專(zhuān)利名稱(chēng)：脫鐵乳鐵蛋白組合物及其用于治療病毒性丙型肝炎的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)，特別涉及肝臟病學(xué)和病毒學(xué)，并且涉及乳鐵蛋白在治療由丙型肝炎病毒(HCV)引起的慢性感染中的用途。更特別地，本發(fā)明提供包含脫鐵乳鐵蛋白 (apolactoferrin)和干擾素的藥物組合物，以及使用這些組合物治療由丙型肝炎病毒引起 的慢性感染的方法。
背景技術(shù)：
HCV屬于含有RNA的病毒家族(黃病毒科(Flaviviridae))，并且導(dǎo)致人的感 染過(guò)程，肝炎是最常見(jiàn)的并發(fā)癥，經(jīng)常發(fā)展成肝硬化和肝癌(Surveillance. H印atitis. CDC Report No 61 ；Younossi Z, Kallman J, Kincaid J. The effects of HCV infection and management onhealth-related quality of life. Hepatology. 2007 Mar ；45 (3) 806-16)。HCV感染在全球已經(jīng)影響了超過(guò)170百萬(wàn)人，并且被感染的數(shù)量持續(xù)增加。在全 世界中，有約1.5百萬(wàn)HCV-相關(guān)的肝癌的病例。僅在美國(guó)，每年HCV感染導(dǎo)致的損失估計(jì) 是200百萬(wàn)(USD)。在總體大部分的病例中，感染HCV的人不經(jīng)歷任何嚴(yán)重健康問(wèn)題或顯示非常輕度 癥狀。但是，當(dāng)感染長(zhǎng)時(shí)間發(fā)展時(shí)，肝炎的發(fā)生是常見(jiàn)的，其特征是疼痛和肝功能障礙?？?HCV抗體出現(xiàn)在已被感染的人的血中，并且在一段時(shí)間之后，也出現(xiàn)病毒的RNA。在大部分 病例中，在血中檢測(cè)不到病毒的RNA。HCV具有抑制人免疫系統(tǒng)的強(qiáng)大能力和由于“適應(yīng)性”突變而逃避它的能力。目前 沒(méi)有商業(yè)上可獲得的針對(duì)HCV感染的疫苗。治療HCV的方法已經(jīng)和依然基于使用大劑量給予的干擾素，特別是，基因工程干 擾素制劑(Shepherd J，Jones J，Hartwell D，DavidsonP，Price A，Waugh N. Interferon alfa(pegylated and non-pegylated)and ribavirin for the treatment of mild chronic hepatitis C :asystematic review and economic evaluation. Health Technol Assess ·2007 Mar ；11(11) 1-224 ；Younossi ZiKallman JiKincaid J. The effectsof HCV infection and management on health-related quality of life. Hepatology. 2007 Mar ； 45(3) :806-16)。但是，根據(jù)不同來(lái)源，基于基因工程干擾素的治療方法具有相對(duì)低的功效， 其范圍是8至25%。這種治療的持續(xù)時(shí)間可以達(dá)到若干年，并且復(fù)發(fā)頻率包括70-80%。此 夕卜，使用基因工程干擾素具有嚴(yán)重副作用，其包括造血功能不全、胃腸失常、脫發(fā)、抑郁和失 眠。廣泛傳播的治療HCV的現(xiàn)代趨勢(shì)是使用綜合治療，其將含有一般抗病毒藥和1或 2種HCV增殖抑制劑(特異性聚合酶-解旋酶和/或RNA-聚合酶抑制劑)的雞尾酒加入 基因工禾呈干擾素(Toniutto P, Fabris C, Bitetto D, Fornasiere E, Rapetti R, Pirisi M. Valopicitabinedihydrochloride -.a specific polymerase inhibitor of hepatitis C virus. Curr Opin Investig Drugs. 2007 Feb ；8 (2) :150-8 ;Johnson CL, OwenDM, Gale M Jr.Functional and therapeutic analysis of hepatitis Cvirus NS3. 4A proteasecontrol of antiviral immune defense. J BiolChem. 2007 Apr ；282 (14) :10792_803)。這 種雞尾酒增加康復(fù)比率，但是，它們不可避免地導(dǎo)致選擇耐受這些抑制劑的HCV適應(yīng)性突 變體。已經(jīng)在克服人免疫缺陷病毒的過(guò)程中明顯顯示出這些臨床問(wèn)題，并且明顯地對(duì)于HCV 也將至少實(shí)際出現(xiàn)這些問(wèn)題。由于基于重組干擾素和病毒酶抑制劑的治療的缺陷，尋找有效對(duì)抗HCV的制劑已 經(jīng)和依然是重要任務(wù)。對(duì)于這個(gè)目的來(lái)說(shuō)，發(fā)展基于與其它抗病毒藥組合的干擾素的新組 合的治療方法似乎是有前景的。乳鐵蛋白是天然結(jié)合鐵的蛋白，存在于淚液、唾液、外周血中，特別是在白細(xì)胞、母 乳、初乳、腺上皮分泌物等中。每分子乳鐵蛋白能夠結(jié)合2個(gè)Fe原子。目前科學(xué)和專(zhuān)利 文獻(xiàn)中沒(méi)有關(guān)于乳鐵蛋白分子量數(shù)值的一致觀點(diǎn)。因此，乳鐵蛋白被認(rèn)為具有約SOOOODa 的分子量(參見(jiàn)，例如，EP 0 253 395 B2)。同時(shí)在文獻(xiàn)中有牛乳鐵蛋白分子量值，例 如 76000Da(Farre 11 H. Μ. ， Jr.,等人，Nomenclature ofProteins of Cows' Milk-Sixth Revision.J.Dairy Sci. (2004), v. 87, p.1641-1674),86000Da(Kazutomo Imabori 禾口 Tamio Yamakawa, Eds. , "Dictionary of Biochemistry，，,第 2 版，p. 1390, Tokyo Kagaku DojinCo. , 1990)以及甚至 93000Da(Weiner R. Ε.禾口 Szuchet S. Themolecular weight of bovine lactoferrin. Biochim. Biophys. Acta(1975), v.393 (1), p. 143-147)。來(lái)自 人母乳的蛋白提供的分子量值是，例如76000Da(Moguilevsky N.，等人，Comparison of humanlactoferrins from milk and neutrophilic leucocytes.Biochem. J. (1985), v.229, p.353-359)禾口 88000Da(Kazumoto Imabori 禾口 TamioYamakawa, Eds. , "Dictionary of Biochemistry”，第 2 版，p. 1390，Tokyo Kagaku Dojin Co.，1990)。提供的分子量值中 的差異可能由使用的不同分析的方法，以及蛋白糖基化的不同程度和/或性質(zhì)導(dǎo)致。乳鐵蛋白和其衍生物具有顯著抗氧化、抗微生物(J. Pediatr.，1979，v. 94，P. 1)、 免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用。存在使用乳鐵蛋白或其片段治療病毒疾病，特別是，由流感病毒、人免疫缺陷病 毒、丙型肝炎病毒和其它病毒導(dǎo)致的病毒疾病的方法。乳鐵蛋白用作干擾素在慢性丙型肝 炎中的治療效果的增強(qiáng)劑(專(zhuān)利申EP 1 352 657，15. 10. 2003)。盡管該文獻(xiàn)包括廣泛的概 括，其允許思考為了增強(qiáng)干擾素的治療效果，并且因此為了成功實(shí)現(xiàn)聲稱(chēng)的治療慢性丙型 肝炎的方法，可以使用任何形式的乳鐵蛋白，包括未用金屬飽和的乳鐵蛋白、用不同金屬飽 和的乳鐵蛋白和適當(dāng)?shù)拿撹F乳鐵蛋白，并且它可以口服或注射給予，該文獻(xiàn)提供了試驗(yàn)數(shù) 據(jù)，證實(shí)了僅僅口服給予僅僅使用天然乳鐵蛋白的可能性。該文獻(xiàn)證實(shí)了與給予干擾素共 同大劑量口服給予乳鐵蛋白(每日至少lmg/lkg重量，特別是，每日1.8g/lkg重量，持續(xù)6 個(gè)月)導(dǎo)致陽(yáng)性治療效果。但是，不能認(rèn)為得到的結(jié)果完全令人滿意，因?yàn)樵诏煶探Y(jié)束之后 6個(gè)月，僅僅在33. 3%病例中記錄到病毒完全根除和肝功能正常化，并且在剩余的66. 7% 的病例中，治療根本無(wú)效或自從在療程結(jié)束之后6個(gè)月起病毒在血中再次出現(xiàn)，盡管事實(shí) 上，觀察到肝功能正?；?。因此，在這個(gè)領(lǐng)域，急切需要用于治療病毒性丙型肝 炎的新藥物治療以及藥物組 合物和治療方法，基于它們，可以兼有以下特點(diǎn)高功效，特別是，完全根除病毒和預(yù)防所述 疾病復(fù)發(fā)的能力，低的花費(fèi)，保存穩(wěn)定性和比使用現(xiàn)有治療方法和方案更快達(dá)到治療效果 的可能性。
發(fā)明概述發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)如下事實(shí)給予基本上不含有結(jié)合的Fe離子的乳鐵蛋白(脫輔基蛋白)治療病毒性丙型肝炎極其有效，從而使本發(fā)明成為可能。因此，在第一方面，本發(fā)明涉及包人乳鐵蛋白和干擾素的組合物，其中所述乳鐵蛋 白基本上不含鐵，并且其中所述組合物基本上不含非人乳鐵蛋白。在本發(fā)明的組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，人乳鐵蛋白具有小于約5 %的鐵飽和度。在根據(jù)本發(fā)明的組合物的另外其它實(shí)施方案中，人乳鐵蛋白具有約SOkDa的表觀 分子量。在組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，人乳鐵蛋白以約20mg的量存在。在另外其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物適于治療HCV感染。在實(shí)施方案之一中， HCV感染是慢性HCV感染。在另一個(gè)實(shí)施方案中，HCV屬于Ib基因型。在另外一個(gè)實(shí)施方案中中，本發(fā)明的組合物能夠從患者身體消除HCV，持續(xù)比3個(gè) 月更長(zhǎng)的時(shí)期。在另一方面，本發(fā)明涉及治療感染HCV的患者的方法，其包括將以下物質(zhì)引入所 述的患者a.組合物，其包含人乳鐵蛋白，其中所述的乳鐵蛋白基本上不含鐵，并且其中所述 的組合物基本上不含非人乳鐵蛋白；以及b.干擾素。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，人乳鐵蛋白具有小于約5%的鐵飽和度。在本發(fā)明方法的另外一個(gè)實(shí)施方案中，人乳鐵蛋白具有約SOkDa的表觀分子量。在方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，人乳鐵蛋白在組合物中以約20mg的量存在。在本發(fā)明方法的另外一個(gè)實(shí)施方案中，使患者接受針對(duì)慢性感染HCV的治療。在 本發(fā)明方法的另外一個(gè)實(shí)施方案中，HCV屬于Ib基因型。在本發(fā)明方法的其它實(shí)施方案中，從患者身體消除HCV，持續(xù)比3個(gè)月更長(zhǎng)的時(shí)期。在其另一方面，本發(fā)明涉及用于治療HCV感染的藥盒(kit)，其包括a.在其中具有治療有效量的人乳鐵蛋白的第一容器，其中所述乳鐵蛋白基本上不 含鐵；b.在其中具有治療有效量的干擾素的第二容器。在根據(jù)本發(fā)明的藥盒的實(shí)施方案之一中，第一容器基本上不含非人乳鐵蛋白。在藥盒的另外一個(gè)實(shí)施方案中，人乳鐵蛋白具有小于約5%的鐵飽和度。在藥盒的其它實(shí)施方案中，人乳鐵蛋白具有約SOkDa的表觀分子量。在根據(jù)本發(fā)明的藥盒的實(shí)施方案之一中，人乳鐵蛋白在組合物中以約20mg的量 存在。在其它實(shí)施方案中，意欲將藥盒用于治療屬于慢性感染的HCV感染。在其它實(shí)施方案中，意欲將藥盒用于治療由具有Ib基因型的病毒導(dǎo)致的HCV感
^fe ο上述類(lèi)別的發(fā)明目標(biāo)是響應(yīng)于制備低花費(fèi)制劑的統(tǒng)一的挑戰(zhàn)，所述制劑總體上對(duì) 人身體具有抗病毒(丙型肝炎)的作用。
所述制劑在藥物實(shí)踐中的臨床使用和其給藥方法允許得到許多技術(shù)、醫(yī)療和經(jīng)濟(jì) 效果1.制劑是與人身體生物學(xué)兼容的，并且它在治療上對(duì)治療慢性病毒性丙型肝炎高 度有效，它可以與給予干擾素組合，并且可以與化學(xué)治療組合。2.可以基于所述制劑制備必需濃度的藥物。3.制劑易于保存和運(yùn)輸。4.以所述制劑為基礎(chǔ)的藥物可以靜脈內(nèi)給予至人身體。5.制劑是支付得起的，其在醫(yī)療實(shí)踐中的使用經(jīng)證明是經(jīng)濟(jì)的。6.為了治療慢性病毒性丙型肝炎，給予與干擾素和化學(xué)治療組合的所述制劑，與 使用治療慢性病毒性丙型肝炎的已知方案相比，允許在短得多的時(shí)間內(nèi)(快10-20倍)達(dá) 到持續(xù)的抗病毒效果。7.制劑明顯增強(qiáng)已知用于慢性病毒性丙型肝炎的治療方案的功效，將完全康復(fù)的 時(shí)間減少至2-3周的療程。附圖簡(jiǎn)述

圖1描述了在變性的條件下通過(guò)SDS PAGE分析人乳鐵蛋白不同樣品的純度的結(jié) 果。泳道A是分子量標(biāo)記物，泳道B是人乳鐵蛋白的標(biāo)準(zhǔn)樣品，泳道1-3是人乳鐵蛋白的樣 品(商業(yè)上可獲得的Laprot的制劑)，泳道4_13是人乳鐵蛋白脫輔基蛋白的樣品。圖2描述了通過(guò)HPLC色譜分析人乳鐵蛋白(商業(yè)上可獲得的制劑Laprot)的結(jié)果。圖3描述了通過(guò)HPLC色譜分析人乳鐵蛋白的結(jié)果。發(fā)明的實(shí)施方案將參照本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案詳細(xì)描述本發(fā)明。盡管描述了優(yōu)選的實(shí)施方案，但 是應(yīng)明確的是，本發(fā)明不限于它們。相反的是，可以預(yù)見(jiàn)的是本發(fā)明包括可代替的實(shí)施方 案、修飾的實(shí)施方案和等價(jià)的實(shí)施方案，考慮到本發(fā)明通過(guò)權(quán)利要求定義的精神和范圍，所 述實(shí)施方案可以包括在本發(fā)明中。定義表達(dá)“基本上不含鐵”意指具有小于約5%的鐵飽和度的乳鐵蛋白組合物，但是，本 發(fā)明也構(gòu)思了更高鐵飽和度，包括但不限于5%至20%。表達(dá)“小于約5 % ”意指具有不超過(guò)6 %，例如，5. 9 %的鐵含量的乳鐵蛋白組合物。短語(yǔ)“以約—mg/μ g的量存在”意指在治療HCV中有效的乳鐵蛋白的量。該量 包括，但是不限于至多15%大于或小于—mg/yg的量。優(yōu)選給予包含在藥物組合物中的本發(fā)明制劑，所述組合物包含治療有效量的作 為活性成分的基本上呈具有約80000道爾頓摩爾重量的脫輔基蛋白形式的乳鐵蛋白和藥 用可接受的載體、填充劑或賦形劑。如本文使用的，短語(yǔ)“約80000道爾頓”意指小于或 大于80000道爾頓至多15%的重量?！八幱每山邮艿妮d體、填充劑或賦形劑”意指對(duì)被給 予的患者不產(chǎn)生任何不期望的副作用的載體、填充劑或賦形劑。這些藥用可接受的載體、 填充劑或賦形劑在本領(lǐng)域中是眾所周知的(參見(jiàn)，例如Remington，s Pharmaceutical Sciences,第 18 版，A. R. Gennaro, Ed. , Mack Publishing Company, 1990 ；Pharmaceutical FormulationDevelopment of Peptides and Proteins, S. Frokjaer 禾口 L. Hovgaard,Eds. , Taylor and Francis,2000 ；and Handbook of PharmaceuticalExcipients，第 3 片反， A. Kibbe，Ed.，Pharmaceutical Press，2000)。藥用可接受的載體、填充劑或賦形劑的實(shí)例包括(但是不限于)緩沖劑、保持等滲 的試劑、防腐劑、表面活性物質(zhì)(離子型和非離子型)、填充劑、穩(wěn)定劑等。使用眾所周知的技術(shù)，可以將乳鐵蛋白的脫輔基蛋白包括在本發(fā)明的藥物 組合物中。用于將上述蛋白包括入組合物的適合技術(shù)描述于，例如在Remington’ s Pharmaceutical Sciences,17 片反(Mack Publ. Co. , Philadelphia, PA,1985)中?？梢詥为?dú)給予本發(fā)明的藥物組合物，或?qū)⑺幬锝M合物與一種或多種其它治療劑組 合給予。這些藥劑可以與脫鐵乳鐵蛋白包括在相同的組合物中，或它們可以存在于單獨(dú)的 組合物中，例如，在藥盒中。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含治療有效量的脫鐵乳鐵蛋白以及干擾 素。干擾素適于在本發(fā)明中使用，可以采用的形式是當(dāng)根據(jù)例如在本發(fā)明中公開(kāi)的方法注 射時(shí)，提供治療效果的任何形式。在本發(fā)明的非限制性實(shí)施方案中，本發(fā)明的脫鐵乳鐵蛋白 組合物可以與干擾素α-2聯(lián)合制備，或可以與干擾素α-2組合引入。本發(fā)明的藥物組合物可以制成多種藥物產(chǎn)品，例如溶液、乳液、用于臨時(shí)溶解的凍 干粉末。特別地，本發(fā)明中的脫鐵乳鐵蛋白藥物組合物可以凍干或穩(wěn)定溶解的產(chǎn)品形式存 在?？梢酝ㄟ^(guò)使用本領(lǐng)域已知的多種方法制備凍干產(chǎn)品。如技術(shù)人員所知的，該產(chǎn)品長(zhǎng)時(shí) 間為組合物提供穩(wěn)定性。制備液體穩(wěn)定的組合物的優(yōu)勢(shì)在于使用簡(jiǎn)便和在緊急情況中起效 更快，這可以潛在地挽救患者生命。液體組合物也可以是冷凍的，因此，先決條件是在將它 給予患者之前將其直接解凍。在患者狀況、并發(fā)疾病的存在、臨床可行性的指導(dǎo)下，同時(shí)考慮關(guān)于醫(yī)療制劑相容 性的已知信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員，例如主治醫(yī)師，可以開(kāi)出附加的藥物或非藥物治療的處方?？梢酝ㄟ^(guò)提供針對(duì)HCV感染(包括慢性HCV感染)的治療效果的任何途徑給予本 發(fā)明脫鐵乳鐵蛋白組合物。例如組合物可以腸胃外給予，例如靜脈內(nèi)給予、動(dòng)脈內(nèi)給予、腹 膜內(nèi)給予、肌內(nèi)給予或通過(guò)上述途徑的任何組合給予。優(yōu)選靜脈內(nèi)給予本發(fā)明的藥物組合 物。這種用于靜脈內(nèi)給藥的組合物可以呈溶液、懸浮液、水包油類(lèi)型的乳液、油包水類(lèi)型的 乳液、脂質(zhì)體懸浮液的形式?？梢詫⒗绲葷B0.9%鹽水溶液(生理鹽水溶液)、5%葡萄糖(右旋糖)溶液、甘露醇溶液等的眾所周知的藥用可接受的溶劑用作用于制備用于靜脈內(nèi) 給藥的溶液的溶劑。如果需要，所述溶液還可以包含輔助成分，例如穩(wěn)定劑、表面活性物質(zhì)、 抗微生物劑(防腐劑)等。制備用于腸胃外給藥的無(wú)菌無(wú)熱原溶液技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且前提 是使用無(wú)菌無(wú)熱原水和對(duì)得到溶液進(jìn)行滅菌，例如使所述溶液過(guò)濾通過(guò)例如具有0. 4微米 尺寸的孔的除菌過(guò)濾器。在本發(fā)明非限制性實(shí)例之一中，在治療慢性HCV中，靜脈內(nèi)給予人脫鐵乳鐵蛋白。 在治療方案的第一和第二天中，以每2小時(shí)20mg的劑量靜脈內(nèi)注射組合物。從方案的第3 天至第7天，以20mg的每日劑量注射脫鐵乳鐵蛋白組合物。在借助體外解毒方法的情況下， 從第3天至第7天也給予高劑量的干擾素(例如干擾素α -2)。試驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)以乳鐵蛋白為基礎(chǔ)的藥物的低級(jí)劑量無(wú)效并且更高劑量可以導(dǎo)致嚴(yán)重不良反應(yīng)時(shí)，存在人乳鐵蛋白的限制劑量(單次和療程劑量)。已聲稱(chēng)用于靜 脈內(nèi)給藥的藥物的單次和療程劑量，所述藥物基于含有人脫鐵乳鐵蛋白的制劑，所述劑量 有利于治療慢性病毒性丙型肝炎。不意欲被任何科學(xué)原理或?qū)W說(shuō)限制，本發(fā)明人將當(dāng)使用脫鐵乳鐵蛋白用于治療病 毒性丙型肝炎時(shí)觀察到的明顯肝保護(hù)效果與以下事實(shí)聯(lián)系被丙型肝炎病毒感染的細(xì)胞在 脫鐵乳鐵蛋白的影響下以程序性細(xì)胞死亡而不是以壞死的方式結(jié)束它們的生命，這預(yù)防更 多新部分的病毒散發(fā)進(jìn)入全身性血循環(huán)。給予乳鐵蛋白脫輔基蛋白的優(yōu)選方式是靜脈內(nèi)，這提供在未改變的條件下快速和有目的的將脫鐵乳鐵蛋白運(yùn)輸至靶器官(肝)，因此，保證活性成分在肝中最大程度的蓄 積。在本研究上下文中，術(shù)語(yǔ)“治療有效量"意指在治療疾病方面將保證期望的效果 的藥物的量。特別地，治療有效量必須能夠預(yù)防和消除被治療的疾病的嚴(yán)重性或擴(kuò)散。期 望的效果可以是在患者血中降低病毒的顆粒滴定度或?yàn)閺难h(huán)完全消除病毒，為肝保護(hù) 功能等。最期望的治療效果是從患者身體完全根除導(dǎo)致病毒性丙型肝炎的生物體。當(dāng)考慮變量，例如患者重量和年齡、一般健康狀況、主要疾病的嚴(yán)重性、并發(fā)疾病 的存在等時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以個(gè)體化確定治療有效量。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以常規(guī)地 確定給藥方案，包括用于本發(fā)明這種藥物治療的成分的劑量、給藥方法和頻率、療程持續(xù)時(shí) 間，并且如果需要，在考慮試驗(yàn)室研究數(shù)據(jù)、臨床觀察、癥狀動(dòng)力學(xué)等的情況下，可以在治療 過(guò)程中糾正給藥方案。可以從人初乳、頭乳或乳和其它人生物學(xué)物質(zhì)提取人乳鐵蛋白，以及通過(guò)基因工 程或轉(zhuǎn)基因方法得到人乳鐵蛋白。可以通過(guò)脫鹽和陽(yáng)離子交換色譜法從人乳血清提取乳鐵 蛋白，如在1990年3月1日的USSR專(zhuān)利No. 1709606中描述的。也存在已知的通過(guò)滲濾-超 濾從人乳提取乳鐵蛋白的方法(申請(qǐng)WO 89/11226，1989年11月30日的國(guó)際公開(kāi)文本)。 描述了通過(guò)在具有固定的針對(duì)人乳鐵蛋白的單克隆抗體的柱上的親和色譜法，從人乳一步 純化乳鐵蛋白的方法(專(zhuān)利JP60100019，1985年8月29日)。所有列舉的方法以及其它方 法可以成功地用于得到天然的乳鐵蛋白(呈含有結(jié)合的鐵的全蛋白形式)。不僅在乳腺中，也在其它組織中觀察到編碼人乳鐵蛋白的基因的表達(dá)。例如，描述 了在精囊中編碼乳鐵蛋白的mRNA的序列(GenBankAcc No. AAN75578)。從人骨髓克隆乳鐵 蛋白基因，其是交替接合的變體(GenBank Acc No. AAR12276)。也公開(kāi)了大量來(lái)自乳腺的人 乳鐵蛋白基因的核苷酸序列和它們相應(yīng)的氨基酸序列，其在特定氨基酸殘基上具有某些差 異(參見(jiàn)，例如，(GenBank Acc Nos. AAA59511，AAB60324，AAG48753)。此外，描述了大量多 態(tài)性，例如在外顯子1人乳鐵蛋白基因中的點(diǎn)-核苷酸多態(tài)性，其導(dǎo)致乳鐵蛋白N末端區(qū)域 的 29 位置的 Lys/Arg 多態(tài)性(參見(jiàn) Velliyagounder K 等人，Infect. Immun. ,2003,71 (11) 6141-6147)。因此，在本發(fā)明框架之內(nèi)適用的是人乳鐵蛋白，其與提供的人乳鐵蛋白的序列 (例如，在GenBank中以登錄號(hào)Acc. No. AAA59511保藏的序列)具有至少80%，更優(yōu)選至少 90%，更優(yōu)選至少95%，和最優(yōu)選至少99%氨基酸序列同源性?？紤]到不可能以工業(yè)規(guī)模得到天然人乳鐵蛋白的事實(shí)，重組人乳鐵蛋白適用于實(shí) 現(xiàn)本發(fā)明。人乳鐵蛋白基因的序列是已知的，例如，已知于申請(qǐng)WO 92/21752 (1992年12 月10日)的國(guó)際公開(kāi)文本，并且也參見(jiàn)上文提及的在GenBank中保藏的序列。已描述了表達(dá)用于這種目的的重組人乳鐵蛋白和質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的技術(shù)(例如專(zhuān)利US 6，277，817，2001 年8月21日)。非常有吸引力的制備重組人乳鐵蛋白方法是在植物細(xì)胞培養(yǎng)物中(申 請(qǐng)US 2004040062)或在甲基營(yíng)養(yǎng)性酵母巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中(申請(qǐng) WO 01/32895的國(guó)際公開(kāi)文本，2001年5月10日)的表達(dá)方法。也認(rèn)為使用從轉(zhuǎn)基因動(dòng) 物(例如奶牛)的乳得到的人乳鐵蛋白在本發(fā)明框架之內(nèi)。已描述了通過(guò)在山羊乳腺中 表達(dá)人乳鐵蛋白的高度有效的制備方法，其硬膜內(nèi)注射重組復(fù)制缺陷性腺病毒(Han Z.S.， 等人’ High-level expression of human lactoferrin inthe milk of goats by using replication-defective adenoviral vectors. Protein Expr. Purif. (2007), v.53(1), p. 225-231)。所述的制劑和所有較早已知含有乳鐵蛋白的藥物之間的主要顯著差異在于以下 事實(shí)由于包括在制劑組合物中的乳鐵蛋白的高純化程度，得到最大濃度的一種同工型 (具有約80k道爾頓的表觀分子量)的脫鐵乳鐵蛋白，最具活性的抗病毒藥劑，因此，保證其 可靠性和其用于治療方法的安全性。制劑中乳鐵蛋白的所述濃度允許長(zhǎng)時(shí)間以其天然狀態(tài)保存乳鐵蛋白，這是處于最 大程度的生理學(xué)活性的狀態(tài)。進(jìn)一步給出的實(shí)施例公開(kāi)了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的最優(yōu)選方法，并且給出它們僅僅為了更好解釋其本質(zhì)。在沒(méi)有偏離超出本發(fā)明框架的情況下，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解在使用 的物質(zhì)和使用的方法方面可能存在很多修飾。實(shí)施例1.-比較分析不同的人乳鐵蛋白制劑根據(jù)下列參數(shù)評(píng)價(jià)各樣品1)人乳鐵蛋白蛋白的含量。2)用鐵飽和乳鐵蛋白的程度3)乳鐵蛋白結(jié)合鐵的能力4)在存在十二烷基硫酸鈉(SDS)的情況下，借助在聚丙烯酰胺凝膠中的變性電泳 評(píng)價(jià)人乳鐵蛋白純度。5)借助高效液相色譜法(HLPC)評(píng)價(jià)人乳鐵蛋白純度。樣品 樣品中乳鐵蛋白蛋白含量從 P. A. Gertsen Moscow Research Oncology Institute 得至Ij “Laprot，，制齊[J。 Laprot制劑(樣品1-3)中乳鐵蛋白蛋白含量變化范圍是2. 7至3. 3mg/10mg凍干制劑。通過(guò)用硫酸銨鹽析和根據(jù)之前描述的方法(USSR專(zhuān)利No. 170960601. 03. 1990) 的具有某些改進(jìn)的陽(yáng)離子交換色譜法，從人乳血清得到脫鐵乳鐵蛋白蛋白(樣品 4-13)。在25mm直徑的柱上，采用50ml體積的陽(yáng)離子交換劑實(shí)施陽(yáng)離子交換色譜法。將Toyoperl CM-650S(TosoHaas part#43253)用作陽(yáng)離子交換劑。流速30ml/小時(shí)，蠕動(dòng)泵 Microperpex(Pharmacia)。通過(guò)Uvicord SII(Pharmacia)檢測(cè)器在洗脫液中檢測(cè)蛋白，通 過(guò)Multirak(Pharmacia)級(jí)份采集器采集級(jí)份。根據(jù)附于所述設(shè)備的說(shuō)明書(shū)，使用一系列在血清“乳鐵蛋 白-ELISA-Best”D-4156(ZA0 “載體-Best”)中用于免疫酶測(cè)定乳鐵蛋白的試劑，測(cè)定溶液 中乳鐵蛋白濃度。采用Excel程序，使用二度的多項(xiàng)式近似法計(jì)算結(jié)果。此外，在具有Icm長(zhǎng)光學(xué)泳道的池中，采用Ultrospec 11分光光度儀，通過(guò)分光光 度法測(cè)定乳鐵蛋白濃度。通過(guò)下式確定制劑中乳鐵蛋白濃度濃度(mg/ml) =A280/1. 27，如 EP O 253 395 B2 中所述。樣品4-13中脫鐵乳鐵蛋白蛋白含量變化范圍是15. 2至20. Omg/lml溶液。人乳鐵蛋白的鐵飽和度通過(guò)分光光度方法，通過(guò)比率A465/A28(JU量人乳鐵蛋白的鐵飽和度。表1顯示所有 受試樣品的鐵飽和度(％)。表1.不同樣品的人乳鐵蛋白的鐵飽和度。 因此，對(duì)于商業(yè)制劑Laprot (樣品1_3)，乳鐵蛋白的鐵飽和度在25至39%的寬范圍內(nèi)變化。這種鐵飽和度的水平對(duì)應(yīng)于天然人乳鐵蛋白的平均飽和度水平。相對(duì)比的是，脫鐵乳鐵蛋白制劑顯示鐵飽和度在3. 4至5. 之間變化。人乳鐵蛋白對(duì)鐵的親和力當(dāng)以硫酸銨-鐵的濃溶液形式添加鐵離子時(shí)，含有不同量的人乳鐵蛋白的所有樣 品顯示100%的乳鐵蛋白被鐵離子飽和。
通過(guò)在聚丙烯酰胺凝膠中的變件電泳(PAGE)技術(shù),評(píng)估人乳鐵蛋白制劑純度。Laemmli U. K描述了在系統(tǒng)中存在十二烷基硫酸鈉(SDS)的情況下，通過(guò)PAGE，分 析樣品(Cleavage of the structural proteins duringthe assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature (1970)，v. 227，p. 680-685)。為了實(shí)施測(cè)定，將 20 μ g 的人 乳鐵蛋白、樣品編號(hào)1-3 (Laprot)和10 μ g的人乳鐵蛋白、樣品編號(hào)4_13用于泳道。需要大量用于實(shí)施所述測(cè)定的人乳鐵蛋白以評(píng)價(jià)人乳鐵蛋白的可能分解產(chǎn)物，主 要因?yàn)閮龈蓸悠凤@示比預(yù)期低得多的人乳鐵蛋白濃度。得到的信息顯示在圖1中。所有樣品具有清楚被標(biāo)記的主帶，其對(duì)應(yīng)于80，000道 爾頓的表觀分子量。特別是，所有No. 4-13樣品顯示存在具有80，000道爾頓的分子量的蛋 白，以及非顯著量的其它蛋白，其似乎是人乳鐵蛋白的分解產(chǎn)物。另一方面，No. 1-3樣品(商業(yè)上可獲得的制劑Laprot)顯示一個(gè)對(duì)應(yīng)于的表觀分 子量80，000道爾頓的主帶，并且還存在對(duì)應(yīng)于75，000和70，000道爾頓的2個(gè)較小帶。這 2個(gè)帶之一也存在于用作參照樣品的乳鐵蛋白中。mitmmmmmi^i (HLPC) w^^mmmm^m為了測(cè)定蛋白的純度和測(cè)定可能的混合物，使用高效液相色譜法測(cè)試來(lái)自各樣品 的50 μ g的人乳鐵蛋白。所有No. 1-3樣品的色譜圖是相同的。得到的No. 1樣品的典型色譜圖顯示在圖2 中。所有呈溶液的形式的No. 4-13樣品的色譜圖是相同的。得到的No. 13樣品的典型 色譜圖顯示在圖3中。1-13樣品的高效液相色譜法結(jié)果顯示，任何樣品中不存在人乳鐵蛋白的分解產(chǎn) 物。實(shí)施例2.在靜脈內(nèi)給予人乳鐵蛋白中的臨床經(jīng)驗(yàn)以單一治療的形式或與干擾素、長(zhǎng)效干擾素、利巴韋林和細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑組合，與 體外解毒方法組合給予人乳鐵蛋白制劑。病例研究1患者G.A.L.，30歲男性。經(jīng)診斷患有乙型肝炎+丙型肝炎的組合。根據(jù)聚合酶鏈 反應(yīng)，初始病毒血癥高(> 100，000IU/ml)。根據(jù)記載的數(shù)據(jù)，疾病持續(xù)5年。但是，通過(guò)病 例歷史數(shù)據(jù)判斷，可以推斷疾病的實(shí)際持續(xù)時(shí)間是約14年。在住院病人診所中治療患者。嘗試在使用每隔一天3百萬(wàn)單位的Reaferon治療 的背景下，給予脈沖劑量的500mg的脫鐵乳鐵蛋白。這種給藥方法在病毒血癥水平或在生 化指標(biāo)方面沒(méi)有產(chǎn)生任何變化。在治療開(kāi)始之后7-9天中，觀察到卡他性疾病的惡化。在 沒(méi)有干涉主要疾病的治療過(guò)程的情況下，這些卡他性現(xiàn)象自然消除和消失。之后使用2小時(shí)給藥方案，每2小時(shí)20mg，持續(xù)10小時(shí)。作為連續(xù)使用這種技術(shù)兩天的結(jié)果，在初步長(zhǎng)期使用Reaferon治療的背景下，消除了丙型肝炎病毒。同時(shí)，不再檢 測(cè)到乙型肝炎病毒，但是，在一周后，已經(jīng)再次檢測(cè)到相同水平的病毒。在使用Reaferon治 療的背景下，在下一個(gè)3月中或在下一個(gè)9、18、27和36個(gè)月這種治療結(jié)束之后沒(méi)有檢測(cè)到 丙型肝炎病毒，這通過(guò)對(duì)照測(cè)試得到證實(shí)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案完成乙型肝炎治療，并且該治療僅 僅在1年之后成功地結(jié)束。病例研究2患者K.V.A，21歲男性。經(jīng)診斷患有由IB病毒基因型引起的丙型肝炎。根據(jù)聚合 酶鏈反應(yīng)，初始病毒血癥高(> 100，000IU/ml)。根據(jù)記載的數(shù)據(jù)，疾病持續(xù)3年。但是，通 過(guò)病例歷史數(shù)據(jù)判斷，可以推斷疾病的實(shí)際持續(xù)時(shí)間是其兩倍長(zhǎng)。根據(jù)采用每周一次的周期的方案進(jìn)行治療，其中在脫鐵乳鐵蛋白給予期間不給 予Reaferon，并且在給予脫鐵乳鐵蛋白之間的一周間隔期間內(nèi)以3百萬(wàn)單位的劑量施用 Reaferon兩次。在治療開(kāi)始之后7_9天中，觀察到卡他性疾病的惡化 。在沒(méi)有干涉主要疾 病的治療過(guò)程的情況下，這些卡他性現(xiàn)象自然消除和消失。病毒消除發(fā)生在綜合治療(脫鐵乳鐵蛋白、ReaferoruHDF)的第3周。在完成治療 之后的6、16、23和30個(gè)月中，得到關(guān)于在所述患者的血中穩(wěn)定不存在病毒的試驗(yàn)室信息。病例研究3患者Sh.A.A.，29歲男性。經(jīng)診斷患有由基因型2a病毒引起的丙型肝炎，在預(yù)防 性檢查期間以3X104IU/ml的滴定度被偶然發(fā)現(xiàn)。根據(jù)記載的數(shù)據(jù)，疾病持續(xù)2個(gè)月，但是， 丙型肝炎臨床現(xiàn)象的歷史是約2年。改變治療，通過(guò)7天方案結(jié)合Reaferon和體外解毒方法給予人乳鐵蛋白脫輔基蛋 白制劑。自從治療開(kāi)始，在血中沒(méi)有檢測(cè)到生化學(xué)障礙，膽紅素和肝酶保持在正常限度之 內(nèi)。在綜合治療的第3周結(jié)束時(shí)，觀察到病毒的消除。在6、12、24和33個(gè)月之后，在 對(duì)照研究中，在血中沒(méi)有病毒。病例研究4患者S.L.G.，37歲男性。經(jīng)診斷患有由基因型Ib病毒引起的丙型肝炎，在預(yù)防性 檢查期間以428000IU/ml的滴定度被發(fā)現(xiàn)。疾病持續(xù)1年。無(wú)肝炎的臨床跡象。無(wú)主訴。 生化學(xué)測(cè)試是正常的。以7天方案，在2個(gè)階段中，實(shí)施人脫鐵乳鐵蛋白與reaferon、利巴 韋林、拉米夫定和體外解毒方法組合的組合給藥。在第一階段的第3周結(jié)束時(shí)，觀察到HCV 滴定度減少至500IU/ml。這顯著增加上述正常肝酶和血中膽紅素，存在免疫抑制的跡象。 因此，在停止治療一周之后，采用減少劑量的利巴韋林和拉米夫定進(jìn)行相同方案的完整治 療的第二階段。到第二階段治療的第一周結(jié)束為止，觀察到病毒的消除。下一個(gè)13個(gè)月的 對(duì)照研究沒(méi)有顯示在血中存在病毒。生化指標(biāo)也是穩(wěn)定的。病例研究5患者S. S. B.，47歲男性。經(jīng)診斷患有由基因型2A病毒引起的丙型肝炎。病毒血 癥高，2. 2 X 105IU/ml。在血液化學(xué)中酶有10倍增加，伴隨膽紅素適度增加至正常值的上限。 根據(jù)記載的數(shù)據(jù)，疾病持續(xù)0，5年。但是，通過(guò)病例歷史數(shù)據(jù)判斷，可以推斷疾病的實(shí)際持 續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)得多，約3年。改變治療。每日以40mg的劑量給予人乳鐵蛋白脫輔基蛋白制劑，持續(xù)3天，然后以20mg的劑量給予人乳鐵蛋白脫輔基蛋白制劑，持續(xù)4天。然后實(shí)施一周間隔，接著進(jìn)行 脫鐵乳鐵蛋白治療的第二療程，其中每日給予40mg的所述制劑?；谒鲋苿┚哂忻庖咭?制作用的假設(shè)，選擇這種治療方案。應(yīng)注意的是，免疫細(xì)胞發(fā)展周期約為7天，決定在不使 用干擾素的情況下，交替進(jìn)行給予脫鐵乳鐵蛋白制劑的7天周期。采用脫鐵乳鐵蛋白的單一治療導(dǎo)致病毒的部分消除病毒血癥從高減少至中等， 3X104IU/ml。在該病例中，采用人乳鐵蛋白脫輔基蛋白的單一治療僅僅部分消除丙型肝炎病毒。我們注意到，在治療的第2和第3周中，酶釋放增加，而病毒血癥的平均水平得以 保留。注意到，在治療開(kāi)始之后7-9天中，觀察到卡他性疾病的惡化。在沒(méi)有干涉主要疾病 的治療過(guò)程的情況下，這些卡他性現(xiàn)象自然消除和消失。
在使用脫鐵乳鐵蛋白單一治療之后，下一個(gè)階段的患者的治療是采用干擾素制劑 的綜合治療。采用每2小時(shí)20mg的脈沖劑量的脫鐵乳鐵蛋白開(kāi)始療程，直到達(dá)到IOOmg的 劑量。然后每日給予每40mg所述脫鐵乳鐵蛋白制劑，沒(méi)有觀察到任何每周一次的周期性。 從脫鐵乳鐵蛋白給予的第5天開(kāi)始，每隔一天，以3百萬(wàn)單位的劑量給予α 2Α(Reaferon) 干擾素制劑。因?yàn)锳lAT (SGPT)和AsAT (SGOT)的高初始水平，作出這個(gè)決定是為了實(shí)現(xiàn) 肝保護(hù)。在給予脫鐵乳鐵蛋白的2小時(shí)方案之后3天之內(nèi)，該患者顯示AIAT(SGPT)和 AsAT(SGOT)水平大于3倍的減少，而保持平均病毒血癥。膽紅素水平顯著減少，證實(shí)2小時(shí) 方案的顯著肝保護(hù)作用。在Reaferon給藥開(kāi)始之后一周中，病毒消除發(fā)生，然后停止給予 脫鐵乳鐵蛋白，并且以相同的量持續(xù)reaferon治療。此外，在2周之內(nèi)得到另外2種陰性 PCR測(cè)試，然后停止reaferon給藥。在治療結(jié)束之后的一個(gè)月中，發(fā)生復(fù)發(fā)。病毒血癥提升至中等水平，伴隨高酶釋 放。到治療開(kāi)始為止，病毒血癥是5X106IU/ml，酶釋放高，盡管它兩倍小于初始水平。然后 根據(jù)2小時(shí)方案，兩天連續(xù)使用采用給予脫鐵乳鐵蛋白的綜合治療，然后每日以20mg的劑 量實(shí)施所述治療，同時(shí)以每周一次的周期觀察以預(yù)防病毒對(duì)所述制劑的可能免疫。每隔一 天，以5百萬(wàn)單位的劑量，采用甘樂(lè)能(Intron A)代替Reaferon，然后通過(guò)每日l(shuí)，200mg利 巴韋林補(bǔ)充治療。假定脫鐵乳鐵蛋白通過(guò)與病毒表位E2結(jié)合"標(biāo)記"病毒，因此，使其對(duì)于免疫系 統(tǒng)來(lái)說(shuō)是可識(shí)別的并阻止其滲透入肝細(xì)胞，決定開(kāi)始這個(gè)階段的采用給予甘樂(lè)能的治療。 然后，在第一次甘樂(lè)能注射之后兩天，使用脫鐵乳鐵蛋白給予的2小時(shí)方案，每2小時(shí)20mg 直到達(dá)到IOOmg的劑量，然后以每日20mg的劑量持續(xù)給予脫鐵乳鐵蛋白。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，在2天給予脫鐵乳鐵蛋白之后，檢測(cè)到病毒血癥水平從5，000, 000 減少至400，000IU/ml以及兩倍減少的酶水平。低水平的抗病毒的IgM引人注意，因?yàn)?其不適應(yīng)方法強(qiáng)度。在治療開(kāi)始之后，其水平輕微增加，盡管難以確定它是否與甘樂(lè)能 (Introne)或脫鐵乳鐵蛋白作用有關(guān)。到綜合治療的第一周結(jié)束為止，病毒血癥水平減少 至低，并且到治療的第二周結(jié)束為止，沒(méi)有給予脫鐵乳鐵蛋白，病毒血癥水平下降至最小 (630IU/ml，敏感性閾值為600IU/ml)。病毒血癥水平的所有變化與酶(首要是AlAT (SGPT) 和AsAT(SGOT))釋放水平的降低相關(guān)聯(lián)。到治療的第3周結(jié)束為止，在血中沒(méi)有檢測(cè)到 病毒，并且生化學(xué)測(cè)試在正常范圍之內(nèi)。使患者轉(zhuǎn)為接受每周135mg的劑量的派羅辛 (Pegasis)制劑的抗復(fù)發(fā)治療。動(dòng)態(tài)觀察4、13和24個(gè)月。沒(méi)有復(fù)發(fā)。
病例研究6患者Α. Α. N. ,37歲女性。經(jīng)診斷患有由IB病毒基因型引起的丙型肝炎。病毒血 癥高，1000. 000IU/mlo根據(jù)記載的數(shù)據(jù)，疾病持續(xù)2年。改變治療。每日以40mg的劑量給予人乳鐵蛋白脫輔基蛋白制劑，持續(xù)3天，然后 以20mg的劑量給藥，持續(xù)4天。然后實(shí)施一周間隔，并且隨后進(jìn)行脫鐵乳鐵蛋白的第二療 程，其中每日給予40mg的所述制劑。基于所述制劑具有免疫抑制作用的假設(shè)，選擇這個(gè)治 療方案。應(yīng)注意的是，免疫細(xì)胞的發(fā)展周期約為7天，決定交替進(jìn)行7天周期的脫鐵乳鐵蛋 白制劑給藥。采用HL的單一治療導(dǎo)致病毒的部分消除病毒血癥從高減少至低2 X 103IU/ml。盡管所有值在正常范圍之內(nèi)，但注意到酶水平的增加。在治療開(kāi)始之后7-9天中， 觀察到卡他性疾病的惡化。在沒(méi)有干涉主要疾病的治療過(guò)程的情況下，這些卡他性現(xiàn)象自 然消除和消失。 在部分成功使用脫鐵乳鐵蛋白單一治療之后患者治療的下一個(gè)階段是采用干擾 素制劑的綜合治療。采用每2小時(shí)20mg的脈沖劑量的脫鐵乳鐵蛋白開(kāi)始療程，直到達(dá)到 IOOmg的劑量。然后每日以40mg的劑量給予脫鐵乳鐵蛋白制劑，沒(méi)有觀察任何每周一次的 周期。在脫鐵乳鐵蛋白給予的同時(shí)，每隔一天以3百萬(wàn)單位的劑量給予α 2A(Reaferon)干 擾素制劑。Reaferon的第一次給藥在脫鐵乳鐵蛋白給藥的2小時(shí)方案之前進(jìn)行。采用脫鐵 乳鐵蛋白的治療開(kāi)始之后5天，發(fā)生病毒消除。每隔一天以相同的3百萬(wàn)單位的劑量給予 Reaferon0重要的是強(qiáng)調(diào)病毒消除伴隨相對(duì)升高的AlAT (SGPT)和AsAT (SGOT)水平，盡管它 們保持在正常范圍之內(nèi)。在給予2小時(shí)方案之前和之后，病毒血癥保持在中等水平。在考 慮IB病毒基因型的情況下，將脫鐵乳鐵蛋白給藥延長(zhǎng)直到8天并且以相同量持續(xù)reaferon 治療。但是，在脫鐵乳鐵蛋白給藥停止之后一周，病毒血癥增加至中等水平。脫鐵乳鐵蛋白 給藥的另一個(gè)療程以每日20mg的劑量開(kāi)始，但是在治療的第4天對(duì)照測(cè)定顯示了高病毒血 癥。在給予脫鐵乳鐵蛋白中實(shí)施2周停止。通過(guò)采用每日1，OOOmg劑量的利巴韋林補(bǔ)充治療過(guò)程，每隔一天，用5百萬(wàn)單位劑 量的干擾素α-2Β(甘樂(lè)能)代替Reaferon。采用被批準(zhǔn)的2小時(shí)方案開(kāi)始脫鐵乳鐵蛋白 給藥，然后以每日20mg的劑量持續(xù)給予脫鐵乳鐵蛋白，沒(méi)有觀察到每周一次的周期性。在 開(kāi)始治療時(shí)，病毒血癥是中等的。抗病毒免疫球蛋白M的量是顯著的。在脫鐵乳鐵蛋白攝 取的第5天開(kāi)始給予甘樂(lè)能。到治療的第6天為止，即到甘樂(lè)能給藥開(kāi)始為止，患者顯示病 毒血癥增加至430千IU/ml，與血測(cè)試中的生化指標(biāo)相關(guān)。保持高水平的抗病毒的IgM。在 甘樂(lè)能給藥開(kāi)始之后，在5天之內(nèi)，病毒血癥水平快速降低，然后在2周之內(nèi)病毒消除。在 其之后停止脫鐵乳鐵蛋白給予，以相同范圍持續(xù)甘樂(lè)能給藥。在脫鐵乳鐵蛋白給予結(jié)束之 后5、12、19和25個(gè)月實(shí)施的對(duì)照測(cè)試沒(méi)有發(fā)現(xiàn)病毒血癥。病例研究7患者M(jìn).T. I. ,47歲女性。經(jīng)診斷患有由基因型Ib病毒引起的丙型肝炎。肝病理 學(xué)的歷史長(zhǎng)約6年，慢性胰腺炎。在預(yù)防性檢查期間，試驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)HCV診斷。根據(jù)記載的數(shù) 據(jù)，疾病持續(xù)1，5年。初始病毒血癥1 X 107IU/ml。在住院病人診所中治療患者。AlAT(SGPT) ,AsAT(SGOT)的基線生化參數(shù)在正常限度之內(nèi)，膽紅素增加兩倍，ALP增加10倍。綜合治療采用7天方式，使用2小時(shí)方案，使用天然的乳鐵蛋白(制劑Laprot)、 reaferon、拉米夫定、利巴韋林和體外解毒方法。將50mg的凍干Laprot制劑用作單次劑量。 到綜合治療的第3周結(jié)束為止，觀察到肝酶增加幾乎2-倍，并且ALP減少至正常。病毒血 癥減少至6. 7 X 105IU/ml。在2周停止之后，進(jìn)行采用Laprot制劑的完整治療的第二階段。 在第二階段中，病毒血癥保持在1. 2 X 105-2. 3 X 105IU/ml之內(nèi)。在3周2階段結(jié)束時(shí)，發(fā)現(xiàn) 減少的病毒血癥低于500IU/ml。鑒于存在免疫抑制的跡象，實(shí)施綜合治療的2周停止。在 所述2周期間僅僅使用長(zhǎng)效干擾素派羅欣，每周使用1次。對(duì)照研究揭示病毒血癥保持在 600IU/ml的水平。在按照所述方案的治療第3階段開(kāi)始時(shí)，病毒血癥增加至3IU/ml，并且直到第3階 段結(jié)束保持該水平。使患者轉(zhuǎn)為接受長(zhǎng)期使用長(zhǎng)效干擾素的方案。在6、12和20月之后， 對(duì)照研究顯示病毒載量在1 X IO3-I X 104IU/ml之內(nèi)。病例研究8
患者Z.A.A.，18歲男性。經(jīng)診斷患有由基因型Ib病毒引起的丙型肝炎。疾病持續(xù) 約5年。初始病毒血癥是500000IU/ml。病人住院治療包括以3階段使用Laprot制劑。各 階段由7天方式和2小時(shí)方案的3周周期組成。所有3個(gè)階段的間歇地測(cè)量?jī)芍艿纳瘏?數(shù)實(shí)際上保持在初始水平，在正常限度之內(nèi)。到第一階段結(jié)束為止，病毒血癥減弱至500IU/ ml。到第二階段的開(kāi)始為止，在血中沒(méi)有檢測(cè)到病毒。但是，在第二階段的第一個(gè)7天的中 期，他再次顯示病毒血癥為2. 2 X 104IU/ml。治療的整個(gè)第3階段，即另一個(gè)21天伴隨穩(wěn)定 的在IX 103-1.6X 103IU/ml之內(nèi)的病毒血癥指標(biāo)。在3個(gè)階段結(jié)束時(shí)，鑒于患者的年齡和 顯著免疫抑制，決定使患者轉(zhuǎn)為接受長(zhǎng)療程的長(zhǎng)效干擾素派羅欣。在6、13、21和29個(gè)月之 后，對(duì)照研究顯示病毒血癥實(shí)際上保持在基線。病例研究9.患者N. Α. V.，33歲男性。經(jīng)診斷患有由基因型Ib病毒引起的丙型肝炎。可信地 記載了約10年的疾病持續(xù)時(shí)間。在病例歷史中有重復(fù)的干擾素療程，沒(méi)有陽(yáng)性效果。初始 病毒血癥2. IX 107IU/ml。以2個(gè)階段進(jìn)行采用2小時(shí)方案，7天周期與Laprot制劑組合 的療程。到此時(shí)為止，減弱了 1，5倍初始增加的生化指標(biāo)。取得的抗病毒治療效果太弱。Mrk這些臨床觀察對(duì)2組患者來(lái)說(shuō)是典型的，其中一組采用包含在Laprot制劑中的天 然人乳鐵蛋白-9個(gè)觀察(由于未知原因，它們之一在治療的第一周中已經(jīng)成為患者的治療 拒絕)，并且在另一組中使用通過(guò)作者在上文描述的方法得到的人脫鐵乳鐵蛋白-51個(gè)觀 察(在一個(gè)病例中存在治療拒絕，患者具有由藥物濫用的長(zhǎng)歷史導(dǎo)致的不穩(wěn)定精神)。在5位患者中進(jìn)行脫鐵乳鐵蛋白單一治療，但是因?yàn)槿鄙倏共《镜男ЧD(zhuǎn)變成 與使用干擾素、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑和體外解毒方法的新組合治療。不意欲被任何科學(xué)理論限制，發(fā)明人推測(cè)腸胃外給予的脫鐵乳鐵蛋白是親丙型肝 炎病毒的，并且與它相互作用，使它被免疫系統(tǒng)識(shí)別并阻止其滲透入肝細(xì)胞。脫鐵乳鐵蛋白 的長(zhǎng)期和定期給藥導(dǎo)致某些免疫抑制效果，在單一治療的情況下其間接特征是病毒血癥增 強(qiáng)和在治療開(kāi)始之后約一周中所有患者發(fā)展卡他性變化。但是，在任何病例中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)過(guò) 敏反應(yīng)。
當(dāng)根據(jù)2小時(shí)方案，5-6次以每2小時(shí)20mg的劑量，將脫鐵乳鐵蛋白與采用干擾素 制劑的初步治療一同給予時(shí)，獲得了最明顯效果。給予所述制劑的分成幾份的方式可能是 臨床上有優(yōu)勢(shì)的，其中采用2-3小時(shí)間隔將它施用更長(zhǎng)時(shí)期，即若干天或周(如果可能)。工業(yè)適應(yīng)性本發(fā)明涉及在治療由丙型肝炎病毒(HCV)導(dǎo)致的感染(特別是慢性感染)中使用 脫鐵乳鐵蛋白，并且提供可以在衛(wèi)生保健中使用的方法、組合物和藥盒。通過(guò)引用將本文引用的或提及的所有專(zhuān)利文件、公開(kāi)文本、科學(xué)文獻(xiàn)和其它文件 和物質(zhì)包括在本說(shuō)明書(shū)中，達(dá)到如下程度如同通過(guò)單獨(dú)引用將這些文件的每一個(gè)并入本 文或完整地將這些文件的每一個(gè)弓I入本文。本文描述的明確的用途、治療方法和方案、藥物組合物意指實(shí)施的優(yōu)選變體，僅僅 以實(shí)例的方式給出，并不意欲限制本發(fā)明的范圍。當(dāng)研究本說(shuō)明書(shū)時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以 認(rèn)為其它目的、方面和實(shí)施在本發(fā)明框架之內(nèi)。在沒(méi)有任何偏離通過(guò)所附 本發(fā)明的表述確 定的本發(fā)明范圍和框架的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解可以結(jié)合本文描述的本發(fā)明進(jìn)行 不同代替和修飾。
權(quán)利要求
包含人乳鐵蛋白和干擾素的組合物，其中所述乳鐵蛋白基本上不含鐵，并且其中所述組合物基本上不含非人乳鐵蛋白。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述人乳鐵蛋白具有小于約5%的鐵飽和度。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述人乳鐵蛋白具有約80kDa的表觀分子量。
4.權(quán)利要求2的組合物，其中所述人乳鐵蛋白的含量為約20mg。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物適用于治療HCV感染。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述HCV感染是慢性HCV感染。
7.權(quán)利要求5的組合物，其中所述HCV是基因型lbHCV。
8.權(quán)利要求5的組合物，其中所述組合物能夠從患者身體消除所述HCV，持續(xù)多于3個(gè) 月的時(shí)期。
9.用于治療感染了HCV的患者的方法，其包括將以下物質(zhì)給予所述患者a.包含人乳鐵蛋白的組合物，其中所述乳鐵蛋白基本上不含鐵，并且其中所述組合物 基本上不含非人乳鐵蛋白；以及b.干擾素。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述人乳鐵蛋白具有小于約5%的鐵飽和度。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述人乳鐵蛋白具有約80kDa的表觀分子量。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述人乳鐵蛋白的含量為約20mg。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述患者慢性感染了HCV。
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述HCV是基因型lbHCV。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述給藥從所述患者清除HCV，持續(xù)多于3個(gè)月的時(shí)期。
16.用于治療HCV的藥盒，其包含a.其中具有治療有效量的人乳鐵蛋白的第一容器，其中所述乳鐵蛋白基本上不含鐵；b.其中具有治療有效量的干擾素的第二容器。
17.權(quán)利要求16的藥盒，其中所述第一容器基本上不含非人乳鐵蛋白。
18.權(quán)利要求17的藥盒，其中所述人乳鐵蛋白具有小于約5%的鐵飽和度。
19.權(quán)利要求18的藥盒，其中所述人乳鐵蛋白具有約80kDa的表觀分子量。
20.權(quán)利要求18的藥盒，其中所述人乳鐵蛋白的含量為約20mg。
21.權(quán)利要求16的藥盒，其中所述HCV感染是慢性HCV感染。
22.權(quán)利要求18的藥盒，其中所述HCV是基因型lbHCV。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)，特別涉及肝臟病學(xué)和病毒學(xué)，并可以用于治療患有病毒性丙型肝炎(包括其慢性形式)的患者，甚至直到使其完全康復(fù)。所述發(fā)明提供用于治療病毒性丙型肝炎，呈單體乳鐵蛋白脫輔基蛋白形式的藥劑。本發(fā)明也涉及用于治療病毒性丙型肝炎的藥物組合物，其包含有效量的單體乳鐵蛋白脫輔基蛋白和藥用可接受的載體、填充劑或賦形劑。本發(fā)明也涉及用于治療病毒性丙型肝炎的方法(包括給予所述單體乳鐵蛋白脫輔基蛋白)，并且涉及將所述單體乳鐵蛋白脫輔基蛋白用于制備用于治療病毒性丙型肝炎的藥劑。本發(fā)明方法可以在2-3周治療期間內(nèi)完全預(yù)防病毒血癥，預(yù)防感染病毒性丙型肝炎的肝細(xì)胞被破壞從而預(yù)防附加的病毒散發(fā)至血系統(tǒng)，并且使程序性細(xì)胞死亡病毒感染的肝細(xì)胞不存在，由此預(yù)防肝功能病、硬化和主要疾病發(fā)展的末期階段的腫瘤學(xué)肝感染的發(fā)展。
文檔編號(hào)A61K38/40GK101848727SQ200880114714
公開(kāi)日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2008年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月5日
發(fā)明者尼古拉·葉夫根尼耶維奇·沙圖諾夫斯基 申請(qǐng)人:尼古拉·葉夫根尼耶維奇·沙圖諾夫斯基