吸道痰液貯留、肺不張，并降低增加呼吸道感染的機(jī)會(huì)。文檔編號(hào)A61K47/48GK101502643SQ20091001463公開(kāi)日2009年8月12日申請(qǐng)日期2009年3月3日優(yōu)先權(quán)日2009年3月3日發(fā)明者厲保秋申請(qǐng)人:山東大學(xué)