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包含肺炎鏈球菌莢膜多糖綴合物的疫苗的制作方法

文檔序號(hào):1144767閱讀:736來(lái)源:國(guó)知局

專利名稱::包含肺炎鏈球菌莢膜多糖綴合物的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明涉及改良的肺炎鏈球菌疫苗。
背景技術(shù)
:2歲以下的兒童不能形成對(duì)大多數(shù)多糖疫苗的免疫應(yīng)答,因此需要通過(guò)與蛋白載體化學(xué)綴合使多糖具有免疫原性。將多糖(T非依賴性抗原)與蛋白(T依賴性抗原)偶聯(lián),使該多糖具有包括同種型轉(zhuǎn)換、親和成熟和記憶誘導(dǎo)的T依賴性特性。然而,在重復(fù)施用多糖_蛋白綴合物或多糖_蛋白綴合物的組合以形成多價(jià)疫苗時(shí)可能存在問題。例如,已報(bào)道了使用破傷風(fēng)類毒素(TT)作為蛋白載體的流感嗜血桿菌b型多糖(PRP)疫苗在劑量范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)試,其根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)嬰兒方案同時(shí)以(游離)TT和肺炎球菌多糖-TT綴合物疫苗進(jìn)行免疫。隨著肺炎球菌疫苗的劑量上升,對(duì)Hib綴合物疫苗的PRP多糖部分的免疫應(yīng)答下降,提示多糖的免疫干擾,這可能是由于相同載體蛋白的使用(Dagan等人,Infectl匪n.(1998);巡2093-2098)。載體蛋白劑量對(duì)于針對(duì)蛋白本身的體液應(yīng)答的效應(yīng)也被證明具有多面性。據(jù)報(bào)道,在人類嬰兒體內(nèi)四價(jià)破傷風(fēng)類毒素綴合物劑量的上升導(dǎo)致對(duì)破傷風(fēng)載體的應(yīng)答的下降(Dagan等人,見上文)。對(duì)組合疫苗這些效應(yīng)的經(jīng)典分析已被描述為載體誘導(dǎo)的表位抑制,這尚未被完全理解,但被認(rèn)為是載體蛋白的過(guò)量所導(dǎo)致(Fattom,VaccineU:126(1999))。這表現(xiàn)為導(dǎo)致針對(duì)載體蛋白的B-細(xì)胞和針對(duì)多糖的B-細(xì)胞對(duì)Th-細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)。如果針對(duì)載體蛋白的B-細(xì)胞占優(yōu),則沒有足夠的Th-細(xì)胞可對(duì)特異性針對(duì)多糖的B-細(xì)胞提供必要的幫助。然而,觀察到的免疫效應(yīng)并不一致,在某些情況下載體蛋白的總量提高了免疫應(yīng)答,在其它情況下則減少了免疫應(yīng)答。因此,將多個(gè)多糖綴合物組合為單個(gè)、有效的疫苗制劑存在著技術(shù)難題。肺炎鏈球菌是一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,其造成了相當(dāng)大的致病率和死亡率(特別是在青年和老年人中),引起了侵襲性疾病如肺炎、菌血癥和腦膜炎,以及與移生有關(guān)的疾病,如急性中耳炎。據(jù)估計(jì)在美國(guó)60歲以上人群中肺炎球菌肺炎的發(fā)病率為每100,000人中3至8人。在20%的情況下其導(dǎo)致了菌血癥,以及其它表現(xiàn)如腦膜炎,即使接受抗菌治療,其死亡率仍然接近30%。肺炎球菌被化學(xué)連接的多糖包封,該多糖帶來(lái)了血清型特異性。肺炎球菌具有90種已知的血清型,而莢膜是肺炎球菌主要的毒性決定因子,因?yàn)榍v膜不僅針對(duì)補(bǔ)體保護(hù)該細(xì)菌的內(nèi)部表面,其本身免疫原性也較差。多糖是T-非依賴性抗原,且不能在MHC分子上加工或呈現(xiàn)以與T-細(xì)胞相互作用。然而,它們可以通過(guò)替代性的機(jī)制剌激免疫系統(tǒng),該機(jī)制包括B細(xì)胞上表面受體的交聯(lián)。在多個(gè)實(shí)驗(yàn)中顯示,針對(duì)侵襲性肺炎雙球菌疾病的保護(hù)很大程度上與特異性針對(duì)該莢膜的抗體相關(guān),所述保護(hù)具有血清型特異性。肺炎鏈球菌是嬰兒和幼兒的侵襲性細(xì)菌性疾病和中耳炎最常見的誘因。同樣地,老年人對(duì)肺炎球菌疫苗具有較差的應(yīng)答[Roghmann等人,(1987),J.Gerontol.42:9265-270],因此增加了在該人群中細(xì)菌性肺炎的發(fā)病率[Verghese和Berk,(1983)Medicine(Baltimore)62:271-285]。因此,本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于開發(fā)一種改良的多重血清型肺炎鏈球菌多糖綴合物疫苗的制劑。附圖簡(jiǎn)述圖1在老年恒河猴中的綴合物免疫原性(II期后的抗-PSIgG水平)柱形圖顯示了在老年恒河猴中11價(jià)綴合物的免疫原性。淺色條棒表示用在磷酸鋁佐劑中的11價(jià)綴合物兩次接種后的GMC。深色條棒表示用在佐劑C中的11價(jià)綴合物兩次接種后的GMC。圖2在老年恒河猴中的綴合物免疫原性(II期后抗-PS3記憶B細(xì)胞頻率)柱形圖顯示了在用佐劑C或磷酸鋁佐劑中的11價(jià)綴合物接種后針對(duì)PS3的記憶B細(xì)胞。圖3在Balb/c小鼠中PS19F的免疫原性(III期后IgG水平)柱形圖顯示了4價(jià)純多糖和4價(jià)dPly綴合物在Balb/C小鼠中的抗多糖19F免疫原性。圖4在Balb/c小鼠中PS22F的免疫原性(III期后IgG水平)柱形圖顯示了4價(jià)純多糖和4價(jià)PhtD綴合物在Balb/C小鼠中的抗多糖22F免疫原性。圖5血清抗-PSIgG抗體水平柱形圖顯示了在Balb/c小鼠中的抗-22FIgG應(yīng)答。圖6在Balb/c小鼠中的抗_22F調(diào)理-吞噬效價(jià)柱形圖顯示了在Balb/c小鼠中的抗_22F調(diào)理-吞噬效價(jià)。圖7在幼年C57BI小鼠III期后以新型佐劑或A1P04免疫誘導(dǎo)的IgG應(yīng)答的比較柱形圖比較了在幼年C57B1小鼠中以與不同佐劑制成的13價(jià)綴合物疫苗免疫后的IgG應(yīng)答。所述柱與右側(cè)欄所示的順序相同。圖8PhtD和dPly蛋白組合在恒河猴中針對(duì)19F型肺部移生的保護(hù)效力柱形圖顯示不同疫苗組合在猴肺炎模型中的保護(hù)效力。"死亡"組包括將死亡但施用了抗生素處理的猴。圖9血清抗-PhtDIgG應(yīng)答柱形圖顯示在Balb/c小鼠中以22F_PhtD或22F_AH_PhtD綴合物免疫后的抗PhtDIgG應(yīng)答。圖10在小鼠中針對(duì)4型肺炎球菌攻擊的保護(hù)在小鼠中以22F-PhtD或22F-AH-PhtD免疫后針對(duì)4型肺炎球菌攻擊的保護(hù)。圖11在以PhtD免疫和以針對(duì)血清型3多糖的抗體被動(dòng)免疫后針對(duì)肺炎鏈球菌菌株3/43的致命攻擊的保護(hù)。圖12在以PhtD免疫和以針對(duì)血清型1多糖的抗體被動(dòng)免疫后針對(duì)肺炎鏈球菌菌株l/57的致命攻擊的保護(hù)。圖13在以多價(jià)綴合物疫苗免疫的老年C57黑色小鼠中針對(duì)血清型19A的調(diào)理吞噬效價(jià)。圖14在以多價(jià)綴合物疫苗免疫的老年C57黑色小鼠中針對(duì)血清型22F的調(diào)理吞噬效價(jià)。圖15在以多價(jià)綴合物疫苗免疫的Balb/c小鼠中針對(duì)血清型19A的調(diào)理吞噬效價(jià)。柱2_llV+19A_dPlygmbs+22F_PhtD0.1iig/50ii1;柱4_llV+19A_dPlygmbs+22F-PhtD-E0.1iig/50ii1;柱62-11V+19A-DT+22F-PD0.1iig/50ii1圖16在以多價(jià)綴合物疫苗免疫的Balb/c小鼠中針對(duì)血清型22F的調(diào)理吞噬效價(jià)。圖17在以多價(jià)綴合物疫苗免疫的豚鼠中針對(duì)血清型19A的調(diào)理吞噬效價(jià)。圖18在以多價(jià)綴合物疫苗免疫的豚鼠中針對(duì)血清型22F的調(diào)理吞噬效價(jià)。圖19在以多價(jià)綴合物疫苗免疫的Balb/c小鼠中針對(duì)血清型19A的調(diào)理吞噬效價(jià)。圖20在以多價(jià)綴合物疫苗免疫的Balb/c小鼠中針對(duì)血清型22F的調(diào)理吞噬效價(jià)。圖21在以多價(jià)綴合物疫苗免疫的0F1小鼠中針對(duì)血清型19A的調(diào)理吞噬效價(jià)。圖22在以多價(jià)綴合物疫苗免疫的0F1小鼠中針對(duì)血清型22F的調(diào)理吞噬效價(jià)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了包含來(lái)自血清型19A和19F的肺炎鏈球菌莢膜糖綴合物的免疫原性組合物,其中19A與作為第一細(xì)菌類毒素的載體蛋白綴合,19F與作為第二細(xì)菌類毒素的載體蛋白綴合,且該肺炎鏈球菌莢膜糖中的2-8種與蛋白D綴合。術(shù)語(yǔ)莢膜糖包括莢膜多糖和由莢膜多糖衍生的寡糖。寡糖包含至少4個(gè)糖殘基。術(shù)語(yǔ)綴合物和綴合的涉及與載體蛋白共價(jià)結(jié)合的莢膜糖。針對(duì)本發(fā)明的目的,"免疫人類宿主抗C0PD的惡化"或"治療或預(yù)防COPD的惡化"或"減少COPD的惡化的嚴(yán)重性"指降低COPD的惡化的發(fā)生率或比例(例如減少0.1、0.5、1、2、5、10、20%或更多的比例),例如在以本發(fā)明的組合物或疫苗免疫的患者組中。術(shù)語(yǔ)細(xì)菌類毒素包括通過(guò)遺傳突變、通過(guò)化學(xué)處理或通過(guò)綴合失活的細(xì)菌毒素。合適的細(xì)菌類毒素包括破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、百日咳類毒素、細(xì)菌溶細(xì)胞素或肺炎球菌溶血素。肺炎球菌溶血素(Ply)的突變已被描述減弱了肺炎球菌溶血素的毒性(W090/06951,WO99/03884)。類似地,已知降低毒性的白喉毒素遺傳突變(參見下文)。白喉毒素的遺傳解毒類似物包括CRM197和在US4,709,017、US5,843,711、US5,601,827和US5,917,017中描述的其它突變體。CRM197是白喉毒素的非毒性形式,但與白喉毒素在免疫學(xué)上無(wú)法區(qū)分。CRM197可由通過(guò)產(chǎn)毒素的棒狀桿菌噬菌體b的亞硝基胍突變生成的無(wú)產(chǎn)毒相P197tox感染的白喉?xiàng)U菌生成(Uchida等人.NatureNewBiology(1971)233;8-11)。CRM197蛋白與白喉毒素具有相同的分子量,但因在結(jié)構(gòu)基因中具有單個(gè)堿基變化而與之不同。這導(dǎo)致在52號(hào)位上由甘氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝滨0返淖兓?,使得片段A不能結(jié)合膽,從而不具毒性(Pappenheimer1977,AnnRev,Biochem.46;69_94,RappuoliAppliedandEnvironmentalMicrobiologySept1983p560_564)。第一和第二細(xì)菌類毒素可相同或不同。當(dāng)?shù)谝缓偷诙?xì)菌類毒素不同時(shí),意味著它們具有不同的氨基酸序列。11例如,19A和19F可被分別綴合至破傷風(fēng)類毒素和破傷風(fēng)類毒素;白喉類毒素和白喉類毒素;Crml97和CRM197、肺炎球菌溶血素和肺炎球菌溶血素、破傷風(fēng)類毒素和白喉類毒素;破傷風(fēng)類毒素和CRM197;破傷風(fēng)類毒素和肺炎球菌溶血素;白喉類毒素和破傷風(fēng)類毒素;白喉類毒素和CRM197、白喉類毒素和肺炎球菌溶血素;CRM197和破傷風(fēng)類毒素、CRM197和白喉類毒素;CRM197和肺炎球菌溶血素;肺炎球菌溶血素和破傷風(fēng)類毒素;肺炎球菌溶血素和白喉類毒素;或肺炎球菌溶血素和CRM197。本發(fā)明的免疫原性組合物包含2-8、2-7、2-6、2-5、3-5、4-5、2-4、2-3、3-4或2、3、4、5、6、7或8種莢膜糖綴合物,其中蛋白D為載體蛋白。例如,來(lái)自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F或23F的糖被綴合至蛋白D。例如,選自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F的2-8、2-7、2-6、2-5、3-5、4-5、2-4、2-3、3-4或2、3、4、5、6、7或8種糖被綴合至蛋白D。在一個(gè)實(shí)施方式中,來(lái)自至少血清型1和3、1和4、1和5、1和6A、1和6B、1和7、1禾口9V、1禾口14、1禾口22F、1禾口23F、3禾口4、3禾口5、3禾口6A、3禾口6B、3禾口7F、3禾口9V、3禾口14、3和22F、3和23F、4和5、4和6A、4和6B、4和7F、4和9V、4和14、4和22F、4和23F、5和6A、5禾口6B、5禾口7F、5禾口9V、5禾口14、5禾口22F、5禾口23F、6A禾口6B、6A禾口7F、6A禾口9V、6A禾口14、6A禾口22F、6A禾口23F、6B禾口7F、6B禾口9V、6B禾口14、6B禾口22F、6B禾口23F、7F禾口9V、7F禾口14、7F禾口22F、7F和23F、9V和14、9V和22F、9V和23F、14和22F、14和23F或者22F和23F的糖被綴合至蛋白D。在一個(gè)實(shí)施方式中,來(lái)自至少血清型1、3和4;1、3和5;1、3和6A;1、3和6B;1、3禾口7F;1、3禾口9V;1、3禾口14;3、4禾口7F;3、4禾口5;3、4禾口7F;3、4禾口9V;3、4禾口14;4、5禾口7F;4、5禾P9V;4、5禾P14;5、7F禾P9V;5、7F禾P14;7F、9V禾P14;1、3、4禾P5;3、4、5禾P7F;4、5、7F和9V;4、5、7F和14;4、5、9V和14;4、7F、9V和14;5、7F、9V和14;或者4、5、7F、9V和14的糖被綴合至蛋白D。在一個(gè)實(shí)施方式中,在本發(fā)明的免疫原性組合物中存在的莢膜糖綴合物中的一半或少于一半或少數(shù)包含作為載體蛋白的蛋白D。例如,在10價(jià)肺炎鏈球菌疫苗中,來(lái)自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4或5種與蛋白D綴合。例如,在ll價(jià)肺炎鏈球菌疫苗中,來(lái)自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4或5種與蛋白D綴合。例如,在12價(jià)肺炎鏈球菌疫苗中,來(lái)自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4、5或6種與蛋白D綴合。例如,在13價(jià)肺炎鏈球菌疫苗中,來(lái)自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4、5或6種與蛋白D綴合。例如,在14價(jià)肺炎鏈球菌疫苗中,來(lái)自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4、5、6或7種與蛋白D綴合。例如,在15價(jià)肺炎鏈球菌疫苗中,來(lái)自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4、5、6或7種與蛋白D綴合。例如,在16價(jià)肺炎鏈球菌疫苗中,來(lái)自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4、5、6、7或8種與蛋白D綴合。例如,在17價(jià)肺炎鏈球菌疫苗中,來(lái)自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4、5、6、7或8種與蛋白D綴合。例如,在18價(jià)肺炎鏈球菌疫苗中,來(lái)自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4、5、6、7、8或9種與蛋白D綴合。例如,在19價(jià)肺炎鏈球菌疫苗中,來(lái)自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4、5、6、7、8或9種與蛋白D綴合??蛇x地,與蛋白D綴合的血清型選自上述的組。在一個(gè)實(shí)施方式中,除了19A和19F的肺炎鏈球菌糖綴合物外,該免疫原性組合物進(jìn)一步包含肺炎鏈球菌莢膜糖4、6B、9V、14、18C和23F的綴合物。在一個(gè)實(shí)施方式中,除了19A和19F的肺炎鏈球菌糖綴合物外,該免疫原性組合物12進(jìn)一步包括肺炎鏈球菌莢膜糖1、4、5、6B、7F、9V、14、18C和23F的綴合物。在一個(gè)實(shí)施方式中,除了19A和19F的肺炎鏈球菌糖綴合物外,該免疫原性組合物進(jìn)一步包括肺炎鏈球菌莢膜糖1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、22F和23F的綴合物。在一個(gè)實(shí)施方式中,除了19A和19F的肺炎鏈球菌糖綴合物外,該免疫原性組合物進(jìn)一步包括肺炎鏈球菌莢膜糖1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、22F和23F的綴合物。在一個(gè)實(shí)施方式中,除了19A和19F的肺炎鏈球菌糖綴合物外,該免疫原性組合物進(jìn)一步包括肺炎鏈球菌莢膜糖1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、22F和23F的綴合物。本發(fā)明的肺炎鏈球菌疫苗通常將包含莢膜糖抗原(可選地綴合),其中所述糖來(lái)自至少十種肺炎鏈球菌血清型。肺炎鏈球菌莢膜糖的數(shù)量范圍可從10種不同血清型(或"v",價(jià))至23種不同血清型(23v)。在一個(gè)實(shí)施方式中,具有10、11U2、13、14或15種不同血清型。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中,該疫苗可包含綴合的肺炎鏈球菌糖和未綴合的肺炎鏈球菌糖。任選地,糖血清型的總數(shù)少于或等于23。例如,本發(fā)明可包含IO種綴合血清型和13種未綴合糖。該疫苗可以類似的方式包含11、12、13、14或16種綴合糖和分別12、11、10、9或7種未綴合糖。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的多價(jià)肺炎球菌疫苗將選自如下血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F,盡管可以理解,根據(jù)接受該疫苗的接受者的年齡以及該疫苗將施用的地理位置,一種或兩種其它血清型可被取代。例如,10價(jià)疫苗可包含來(lái)自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的多糖。11價(jià)疫苗還可包含來(lái)自血清型3或19A的糖。12或13價(jià)兒童(嬰兒)疫苗還可包括添加了血清型6A和19A,或者6A禾口22F,或者19A和22F,或者6A和15,或者19A和15,或者22F和15的11價(jià)制劑(包含來(lái)自血清型3的糖),而13價(jià)老年疫苗可包括添加了血清型19A和22F、8和12F,或者8和15,或者8和19A,或者8和22F,或者12F和15,或者12F和19A,或者12F和22F,或者15和19A,或者15和22F的10或11價(jià)制劑。14價(jià)兒童疫苗可包括添加了血清型3、6A、19A和22F;血清型6A、8、19A和22F;血清型6A、12F、19A和22F;血清型6A、15、19A和22F;血清型3、8、19A和22F;血清型3、12F、19A和22F;血清型3、15、19A和22F;血清型3、6A、8和22F;血清型3、6A、12F和22F;或者血清型3、6A、15和22F的上述IO價(jià)制劑。在一個(gè)實(shí)施方式中該組合物包含來(lái)自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F(任選地綴合)的莢膜糖。在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式中包括至少ll種糖抗原(任選地綴合),例如,來(lái)自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的莢膜糖。在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式中包括至少12或13種糖抗原,例如,疫苗可包含來(lái)自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的莢膜糖或者來(lái)自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F的莢膜糖,盡管本發(fā)明還可預(yù)期其它的糖抗原,例如23價(jià)(例如血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)。本發(fā)明的免疫原性組合物包含來(lái)自流感嗜血桿菌的蛋白D(PD)(參見EP0594610圖9)。流感嗜血桿菌是中耳炎的關(guān)鍵引發(fā)微生物,本發(fā)明人已顯示在肺炎鏈球菌疫苗中包含該蛋白將提供針對(duì)與中耳炎相關(guān)的流感嗜血桿菌的保護(hù)水平(Pyrmula等人Lancet367;740-748(2006))。一方面,PD作為一種或多種糖的載體蛋白存在。在另一方面,蛋白D可作為游離蛋白存在于疫苗組合物中。在進(jìn)一步方面,蛋白D同時(shí)作為載體蛋白和作為游13離蛋白存在。蛋白D可以全長(zhǎng)蛋白或片段使用(W00056360)。在其它方面,蛋白D作為多數(shù)糖的載體蛋白存在,例如糖中的6、7、8、9或更多種可與蛋白D綴合。在該方面,蛋白D還可作為游離蛋白存在。本發(fā)明的疫苗將包含兩種或兩種以上不同類型的載體蛋白。每種類型的載體蛋白可作為一種以上糖的載體,該糖可以相同或不同。例如,血清型3和4可被綴合至相同的載體蛋白,綴合至載體蛋白的相同分子或相同載體蛋白的不同分子。在一個(gè)實(shí)施方式中,兩種或兩種以上不同的糖可被綴合至相同的載體蛋白,綴合至載體蛋白的相同分子或相同載體蛋白的不同分子。在本發(fā)明的免疫原性組合物中存在的除了19A和19F以外的任意肺炎鏈球菌莢膜糖可被綴合至載體蛋白,所述載體蛋白獨(dú)立選自TT、DT、CRM197、TT的片段C、PhtD、PhtBE或PhtDE融合體(特別是W001/98334和W003/54007中描述的那些)、解毒肺炎鏈球菌溶血素和蛋白D。下文顯示了可用于本發(fā)明綴合物的蛋白載體的更完整清單。綴合至本發(fā)明的免疫原性組合物中存在的綴合物中的一種或多種肺炎鏈球菌莢膜糖的載體蛋白任選地是聚組氨酸三聯(lián)體家族(Pht)蛋白成員,其片段或融合蛋白。PhtA、PhtB、PhtD或PhtE蛋白可與W000/37105或W000/39299中披露的序列(例如,與W000/37105中PhtD的SEQIDNO:4的氨基酸序列1-838或21-838)具有80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%—致性。例如,融合蛋白由全長(zhǎng)PhtA、PhtB、PhtD、PhtE或其2、3或4個(gè)片段組成。融合蛋白的范例為PhtA/B、PhtA/D、PhtA/E、PhtB/A、PhtB/D、PhtB/E、PhtD/A、PhtD/B、PhtD/E、PhtE/A、PhtE/B和PhtE/D,其中該蛋白與首先提及的蛋白在N末端連接(例如參見W001/98334)。在使用Pht蛋白片段時(shí)(單獨(dú)或作為融合蛋白的部分),每個(gè)片段可選地包含該種多肽的一個(gè)或多個(gè)組氨酸三聯(lián)體基序和/或巻曲螺旋區(qū)。組氨酸三聯(lián)體基序是多肽的部分,其具有序列HxxHxH,其中H為組氨酸,x為非組氨酸的氨基酸。巻曲螺旋區(qū)是通過(guò)"巻曲"算法預(yù)測(cè)的區(qū)域Lupus,A等人(1991)Science252;1162-1164。在一個(gè)實(shí)施方式中,該片段或每個(gè)片段包含一個(gè)或多個(gè)組氨酸三聯(lián)體基序和至少一個(gè)巻曲螺旋區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方式中,該片段或每個(gè)片段包含恰好或至少2、3、4或5個(gè)組氨酸三聯(lián)體基序(任選地,具有介于2或2個(gè)以上三聯(lián)體的天然Pht序列,或者與天然肺炎球菌內(nèi)三聯(lián)體Pht序列具有超過(guò)50、60、70、80、90或100%—致性的內(nèi)三聯(lián)體序列-例如,W000/37105中PhtD的SEQIDNO:4中所示的內(nèi)三聯(lián)體序列)。在一個(gè)實(shí)施方式中,該片段或每個(gè)片段包含恰好或至少2、3或4個(gè)巻曲螺旋區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方式中,此處披露的Pht蛋白包含連接信號(hào)序列的全長(zhǎng)蛋白,去除信號(hào)肽(例如在N末端的20個(gè)氨基酸)的成熟全長(zhǎng)蛋白,Pht蛋白的天然存在變體以及Pht蛋白的免疫原性片段(例如,如上所述的片段或者包含來(lái)自W000/37105(SEQIDNOs4,6,8或10)或WOOO/39299(SEQIDNOs2,4,6,8,10或14)的氨基酸序列的至少15或20個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽,其中所述多肽能夠引發(fā)特異性針對(duì)W000/37105或WOOO/39299所述氨基酸序列的免疫應(yīng)答)。具體而言,此處所用的"PhtD"包含連接信號(hào)序列的全長(zhǎng)蛋白,去除信號(hào)肽(例如在N末端的20個(gè)氨基酸)的成熟全長(zhǎng)蛋白,PhtD的天然存在變體以及PhtD的免疫原性片段(例如,如上所述的片段或者包含來(lái)自W000/37105或WOOO/39299的PhtD氨基酸序列的至少15或20個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽,其中所述多肽能夠引發(fā)特異性針對(duì)W000/37105或WOOO/39299所述PhtD氨基酸序列(例如,針對(duì)PhtD的WO00/37105的SEQIDNO:4或WO00/39299的SEQIDNO:14)的免疫應(yīng)答)。上述PhtD的所有形式均可用于本發(fā)明。如果該組合物中蛋白載體有2種或2種以上的糖相同,該糖可被綴合至該蛋白載體的相同分子(載體分子具有另外2種與之綴合的不同的糖)[例如參見W004/083251]。替代性地,該糖可各自獨(dú)立地綴合至該蛋白載體的不同分子(每個(gè)蛋白載體分子僅具有一種類型的糖與之綴合)??捎糜诒景l(fā)明的載體蛋白的范例為DT(白喉類毒素),TT(破傷風(fēng)類毒素)或TT的片段C,DTCRM197(—種DT突變體),其它DT點(diǎn)突變體如CRM176、CRM228、CRM45(Uchida等人J.Biol.Chem.218;3838-3844,1973);CRM9、CRM45、CRM102、CRM103和CRM107以及Nicholls禾口Youle在GeneticallyEngineeredToxins,Ed:Frankel,MaecelDekkerInc,1992中所述的其它突變體;Glu-148缺失或突變?yōu)锳sp、Gin或Ser和/或Ala158刪除或突變?yōu)镚ly以及US4709017或US4950740中披露的其它突變;在至少一個(gè)或多個(gè)殘基Lys516、Lys526、Phe530和/或Lys534的突變以及US5917017或US6455673中披露的其它突變;或者US5843711中披露的片段,肺炎球菌肺炎球菌溶血素(Kuo等人(1995)InfectImmun63;2706-13),其包括以某些方式解毒的ply例如dPLY-GMBS(WO04081515,PCT/EP2005/010258)或dPLY-formol,PhtX,其包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE以及Pht蛋白融合體如PhtDE融合體、PhtBE融合體(WO01/98334和WO03/54007),(PhtA_E在下文更加具體描述),OMPC(腦膜炎球菌外膜蛋白_通常由腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B提取-EP0372501),PorB(來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌)、PD(流感嗜血桿菌蛋白D_參見,例如EP0594610B),或其免疫學(xué)功能等同物,合成肽(EP0378881,EP0427347),熱休克蛋白(WO93/17712,WO94/03208),百日咳蛋白(WO98/58668,EP0471177),細(xì)胞因子,淋巴因子,生長(zhǎng)因子或激素(WO91/01146),包含多個(gè)來(lái)自不同病原體衍生抗原的人CD4+T細(xì)胞表位的人工蛋白(Falugi等人(2001)EurJImmunol31;3816-3824),例如N19蛋白(Baraldoi等人(2004)InfectImmun72;4884-7)肺炎球菌表面蛋白PspA(WO02/091998),鐵攝取蛋白(WO01/72337),艱難梭菌的毒素A或B(WO00/61761)。Nurkka等人PediatricInfectiousDiseaseJournal.23(11):1008—14,2004Nov描述了所有血清型綴合至PD的11價(jià)肺炎球菌疫苗。然而本發(fā)明人顯示與綴合至PD的19F相比,具有與DT綴合的19F綴合物誘導(dǎo)的抗體的調(diào)理吞噬活性更高。此外,本發(fā)明人顯示與DT綴合的19F具有對(duì)19A更大的交叉反應(yīng)。因此,本發(fā)明的組合物的一個(gè)特征是血清型19F被綴合至細(xì)菌類毒素,例如,TT、肺炎球菌溶血素、DT或CRM197。一方面,血清型19F被綴合至DT。本發(fā)明的另一特征是血清型19A被綴合至細(xì)菌類毒素,例如,TT、肺炎球菌溶血素、DT或CRM197。該免疫原性組合物剩余的糖血清型可全部綴合至一種或多種非DT載體蛋白(即,僅19F綴合至DT),或者可部分綴合至非DT載體蛋白,部分DT綴合至DT。在一個(gè)實(shí)施方式中,19F綴合至DT或CRM197,剩余的血清型分別綴合至PD,以及TT或DT或CRM197。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,19F綴合至DT或CRM197,且不超過(guò)一種糖綴合至TT。在該實(shí)施方式的一個(gè)方面,所述的一種糖為18C或12F。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,19F綴合至DT或CRM197,且不超過(guò)兩種糖綴合至TT。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,19F綴合至DT或CRM197,剩余的血清型分別綴合至PD,TT和DT或CRM197。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,19F綴合至DT或CRM197,剩余的血清型分別綴合至PD,TT和肺炎球菌溶血素。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,19F15綴合至DT或CRM197,剩余的血清型分別綴合至PD,TT和CRM197。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,19F綴合至DT或CRM197,剩余的血清型分別綴合至PD,TT,肺炎球菌溶血素和任選地PhtD或PhtD/E融合蛋白。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,19F綴合至DT或CRM197,19A綴合至肺炎球菌溶血素或TT,剩余的血清型分別綴合至PD,TT,肺炎球菌溶血素和任選地PhtD或PhtD/E融合蛋白。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,19F綴合至DT或CRM197,19A綴合至肺炎球菌溶血素或TT,一種其它的糖綴合至TT,一種其它的糖綴合至PhtD或PhtD/E,且所有其它的糖綴合至PD。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,19F綴合至DT或CRM197,19A綴合至肺炎球菌溶血素,一種其它的糖綴合至TT,一種其它的糖綴合至肺炎球菌溶血素,2種其它的糖綴合至PhtD或PhtD/E,且所有其它的糖綴合至PD。在整個(gè)說(shuō)明書中術(shù)語(yǔ)"糖"可指多糖或寡糖,并同時(shí)包括兩者。多糖可從細(xì)菌分離并可通過(guò)已知的方法(例如參見EP497524和EP497525)和可選地通過(guò)微射流(microfluidisation)進(jìn)行一定程度的大小處理??蓪?duì)多糖進(jìn)行大小處理(sized)以減少多糖樣本的粘度和/或提高綴合產(chǎn)物的可濾過(guò)性。寡糖具有少量的重復(fù)單元(通常5-30重復(fù)單元),并通常為水解的多糖。肺炎鏈球菌的莢膜多糖包含重復(fù)的寡糖單元,該寡糖單元可包含多達(dá)8個(gè)糖殘基。關(guān)鍵肺炎鏈球菌血清型的寡糖單元可參見綜述JONES,Christopher.Vaccinesbasedonthecellsurfacecarbohydratesofpathogenicbacteria.An.Acad.Bras.Ci紐c.,2005年6月,第77巻,第2期,第293-324頁(yè).表IIISSN0001-3765。在一個(gè)實(shí)施方式中,莢膜糖抗原可以是全長(zhǎng)多糖,然而在其它實(shí)施方式中,它可以是一個(gè)寡糖單元或短于天然長(zhǎng)度的重復(fù)寡糖單元的糖鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中,在疫苗中存在的所有糖都是多糖。全長(zhǎng)多糖可被"大小處理(sized)",即,它們的大小可通過(guò)各種方法減小,所述方法例如酸水解處理、過(guò)氧化氫處理、通過(guò)emulsiflex⑧大小處理后以過(guò)氧化氫處理以生成寡糖片段或者微射流。本發(fā)明人還注意到本領(lǐng)域曾關(guān)注采用寡糖以便于綴合物生成。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)通過(guò)采用天然或略微進(jìn)行大小處理的多糖綴合物,可實(shí)現(xiàn)以下一種或多種優(yōu)點(diǎn)1)具有高免疫原性的可濾過(guò)綴合物,2)可改變多糖與蛋白在綴合物中的比例,使得在綴合物中多糖與蛋白的比例(w/V)增加(這可對(duì)載體抑制作用具有影響),3)可通過(guò)使用更大的糖進(jìn)行綴合來(lái)穩(wěn)定易于水解的免疫原性綴合物。更大的多糖的使用可導(dǎo)致與綴合物載體的更多交聯(lián),并可減少游離糖從綴合物的釋放。在現(xiàn)有技術(shù)中描述的綴合物疫苗傾向于在綴合前將多糖解聚以改善綴合。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)保留更大大小的糖的糖綴合物疫苗可提供針對(duì)肺炎球菌疾病的良好免疫應(yīng)答。本發(fā)明的免疫原性組合物因而可包含一種或多種糖綴合物,其中在綴合前每種糖的平均大小(重均分子量;Mw)在80kDa、100kDa、200kDa、300kDa、400kDa、500kDa或1000kDa以上。在一個(gè)實(shí)施方式中,該綴合后的綴合物應(yīng)當(dāng)易于通過(guò)0.2微米過(guò)濾器,從而與過(guò)濾前樣本相比,在過(guò)濾后可得到50、60、70、80、90或95%以上的產(chǎn)率。為了本發(fā)明的目的,"天然多糖"指未經(jīng)過(guò)加工的糖,該加工過(guò)程在于減小該糖的大小。在常規(guī)純化步驟中多糖可能會(huì)被略微減小。這種糖仍然是天然的。僅當(dāng)多糖采用了大小處理技術(shù)后,該多糖會(huì)被認(rèn)為不是天然的。天然多糖的大小例如介于250kDa-2,000kDa、400-1,500kDa、750kDa-l,250kDa、300kDa-600kDa、500-1,000kDa或1,000-1,500kDa,如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解,不同的血清型具有不同大小的天然多糖。針對(duì)本發(fā)明的目的,"以最大x2的因子進(jìn)行大小處理"表示該糖通過(guò)加工意圖減小糖的大小,但保留天然多糖一半以上的大小。x3、x4等可以相同方式解釋,S卩,該糖通過(guò)加工減小多糖的大小,但保留天然多糖三分之一、四分之一等以上的大小。在本發(fā)明的一個(gè)方面,該免疫原性組合物包含與載體蛋白綴合的來(lái)自至少10種血清型的肺炎鏈球菌糖,其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或每一種肺炎鏈球菌糖是天然多糖。在本發(fā)明的一個(gè)方面,該免疫原性組合物包含與載體蛋白綴合的來(lái)自至少10種血清型的肺炎鏈球菌糖,其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或每一種肺炎鏈球菌糖以最多x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或x10的因子進(jìn)行大小處理。在該方面的一個(gè)實(shí)施方式中,大部分糖(例如,6、7、8或更多種糖)以多達(dá)x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或x10的因子進(jìn)行大小處理。本文的糖的分子量或平均分子量指在綴合前通過(guò)MALLS測(cè)量的糖的重均分子量(Mw)。MALLS技術(shù)已為本領(lǐng)域公知,并通常可按實(shí)施例2所述進(jìn)行。為對(duì)肺炎球菌糖進(jìn)行MALLS分析,可聯(lián)合使用兩根柱(TSKG6000和5000PWxl)并在水中洗脫糖。糖可采用光散射檢測(cè)器(例如配置10mW氬激光器的WyattDawnDSP以488nm)和干涉折射儀(例如裝備P100池和紅色濾光器的Wyatt0tilabDSP以498nm)進(jìn)行檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方式中,該肺炎鏈球菌糖為天然的多糖或在常規(guī)提取過(guò)程中大小減小的天然多糖。在一個(gè)實(shí)施方式中,該肺炎鏈球菌糖通過(guò)機(jī)械切割進(jìn)行大小處理,例如可通過(guò)微射流或超聲。微射流和超聲具有能夠減小更大的天然多糖的大小,從而足以提供可濾過(guò)綴合物的優(yōu)勢(shì)。大小處理的因子不超過(guò)x20、x10、x8、x6、x5、x4、x3或x2。在一個(gè)實(shí)施方式中,該免疫原性組合物包含肺炎鏈球菌綴合物,其由通過(guò)以不超過(guò)x20的因子進(jìn)行大小處理的天然多糖和糖的混合物制成。在該實(shí)施方式的一個(gè)方面,大部分糖(例如,6、7、8或更多種糖)以多達(dá)x2、x3、x4、x5或x6的因子進(jìn)行大小處理。在一個(gè)實(shí)施方式中,該肺炎鏈球菌糖通過(guò)接頭(例如,雙功能接頭)綴合至載體蛋白。該接頭可選地為異雙功能或同雙功能的,其具有例如一個(gè)反應(yīng)性氨基基團(tuán)和一個(gè)反應(yīng)性羧酸基團(tuán),2個(gè)反應(yīng)性氨基基團(tuán)或兩個(gè)反應(yīng)性羧酸基團(tuán)。該接頭具有例如介于4和20、4和12、5和10個(gè)碳原子。一種可能的接頭是ADH。其它的接頭包括B-丙酰胺基(WO00/10599)、硝基苯基-乙胺(Gever等人(1979)Med.Microbiol.Immunol.165;171-288)、卣烷基卣化物(US4057685)、糖苷鍵(US4673574,US4808700)、己二胺和6-氨基己酸(US4459286)。在一個(gè)實(shí)施方式中,ADH被用作綴合來(lái)自血清型18C的糖的接頭。本發(fā)明的免疫原性組合物中存在的糖綴合物可通過(guò)任意已知的偶聯(lián)技術(shù)制備。該綴合方法可依賴于以l-氰基-4-二甲氨基四氟硼酸吡啶(CDAP)活化糖形成氰酸酯。該活化的糖可由此直接地或通過(guò)間隔(接頭)基團(tuán)偶聯(lián)至載體蛋白上的氨基基團(tuán)。例如,該間隔基可以是胱胺或半胱胺以得到硫醇多糖,后者可通過(guò)與馬來(lái)酰亞胺活化的載體蛋白(例如采用GMBS)或者鹵代乙?;d體蛋白(例如采用碘乙酰亞胺[例如,乙基碘乙酰亞胺HC1]或N-溴乙酸琥伯酰亞胺酯或SIAB,或SIA,或SBAP)反應(yīng)后獲得的硫醚鍵偶聯(lián)至載體。任選地,該氰酸酯(任選地通過(guò)CDAP化學(xué)制備)與己二胺或ADH偶聯(lián),且該氨基衍生的糖采用碳二亞胺(例如EDAC或EDC)化學(xué)通過(guò)蛋白載體上的羧基基團(tuán)被綴合至載體蛋白。該種綴合物描述于PCT公布申請(qǐng)UniformedServicesUniversity的WO93/15760以及WO95/08348和WO96/29094。其它合適的技術(shù)采用碳二亞胺、碳亞胺、肼、活性酯、降莰烷、對(duì)硝基苯甲酸、N-羥基琥珀酰亞胺、S-NHS、EDC、TSTU。許多描述于W098/42721。綴合可涉及羰基接頭,其可通過(guò)糖的游離羥基基團(tuán)與CDI反應(yīng)(Bethell等人J.Biol.Chem.1979,254;2572-4,Hearn等人J.Chromatogr.1981.218;509-18),然后與蛋白反應(yīng)形成氨基甲酸酯鍵而形成。這可包括將還原為伯羥基基團(tuán)的末端異構(gòu)反應(yīng),任選地在伯羥基基團(tuán)與CDI的反應(yīng)中保護(hù)/脫保護(hù)該伯羥基基團(tuán)以形成CDI氨基甲酸酯中間體,并將該CDI氨基甲酸酯中間體與蛋白上的氨基基團(tuán)綴合。該綴合物可通過(guò)US4365170(Jennings)和US4673574(Anderson)所述的直接還原胺化法制備得到。其它方法描述于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0_477508。其它方法包括將溴化氰(或CDAP)活化的糖的己二酸雙肼(ADH)衍生物通過(guò)碳二亞胺縮合(例如采用EDAC)綴合至蛋白載體(ChuC.等人Infect.Immunity,1983245256)。在一個(gè)實(shí)施方式中,糖上的羥基基團(tuán)(任選地活化羥基基團(tuán),例如[如采用CDAP]活化制備氰酸酯的羥基基團(tuán))被直接或間接(通過(guò)接頭)連接至蛋白上的氨基或羧基基團(tuán)。當(dāng)接頭存在時(shí),糖上的羥基基團(tuán)任選地連接至接頭上的氨基基團(tuán),例如,通過(guò)CDAP綴合連接。在接頭如ADH中的其它氨基基團(tuán)可被綴合至蛋白上的羧酸基團(tuán),例如,可采用碳二亞胺化學(xué),例如采用EDAC進(jìn)行綴合。在一個(gè)實(shí)施方式中,該肺炎球菌莢膜糖在綴合至載體蛋白前先背綴合至接頭。替代性地,該接頭可在綴合至糖之前被綴合至載體。也可采用組合技術(shù),其中部分糖_蛋白綴合物通過(guò)CDAP制備,部分通過(guò)還原胺化制備。總體而言,在蛋白載體上的以下類型的化學(xué)基團(tuán)可用于綴合/結(jié)合A)羧基(例如通過(guò)天冬氨酸或谷氨酸)。在一個(gè)實(shí)施方式中該基團(tuán)被直接連接至糖上的氨基基團(tuán)或通過(guò)碳二亞胺化學(xué)(例如通過(guò)EDAC)連接至接頭上的氨基基團(tuán)。B)氨基基團(tuán)(例如通過(guò)賴氨酸)。在一個(gè)實(shí)施方式中該基團(tuán)被直接連接至糖上的羧基基團(tuán)或通過(guò)碳二亞胺化學(xué)(例如通過(guò)EDAC)連接至接頭上的羧基基團(tuán)。在另一實(shí)施方式中該基團(tuán)直接連接至糖上以CDAP或CNBr活化的羥基基團(tuán)或者連接至接頭上的該種基團(tuán);連接至具有醛基團(tuán)的糖或接頭;連接至具有丁二酰亞胺酯基團(tuán)的糖或接頭。C)硫氫基(例如通過(guò)半胱氨酸)。在一個(gè)實(shí)施方式中,該基團(tuán)被連接至溴或氯乙?;奶腔蚓哂旭R來(lái)酰亞胺化學(xué)的接頭。在一個(gè)實(shí)施方式中,該基團(tuán)通過(guò)雙重氮聯(lián)苯胺活化/修飾。D)羥基基團(tuán)(例如通過(guò)酪氨酸)。在一個(gè)實(shí)施方式中,該基團(tuán)通過(guò)雙重氮聯(lián)苯胺活化/修飾。E)咪唑基基團(tuán)(例如通過(guò)組氨酸)。在一個(gè)實(shí)施方式中,該基團(tuán)通過(guò)雙重氮聯(lián)苯胺活化/修飾。F)胍基基團(tuán)(例如通過(guò)精氨酸)。[OWO]G)吲哚基基團(tuán)(例如通過(guò)色氨酸)。18在一個(gè)實(shí)施方式中,肺炎鏈球菌莢膜糖中至少一種與載體蛋白直接綴合。任選地,肺炎鏈球菌莢膜糖中至少一種通過(guò)CDAP直接綴合。在一個(gè)實(shí)施方式中,莢膜糖中的大部分例如5、6、7、8、9或更多種通過(guò)CDAP直接連接至該載體蛋白(參見W095/08348和W096/29094)。該免疫原性組合物可包含肺炎鏈球菌蛋白,此處稱為本發(fā)明的肺炎鏈球菌蛋白。該種蛋白可用作載體蛋白,或者可作為游離蛋白存在,或者可同時(shí)作為載體蛋白和游離蛋白存在。本發(fā)明的肺炎鏈球菌蛋白可至少在肺炎球菌生命周期的一部分中暴露在表面,或者可作為由肺炎球菌分泌或釋放的蛋白。任選地,本發(fā)明的蛋白選自如下類別,例如具有LXXCII型信號(hào)序列基序的蛋白(其中X為任意氨基酸,例如,聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)),膽堿結(jié)合蛋白,具有I型信號(hào)序列基序的蛋白(如,Spl01),具有LPXTG基序的蛋白(其中X為任意氨基酸,例如,Spl28,Spl30),以及毒素(例如,Ply)。這些類別(或基序)中的范例為如下蛋白,或者其免疫學(xué)功能等同物。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的免疫原性組合物包含至少l種選自如下組合的蛋白聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、截短CbpX、LytX家族、截短LytX、截短CbpX-截短LytX嵌合蛋白(或融合體)、肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Spl28、Spl01、Spl30、Spl25和Sp133。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,該免疫原性組合物包含2種或多種選自如下組合的蛋白聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、截短CbpX、LytX家族、截短LytX、截短CbpX-截短LytX嵌合蛋白(或融合體)、肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA和Spl28。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,該免疫原性組合物包含2種或多種選自如下組合的蛋白聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、截短CbpX、LytX家族、截短LytX、截短CbpX-截短LytX嵌合蛋白(或融合體)、肺炎球菌溶血素(Ply)和Spl28。該P(yáng)ht(聚組氨酸三聯(lián)體)家族包含蛋白PhtA、PhtB、PhtD和PhtE。該家族的特征在于脂酶序列、被富脯氨酸區(qū)分離的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域和多個(gè)組氨酸三聯(lián)體,可能涉及金屬或核苷結(jié)合或酶催化活性、(3-5)巻曲螺旋區(qū)、保守N末端和異種C末端。它存在于所有測(cè)試的肺炎雙球菌菌株中。在鏈球菌和奈瑟菌中也曾發(fā)現(xiàn)了同源蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的Pht蛋白為PhtD。然而,可以理解,術(shù)語(yǔ)PhtA、B、D和E指具有下文引用文獻(xiàn)中披露的序列的蛋白以及與該參考蛋白具有至少90%—致性的序列同源性的天然存在(和人工)變體。任選地,具有至少95%—致性或至少97%—致性。對(duì)于PhtX蛋白,PhtA披露于WO98/18930,也被稱為Sp36。如上文指出,它是一種來(lái)自聚組氨酸三聯(lián)體家族的蛋白,并具有LXXC的II型信號(hào)基序。PhtD披露于WO00/37105,也被稱為Sp036D。如上文指出,它也是一種來(lái)自聚組氨酸三聯(lián)體家族的蛋白,并具有II型LXXC信號(hào)基序。PhtB披露于WO00/37105,也被稱為Sp036B。PhtB家族的另一成員為C3-降解多肽,披露于W000/17370。該蛋白也來(lái)自于聚組氨酸三聯(lián)體家族,并具有II型LXXC信號(hào)基序。例如,一種免疫原性功能等同物是披露于WO98/18930的蛋白Sp42。一種截短PhtB(約79kD)披露于W099/15675,也被認(rèn)為是PhtX家族的一元。PhtE披露于WOOO/30299并被稱為BVH-3。此處提及Pht蛋白時(shí)表示可使用Pht蛋白的免疫原性片段或其融合體。例如,提及PhtX時(shí)包括任意Pht蛋白的免疫原性片段或其融合體。提及PhtD時(shí)也表示提及在例如W00198334中發(fā)現(xiàn)的PhtDE或PhtBE融合體。肺炎球菌溶血素是一種多功能毒素,其具有明顯的細(xì)胞溶解性(溶血性)和補(bǔ)體激活活性(Rubins等人,Am.Respi.CitCareMed,153:1339-1346(1996))。該毒素不由肺炎雙球菌分泌,但在自溶素影響下在肺炎雙球菌溶解時(shí)釋放。它的影響包括,例如,剌激人單核細(xì)胞生成炎癥性細(xì)胞因子,抑制纖毛對(duì)人呼吸道上皮的拍打,以及減少細(xì)菌活性和嗜中性白血球遷移。肺炎球菌溶血素最明顯的影響是在紅血細(xì)胞的溶解,其涉及與膽固醇結(jié)合。由于它是一種毒素,它需要在體內(nèi)施用前被解毒(在適于保護(hù)的劑量下提供時(shí)對(duì)人體無(wú)毒)。野生型或天然肺炎球菌溶血素的表達(dá)和克隆已為本領(lǐng)域所知。例如,參見Walker等人(InfectI匪n,55:1184-1189(1987))、Mitchel1等人(BiochimBiophysActa,1007:67-72(1989)和Mitchell等人(NAR,18:4010(1990))。ply的解毒可通過(guò)化學(xué)手段實(shí)現(xiàn),例如,進(jìn)行甲醛或戊二醛處理或兩者的組合(W004081515,PCT/EP2005/010258)。該種方法在本領(lǐng)域中公知由于各種毒素。替代性地,ply可遺傳解毒。因此,本發(fā)明包括可以是例如突變蛋白的肺炎球菌蛋白衍生物。此處所用的術(shù)語(yǔ)"突變的"表示采用公知的定點(diǎn)突變技術(shù)或其它常規(guī)方法進(jìn)行了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的刪除、添加或替換的分子。例如,如上所述,突變體ply蛋白可被改變?yōu)樯锸Щ?,同時(shí)保持其免疫原性表位,例如參見W090/06951,Berry等人(InfectI匪n,67:981-985(1999))和W099/03884。此處所用的術(shù)語(yǔ)"Ply"應(yīng)理解為適于醫(yī)學(xué)用途的突變或解毒肺炎球菌溶血素(即,無(wú)毒的)。對(duì)于膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX),該家族的成員最初被鑒定為可通過(guò)膽堿親合層析純化的肺炎球菌蛋白。所有的膽堿結(jié)合蛋白為非共價(jià)結(jié)合至細(xì)胞壁磷壁酸和膜關(guān)聯(lián)脂磷壁酸的磷酸膽堿部分。這整個(gè)家族在結(jié)構(gòu)上具有多個(gè)共同區(qū)域,盡管這些蛋白的確切性質(zhì)(氨基酸序列、長(zhǎng)度等)可能不同。總體而言,膽堿結(jié)合蛋白包含N末端區(qū)(N)、保守重復(fù)區(qū)(Rl和/或R2)、脯氨酸富集區(qū)(P)和保守膽堿結(jié)合區(qū)(C),由多個(gè)重復(fù)單元組成,構(gòu)成了該蛋白的約一半。本申請(qǐng)中所用的術(shù)語(yǔ)"膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)"選自在W097/41151中鑒定的膽堿結(jié)合蛋白PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD和CbpG。CbpA披露于W097/41151。CbpD和CbpG披露于W000/29434。PspC披露于W097/09994。PbcA披露于W098/21337。SpsA是一種披露于W098/39450的膽堿結(jié)合蛋白。任選地膽堿結(jié)合蛋白選自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式包括截短CbpX,其中"CbpX"如上定義,而"截短"指CbpX蛋白缺失了50%或更多的膽堿結(jié)合區(qū)(C)。任選地,該種蛋白缺失了整個(gè)膽堿結(jié)合區(qū)。任選地,該種截短蛋白缺失了(i)膽堿結(jié)合區(qū)和(ii)N末端一部分以及該蛋白的一半,并保留了至少一個(gè)重復(fù)區(qū)(Rl或R2)。任選地,該截短物具有2個(gè)重復(fù)區(qū)(Rl或R2)。該種實(shí)施方式的范例為W099/51266或W099/51188中所示的NRlxR2和RlxR2,然而,缺失了類似膽堿結(jié)合區(qū)的其它膽堿結(jié)合蛋白通常在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。LytX家族是與細(xì)胞溶解相關(guān)的膜相關(guān)蛋白。N末端結(jié)構(gòu)與包含膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域,然而,LytX家族并不具有上述指出的CbpA家族中發(fā)現(xiàn)的所有特征,因此對(duì)于本發(fā)明,LytX家族被認(rèn)為不同于CbpX家族。與CbpX家族相反,C末端結(jié)構(gòu)域包含LytX蛋白家族的催化結(jié)構(gòu)域。該家族包括了LytA、B和C。對(duì)于LytX家族,LytA披露于Ronda等人,EurJBiochem,164:621-624(1987)。LytB披露于WO98/18930,也被稱為Sp46。LytC也披露于W098/18930,也被稱為Sp9。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式包括LytC。另一實(shí)施方式包括截短LytX,其中"LytX"如上定義,而"截短"指缺失了膽堿結(jié)合區(qū)50X或更多的LytX蛋白。任選地,該種蛋白缺失了整個(gè)膽堿結(jié)合區(qū)。本發(fā)明的另一實(shí)施方式包括了截短CbpX-截短LytX嵌合蛋白(或融合體)。任選地,其包含了CbpX的NRlxR2(或RlxR2)和LytX的C末端部分(Cterm,S卩,缺失了膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域)(例如,LytCCterm或Sp91Cterm)。任選地,CbpX選自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。任選地,它是CbpA。任選地,LytX是LytC(也稱為Sp91)。本發(fā)明的另一實(shí)施方式是缺失了膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域(C)并作為具有LytX的融合蛋白表達(dá)截短的PspA或PsaA。任選地,LytX為L(zhǎng)ytC。PsaA和PspA均為本領(lǐng)域所知。例如,PsaA及其跨膜刪除變體已被Berry&Paton,InfectImmun1996Dec;64(12):5255-62描述。PspA及其跨膜刪除變體已被例如US5804193、WO92/14488和WO99/53940所披露。Spl28和Spl30披露于W000/76540。Spl25是具有LPXTG細(xì)胞壁錨定基序的肺炎球菌表面蛋白的范例(其中X為任意氨基酸)。在具有該基序的該類肺炎球菌表面蛋白中的任意蛋白已被發(fā)現(xiàn)可用于本發(fā)明的背景中,因此被認(rèn)為本發(fā)明的其它蛋白。Spl25本身披露于WO98/18930,并被稱為ZmpB-—種鋅金屬蛋白酶。SplOl披露于WO98/06734(其中它具有參考編號(hào)y85993)。它以I型信號(hào)序列為特征。Spl33披露于W098/06734(其中它具有參考編號(hào)y85992)。它同樣以I型信號(hào)序列為特征??砂ㄔ诮M合疫苗(特別是用于預(yù)防中耳炎)中的粘膜炎莫拉菌蛋白抗原的范例為:0MP106[W097/41731(Antex)&WO96/34960(PMC)];OMP21或其片段(WO0018910);LbpA和/或LbpB[WO98/55606(PMC)];TbpA和/或TbpB[WO97/13785&WO97/32980(PMC)];CopB[HelminenME,等人(1993)Infect.Immun.61:2003-2010];UspAl和/或UspA2[WO93/03761(UniversityofTexas)];OmpCD;HasR(PCT/EP99/03824);PilQ(PCT/EP99/03823);0MP85(PCT/EP00/01468);lipo06(GB9917977.2);lipolO(GB9918208.1);lipoll(GB9918302.2);lipol8(GB9918038.2);P6(PCT/EP99/03038);D15(PCT/EP99/03822);OmplAl(PCT/EP99/06781);Hly3(PCT/EP99/03257);以及OmpE??砂ㄔ诮M合疫苗(特別是用于預(yù)防中耳炎)中的不可分型的流感嗜血桿菌抗原或其片段的范例Fimbrin蛋白[(US5766608-OhioStateResearchFoundation)]其包含其肽的融合體[例如LB1(f)肽融合體;US5843464(OSU)或WO99/64067];0MP26[WO97/01638(Cortecs)];P6[EP281673(StateUniversityofNewYork)];TbpA和/或TbpB;Hia;Hsf;Hin47;Hif;Hmwl;Hmw2;Hmw3;Hmw4;H鄰;D15(W094/12641);P2;以及P5(W094/26304)。本發(fā)明的蛋白還可被有利地合并。合并表示該免疫原性組合物包含來(lái)自以下組合的所有蛋白,該蛋白可作為載體蛋白或作為游離蛋白或者作為這兩者的混合物。例如,在下文所示的兩種蛋白的組合中,兩種蛋白均被用作載體蛋白,或者均作為游離蛋白存在,或者可同時(shí)作為載體蛋白和游離蛋白,或者一種可作為載體蛋白和游離蛋白而另一種僅作為載體蛋白或僅作為游離蛋白,或者一種可作為載體蛋白而另一種作為游離蛋白。當(dāng)給出三種蛋白的組合時(shí),存在類似的可能性。組合包括,但不限于PhtD+NRlxR2、PhtD+NRlxR2-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白、PhtD+Ply、PhtD+Sp128、PhtD+PsaA、PhtD+PspA、PhtA+NRlxR2、PhtA+NRlxR2-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白、PhtA+Ply、PhtA+Sp128、PhtA+PsaA、PhtA+PspA、NRlxR2+LytC、NRlxR2+PspA、NRlxR2+PsaA、NRlxR2+Sp128、RlxR2+LytC、RlxR2+PspA、RlxR2+PsaA、RlxR2+Sp128、RlxR2+PhtD、RlxR2+PhtA。任選地,NRlxR2(或RlxR2)來(lái)自于CbpA或PspC。任選地,它來(lái)自于CbpA。其它組合包括3蛋白組合,例如PhtD+NRlxR2+Ply和PhtA+NRlxR2+PhtD。在一個(gè)實(shí)施方式中,該疫苗組合物包含作為載體蛋白的解毒肺炎球菌溶血素和PhtD或PhtDE。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,該疫苗組合物包含作為游離蛋白的解毒肺炎球菌溶血素和PhtD或PhtDE。在一個(gè)獨(dú)立的方面,本發(fā)明提供了免疫原性組合物,其包含至少四種含有來(lái)自不同肺炎鏈球菌血清型的糖的肺炎鏈球菌莢膜糖綴合物,其中至少一種糖綴合PhtD或其融合蛋白,且該免疫原性組合物能夠引發(fā)針對(duì)PhtD的有效免疫應(yīng)答。對(duì)PhtD或其融合蛋白的有效免疫應(yīng)答可通過(guò)例如實(shí)施例15所述的保護(hù)測(cè)定進(jìn)行測(cè)量。有效免疫應(yīng)答可在異種菌株攻擊后7天提供至少40%、50%、60%、70%、80%或90%的存活。假定該攻擊菌株是異種的,所提供的保護(hù)是由于對(duì)PhtD或其融合蛋白的免疫應(yīng)答。替代性地,對(duì)PhtD的有效免疫應(yīng)答可通過(guò)例如實(shí)施例14所述的ELISA進(jìn)行測(cè)量。有效免疫應(yīng)答給出了至少250、300、350、400、500、550或600iig/mlGMC的抗-PhtDIgG應(yīng)答。例如,該免疫原性組合物包含綴合至PhtD或其融合蛋白的來(lái)自不同血清型的至少2、3、4、5、6、7、8、9或IO種肺炎鏈球菌莢膜糖。例如進(jìn)一步選自血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15、17F、18C、19A、19F、20、23F和33F的血清型22F和1、2、3、4、5、6或7被綴合至PhtD。在一個(gè)實(shí)施方式中,血清型3、6A和22F中的兩種或三種被綴合至PhtD或其融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的免疫原性組合物包含至少一種通過(guò)接頭(例如ADH)綴合至PhtD或其融合蛋白的肺炎鏈球菌莢膜糖。在一個(gè)實(shí)施方式中,采用了如下列舉的其中一種綴合化學(xué)。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的免疫原性組合物包含了至少一種綴合至PhtD或其融合蛋白的肺炎鏈球菌莢膜糖,其中PhtD與糖在綴合物中的比例介于6:i和i:5、6:i和2:1、6:i和2.5:1、6:i和3:1、6:l和3.5:i(w/w)或大于(S卩,包含更大比例的PhtD)2.0:1、2.5:1、3.0:1、3.5:1或4.0:l(w/w)。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的免疫原性組合物包含肺炎球菌溶血素。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含本發(fā)明的免疫原性組合物和藥學(xué)可接受的賦形劑的疫苗。本發(fā)明的疫苗可補(bǔ)充佐劑,特別是當(dāng)該疫苗意圖用于老年人群,同時(shí)用于嬰兒時(shí)。合適的佐劑包括鋁鹽,例如氫氧化鋁凝膠或磷酸鋁或明砜,但也可以是其它的金屬鹽,例如鈣、鎂、鐵或鋅的鹽,或者可以是?;野彼峄蛘啧;?、陽(yáng)離子或陰離子衍生的糖或者聚磷腈的不溶性懸浮液。該佐劑任選地選擇為TH1型應(yīng)答的優(yōu)選誘導(dǎo)劑。該種高水平的Thl型細(xì)胞因子傾向于促進(jìn)針對(duì)給定抗原的細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的誘導(dǎo),而高水平的Th2型細(xì)胞因子傾向于促進(jìn)針對(duì)該抗原的體液免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。Th2和Th2型免疫應(yīng)答的區(qū)別并不絕對(duì)。實(shí)際上一個(gè)個(gè)體將支持被描述為主要是Thl或主要是Th2的免疫應(yīng)答。然而,通??煞奖愕囊訫osmann和Coffman對(duì)鼠CD4+veT細(xì)胞克隆的描述來(lái)考慮細(xì)胞因子家族(Mosmann,T.R.和Coffman,R.L.(1989)TH1andTH2cells-differentpatternsoflymphokinesecretionleadtodifferentfunctionalproperties.(AnnualReviewofl匪nology,7,pl45_173)。習(xí)慣上,Thl型應(yīng)答與T淋巴細(xì)胞生成INF-y和IL-2細(xì)胞因子相關(guān)聯(lián)。其它通常與Thl型免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)關(guān)聯(lián)的細(xì)胞因子并非由T細(xì)胞生成,例如IL-2。相反地,Th2型應(yīng)答與IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌關(guān)聯(lián)。促進(jìn)主要是Thl應(yīng)答的合適佐劑系統(tǒng)包括單磷酰脂質(zhì)A或其衍生物(或者一般而言的解毒lipidA-例如參見W02005107798),特別是3-脫-0-?;瘑瘟柞V|(zhì)A(3D-MPL)(其制備可參見GB2220211A);以及單磷酰脂質(zhì)A,任選地3-脫-0-酰化單磷酰脂質(zhì)A,和鋁鹽(例如磷酸鋁或氫氧化鋁)或水包油乳液的組合。在該種組合中,抗原和3D-MPL包含在相同的顆粒結(jié)構(gòu)中,從而允許抗原性和免疫剌激信號(hào)被更有效傳遞。研究顯示3D-MPL能夠進(jìn)一步增強(qiáng)alum吸附抗原的免疫原性[Thoelen等人Vaccine(1998)16:708-14;EP689454-B1]。增強(qiáng)系統(tǒng)包括單磷酰脂質(zhì)A和皂甙衍生物的組合,特別是WO94/00153中披露的QS21和3D-MPL的組合,或者WO96/33739中披露的反應(yīng)原性較低的組合物,其中以膽固醇淬滅QS21。特別有效的佐劑配方包括在W095/17210中描述的在水包油乳液中的QS21、3D-MPLS和生育酚。在一個(gè)實(shí)施方式中,該免疫原性組合物額外包含皂甙,其可以是QS21。該配方還可包含水包油乳液和生育酚(W095/17210)。含有未甲基化的CpG的寡核苷酸(W096/02555)和其它免疫調(diào)節(jié)寡核苷酸(W00226757和W003507822)也是TH1應(yīng)答的潛在誘導(dǎo)劑,并適于在本發(fā)明使用。具體的佐劑選自金屬鹽、水包油乳液、Toll樣受體激動(dòng)劑(特別是Toll樣受體2激動(dòng)劑、Toll樣受體3激動(dòng)劑、Toll樣受體4激動(dòng)劑、Toll樣受體7激動(dòng)劑、Toll樣受體8激動(dòng)劑和Toll樣受體9激動(dòng)劑)、皂甙及其組合?!N可用于本發(fā)明的疫苗組合物的佐劑為來(lái)自革蘭氏陰性細(xì)菌菌株的皰(bleb)或外膜囊泡,例如W002/09746所啟示-特別是腦膜炎奈瑟氏球菌皰。皰的佐劑特性可通過(guò)在其表面保留L0S(脂低聚糖)得到增強(qiáng)(通過(guò)以低濃度清潔劑[例如0-0.1%脫氧膽酸鹽]萃取)。L0S可通過(guò)W002/09746中討論的msbB(-)或htrB(-)突變進(jìn)行解毒。佐劑特性還可通過(guò)從腦膜炎球菌皰保留PorB(并任選地去除PorA)得到增強(qiáng)。佐劑特性還可通過(guò)截短腦膜炎球菌皰上的L0S的外核糖結(jié)構(gòu)得到增強(qiáng)_例如通過(guò)¥02004/014417中討論的lgtB(-)突變。替代性地,前述L0S(例如,從msbB(-)和/或lgtB(-)菌株分離)可被純化并被用作本發(fā)明組合物的佐劑。可用于本發(fā)明的組合物的另一佐劑選自如下組合皂甙、脂質(zhì)A或其衍生物、免疫剌激寡核苷酸、烷基氨基葡糖苷磷酸酯、水包油乳液或其組合??捎糜诒景l(fā)明的組合物的其它佐劑為與另一佐劑組合的金屬鹽。在一個(gè)實(shí)施方式中,該佐劑為Toll樣受體激動(dòng)劑,特別是Toll氧受體2、3、4、7、8或9的激動(dòng)劑,或者皂甙,特別是Qs21。在一個(gè)實(shí)施方式中,佐劑系統(tǒng)包含來(lái)自上文列表的兩種或多種佐劑。具體而言,該組合任選地包含皂甙(特別是Qs21)佐劑和/或Toll樣受體9激動(dòng)劑,例如含CpG的免疫剌激寡核苷酸。其它的組合包含皂甙(特別是Qs21)佐劑和Toll樣受體4激動(dòng)劑或其3脫?;苌?D-MPL,或者包含皂甙(特別是Qs21)佐劑和Toll樣受體4配體如烷基氨基葡糖苷磷酸酯。在一個(gè)實(shí)施方式中,佐劑為3D-MPL和QS21的組合(EP0671948Bl),包含3D-MPL和QS21的水包油乳液(WO95/17210,WO98/56414),或者與其它載體配制的3D-MPL(EP0689454Bl)。在一個(gè)實(shí)施方式中,佐劑系統(tǒng)包含中所述的3DMPL、QS21和CpG寡核苷酸的組合。在一個(gè)實(shí)施方式中,該佐劑為Toll樣受體(TLR)4配體,任選地如脂質(zhì)A衍生物激動(dòng)劑,具體而言單磷酰脂質(zhì)A,更具體而言3脫酰化單磷酰脂質(zhì)A(3D-MPL)。3D-MPL可由GlaxoSmithKlineBiologicalsNorthAmerica獲得,主要促進(jìn)具有IFN-g(Thl)表型的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。它可根據(jù)GB2220211A中披露的方法生成。從化學(xué)上看它是具有2、3、4或6條?;湹?-脫酰單磷酰脂質(zhì)A。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的該組合物采用了微粒3D-MPL。微粒3D-MPL具有可通過(guò)0.22ym過(guò)濾器進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾的粒徑。該種制備物描述于國(guó)際專利申請(qǐng)WO94/21292。脂質(zhì)A的人工衍生物已知,并被認(rèn)為是TLR4激動(dòng)劑,包括但不限于0M174(2-脫氧_6-0-[2_脫氧_2_[(R)_3_十二烷酰氧基四_癸酰基氨基]_4-0-膦?;鵢13-D-吡喃葡糖基]-2-[(R)-3-羥基四癸?;被鵠_a-D-吡喃葡糖基二氫磷酸),(W095/14026)0M294DP(3S,9R)-3—[(R)-十二烷酰氧基四癸?;被鵠-4-氧代-5-氮雜_9(R)-[(R)-3-羥基四癸?;被鵠癸烷-1,10-二醇,1,10-雙(二氫磷酸)(W099/64301和W000/0462)0M197MP-AcDP(3S_,9R)_3_[(R)-十二烷酰氧基四癸?;被鵠_4_氧代-5_氮雜-9-[(R)-3-羥基四癸?;被鵠癸烷-1,10-二醇,1-二氫磷酸10-(6-氨基己酸)(W001/46127)其它可用的TLR4配體為例如W09850399或US6303347所披露的烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)(同樣披露了AGP的制備方法)或者US6764840中披露的AGP藥學(xué)可接受的鹽。部分AGP為TLR4激動(dòng)劑,部分為TLR4拮抗劑。兩者均為認(rèn)為可用作佐劑??捎糜诒景l(fā)明的另一免疫剌激劑是QuilA及其衍生物。QuilA是一種從南美樹種QuilajaS即onariaMolina中分離的皂甙制備物,并由Dalsgaard等人在1974年首次描述為具有佐劑活性("saponinadjuvants,,,Archiv.fiirdiegesamteVirusforschung,Vol.44,SpringerVerlag,Berlin,p243_254)。以通過(guò)HPLC分離了QuilA的純化片段,其保留了佐劑活性,而不具有QuilA的毒性(EP0362278),例如QS7和QS21(也被稱為QA7和QA21)。QS-21是一種來(lái)自的Quillajas即onariaMolina樹皮的天然皂武,其誘導(dǎo)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTLs)、Thl細(xì)胞和主要的IgG2a抗體應(yīng)答,并且是本發(fā)明背景中的皂甙。QS21的具體配方已被表述,并且是本發(fā)明的實(shí)施方式,這些配方進(jìn)一步包含固醇(W096/33739)。本發(fā)明的皂甙形成部分可以微團(tuán)、混合微團(tuán)(可選地具有膽鹽)或者可以ISC0M基質(zhì)(EP0109942Bl)、脂質(zhì)體或相關(guān)膠體結(jié)構(gòu)例如蠕蟲狀或環(huán)狀多聚體復(fù)合物或油脂/分層結(jié)構(gòu)以及與膽固醇和脂質(zhì)配制形成的薄片、或以水包油乳液(例如在W095/17210)的形式分離。該皂甙可與金屬鹽(例如氫氧化鋁或磷酸鋁)(W098/15287)相關(guān)聯(lián)。任選地,該皂甙以脂質(zhì)體、ISC0M或水包油乳液形式存在。增強(qiáng)系統(tǒng)包括單磷酰脂質(zhì)A(或解毒脂質(zhì)A)和皂甙衍生物的組合,特別是WO94/00153中披露的QS21和3D-MPL的組合,或者W096/33739中披露的反應(yīng)原性較低的組合物,其中以膽固醇淬滅QS21。一種特別有效的佐劑配方包括在WO95/17210中描述的在水包油乳液中的具有或不具有QS21和/或3D-MPL的生育酚。在一個(gè)實(shí)施方式中,該免疫原性組合物額外包含皂甙,其可以是QS21。也可使用免疫剌激寡核苷酸或任意其它Toll樣受體(TLR)9激動(dòng)劑。在本發(fā)明的佐劑或疫苗中使用的寡核苷酸為可選地含CpG的寡核苷酸,任選地包含被至少三個(gè)、任選地至少六個(gè)或更多個(gè)核苷酸分離的兩個(gè)或多個(gè)雙核苷酸CpG基序。CpG基序是一種后接鳥嘌呤核苷酸的胞嘧啶核苷酸。本發(fā)明的CpG寡核苷酸通常為脫氧核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中,該寡核苷酸中的核苷酸間鍵合為二硫代磷酸酯或硫代磷酸酯鍵,盡管磷酸二酯和其它核苷酸間鍵合鍵也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。同樣包含在本發(fā)明范圍內(nèi)的是與核苷酸間鍵合混合的寡核苷酸。生產(chǎn)硫代磷酸酯寡核苷酸或而硫代磷酸酯的方法描述于US5,666,153、US5,278,302和W095/26204。寡核苷酸的范例具有如下序列。這些序列任選地包含硫代磷酸酯修飾的核苷酸間鍵合。0LIG0l(SEQIDN0:1):TCCATGACGTTCCTGACGTT(CpG1826)0LIG02(SEQIDNO:2):TCTCCCAGCGTGCGCCAT(CpG1758)OLIGO3(SEQIDNO:3):ACCGATGACGTCGCCGGTGACGGCACCACGOLIGO4(SEQIDNO:4):TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(CpG2006)OLIGO5(SEQIDNO:5):TCCATGACGTTCCTGATGCT(CpG1668)OLIGO6(SEQIDNO:6):TCGACGTTTTCGGCGCGCGCCG(CpG5456)替代性的CpG寡核苷酸可包含上述序列,其中具有序列內(nèi)刪除或添加。本發(fā)明中采用的CpG寡核苷酸可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法合成(例如參見EP468520)。這些寡核苷酸可方便地采用自動(dòng)合成儀合成得到。該佐劑可以是水包油乳液或者可包含于其它佐劑組合的水包油乳液。該乳液系統(tǒng)的油相可選地包含可代謝的油。術(shù)語(yǔ)可代謝的油的含義已為本領(lǐng)域公知。可代謝的可被定義為',夠通過(guò)代話撫化的,,(Dorland'sIllustratedMedicalDictionary,W.B.SandersCompany,25thedition(1974))。該油可以是任意植物油、魚油、動(dòng)物或人造油,其對(duì)受體沒有毒性并能夠通過(guò)代謝轉(zhuǎn)化。堅(jiān)果、種子和谷物是植物油的常見來(lái)源。人造有也是本發(fā)明的一部分,并可包括已有市售的油,例如NEOBEE⑧等。角鯊烯(2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳己烯)是一種不飽和油,其大量發(fā)現(xiàn)于鯊魚肝油中,少量發(fā)現(xiàn)于橄欖油、麥胚油、米糠油和酵母中,并且是一種可用于本發(fā)明的油。角鯊烯是一種可代謝的油,事實(shí)上它是膽固醇生物合成中的一種中間體(Merckindex,10thEdition,entryno.8619)。母育酚(例如,維生素E)也常被用在油乳液佐劑中(EP0382271Bl;US5667784;WO95/17210)。在本發(fā)明的油乳液(任選地水包油乳液)中所用的母育酚可參照EP0382271Bl所述進(jìn)行配制,其中母育酚可作為母育酚液體的分散體,任選地包含乳化劑,任選地其直徑小于1微米。替代性惡,該母育酚可與另一種油聯(lián)用,以形成油乳液的油相??膳c母育酚聯(lián)用的油乳液的范例已在此處描述,例如上述可代謝的油。水包油乳液本身已被建議用作佐劑組合物(EP0399843B),此外水包油乳化和其它活性劑的組合也被描述為疫苗的佐劑(WO95/17210;WO98/56414;WO99/12565;WO99/11241)。其它的油乳液佐劑已被描述,例如油包水乳液(US5,422,109;EP0480982B2)和水包油乳液(US5,424,067;EP0480981B)。所有這些形成油乳液系統(tǒng)(特別當(dāng)結(jié)合了母育酚時(shí)),以形成本發(fā)明的佐劑和組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中,該油乳液(例如水包油乳液)進(jìn)一步包含乳化劑,例如TWEEN80和/或固醇(如膽固醇)。在一個(gè)實(shí)施方式中,該油乳液(任選地水包油乳液)包含可代謝的無(wú)毒性油,例如角鯊?fù)?、角鯊烯或生育酚如a生育酚(以及可選地角鯊烯和a生育酚兩者)以及任選地包含乳化劑(或表面活性劑)如Tween80。還可包含固醇(如膽固醇)。生產(chǎn)水包油乳液的方法已為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。該方法通常包括將含母育酚的油相與表面活性劑(如PBS/TWEEN80tm溶液)混合,然后采用勻漿機(jī)勻漿化,本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然了解將混合物兩次通過(guò)注射器針頭的方法可用于將小量液體勻漿化。同樣地,本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用微射流儀(M110S微射流機(jī)器,最大50次,周期2分鐘,最大輸入壓力6bar(輸出壓約850bar))中的乳化過(guò)程來(lái)生成更小或更大體積的乳液。這種方法可通過(guò)包括測(cè)量所得乳液直至制備物達(dá)到所需直徑的油滴的常規(guī)實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)。在水包油乳液中,該油和乳化劑應(yīng)當(dāng)在水性載體中。該水性載體可以是,例如,磷酸鹽緩沖鹽水。在穩(wěn)定的水包油乳液中發(fā)現(xiàn)的油滴的大小任選地小于1微米,可以在大約30-600nm范圍內(nèi),任選地直徑大約為30-500nm,且任選地直徑大約為150-500nm,特別是直徑大約150nm,該直徑可通過(guò)光子相關(guān)光譜學(xué)測(cè)定。就此而言,數(shù)量上80%的油滴應(yīng)在該范圍內(nèi),任選地?cái)?shù)量上超過(guò)90%和任選地超過(guò)95%的油滴在指定的大小范圍內(nèi)。在本發(fā)明的油乳液中存在的成分如角鯊烯的量通常約油(總劑量體積)的O.5-20%或2-10%范圍內(nèi);當(dāng)a生育酚存在時(shí)為2-10%;表面活性劑(例如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯)為0.3-3%。任選地油(例如角鯊烯)母育酚(例如a-母育酚)的比例等于或小于l,因?yàn)檫@提供了更穩(wěn)定的乳液。乳化劑如Tween80或Span85也可以約1%的水平存在。在部分情況下,本發(fā)明的疫苗可有利地進(jìn)一步包含穩(wěn)定劑。乳液系統(tǒng)的范例描述于WO95/17210、WO99/11241禾口WO99/12565,其中披露了基于角鯊烯、生育酚和TWEEN80,任選地與免疫剌激劑QS21和/或3D-MPL配制的乳液佐劑。因此在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的佐劑可額外地進(jìn)一步包含免疫剌激劑,例如LPS或其衍生物和/或皂甙。其它免疫剌激劑的范例在此處描述,并描述于"VaccineDesign-TheSubunitandAdjuvantApproach"1995,PharmaceuticalBiotechnology,Volume6,Eds.Powell,M.F.,andNewman,M.J.,PlenumPress,NewYorkandLondon,ISBN0-306-44867-X。在一個(gè)實(shí)施方式中,根據(jù)本發(fā)明的佐劑和免疫原性組合物在上述油乳液中包含皂甙(例如QS21)和/或LPS衍生物(例如3D-MPL),任選地具有固醇(例如,膽固醇)。此外,該油乳液(任選地水包油乳液)可包含span85和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。包含水包油乳液、固醇和皂甙的佐劑描述于WO99/12565。典型地,用于向人施用時(shí),皂甙(例如QS21)和/或LPS衍生物(例如3D-MPL)在人用劑量的免疫原性組合物中的范圍為每劑量1Pg-200iig,例如10-100iig,或10iig-50iig。通常油乳液(任選地水包油乳液)將包含2-10%可代謝油。任選地它將包含2-10%角鯊烯,2_10%a生育酚和0.3-3%(任選地0.4-2%)乳化劑(任選地tween80[聚氧乙烯山梨醇單油酸酯])。當(dāng)角鯊烯和a生育酚都存在時(shí),任選地角鯊烯a生育酚的比例等于或小于l,這提供了更穩(wěn)定的乳液。Span85(去水山梨糖醇三油酸酯)也可在本發(fā)明所用乳液中以0.5_1%的水平存在。在部分情況下,本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗可有利地進(jìn)一步包含穩(wěn)定劑,例如其它乳化劑/表面活性劑,包括辛酸(merckindex10thEdition,entryno.1739),例如三辛酸甘油酯。當(dāng)包含角鯊烯和皂甙(任選地QS21)時(shí),在配方中還可有利地包含固醇(任選地膽固醇),這允許減少乳液中油的總體水平。這帶來(lái)了生產(chǎn)成本的下降,疫苗總體舒適性的提高,以及所得免疫應(yīng)答的定性和定量改善,例如提高了IFN-Y生產(chǎn)。相應(yīng)地,本發(fā)明的佐劑系統(tǒng)通常包含的可代謝的油皂甙(w/V)比例范圍為200:l至300:i,此外本發(fā)明還可以"低油"方式使用,其任選的范圍為i:l至200:1,任選地20:i至ioo:i,或者約48:i,該疫苗保留了所有成分的有益佐劑性能,同時(shí)反應(yīng)原性大大下降。相應(yīng)地,部分實(shí)施方式中的角鯊烯QS2i(w/w)比例范圍為i:l至250:1,或20:l至200:i,或20:i至ioo:1,或約48:i。任選地以此處所述的皂甙固醇比例包含固醇(例如,膽固醇)。本發(fā)明的乳液系統(tǒng)任選地具有在亞微米范圍內(nèi)的小油滴大小。任選地該油滴直徑將在120-750nm或120-600nm范圍內(nèi)?!N特別有效的佐劑配方(最終與A1P04在本發(fā)明的免疫原性組合物中合并)包含了皂甙(例如,QS21)、LPS衍生物(例如3D-MPL)和油乳液(例如含于水包油乳液的角鯊烯和a生育酚),其描述于WO95/17210或W099/12565(特別是實(shí)施例2,表1中的佐劑配方11)。TLR2激動(dòng)劑的范例包括肽聚糖或脂蛋白。咪唑喹啉,例如咪喹莫特和瑞喹莫德是已知的TLR7激動(dòng)劑。單鏈RNA也是已知的TLR激動(dòng)劑(人TLR8的和小鼠的TLR7),而取鏈RNA和聚IC(聚肌苷酸-聚胞苷酸,一種商業(yè)合成的病毒RNA模擬物)是示范性的TLR3激動(dòng)劑。3D-MPL是TLR4激動(dòng)劑的范例,而CPG是TLR9動(dòng)劑的范例。免疫原性組合物可包含吸附在金屬鹽上的抗原和免疫剌激劑。EP0576478Bl、EP0689454B1和EP0633784Bl描述了基于鋁的疫苗制劑,在其顆粒上吸附了抗原和免疫剌激劑3-脫-0-?;瘑瘟柞V|(zhì)A(3D-MPL)。在這些情況下,抗原首先被吸附在鋁鹽上,然后將免疫剌激劑3D-MPL吸附到相同的鋁鹽顆粒上。該方法包括用超聲在水浴中懸浮3D-MPL,直至顆粒大小介于80和500nm。該抗原通常在室溫?cái)嚢柘略阡X鹽上吸附一小時(shí)。然后將3D-MPL懸浮液添加至吸附抗原,并將該配方在室溫下孵育1小時(shí),并在fC下保存待用。在另一方法中,該免疫剌激劑和該抗原分別吸附在單獨(dú)的金屬顆粒上,如EP1126876所述。這種改進(jìn)的方法包括將免疫剌激劑吸附在金屬鹽顆粒上,然后將抗原吸附在另一金屬鹽顆粒上,然后混合分散的金屬鹽顆粒以形成疫苗。在本發(fā)明中所用的佐劑可以是包含吸附在金屬鹽顆粒上的免疫剌激劑的佐劑組合物,其特征在于該金屬鹽顆?;静缓渌乖?。此外,本發(fā)明提供的疫苗的特征在于該免疫剌激劑被吸附在基本不含其它抗原的金屬鹽顆粒上,且該金屬鹽顆粒吸附至基本不含其它免疫剌激劑的抗原。相應(yīng)地,本發(fā)明提供了包含免疫剌激劑的佐劑配方,其被吸附在金屬鹽顆粒上,特征在于該組合物基本不含其它抗原。此外,本發(fā)明的佐劑配方可以是中間體,如果采用該種佐劑時(shí),疫苗的生產(chǎn)中需要該種中間體。相應(yīng)地提供了一種生產(chǎn)疫苗的方法,其包括將一種或多種免疫剌激劑吸附在金屬顆粒上的佐劑組合物與抗原相混合。任選地,該抗原已被預(yù)先吸附在金屬鹽上。所述的金屬鹽與吸附了免疫剌激劑的金屬鹽相同或類似。任選地,該金屬鹽為鋁鹽,例如磷酸鋁或氫氧化鋁。本發(fā)明進(jìn)一步提供了疫苗組合物,其包含了第一金屬鹽顆粒上的免疫剌激劑,以及吸附在金屬鹽上的抗原,其特征在于該第一和第二金屬鹽顆粒是單獨(dú)的顆粒。此處所述的LPS或LOS衍生物或突變體或脂質(zhì)A衍生物被設(shè)計(jì)為別天然脂多糖具有更低的毒性(例如,3D-MPL),并對(duì)于此處所述的部分的任意用途而言是可以互換的等同物。在一個(gè)實(shí)施方式中,在本發(fā)明的組合物中所用的佐劑包含脂質(zhì)體載體(通過(guò)已知技術(shù)由磷脂(例如二油?;字D憠A[DOPC])和可選地固醇[例如膽固醇]制備)。該種脂質(zhì)體載體可攜帶脂質(zhì)A衍生物[例如3D-MPL,-參見上文]和/或皂甙(例如QS21參見上文)。在一個(gè)實(shí)施方式中,該佐劑包含(每O.5mL劑量)0.l-10mg、0.2_7、0.3_5、0.4-2或0.5-lmg(e.g.0.4-0.6、0.9-1.1、0.5或lmg)磷月旨(例如DOPC)、0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25mg(例如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25or0.125mg)固醇(例如膽固醇)、5-60、10-50、or20_30iig(例如5-15、40_50、10、20、30、40或50iig)脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL)以及5-60、10-50或20-30iig(例如5-15、40-50、10、20、30、40或50iig)皂甙(例如QS21)。該佐劑特別適用于老年疫苗制劑。在一個(gè)實(shí)施方式中,含有該佐劑的該疫苗組合物包含來(lái)自至少如下血清型的糖綴合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(還可包含一種或多種來(lái)自血清型3、6A、19A和22F的糖綴合物),其中在人類接種者中針對(duì)一種或多種(或者所有)疫苗成分4、6B、9V、14、18C、19F和23F誘導(dǎo)的GMC抗體效價(jià)不明顯低于由Prevnai^疫苗誘導(dǎo)的相應(yīng)效價(jià)。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的組合物中所用的佐劑包含由可代謝的油(例如角鯊烯)、乳化劑(例如Tween80)和任選地母育酚(例如a生育酚)制成的水包油乳液。在一個(gè)實(shí)施方式中,該佐劑包含(每O.5mL劑量)0.5-15、l-13、2-ll、4-8或5-6mg(例如2-3、5-6或10-llmg)可代謝的油(如角鯊烯)、0.1-10、0.3-8、0.6-6、0.9-5、l-4或2-3mg(例如0.9-1.1、2-3或4-5mg)乳化劑(如Tween80)以及任選地0.5-20、1-15、2-12、4-10、295-7mg(例如11-13、5-6或2-3mg)母育酚(如a生育酚)。該佐劑可任選地進(jìn)一步包含5-60、10-50或20-30yg(例如5-15、40_50、10、20、30、40或50iig)脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL)。這些佐劑特別適于嬰兒或老年疫苗制劑。在一個(gè)實(shí)施方式中,含有該佐劑的該疫苗組合物包含來(lái)自至少如下血清型的糖綴合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(還可包含一種或多種來(lái)自血清型3、6A、19A和22F的糖綴合物),其中在人類接種者中針對(duì)一種或多種(或者所有)疫苗成分4、6B、9V、14、18C、19F和23F誘導(dǎo)的GMC抗體效價(jià)不明顯低于由Prevnar⑧疫苗誘導(dǎo)的相應(yīng)效價(jià)。該佐劑可任選地包含0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25mg(例如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25或0.125mg)固醇(例如膽固醇)、5-60、10-50或20-30iig(例如5-15、40-50、10、20、30、40或50iig)脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL)以及5-60、10-50或20-30iig(例如5-15、40_50、10、20、30、40或50iig)皂武(例如QS21)。該佐劑特別適用于老年疫苗制劑。在一個(gè)實(shí)施方式中,含有該佐劑的該疫苗組合物包含來(lái)自至少如下血清型的糖綴合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(還可包含一種或多種來(lái)自血清型3、6A、19A和22F的糖綴合物),其中在人類接種者中針對(duì)一種或多種(或者所有)疫苗成分4、6B、9V、14、18C、19F和23F誘導(dǎo)的GMC抗體效價(jià)不明顯低于由—Prevnar—疫苗誘導(dǎo)的相應(yīng)效價(jià)。在一個(gè)實(shí)施方式中,用于本發(fā)明組合物的該佐劑包含磷酸鋁和脂質(zhì)A衍生物(如3D-MPL)。該佐劑可包含(每O.5mL劑量)100-750、200-500、400-500或300-400iigAl(磷酸鋁)以及5-60、10-50或20-30iig(例如5-15、40_50、10、20、30、40或50yg)脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL)。該佐劑特別適用于老年或嬰兒疫苗制劑。在一個(gè)實(shí)施方式中,含有該佐劑的該疫苗組合物包含來(lái)自至少如下血清型的糖綴合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(還可包含一種或多種來(lái)自血清型3、6A、19A和22F的糖綴合物),其中在人類接種者中針對(duì)一種或多種(或者所有)疫苗成分4、6B、9V、14、18C、19F和23F誘導(dǎo)的GMC抗體效價(jià)不明顯低于由Prevnar⑧疫苗誘導(dǎo)的相應(yīng)效價(jià)。包含該疫苗制備物的本發(fā)明的免疫原性組合物可通過(guò)經(jīng)全身或粘膜途徑施用所述疫苗的方式保護(hù)或治療易受傳染的哺乳動(dòng)物。這些施用可包括通過(guò)肌肉內(nèi)(M)、腹膜內(nèi)(IP)、皮內(nèi)(ID)或皮下(SC)途徑注射;或通過(guò)粘膜施用至口腔/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。通過(guò)鼻內(nèi)(IN)施用疫苗治療肺炎或中耳炎是可能的(因?yàn)榉窝纂p球菌的鼻咽運(yùn)輸能被更有效的預(yù)防,從而在其最早的階段減少感染)。盡管本發(fā)明的疫苗可作為單個(gè)劑量施用,其成分也可同時(shí)或不同時(shí)共同施用(例如肺炎球菌糖綴合物可在該疫苗的任意細(xì)菌蛋白成分的施用同時(shí)或1-2周后單獨(dú)施用,以最佳最佳協(xié)調(diào)彼此的免疫應(yīng)答)。對(duì)于同時(shí)施用,任選地Thl佐劑可存在于任意或所有的不同施用中。處理單途徑施用,可采用2種不同的施用途徑。例如,糖或糖綴合物可IM(或ID)施用,而細(xì)菌蛋白可IN(或ID)施用。此外,本發(fā)明的疫苗可IM施用初次劑量,IN施用促升劑量。在疫苗中的蛋白抗原含量通常在1-100yg范圍內(nèi),任選地在5-50yg范圍內(nèi),例如在5-25iig范圍內(nèi)。在初次接種后,對(duì)象可以充分的間隔接受一次或多次促升接種。疫苗制備總體描述于疫苗設(shè)計(jì)中("Thesub皿itandadju麗t卿roach,,(edsPowellM.F.&NewmanM.J.)(1995)PlenumPressNewYork)。Fullerton的美國(guó)專利US4,235,877描述了在脂質(zhì)體中的膠囊化。本發(fā)明的疫苗或免疫原組合物可被貯存在溶液中或被凍干。在一個(gè)實(shí)施方式中,該溶液在作為無(wú)定形凍干保護(hù)劑的糖(例如蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘露糖、麥芽糖或者乳糖)的存在下被凍干。在一個(gè)實(shí)施方式中,該溶液在作為無(wú)定形凍干保護(hù)劑的糖以及提供改善的餅結(jié)構(gòu)的填充劑(例如甘氨酸或甘露糖醇)的存在下被凍干。結(jié)晶填充劑的存在允許在高鹽濃度存在下縮短冷凍干燥周期。用于本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗的冷凍干燥的該種混合物的范例包括蔗糖/甘氨酸、海藻糖/甘氨酸、葡萄糖/甘氨酸、甘露糖/甘氨酸、麥芽糖/甘氨酸、蔗糖/甘露糖醇/海藻糖/甘露糖醇、葡萄糖/甘露糖醇、甘露糖/甘露糖醇和麥芽糖/甘露糖醇。典型的兩種組分的摩爾比例任選地為i:i、i:2、i:3、i:4、i:5或i:6。本發(fā)明的免疫原性組合物任選地包含上述凍干試劑。上述穩(wěn)定劑和穩(wěn)定劑的混合物可以進(jìn)一步包含能夠提高制劑的玻璃轉(zhuǎn)化溫度(Tg')的聚合物如聚(乙烯-吡咯烷酮)(PVP)、羥乙基淀粉或葡聚糖,或者作為結(jié)晶填充劑的聚合物如分子量介于1500和6000的聚乙二醇(PEG)和葡聚糖。本發(fā)明的免疫原性組合物任選地凍干并在使用前臨時(shí)復(fù)原。凍干可導(dǎo)致更穩(wěn)定的組合物(疫苗),并可能導(dǎo)致在3D-MPL存在下和鋁基佐劑缺失下更高的抗體效價(jià)。在本發(fā)明的一個(gè)方面提供了疫苗試劑盒,其包含了含有本發(fā)明的免疫原性組合物(任選地呈凍干形式)的小瓶,并進(jìn)一步包含含有此處所述的佐劑的小瓶。在本發(fā)明的該方面預(yù)想,該佐劑將被用于復(fù)原該凍干的免疫原性組合物。盡管本發(fā)明的疫苗可通過(guò)任意途徑施用,所述疫苗施用至皮膚(ID)形成了本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式。人類的皮膚包含了外部"角質(zhì)"表皮,被稱為角質(zhì)層,其覆蓋了表皮。在表皮下是一個(gè)成為真皮的層,其進(jìn)而覆蓋了皮下組織。研究人員已經(jīng)顯示將疫苗注射進(jìn)入皮膚,特別是真皮時(shí),可剌激免疫應(yīng)答,這還伴隨了多種額外的優(yōu)點(diǎn)。以此處所述的疫苗進(jìn)行皮內(nèi)疫苗接種形成了本發(fā)明的任選特征。皮內(nèi)注射的常規(guī)技術(shù)"mantoux步驟"包括清潔皮膚,然后伸展一只手,用窄軌針頭(26-31號(hào))的斜面向上,將針頭以介于10-15°的角度插入。當(dāng)針頭的斜面插入時(shí),針頭的圓筒部分下降,進(jìn)一步插入同時(shí)提供略微的壓力使其在皮膚下抬升。然后極為緩慢地注射液體,從而在皮膚表面形成皰或腫塊,然后緩慢退出針頭。最近,已描述了特別設(shè)計(jì)用于將液體藥劑施用至皮膚或透過(guò)皮膚的裝置,例如,在W099/34850和EP1092444中描述的裝置,以及在例如W001/13977;US5,480,381,US5,599,302,US5,334,144,US5,993,412,US5,649,912,US5,569,189,US5,704,911,US5,383,851,US5,893,397,US5,466,220,US5,339,163,US5,312,335,US5,503,627,US5,064,413,US5,520,639,US4,596,556,US4,790,824,US4,941,880,US4,940,460,WO97/37705和WO97/13537中描述的快速注射裝置。替代性地皮內(nèi)施用疫苗制劑的方法包括常規(guī)的注射器和針頭,或者設(shè)計(jì)用于沖擊傳遞固體疫苗的裝置(W099/27961),或者透皮貼劑(W097/48440;W098/28037);或者應(yīng)用于皮膚表面(經(jīng)真皮或經(jīng)表皮傳遞W098/20734;W098/28037)。當(dāng)本發(fā)明的疫苗被施用至皮膚時(shí),或者更具體而言被施用至真皮時(shí),該疫苗具有較少的液體體積,特別是介于約0.05ml和0.2ml的體積。31本發(fā)明的皮膚或皮內(nèi)疫苗中抗原的含量類似于肌肉疫苗中的常規(guī)劑量(見上文)。然而,皮膚或皮內(nèi)疫苗的一個(gè)特征在于該制劑可能是"低劑量的"。相應(yīng)的,該"低劑量"疫苗中的蛋白抗原任選地以低至每劑量O.l-lOyg或O.l-5yg存在;且該糖(任選地糖綴合物)抗原可以每劑量0.01-1yg或0.01-0.5g存在。此處所用的術(shù)語(yǔ)"皮內(nèi)傳遞"指將疫苗傳遞至皮膚的真皮區(qū)域。然而,該疫苗并不必須僅處于真皮中。真皮是皮膚內(nèi)從人皮膚表面約1.0和2.Omm的層,但它隨著個(gè)體和身體的不同部位有著一定程度的變化??傮w而言,預(yù)計(jì)在皮膚表面以下1.5mm可達(dá)到真皮。真皮位于表面的角質(zhì)層和表皮與下方的皮下層之間。根據(jù)傳遞的模式,該疫苗最終可唯一或主要存在于真皮中,或者最終分布在表皮和真皮內(nèi)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于預(yù)防或緩解由流感嗜血桿菌引起的中耳炎的改良疫苗,該改良疫苗通過(guò)添加流感嗜血桿菌蛋白例如綴合形式的蛋白D得到。此外,本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于預(yù)防或緩解嬰兒肺炎球菌感染(例如,中耳炎)的改良疫苗,其通過(guò)向本發(fā)明的肺炎鏈球菌綴合物組合物添加一種或兩種作為游離或綴合蛋白的肺炎球菌蛋白得到。所述肺炎球菌游離蛋白可與用作載體蛋白的任意肺炎鏈球菌蛋白相同或不同。一種或多種粘膜炎莫拉菌蛋白抗原可以游離或綴合形式包含在組合疫苗中。因此,本發(fā)明是一種誘發(fā)針對(duì)嬰兒中耳炎的(保護(hù)性)免疫應(yīng)答的改良方法。在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明是通過(guò)施用安全和有效量的本發(fā)明的疫苗[兒科疫苗]誘發(fā)嬰兒(在本發(fā)明的上下文中定義為0-2歲大)的(保護(hù)性)免疫應(yīng)答的改良方法。本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式包括準(zhǔn)備本發(fā)明的抗原性肺炎鏈球菌綴合物組合物以用于藥物,以及本發(fā)明的肺炎鏈球菌綴合物在生產(chǎn)用于預(yù)防(或治療)肺炎球菌疾病的藥物中的應(yīng)用。在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明是一種通過(guò)施用安全和有效量的本發(fā)明的疫苗、任選地結(jié)合一種或兩種作為游離或綴合蛋白肺炎鏈球菌蛋白(其中游離肺炎鏈球菌蛋白可與此處用作載體蛋白的任意肺炎鏈球菌蛋白相同或不同),誘發(fā)老年人群(在本發(fā)明的上下文中定義為50歲或更大,通常超過(guò)55歲,更通常超過(guò)60歲)的(保護(hù)性)免疫應(yīng)答的改良方法。本發(fā)明的進(jìn)一步的方面是一種針對(duì)肺炎鏈球菌和任選地流感嗜血桿菌引起的疾病免疫人類宿主的方法,其包括向該宿主施用免疫保護(hù)劑量的本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗或試劑盒。本發(fā)明的進(jìn)一步的方面是用于治療或預(yù)防由肺炎鏈球菌和任選地流感嗜血桿菌感染引起的疾病的本發(fā)明的免疫原性組合物。本發(fā)明進(jìn)一步的方面是本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗或試劑盒在生產(chǎn)用于治療或預(yù)防由肺炎鏈球菌和任選地流感嗜血桿菌感染引起的疾病的藥物中的用途。此處的術(shù)語(yǔ)"包含"、"包括""含有"在每種情況下可任選地分別被術(shù)語(yǔ)"由......組成"所取代。涉及本發(fā)明的"疫苗組合物"的實(shí)施方式同樣適用于涉及本發(fā)明"免疫原性組合物"的實(shí)施方式,反之亦然。在本發(fā)明說(shuō)明書中所引用的所有參考文獻(xiàn)或?qū)@暾?qǐng)均引入作為參考。為使本發(fā)明被更好地理解,列舉了以下實(shí)施例。這些實(shí)施例僅用于闡述,不應(yīng)解釋32為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1:蛋白D的表達(dá)流感嗜血桿菌蛋白D蛋白D表達(dá)的遺傳構(gòu)建起始材料蛋白D編碼DNA蛋白D在所有血清型和不可分型菌株的流感嗜血桿菌之間高度保守。含有編碼完整蛋白D基因的DNA序列的載體pHlC348已從瑞典Malm6的Malm6綜合醫(yī)院,L皿d大學(xué)醫(yī)學(xué)微生物部的A.Forsgren博士處獲得。蛋白D的DNA序列已由Janson等人(1991)Infect.Immun.59:119-125公開。表達(dá)載體pMGl表達(dá)載體pMGl是一種pBR322衍生物(Gross等人,1985),其中導(dǎo)入了來(lái)自噬菌體入的用于外源插入基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的控制元件(Shatzman等人,1983)。此外,氨芐青霉素抗性基因與卡那霉素抗性基因相交換。大腸桿菌菌株AR58大腸桿菌菌株AR58可通過(guò)以預(yù)先在SA500衍生物上生長(zhǎng)的PI噬菌體儲(chǔ)液轉(zhuǎn)導(dǎo)N99后生成(galE::TN10,lambdaKil—cI857AHI)。N99和SA500是來(lái)自國(guó)立衛(wèi)生研究院的MartinRosenberg博士實(shí)驗(yàn)室的大腸桿菌K12菌株。表達(dá)載體pMG1為了生產(chǎn)蛋白D,編碼該蛋白的DNA被克隆進(jìn)入表達(dá)載體pMG1。該質(zhì)粒采用了來(lái)自lambda噬菌體DNA的信號(hào)來(lái)推動(dòng)插入外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。該載體包含啟動(dòng)子PL、操縱子OL和兩個(gè)使用位點(diǎn)(NutL和NutR)以接受N蛋白被提供時(shí)的轉(zhuǎn)錄極性效應(yīng)。包含該P(yáng)L啟動(dòng)子的載體被導(dǎo)入大腸桿菌溶源性宿主,以穩(wěn)定質(zhì)粒DNA。溶源性宿主菌株包含整合進(jìn)入基因組的復(fù)制缺陷型lambda噬菌體DNA(Shatzman等人,1983)。染色體的lambda噬菌體DNA引導(dǎo)與載體的0L阻遏物結(jié)合的cl阻遏蛋白的合成,并防止RNA聚合酶結(jié)合至PL啟動(dòng)子從而轉(zhuǎn)錄插入基因。表達(dá)菌株AR58的cl基因包含溫度敏感性突變體,從而使PL引導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄可被溫度變化調(diào)節(jié),即,培養(yǎng)溫度的上升可使阻遏物失活,并啟動(dòng)外援蛋白的合成。這種表達(dá)系統(tǒng)允許外源蛋白(特別是對(duì)細(xì)胞可能有毒性的那些蛋白)的受控合成(Shimataka&Rosenberg,1981)。大腸桿菌菌株AR58用于生產(chǎn)蛋白D載體的AR58溶源性大腸桿菌菌株是標(biāo)準(zhǔn)NIH大腸桿菌K12菌株N99的衍生物(F—su—galK2,lacZ—thr—)。它包含了缺陷型溶源性lambda噬菌體(galE::TN10,lambdaKil—cI857AHI)。Kil—表型可阻止宿主大分子合成的切斷。cI857突變賦予了cl阻遏蛋白溫度敏感性損傷。AH1缺失去除了lambda噬菌體右操縱子和宿主bio、uvr3和chlA基因座。AR58菌株可通過(guò)以預(yù)先在SA500衍生物上生長(zhǎng)的PI噬菌體儲(chǔ)液轉(zhuǎn)導(dǎo)N99后生成(galE::TN10,lambdaKil—cI857AH1)。缺陷型溶源體導(dǎo)入N99中可采用四環(huán)素通過(guò)鄰近galE基因的編碼四環(huán)素抗性的TN10轉(zhuǎn)座子的存在進(jìn)行選擇。載體pMGMDPPrD的構(gòu)建33包含編碼流感病毒非結(jié)構(gòu)SI蛋白的基因的pMG1載體(pMGNSI)被用于構(gòu)建pMGMDPPrD。蛋白D基因通過(guò)PCR從pHIC348載體擴(kuò)增(Janson等人1991Infect.Immun.59:119-125),其中采用了在5'和3'端分別包含了NcoI和XbaI限制性位點(diǎn)的PCR引物。該Ncol/Xbal片段隨后被導(dǎo)入Ncol和Xbal之間的pMGNSl,從而創(chuàng)建了含有后接PD蛋白的NS1蛋白的N末端81氨基酸的融合蛋白。該載體被標(biāo)記為pMGNSlPrD?;谏鲜鰳?gòu)建體,生成了用于蛋白D表達(dá)的最終構(gòu)建體。從pMGNSlPrD去除BamHI/BamHI片段。該DNA水解去除NS1編碼區(qū)(除了前三個(gè)N末端殘基)。再次連接載體時(shí),生成了具有WO07/71711第44頁(yè)實(shí)施例1所示序列的編碼融合蛋白的基因。蛋白D不包含通常連接了脂質(zhì)鏈的前導(dǎo)肽或N末端半胱氨酸。因此該蛋白既不分泌進(jìn)入周質(zhì),也不脂化,而是以可溶形式保留在細(xì)胞質(zhì)中。最終的構(gòu)建體pMG-MDPPrD通過(guò)37。C下熱休克導(dǎo)入AR58宿主株。含質(zhì)粒的細(xì)菌可在卡那霉素存在下進(jìn)行選擇。蛋白D編碼DNA插入物的存在可通過(guò)采用選定的內(nèi)切核酸酶消化分離的質(zhì)粒DNA進(jìn)行證實(shí)。該重組大腸桿菌菌株被稱為ECD4。蛋白D的表達(dá)受到lambda啟動(dòng)子/(\操縱子的控制。宿主株AR58在基因組中包含了溫度敏感型cl基因,其通過(guò)與(\結(jié)合在低溫下阻斷l(xiāng)ambdaP^的表達(dá)。一旦溫度升高,cl從(\釋放,蛋白D被表達(dá)。小規(guī)模制備在發(fā)酵末期,該細(xì)胞被濃縮并冷凍。從收獲細(xì)胞的提取和蛋白D的純化按照如下進(jìn)行。將冷凍的細(xì)胞培養(yǎng)物團(tuán)解凍,并重懸浮于細(xì)胞破壞溶液(檸檬酸緩沖液pH6.0)中,至最終OD,=60。將懸浮液在P=1000bar下兩次通過(guò)高壓勻槳機(jī)。離心澄清細(xì)胞培養(yǎng)勻槳液,通過(guò)過(guò)濾去除細(xì)胞碎片。在第一純化步驟中,過(guò)濾的細(xì)胞溶解物被應(yīng)用至陽(yáng)離子交換層析柱(SPS印haroseFastFlow)。PD通過(guò)離子相互作用結(jié)合至凝膠基質(zhì),并通過(guò)增加洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度的步驟來(lái)洗脫。在第二純化步驟中,雜質(zhì)被保留在陰離子交換基質(zhì)(QS印haroseFastFlow)上。PD不與凝膠結(jié)合,并可在流出液中收集。在兩個(gè)柱層析步驟中,通過(guò)OD監(jiān)測(cè)收集的組分。用超濾濃縮通過(guò)該陰離子交換柱層析的含有純化蛋白D的流出液。將含有蛋白D的超濾保留物最終通過(guò)0.2m膜。大規(guī)模制備從收獲細(xì)胞的提取和蛋白D的純化按照如下進(jìn)行。冷卻收集的肉湯,直接在約800的壓力下兩次通過(guò)高壓勻漿機(jī)。在第一純化步驟中,細(xì)胞培養(yǎng)勻漿液被稀釋并被應(yīng)用至陽(yáng)離子交換層析柱(SPS印haroseBigbeads)。PD通過(guò)離子相互作用結(jié)合至凝膠基質(zhì),通過(guò)增加洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度的步驟來(lái)洗脫并過(guò)濾。在第二純化步驟中,雜質(zhì)被保留在陰離子交換基質(zhì)(QS印haroseFastFlow)上。PD不與凝膠結(jié)合,并可在流出液中收集。在兩個(gè)柱層析步驟中,通過(guò)OD監(jiān)測(cè)收集的組分。用超濾濃縮通過(guò)該陰離子交換柱層析的含有純化蛋白D的流出液并進(jìn)行滲濾。34將含有蛋白D的超濾留物最終通過(guò)0.2m膜。實(shí)施例lb:PhtD的表達(dá)PhtD蛋白是肺炎球菌組氨酸三聯(lián)體(Pht)蛋白家族的成員,其特征在于組氨酸三聯(lián)體(HXXHXH基序)的存在。PhtD是一個(gè)838aa-的分子,并攜帶5個(gè)組氨酸三聯(lián)體(參見MedlmmuneWOOO/37105的氨基酸序列SEQIDNO:4禾PDNA序列SEQIDNO:5)。PhtD還在中部(氨基酸位置348-380)含有富脯氨酸區(qū)。PhtD具有帶LXXC基序的20aa-N-末端信號(hào)序列。遺傳構(gòu)建體成熟MedlmmunePhtD蛋白的基因序列(從aa21至aa838)通過(guò)攜帶pA啟動(dòng)子的內(nèi)部pTCMP14載體重組轉(zhuǎn)移至大腸桿菌。該大腸桿菌宿主菌株為AR58,其攜帶了cI857熱敏感性阻遏物,允許啟動(dòng)子的熱誘導(dǎo)。實(shí)施聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以從Medlmmune質(zhì)粒(攜帶來(lái)自肺炎鏈球菌菌株Norway4(血清型4)的phtD基因-WO00/37105中所述的SEQIDNO:5)擴(kuò)增phtD基因。僅特異性針對(duì)phtD基因的引物被用于擴(kuò)增兩個(gè)片段中的phtD基因。引物攜帶Ndel和JKpnl或者Kpnl和Xbal限制性位點(diǎn)。這些引物不與除了phtD特異性基因序列外的載體的任何核苷酸雜交。人工ATG起始密碼子可采用攜帶NdeI限制性位點(diǎn)的第一引物插入。然后將所生成的PCR產(chǎn)物插入pGEM-T克隆載體(Promega),并確認(rèn)該DNA序列。然后采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)TCMP14表達(dá)載體中的片段亞克隆,然后將載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入AR58大腸桿菌。PhtD純化PhtD純化按如下方式實(shí)現(xiàn)口在卡那霉素存在下生長(zhǎng)大腸桿菌細(xì)胞在3(TC下生長(zhǎng)30小時(shí),然后在39.5"C下誘導(dǎo)18小時(shí)口在EDTA5mM和作為蛋白酶抑制劑的PMSF2mM存在下從0D±115全培養(yǎng)物破裂大腸桿菌細(xì)胞Rannie,2代,1000bars??谠谑覝叵?20°C)在膨脹床模式StreamlineQXL色譜上進(jìn)行抗原捕獲和細(xì)胞碎片去除,用NaCl150mM+Empigen0.25%pH6.5洗柱,并用含于pH7.4的25mM磷酸鉀緩沖液的NaCl400mM+Empigen0.25%洗脫??谠赟artobran150柱體(0.45+0.2iim)上過(guò)濾口在4。C下5mM咪唑存在下于pH7.4下將抗原結(jié)合在ZrT螯合S印haroseFFIMAC色譜上;用咪唑5mM和Empigen1%洗柱,并用50mM咪唑洗脫,兩者均在pH8.0的25mM磷酸鉀緩沖液中。口在4。C下于pH8.0(25mM磷酸鉀)的FractogelEMDDEAE上以正電荷模式進(jìn)行弱陰離子交換色譜;用140mMNaCl洗柱,并用200mMNaCl洗脫,同時(shí)污染物(蛋白和DNA)保持吸附在交換劑上。口在50kDa膜上用pH7.15的2mMNa/K磷酸鹽濃縮和超濾??谠贛illipak-200.2iim過(guò)濾筒上對(duì)純化物進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。實(shí)施例lc:肺炎球菌溶血素的表達(dá)肺炎球菌的肺炎球菌溶血素可參照W02004/081515和W02006/032499所述進(jìn)行制備和解毒。35實(shí)施例2:綴合物制備本領(lǐng)域公知如何制備純化的肺炎球菌多糖。針對(duì)這些實(shí)施例的目的,這些多糖主要參照EP072513所述或通過(guò)密切相關(guān)的方法制備。在綴合之前,該多糖可通過(guò)如下所述的微射流進(jìn)行大小處理?;罨团悸?lián)條件對(duì)每種多糖均為特定。這些條件在表1中給出。將大小處理的多糖(除PS5、6B和23F)溶解于NaCl2M、NaCl0.2M或水中以進(jìn)行注射(WFI)。對(duì)所有血清型評(píng)估最佳多糖濃度。如下文具體描述,除血清型18C外的所有血清型直接綴合至載體蛋白。制備了兩種替代型的血清型22F綴合物;一種直接綴合,一種通過(guò)ADH接頭綴合。從含于乙腈或乙腈/水50%/50%溶液的100mg/ml儲(chǔ)備液中,將CDAP(CDAP/PS比例0.5-1.5mg/mgPS)添加至多糖溶液。1.5分鐘后,添加0.2M-0.3MNaOH以獲得特定的活化pH。多糖的活化可在該pH下于25t:下在3分鐘內(nèi)進(jìn)行。將純化蛋白(蛋白D、PhtD、肺炎球菌溶血素或DT)(其數(shù)量取決于初始PS/載體蛋白比例)添加至活化多糖,經(jīng)pH調(diào)節(jié)在特定pH下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)達(dá)2小時(shí)(取決于血清型)。為了淬滅未反應(yīng)的氰酸酯基團(tuán),向混合物中添加2M甘氨酸溶液。將pH調(diào)節(jié)至淬滅pH(pH9.0)。將所述溶液在25t:下攪拌30分鐘,然后在2-『C下連續(xù)緩慢攪拌過(guò)夜。18C的制備將18C通過(guò)接頭_己二酸雙肼(ADH)連接至載體蛋白在綴合前對(duì)多糖血清型18C進(jìn)行微射流。以EDAC衍生破傷風(fēng)類毒素對(duì)于破傷風(fēng)類毒素的衍生,在0.2MNaCl中稀釋純化TT至25mg/ml,并添加ADH間隔基以達(dá)到最終濃度O.2M。當(dāng)間隔基的溶解完全時(shí),將pH調(diào)節(jié)至6.2。然后加入EDAC(l-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亞胺)以達(dá)到最終濃度0.02M,將混合物在pH調(diào)節(jié)下攪拌1小時(shí)。通過(guò)在25t:下將pH升至9.0至少30分鐘終止縮合反應(yīng)。然后滲濾(10kDaCO膜)衍生化TT,從而去除殘留ADH和EDAC試劑。TTffl整體最終無(wú)菌過(guò)濾直至偶聯(lián)步驟,并在_701:下貯存。將TTAH化學(xué)偶聯(lián)至PS"C詳細(xì)綴合參數(shù)可參見表l。將2克微射流PS在水中稀釋至指定濃度,并通過(guò)添加NaCl粉末調(diào)節(jié)至2MNaCl。添加CDAP溶液(100mg/ml,在50/50v/v乙腈/WFI中新鮮制備)至達(dá)到合適的CDAP/PS比例。通過(guò)添加0.3MNaOH將pH升高至活化pH9.0,并在該pH下穩(wěn)定至添加TTAH。3分鐘后,添加衍生TT旭(20mg/ml,含于0.2MNaCl)至TTAH/PS比例為2;將pH調(diào)節(jié)至偶聯(lián)pH9.0。將溶液在pH調(diào)節(jié)下保持一小時(shí)。向混合物PS/TTAH/CDAP添加2M甘氨酸溶液以淬滅。將pH調(diào)節(jié)至淬滅pH(pH9.0)。將溶液在25t:下攪拌30分鐘,然后在2-『C下連續(xù)緩慢攪拌過(guò)夜。PS22F,-PhtD綴合物在該糖的第二種綴合方法中(第一種為表1所示的直接PS22-PhtD綴合法),通過(guò)接頭_己二酸雙肼(ADH)將22F連接至載體蛋白。在綴合前對(duì)多糖血清型22F進(jìn)行微射流。PS22F衍生在溫控水浴中在25t:連續(xù)攪拌下進(jìn)行活化和偶聯(lián)。稀釋微射流PS22F以獲得在O.2MNaCl中的6mg/ml的最終PS濃度,并用0.INHC1將該溶液調(diào)節(jié)至P朋.05±0.2。添加CDAP溶液(100mg/ml,在50/50乙腈/WFI中新鮮制備)至達(dá)到合適的CDAP/PS比例(1.5/lww)。通過(guò)添加O.5MNa0H將pH升高至活化pH9.00±0.05,并在該pH下穩(wěn)定至添加ADH。3分鐘后,添加ADH以達(dá)到合適的ADH/PS比例(8.9/lw/w);將pH調(diào)節(jié)至偶聯(lián)pH9.0。將溶液在pH調(diào)節(jié)下保持一小時(shí)。濃縮并滲濾該P(yáng)SAH衍生物。偶聯(lián)將含于O.2MNaCl的10mg/mlPhtD添加至PS22F旭衍生物,以使PhtD/PS22FAH比例為4/l(w/w)。用HCl將pH調(diào)節(jié)至5.0±0.05。在10分鐘內(nèi)人工添加(250iU/min)EDAC溶液(20mg/ml,含于0.1MTris-HCl,pH7.5)以達(dá)到lmgEDAC/mgPS22FAH。在25。C攪拌和pH調(diào)節(jié)下將所得溶液孵育150分鐘(盡管也使用60分鐘)。通過(guò)添加1MTris-HClpH7.5(最終體積的1/10)中和該溶液,并在25t:下保持30分鐘。在S印hacrylS400HR上洗脫前,使用5iimMinisart過(guò)濾器澄清綴合物。所得綴合物的最終PhtD/PS比例為4.1(w/w),游離PS含量低于1%,抗原性(a-PS/a-PS)36.3%,抗-PhtD抗原性7.4%。蛋白和多糖比例的測(cè)定采用Lowry和Resorcinol法進(jìn)行,抗原性采用夾心ELISA進(jìn)行測(cè)定。綴合物純化采用以0.15MNaCl平衡的S印hacrylS400HR凝膠過(guò)濾柱(18C采用S500HR)對(duì)綴合物進(jìn)行凝膠過(guò)濾純化以去除小分子(包括DMAP)和未結(jié)合的PS和蛋白?;诜磻?yīng)成分的不同分子大小,PS-PD、PS-TT、PS-PhtD、PS-肺炎球菌溶血素或PS-DT綴合物被首先洗脫,然后是游離PS,然后為游離PD或游離DT,最后為DMAP和其它鹽(NaCl,甘氨酸)。含有綴合物的組分可通過(guò),28?!獧z測(cè)。根據(jù)它們的Kd匯集組分,無(wú)菌過(guò)濾(0.22iim)并在+2-『C下貯存。測(cè)定綴合物制劑中的PS/蛋白比例。PS肺炎鏈球菌_蛋白D/TT/DT/PhtD/Ply綴合物的特定活化/偶聯(lián)/淬滅條件"yfluid"在表頭中出現(xiàn)時(shí)表示該糖在綴合前通過(guò)微射流調(diào)節(jié)大小。微射流后的糖的大小在表2中給出。表1PS肺炎鏈球菌_蛋白D/TT/DT/PhtD/Ply綴合物的特定活化/偶聯(lián)/淬滅碰37<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>注pHa、c、q分別對(duì)應(yīng)于活化、偶聯(lián)和淬滅pH鑒別每種綴合物均經(jīng)過(guò)鑒別并滿足了表2中所述的規(guī)格。多糖含量(Pg/ml)通過(guò)Resorcinol測(cè)試檢測(cè),蛋白含量(Pg/ml)通過(guò)Lowry測(cè)試檢測(cè)。最終的PS/PD比例(w/w)通過(guò)濃度的比例確定。游離多糖含量(%):在fC下保存或在37t:下貯存7天的綴合物的游離多糖含量可在與a-載體蛋白抗體和飽和硫酸銨孵育后離心所得的上清液中測(cè)定。在上清液中游離多糖的定量采用a-PS/a-PSELISA。不含綴合物還作為a_載體蛋白/a-PSELISA的對(duì)照??乖栽谙嗤Y合物上的抗原性可在夾心型ELISA中分析,其中抗體的捕獲和檢測(cè)分別為a-PS和a-蛋白。游離蛋白含量(%):未綴合的載體蛋白可在純化步驟中從綴合物中分離。游離殘留蛋白的含量可在分子排阻色譜(TSK5000-PWXL)后通過(guò)UV檢測(cè)(214nm)進(jìn)行測(cè)定。洗脫條件允許分離游離載體蛋白和綴合物。然后相對(duì)校正曲線測(cè)定在大量綴合物中的游離蛋白含量(0-50yg/ml載體蛋白)。以%表示的游離載體蛋白參照如下獲得%游離載體=(游離載體g/ml)/(通過(guò)Lowry測(cè)定的相應(yīng)載體蛋白總濃度(Pg/ml)*100%)。穩(wěn)定性在HPLC-SEC凝膠過(guò)濾(TSK5000-PWXL)上對(duì)4。C下保存和在37。C下貯存7天的綴合物測(cè)定分子量分布(Kav)和穩(wěn)定性。10/11/13/14-價(jià)鑒別在表2中給出(參見下方的注釋)。蛋白綴合物可被吸附在磷酸鋁上,并匯集形成最終的疫苗。表2-綴合物的特性40<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>*天然PS微射流后的PS大小***未進(jìn)行大小處理的多糖ND-未測(cè)定IO價(jià)疫苗可通過(guò)將血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F混合綴合物(例如,每人劑量分別采用1、3、1、1、1、1、1、3、3、1g糖)后制備得到。11價(jià)疫苗可通過(guò)進(jìn)一步添加表5中的血清型3綴合物(例如每人劑量添加1Pg糖)制備得到。13價(jià)疫苗可通過(guò)進(jìn)一步添加上述血清型19A和22F綴合物(22F既可直接連接至PhtD,也可通過(guò)ADH接頭連接)[例如每人劑量添加3g的每種糖]制備得到。14價(jià)疫苗可通過(guò)進(jìn)一步添加上述血清型6A綴合物[例如每人劑量添加1Pg糖]制備得到。實(shí)施例3:在本發(fā)明免疫原性組合物中包含流感嗜血桿菌蛋白D可提供對(duì)急性中耳炎(AOM)增強(qiáng)的保護(hù)的證據(jù)研究設(shè)計(jì)。該研究采用了llPn-PD疫苗,其包含了各自與來(lái)自流感嗜血桿菌的蛋白D綴合的血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F(參見實(shí)施例4表5)。研究對(duì)象被隨機(jī)分成兩組以在約3、4、5和12-15個(gè)月齡時(shí)接受四個(gè)劑量的11Pn-PD疫苗或賀福立適(Havirx)。所有對(duì)象在3、4和5個(gè)月齡時(shí)同時(shí)接受GSKBiologicals的Infanrix-hexa(DTPa-HBV-IPV/Hib)疫苗。Infanrix-hexa是在施用前混合的Pediarix和Hib的組合。在"根據(jù)方案"分析的效力隨訪起始于第三疫苗劑量施用后2周,并持續(xù)至24-27個(gè)月齡。肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的鼻咽運(yùn)輸可在選定的對(duì)象亞組中評(píng)估。如果兒童出現(xiàn)惡心、耳部疼痛、鼓膜自發(fā)穿孔或自發(fā)性耳液溢,建議家長(zhǎng)向研究人員咨詢。如果該研究人員懷疑是AOM事件,則該兒童應(yīng)立即讓耳鼻喉(ENT)專家確認(rèn)診斷。AOM的臨床診斷可基于鼓膜的外觀(g卩,發(fā)紅、腫脹、光反射損失)或者中耳液體流出的存在(可通過(guò)簡(jiǎn)單的或氣動(dòng)式耳鏡檢查或通過(guò)顯微鏡觀察證實(shí))。此外,至少應(yīng)存在如下跡象或癥狀中的兩種耳部疼痛、耳液溢、聽力損失、發(fā)燒、昏睡、過(guò)敏、厭食、嘔吐或腹瀉。如果ENT專家確認(rèn)臨床診斷,則通過(guò)鼓膜穿剌術(shù)采集中耳液樣本進(jìn)行細(xì)菌學(xué)測(cè)試。對(duì)于重復(fù)患病的對(duì)象,如果在前一事件開始后持續(xù)了30天以上,則認(rèn)為出現(xiàn)了新的AOM事件。此外,如果分離的細(xì)菌/血清型不同于之前的分離物,不管兩個(gè)連續(xù)事件之間的間隔,AOM事件被認(rèn)為新的細(xì)菌事件。試驗(yàn)結(jié)果總計(jì)4968名嬰兒入組,2489名進(jìn)入llPn-PD組,2479名進(jìn)入對(duì)照組。在兩個(gè)組之間沒有人口統(tǒng)計(jì)特征或風(fēng)險(xiǎn)因素的較大差異。臨床事件和A0M案例定義在依據(jù)方案的隨訪期,在11Pn-PD組總計(jì)記錄了333次臨床AOM事件,在對(duì)照組記錄了499次。表3顯示了11Pn-PD疫苗和之前在芬蘭測(cè)試的兩種7價(jià)疫苗(Eskola等人NEnglJMed2001;344:403-409和Kilpi等人ClinInfectDis200337:1155-64)對(duì)任意AOM事件或不同肺炎球菌血清型、流感嗜血桿菌、NTHi和卡他莫拉菌引起的AOM的保護(hù)性效力。不管針對(duì)何種病原學(xué),11Pn-PD實(shí)現(xiàn)了總體AOM疾病負(fù)擔(dān)的33.6%的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的和臨床相關(guān)的減少(表3)。在11Pn-PD疫苗中包含的11種肺炎球菌血清型中任意一種對(duì)A0M事件的總體效力為57.6%(表3)。在當(dāng)前研究中另一重要的發(fā)現(xiàn)是llPn-PD疫苗對(duì)流感嗜血桿菌引起的AOM提供了35.6%的保護(hù)(特別地,對(duì)NTHi引起的A0M提供了35.3X的保護(hù))。鑒于在肺炎球菌綴合物疫苗時(shí)代流感嗜血桿菌作為AOM主要起因的持續(xù)增加的重要性,這一發(fā)現(xiàn)具有重要的臨床意義。與針對(duì)AOM提供的保護(hù)一致,11Pn-PD疫苗還減少了生命的第二年中的加強(qiáng)劑量后流感嗜血桿菌的鼻咽運(yùn)輸。這些發(fā)現(xiàn)不同于之前在芬蘭的觀察結(jié)果,其中作為病因替換的證據(jù),對(duì)于兩種7價(jià)肺炎球菌綴合物疫苗均觀察到了流感嗜血桿菌引起的AOM事件的增加(Eskola等人和Kilpi等人)。在對(duì)Hi引起的A0M事件的保護(hù)和針對(duì)載體蛋白D的抗體水平之間無(wú)法建立明確的關(guān)聯(lián),因?yàn)樵?1Pn-PD疫苗中初次免疫后的抗-PDIgG抗體濃度(其保持無(wú)HiA0M事件),與在效力隨訪期過(guò)程中發(fā)生至少一次HiAOM事件時(shí)在llPn-PD疫苗中測(cè)得的初始劑量后抗-PDIgG抗體水平基本相同。然而,盡管在疫苗的生物學(xué)影響和初次免疫后IgG抗-PD免疫原性之間無(wú)法建立關(guān)聯(lián),可以合理地假設(shè)在流感嗜血桿菌菌株之間高度保守的PD載體蛋白很大程度上有助于誘導(dǎo)針對(duì)Hi的保護(hù)。對(duì)AOM疾病的作用伴隨著對(duì)鼻咽運(yùn)輸?shù)淖饔?,?duì)此,疫苗血清型肺炎雙球菌和流感嗜血桿菌的作用在類似的等級(jí)上(圖1)。PD-綴合物疫苗對(duì)流感嗜血桿菌的鼻咽運(yùn)輸?shù)臏p少支持了PD-綴合物疫苗針對(duì)流感嗜血桿菌的直接保護(hù)作用的假設(shè),即使這種保護(hù)效力無(wú)法與ELISA測(cè)得的抗-PDIgG免疫應(yīng)答相關(guān)聯(lián)。在以下實(shí)驗(yàn)中采用了毛絲鼠中耳炎模型和以本實(shí)施例的11價(jià)制劑或?qū)嵤├?的10價(jià)疫苗免疫的嬰兒獲得的血清匯集物(還可參見表1和2以及下方的注釋)。兩種匯集物均相對(duì)免疫前血清匯集物使得患中耳炎動(dòng)物百分比的明顯減少。在10和11價(jià)免疫匯集物之間不存在顯著差異。這證明了兩種疫苗對(duì)于在該模型中誘導(dǎo)針對(duì)不可分型流感嗜血桿菌引起的中耳炎的保護(hù)具有類似的潛力。<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>實(shí)施例4:血清型19F載體蛋白的選擇采用的ELISA測(cè)定22F抑制ELISA法主要基于Conc印cion和Frasch在2001年提出的測(cè)定,并在Henckaerts等人,2006,ClinicalandVaccineImmunology13:356-360中報(bào)道。簡(jiǎn)單而言,將純化的肺炎球菌多糖與甲基化人血清白蛋白混合,并吸附在N皿cMaxisorpTM(Roskilde,DK)高結(jié)合微量滴定板上4°C過(guò)夜。用含于PBS的10%胎牛血清(FBS)在室溫?cái)嚢柘路忾]該板1小時(shí)。用含10%FBS、10iig/mL細(xì)胞壁多糖(SSI)禾P2yg/mL血清型22F的肺炎球菌多糖(ATCC)的PBS稀釋血清樣本,并用相同緩沖液在該微量滴定板上進(jìn)一步稀釋。采用89-SF中血清型-特異性IgG濃度針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)血清89-SF校準(zhǔn)的內(nèi)部參照以相同方式處理并包含在每塊板上。洗滌后,采用在10%FBS(含于PBS)中稀釋的過(guò)氧卜=dss—AZ.備J2IAaJd-荊啦Tf別n=cw-£ll:斜*.-9.敏喻》紫扭^*咖裙拿棒"e^^s^貪容務(wù)塌^裙Atv"Ni^々、<=dz化物酶綴合的抗人IgG單克隆抗體(StratechScientificLtd.,Soham,UK)并在室溫小攪拌1小時(shí)孵育,以檢測(cè)結(jié)合抗體。采用即時(shí)可用的單組份四甲基聯(lián)苯胺過(guò)氧化物酶免疫測(cè)定底物試劑盒(BioRad,Hercules,CA,US)在室溫下暗處顯色。用H2S040.18M終止反應(yīng),在450nm下讀取光密度。通過(guò)參考內(nèi)部參照血清曲線指定限度內(nèi)的光密度點(diǎn)計(jì)算樣本中的血清型特異性IgG濃度(yg/mL),所述曲線可通過(guò)用SoftMaxProTM(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)軟件計(jì)算的4_參數(shù)邏輯對(duì)數(shù)方程建模。對(duì)于所有的血清型(考慮檢測(cè)限和定量極限),ELISA的截?cái)酁?.05iig/mLIgG。調(diào)理吞噬測(cè)定在2003年6月的WHO咨詢會(huì)議上建議使用Romero-Steiner等人ClinDiagnLabImmunol200310(6):卯1019_1024提出的OPA測(cè)定。該方案用于在如下試驗(yàn)中測(cè)試血清型的OPA活性。綴合物制備在研究llPn-PD&Di-OOl以及l(fā)lPn-PD&Di_007中包括了三種11價(jià)疫苗制劑(表4),其中3g的19F多糖被綴合至白喉類毒素(19F-DT),而非將1yg多糖綴合至蛋白D(19F-PD)。研究11Pn-PD、llPn-PD&Di-001禾PllPn-PD&Di_007的綴合參數(shù)分別披露于表5、6禾口7。這些19F-DT制劑進(jìn)行初次免疫后一個(gè)月時(shí)針對(duì)血清型19F的抗肺炎球菌抗體應(yīng)答和OPA活性分別顯示于表8和9中。表10顯示了在23價(jià)純多糖加強(qiáng)免疫之前和之后的22F-ELISA抗體濃度和達(dá)到0.2iig/mL閾值的對(duì)象比例。以這些19F-DT制劑誘導(dǎo)的抗體顯示明顯提高了調(diào)理吞噬活性,這可通過(guò)初次免疫后一個(gè)月時(shí)更高的血清陽(yáng)性比例(調(diào)理吞噬效價(jià)^1:8)和OPAGMT得到證明(表9)。23價(jià)純多糖加強(qiáng)免疫后一個(gè)月時(shí),19F抗體的調(diào)理吞噬活性依舊明顯高于用19F-DT制劑初次免疫的兒童(表ll)。表12顯示了在之前以19F-DT或19F-PD綴合物接種的幼兒在11Pn-PD加強(qiáng)劑量后與第四次連續(xù)Prevnar(S)劑量對(duì)比的免疫原性數(shù)據(jù)??紤]在美國(guó)Prevnar⑧的引入后報(bào)道的爆發(fā)案例,血清型19F綴合至DT載體蛋白時(shí)提高的調(diào)理吞噬活性可能對(duì)該候選疫苗有利。表13提供了19F-DT綴合物相對(duì)于交叉反應(yīng)性血清型19A的ELISA和OPA數(shù)據(jù)。據(jù)發(fā)現(xiàn)19F-DT誘導(dǎo)了少量但明顯的針對(duì)19A的OPA活性。表4在臨床研究中所用的肺炎球菌綴合物疫苗制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表6用于llPn-PD&Di-OOl研究的PS肺炎鏈球菌-蛋白D/DT綴合物的特異件活仆,/鵬/艇脅<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>表7用于11Pn-PD&Di-007研究的PS肺炎鏈球菌-蛋白D/DT綴合物的特異件活仆,/鵬/艇脅<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>〔0382〕〔0383〕謝8浙1ug19FIPEK3ug19FIDT勢(shì)Prevnar(2ug19F-CHM)哲突沙輸(,降)后一個(gè)月時(shí)的19F抗體濃度^0.20g/mL的對(duì)象的百分比和19F抗體幾何平均抗體濃度(95%CI的GMC;iig/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>F不同制劑的組成在表4中提供。表9在1iig19F_PD、3iig19F-DT或Prevnar(2iig19F-CRM)初次免疫(全組)后一個(gè)月時(shí)的19F0PA效價(jià)^1:8的對(duì)象的百分比和19F0PAGMT<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>F不同制劑的組成在表4中提供。表11對(duì)兒童以1iig19F_PD、3iig19F-DT或Prevnar(2iig19F-CRM)初次免疫后以23價(jià)純多糖加強(qiáng)免疫前或一個(gè)月后(全組)19F0PA效價(jià)^1:8的對(duì)象的百分比和19F0PAGMT<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>F不同制劑的組成在表4中提供。表12對(duì)兒童以liig19F-PD、3iig19F-DT或Prevnar(2iig19F-CRM)初次免疫后以llPn-PD或Prevnar加強(qiáng)免疫一個(gè)月后(全組)針對(duì)19F肺炎雙球菌的抗體濃度20iig/mL、OPA>1:8的對(duì)象的百分比和GMC/GMT<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>F不同制劑的組成在表4中提供。表13以1iig19F_PD、3iig19F-DT或Prevnar(2iig19F-CRM)(全組)初次免疫后一個(gè)月時(shí)針對(duì)19A肺炎雙球菌的抗體濃度》0.20iig/mL、OPA>1:8的對(duì)象的百分比禾口GMC/GMT<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>F不同制劑的組成在表4中提供。實(shí)施例5:在臨床前模型中的佐劑實(shí)驗(yàn)對(duì)老年恒河猴中肺炎球菌11價(jià)多糖綴合物的免疫原性的影響為了優(yōu)化老年群體中引發(fā)的對(duì)綴合肺炎球菌疫苗的應(yīng)答,GSK配制了具有新型佐劑佐劑C的11價(jià)多糖(PS)綴合疫苗_見下文。5只老年恒河猴(14-28歲)組成的組在第0天和第28天以500的吸附在315iigA1P04上的11價(jià)PS綴合物或與佐劑C混合的11價(jià)PS綴合物進(jìn)行肌肉內(nèi)免疫。在兩種疫苗制劑中,該11價(jià)PS綴合物分別由以下綴合物組成PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS7F-PD、PS9V_PD、PS14_PD、PS18C-PD、PS19F-PD、PS23F-DT和PS6B-DT。所用的疫苗為該疫苗的人用劑量的1/5劑量(除6B[10i!g]外每人用劑量每種糖5i!g),該疫苗根據(jù)表6的條件(實(shí)施例4)綴合,除了19F參照如下CDAP工藝條件制備9mg/ml大小處理的糖、5mg/ml的PD、初始PD/PS比例為1.2/1、CDAP濃度為0.75mg/mgPS、pHa=pHc=pHq9.0/9.0/9.0且偶聯(lián)時(shí)間為60min???PSELISAIgG水平和調(diào)理吞噬效價(jià)可在第42天采集的血清中測(cè)定。抗-PS3記憶B細(xì)胞頻率可從第42天采集的外周血細(xì)胞通過(guò)Elispot測(cè)定。根據(jù)下文所示的結(jié)果,佐劑C相比具有A1P04的綴合物明顯提高了老年猴中11價(jià)PS綴合物的免疫原性。該新型佐劑增強(qiáng)了對(duì)PS的IgG應(yīng)答(圖1)和調(diào)理吞噬抗體效價(jià)(表14)。另有支持證據(jù)顯示通過(guò)使用佐劑C增加了PS3-特異性記憶B細(xì)胞的頻率(圖2)。表14在老年恒河猴中的綴合物免疫原性(II期后的調(diào)理_吞噬效價(jià))PS1PS3PS4PS5PS銀PS7FP幼VPS14PS18CPS19FPS23F11.價(jià)AIP04免疫前n期后14天<8B181<864549<864164096鄰42<837<8169<864<8<6411價(jià)AdJ-C免疫前59<85837<8<8<8<8<8n期后14天7761351的1676620816384"116171322048<64B細(xì)胞Elispot該測(cè)定的原理依賴于記憶B細(xì)胞與CpG體外培養(yǎng)5天后發(fā)育成漿細(xì)胞的事實(shí)。體外生成的抗原特異性漿細(xì)胞可被容易地檢測(cè),因此通過(guò)B細(xì)胞elispot測(cè)定進(jìn)行計(jì)算。特異性漿細(xì)胞的數(shù)量反映了培養(yǎng)中發(fā)生的記憶B細(xì)胞的頻率。簡(jiǎn)單而言,在涂覆了抗原的培養(yǎng)板上孵育體外生成的漿細(xì)胞。通過(guò)常規(guī)免疫-酶催化步驟檢測(cè)并作為記憶B細(xì)胞計(jì)算的抗原特異性漿細(xì)胞形成了抗體/抗原斑點(diǎn)。在本研究中,多糖曾被用于涂覆培養(yǎng)板,從而計(jì)算相應(yīng)的記憶B細(xì)胞。結(jié)果表示為一百萬(wàn)個(gè)記憶B細(xì)胞中PS特異性記憶B細(xì)胞的頻率。58該研究顯示佐劑C能夠減少PS3加強(qiáng)性的已知問題(參見5thlnternationalSymposiumonPneumococciandPneumococcalDiseases,April2—62006,AliceSprings,CentralAustralia)Specificitiesofimmuneresponsesagainstaserotype3pneumococcalconjugate.SchuermanL,PrymulaR,PoolmanJ.Abstractbookp245,P010.06)。實(shí)施例6解毒肺炎球菌溶血素(dPly)作為蛋白載體增強(qiáng)幼年Balb/c小鼠中的PS19F免疫原性的效力40只雌性Balb/c小鼠(4周齡)的組在第0、14和28天用50的4價(jià)純PS或4價(jià)dPly-綴合PS(均與佐劑C混合)IM免疫。兩種疫苗制劑均由0.liig(糖的量)的各種如下PS組成PS8、PS12F、PS19F和PS22F。在第42天采集的血清中檢測(cè)抗-PSELISAIgG水平。與純PS免疫的小鼠相比,4價(jià)dPly綴合物免疫的小鼠中的抗-PS19F應(yīng)答明顯增加(在圖3中作為范例顯示)。對(duì)于抗-PS8、12F和22FIgG應(yīng)答,觀察到了相同的提高(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例7肺炎球菌組氨酸三聯(lián)體蛋白D(PhtD)作為蛋白載體增強(qiáng)幼年Balb/c小鼠中的PS22F免疫原性的效力40只雌性Balb/c小鼠(4周大)的組在第0、14和28天用50iU的4價(jià)純PS或4價(jià)PhtD-綴合PS(均與佐劑C混合)IM免疫。兩種疫苗制劑均由0.1iig(糖的量)的各種如下PS組成PS8、PS12F、PS19F和PS22F。在第42天采集的血清中檢測(cè)抗-PSELISAIgG水平。與純PS免疫的小鼠相比,4價(jià)PhtD綴合物免疫的小鼠中的抗-PS22F應(yīng)答明顯增加(在圖4中作為范例顯示)。對(duì)于抗-PS8、12F和19FIgG應(yīng)答,觀察到了相同的提高(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例8含19A-dPly和22F_PhtD的13價(jià)PS綴合物在老年C57B1小鼠中的免疫原性30只老年C57B1小鼠(>69周齡)的組在第0、14和28天用50yl的11價(jià)PS綴合物或13價(jià)PS綴合物(均與佐劑C混合)IM免疫(見下文)。該11價(jià)疫苗制劑由如下每種綴合物的0.1iig糖組成PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(參見表1和表2下方對(duì)11價(jià)疫苗的注釋)。該13價(jià)疫苗制劑額外包含0.1iig的PS19A-dPly和PS22F-PhtD綴合物(參見表1和表2下方對(duì)13價(jià)疫苗的注釋[使用直接綴合的22F])。在第2和第4組中,該肺炎球菌溶血素載體通過(guò)GMBS處理解毒,在第3和第5組中,其通過(guò)甲醛解毒(該方法描述于W004/81515)。在第2和第3組中,PhtD被用于綴合PS22F,在第4和第5組中,采用了PhtD_E融合體(構(gòu)建體VP147來(lái)自于W003/054007)。在第6組中,19A被綴合至白喉類毒素,22F被綴合至蛋白D???PS19A和22FELISAIgG水平可通過(guò)如下步驟在第42天采集的單獨(dú)血清中確定。在匯集的血清中測(cè)量對(duì)其它PS生成的ELISAIgG應(yīng)答。小鼠血清學(xué)歩驟:抗-PS19AELISAIgG水平可用如下所述步驟在第42天采集的血清中評(píng)估用含于PBS緩沖液的純化19A型肺炎球菌PS(10yg/ml)在37。C下涂覆微量滴定板2小時(shí)。用NaCl0.9%mM-Tween200.05%洗滌滴定板四次。將血清與含于PBS0.05%Tween20的50yg/mlCPS(V/V)在37。C下孵育1小時(shí)。將血清加入微孔,并在PBS-BSA0.05%Tween0.05%中系列稀釋(兩倍稀釋步驟)。將滴定板在室溫下攪拌孵育30分鐘。參照上文洗滌滴定板,添加抗_小鼠IgG-過(guò)氧化物酶綴合物(1/2500稀釋)并將滴定板在室溫下孵育30分鐘。洗滌后,向每個(gè)微孔添加底物(含于10ml0.1MpH4.5檸檬酸鹽的4mgOPDA禾P5illH202),反應(yīng)進(jìn)行15分鐘。添加INHCl終止反應(yīng)。使用分光光度計(jì)讀取490-620nm下的吸收值。形成的顏色與血清中存在的抗體的量成直接比例。通過(guò)與參考曲線比較確定血清樣本中存在的抗-PS19AIgG水平,并以iig/ml表示??捎舍槍?duì)所添加血清的已知量的ELISA結(jié)果對(duì)每塊板生成參考曲線。抗-PS22FELISAIgG水平可用如下所述的步驟在第42天采集的血清中評(píng)估用含于PBS緩沖液的純化22F型肺炎球菌PS(10yg/ml)在37。C下涂覆微量滴定板2小時(shí)。用NaCl0.9%mM-Tween200.05%洗滌滴定板四次。將血清與含于PBS0.05%Tween20的50yg/mlCPS(V/V)在37。C下孵育1小時(shí)。將血清加入微孔,并在PBS-BSA0.05%Tween0.05%中系列稀釋(兩倍稀釋步驟)。將滴定板在室溫下攪拌孵育30分鐘。參照上文洗滌滴定板,添加抗_小鼠IgG抗體過(guò)氧化物酶綴合物(1/2500稀釋)并將滴定板在室溫下孵育30分鐘。洗滌后,向每個(gè)微孔添加底物(含于10ml檸檬酸鹽0.1MpH4.5的4mgOPDA和5illH202),反應(yīng)進(jìn)行15分鐘。添加INHCl終止反應(yīng)。使用分光光度計(jì)讀取490-620nm下的吸收值。形成的顏色與血清中存在的抗體的量成直接比例。通過(guò)與各板上添加血清的參考曲線比較確定未知血清中存在的抗-PS22FIgG水平,并以yg/ml表示。除了將小鼠血清匯集以外,可參照相同的步驟實(shí)現(xiàn)針對(duì)所有其它血清型的免疫應(yīng)答。在13價(jià)綴合物疫苗制劑中施用的19A-dPly和22F_PhtD在老年C57B1小鼠中顯示了免疫原性(表15)。與用ll價(jià)疫苗制劑免疫的小鼠相比,用13價(jià)制劑免疫的小鼠中針對(duì)其他PS誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答未受到負(fù)面影響。表15在老年C57B1小鼠中的PS免疫原性(III期后IgG水平)60<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>NR-未測(cè)得實(shí)驗(yàn)結(jié)果小鼠OPA步驟將血清樣本在56t:下加熱45分鐘,以滅活任意殘留的內(nèi)源性補(bǔ)體。將每等分二十五微升的每種1:2稀釋的血清樣本在96孔圓底微量滴定板的每個(gè)微孔中以25OPA緩沖液(HBSS-14.4%滅活FBS)兩倍系列稀釋。然后,將25的活化HL-60細(xì)胞(IX107細(xì)胞/ml)、新鮮解凍的肺炎球菌工作種子和新鮮解凍的幼兔補(bǔ)體混合物以例如4/2/1比例(v/v/v)添加至稀釋的血清中,以得到50iU的終體積。將測(cè)定板在37t:下定軌振蕩(210rpm)孵育2小時(shí),以促進(jìn)吞噬過(guò)程。通過(guò)將微量滴定板在冰上放置至少1分鐘終止反應(yīng)。將板上每個(gè)微孔的20i!1等分轉(zhuǎn)移至96孔平底微量滴定板的相應(yīng)微孔中,并向每個(gè)微孔添加50ii1Todd-HewittBroth-O.9%瓊脂。在37"和5%C02下孵育過(guò)夜后,在瓊脂中出現(xiàn)肺炎球菌集落,采用自動(dòng)化圖像分析系統(tǒng)(KS400,Zeiss,Oberkochen,Germany)進(jìn)行計(jì)數(shù)。八個(gè)無(wú)血清樣本的微孔被用作細(xì)菌對(duì)照,以確定每個(gè)微孔的肺炎球菌數(shù)量。測(cè)定對(duì)照微孔的CFU平均數(shù),并用于計(jì)算每個(gè)血清樣本的殺傷活性。血清樣本的OPA效價(jià)可通過(guò)能夠殺傷50%的肺炎球菌的血清的倒數(shù)(reciprocal)稀釋進(jìn)行確定。調(diào)理吞噬效價(jià)可采用4參數(shù)曲線擬合分析進(jìn)行計(jì)算。調(diào)理吞噬測(cè)定的結(jié)果顯示于圖13和14中。實(shí)施例9含19A-dPly和22F-PhtD的13價(jià)PS綴合物在幼年Balb/c小鼠中的免疫原性30只幼年Balb/c小鼠(4周齡)的組在第0、14和28天用50iU的11價(jià)PS綴合物或13價(jià)PS綴合物(均與佐劑C混合)IM免疫(見下文)。該11價(jià)疫苗制劑由如下每種綴合物的0.1iig糖組成PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(參見表1和表2下方對(duì)11價(jià)疫苗的注釋)。該13價(jià)疫苗制劑額外包含0.1iig的PS19A-dPly和PS22F-PhtD綴合物(參見表1和表2下方對(duì)13價(jià)疫苗的注釋[使用直接綴合的22F])。在第2和第4組中,該肺炎球菌溶血素載體通過(guò)GMBS處理解毒,在第3和第5組中,其通過(guò)甲醛解毒(該方法描述于WO04/81515)。在第2和第3組中,PhtD被用于綴合PS22F,在第4和第5組中,采用了PhtD_E融合體(構(gòu)建體VP147來(lái)自于WO03/054007)。在第6組中,19A被綴合至白喉類毒素,22F被綴合至蛋白D???PS19A和22FELISAIgG水平可在第42天采集的單獨(dú)血清中確定。在匯集的血清中測(cè)量對(duì)其它PS生成的ELISAIgG應(yīng)答。在13價(jià)綴合物疫苗制劑中施用的19A-dPly和22F-PhtD在幼年Balb/c小鼠中顯示了免疫原性(表16)。與用ll價(jià)疫苗制劑免疫的小鼠相比,用13價(jià)制劑免疫的小鼠中針對(duì)其他PS誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答未受到負(fù)面影響。ELISA按照實(shí)施例8所述進(jìn)行。表16在幼年Balb/c小鼠中的PS免疫原性(III期后IgG水平)<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>NR-未測(cè)得實(shí)驗(yàn)結(jié)果小鼠OPA歩驟:將血清樣本在56t:下加熱45分鐘,以滅活任意殘留的內(nèi)源性補(bǔ)體。將每等分二十五微升的每種1:2稀釋的血清樣本在96孔圓底微量滴定板的每個(gè)微孔中以25OPA緩沖液(HBSS-14.4%滅活FBS)兩倍系列稀釋。然后,將25的活化HL-60細(xì)胞(IX107細(xì)胞/ml)、新鮮解凍的肺炎球菌工作種子和新鮮解凍的幼兔補(bǔ)體混合物以例如4/2/1比例(v/v/v)添加至稀釋的血清中,以得到50iU的終體積。將測(cè)定板在37t:下定軌振蕩(210rpm)孵育2小時(shí),以促進(jìn)吞噬過(guò)程。通過(guò)將微量滴定板在冰上放置至少1分鐘終止反應(yīng)。將板上每個(gè)微孔的20i!1等分轉(zhuǎn)移至96孔平底微量滴定板的相應(yīng)微孔中,并向每個(gè)微孔添加50ii1Todd-HewittBroth-O.9%瓊脂。在37"和5%C02下孵育過(guò)夜后,在瓊脂中出現(xiàn)肺炎球菌集落,采用自動(dòng)化圖像分析系統(tǒng)(KS400,Zeiss,Oberkochen,Germany)進(jìn)行計(jì)數(shù)。八個(gè)無(wú)血清樣本的微孔被用作細(xì)菌對(duì)照,以確定每個(gè)微孔的肺炎球菌數(shù)量。測(cè)定對(duì)照微孔的CFU平均數(shù),并用于計(jì)算每個(gè)血清樣本的殺傷活性。血清樣本的OPA效價(jià)可通過(guò)能夠殺傷50%的肺炎球菌的血清的倒數(shù)稀釋進(jìn)行確定。調(diào)理吞噬效價(jià)可采用4參數(shù)曲線擬合分析進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果顯示于圖15和16。在alum制劑中的結(jié)是:含19A-dPly和22F-PhtD的13價(jià)PS綴合物在幼年Balb/c小鼠中的免疫原性40只幼年Balb/c小鼠(4周齡)的組在第0、14和28天用50的11價(jià)PS綴合物或13價(jià)PS綴合物(均吸附在A1P04上)IM免疫。同時(shí)施用InfanrixHexa。該11價(jià)疫苗制劑由如下每種綴合物的0.1iig糖組成PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(參見表1和表2下方對(duì)11價(jià)疫苗的注釋)。該13價(jià)疫苗制劑額外包含0.1iig的PS19A-dPly和PS22F-PhtD綴合物(參見表1和表2下方對(duì)13價(jià)疫苗的注釋[使用直接綴合的22F])。在第2和第4組中,該肺炎球菌溶血素載體通過(guò)GMBS處理解毒,在第3和第5組中,其通過(guò)甲醛解毒。在第2和第3組中,PhtD被用于綴合PS22F,在第4和第5組中,采用了PhtD_E融合體(構(gòu)建體VP147來(lái)自于W003/054007)。在第6組中,19A被綴合至白喉類毒素,22F被綴合至蛋白D???PS19A和22FELISAIgG水平以及調(diào)理吞噬效價(jià)可在第42天采集的單獨(dú)血清中確定。在匯集的血清中測(cè)量對(duì)其它PS生成的ELISAIgG應(yīng)答。在13價(jià)綴合物疫苗制劑中施用的19A-dPly和22F-PhtD在幼年Balb/c小鼠中顯示了免疫原性和調(diào)理吞噬效價(jià)(表17和圖19-20)。與用11價(jià)疫苗制劑免疫的小鼠相比,用13價(jià)制劑免疫的小鼠中針對(duì)其他PS誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答未受到負(fù)面影響。調(diào)理吞噬測(cè)定被用于評(píng)估該血清,結(jié)果顯示于圖19和20。<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>或13價(jià)PS綴合物(均吸附在A1P04上)IM免疫。同時(shí)施用InfanrixHexa。該11價(jià)疫苗制劑由如下每種綴合物的0.1iig糖組成PS1-PD、PS3-PD、PS4_PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V_PD、PS14_PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(參見表1和表2下方對(duì)11價(jià)疫苗的注釋)。該13價(jià)疫苗制劑額外包含0.1g的PS19A-dPly和PS22F-PhtD綴合物(參見表1和表2下方對(duì)13價(jià)疫苗的注釋[使用直接綴合的22F])。在第2和第4組中,該肺炎球菌溶血素載體通過(guò)GMBS處理解毒,在第3和第5組中,其通過(guò)甲醛解毒(該方法描述于W004/81515)。在第2和第3組中,PhtD被用于綴合PS22F,在第4和第5組中,采用了PhtD_E融合體(構(gòu)建體VP147來(lái)自于W003/054007)。在第6組中,19A被綴合至白喉類毒素,22F被綴合至蛋白D。抗-PS19A和22FELISAIgG水平以及調(diào)理吞噬效價(jià)可在第42天采集的單獨(dú)血清中確定。在匯集的血清中測(cè)量對(duì)其它PS生成的ELISAIgG應(yīng)答。在13價(jià)綴合物疫苗制劑中施用的19A-dPly和22F-PhtD在幼年0F1小鼠中顯示了免疫原性和調(diào)理吞噬效價(jià)(表18和圖21-22)。與用ll價(jià)疫苗制劑免疫的小鼠相比,用13價(jià)制劑免疫的小鼠中針對(duì)其他PS誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答未受到負(fù)面影響。該血清同樣通過(guò)調(diào)理吞噬測(cè)定評(píng)估,結(jié)果顯示于圖21和22。實(shí)施例10含19A-dPly和22F_PhtD的13價(jià)PS綴合物在豚鼠中的免疫原性[O476]20只幼年豚鼠(Hartley株;5周齡)的組在第0、14和28天用125的11價(jià)PS69<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>綴合物或13價(jià)PS綴合物(均與佐劑C混合)IM免疫(見下文)。該11價(jià)疫苗制劑由如下每種綴合物的0.25iig糖組成PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V_PD、PS14_PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(參見表1和表2下方對(duì)11價(jià)疫苗的注釋)。該13價(jià)疫苗制劑額外包含0.1g的PS19A-dPly和PS22F-PhtD綴合物(參見表1和表2下方對(duì)13價(jià)疫苗的注釋[使用直接綴合的22F])。在第2和第4組中,該肺炎球菌溶血素載體通過(guò)GMBS處理解毒,在第3和第5組中,其通過(guò)甲醛解毒。在第2和第3組中,PhtD被用于綴合PS22F,在第4和第5組中,采用了PhtD—E融合體(構(gòu)建體VP147來(lái)自于W003/054007)。在第6組中,19A被綴合至白喉類毒素,22F被綴合至蛋白D。抗-PS19A和22FELISAIgG水平可通過(guò)如下方案在第42天采集的單獨(dú)血清中確定。在匯集的血清中測(cè)量對(duì)其它PS生成的ELISAIgG應(yīng)答。隨血齢雄:抗-PS19AELISAIgG水平可用如下所述步驟在第42天采集的血清中評(píng)估用含于PBS緩沖液的純化19A型肺炎球菌PS(IOyg/ml)在37。C下涂覆微量滴定板2小時(shí)。用NaCl0.9%mM-Tween200.05%洗滌滴定板四次。將血清與含于PBS0.05%Tween20的50yg/mlCPS(V/V)在37。C下孵育1小時(shí)。將血清加入微孔,并在PBS-BSA0.05XTween0.05%中系列稀釋(兩倍稀釋步驟)。將滴定板在室溫下攪拌孵育30分鐘。參照上文洗滌滴定板,添加抗-豚鼠IgG過(guò)氧化物酶綴合物(1/1000稀釋)并將滴定板在室溫下孵育30分鐘。洗滌后,向每個(gè)微孔添加底物(含于10ml檸檬酸鹽0.1MpH4.5的4mgOPDA和5y1H202),反應(yīng)進(jìn)行15分鐘。添加INHC1終止反應(yīng)。使用分光光度計(jì)讀取490-620nm下的吸收值。形成的顏色與血清中存在的抗體的量成直接比例。通過(guò)與各板上添加血清的參考曲線比較確定未知血清中存在的抗-PS19AIgG水平,并以yg/ml表示???PS22FELISAIgG水平可用如下所述步驟在第42天采集的血清中確定用含于PBS緩沖液的純化22F型肺炎球菌PS(10yg/ml)在37。C下涂覆微量滴定板2小時(shí)。用NaCl0.9%mM-Tween200.05%洗滌滴定板四次。將血清與含于PBS0.05%Tween20的50yg/mlCPS(V/V)在37。C下孵育1小時(shí)。將血清加入微孔,并在PBS-BSA0.05%Tween0.05%中系列稀釋(兩倍稀釋步驟)。將滴定板在室溫下攪拌孵育30分鐘。參照上文洗滌滴定板,添加抗_豚鼠IgG過(guò)氧化物酶綴合物(1/1000稀釋)并將滴定板在室溫下孵育30分鐘。洗滌后,向每個(gè)微孔添加底物(含于10ml檸檬酸鹽0.1MpH4.5的4mgOPDA和5iUH202),反應(yīng)進(jìn)行15分鐘。添加INHC1終止反應(yīng)。使用分光光度計(jì)讀取490-620nm下的吸收值。形成的顏色與血清中存在的抗體的量成直接比例。通過(guò)與各板上添加血清的參考曲線比較確定未知血清中存在的抗-PS22FIgG水平,并以yg/ml表示。除了將豚鼠血清匯集以外,可根據(jù)相同的步驟實(shí)現(xiàn)針對(duì)所有其它血清型的免疫應(yīng)答。表19在豚鼠中的PS免疫原性(III期后IgG水平)70<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>調(diào)理吞噬測(cè)定同樣被用于測(cè)試該血清,結(jié)果顯示于圖17和18。實(shí)施例11制備和測(cè)試的制劑a)制備以下制劑(采用了表1的13價(jià)疫苗和表5的血清型3_參見表2下方關(guān)于14價(jià)疫苗的注釋[采用了直接綴合的22F或通過(guò)ADH接頭綴合])。所述糖按如下所示與磷酸鋁和3D-MPL配制。<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>b)向相同的糖制劑添加如下佐劑中的每一種-在下文的表中顯示了每500ii1劑量的乳液成分的濃度。佐劑A1佐劑A2佐劑A3成分250ii10,乳液125ii1o/w乳液50ii1o/w乳液a生育酚11.88mg5.94mg2.38mg角鯊烯10.7mg5.35mg2.14mgTween804.85mg2.43mg0.97mg佐劑A4佐劑A5佐劑A6佐劑A7成分250ii10,250ii1o/w乳125ii10,乳50ii1o/w乳液液液乳液a生育酚11.88mg11.88mg5.94mg2.38mg角鯊烯10.7mg10.7mg5.35mg2.14mgTween804.85mg4.85mg2.43mg0.97mg3D-MPL50iig25iig25iig10iigc)該糖還可與兩種基于脂質(zhì)體的佐劑配制佐劑B1組成性質(zhì)數(shù)量(每0.5mL劑量)脂質(zhì)體-D0PClmg-膽固醇O.25mg3DMPL50ugQS2150iigKH2P0413.124mg緩沖液Na2HP0410.290mg緩沖液NaCl2.922mg(lOOmM)WFI添加額外(q.s.ad)0.5ml溶劑p服.11.總P04濃度二50mM佐劑B2組成性質(zhì)數(shù)量(每0.5mL劑量)脂質(zhì)體-DOPC0.5mg-膽固醇O.125mg3DMPL25iigQS2125ugKH2P0413.124mg緩沖液Na2HP0410.290mg緩沖液NaCl2.922mg(lOOmM)WFI添加額外0.5ml溶劑pH6.1d)該糖還可與佐劑C配制(參見上文使用了該佐劑的其它組合物)性質(zhì)數(shù)量(每0.5mL劑量)水包油乳液50ul-角鯊烯2.136mg-a-生育酚2.372mg-Tween800.97mg-膽固醇O.lmg3DMPL50ygQS2150iigKH2P0410.470mg緩沖液Na2HP0410.219mg緩沖液NaCl4.003mg74(137mM)KC10.lOlmg(2.7mM)WFI添加額外0.5ml溶劑p朋.8實(shí)施例12綴合化學(xué)對(duì)22F-PhtD綴合物在Balb/c小鼠中免疫原性的影響30只雌性Balb/c小鼠的組在第0、14和28天用包含PS1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F的13價(jià)PS制劑(劑量:對(duì)于PS4、18C、19A、19F和22F為0.3iig糖/綴合物,對(duì)于其它PS為0.liig糖/綴合物)肌肉內(nèi)(IM)途徑免疫。PS18C被綴合至破傷風(fēng)類毒素,19F被綴合至白喉類毒素,19A被綴合至甲醛_解毒Ply,22F被綴合至PhtD,其它PS被綴合至PD。對(duì)通過(guò)直接CDAP化學(xué)制備的22F-PhtD或22F_AH_PhtD(ADH衍生PS)組成的兩種制劑進(jìn)行比較。以直接綴合或通過(guò)ADH間隔基綴合22F制備的13價(jià)疫苗的特征參見實(shí)施例2,表1以及表2下方的注釋。該疫苗制劑添加了佐劑C???PS22FELISAIgG水平和調(diào)理吞噬效價(jià)在42天采集的血清中測(cè)定。對(duì)于IgG水平(圖5)和調(diào)理吞噬效價(jià)(圖6),22F-AH-PhtD均顯示了比22F_PhtD高得多的免疫原性。實(shí)施例13新佐劑對(duì)肺炎鏈球菌莢膜PS綴合物的免疫原性的影響40只幼年C57B1小鼠的組在第0、14和28天用包含PS1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F的13價(jià)PS制劑(劑量:對(duì)于PS4、18C、19A、19F和22F為0.3iig/綴合物,對(duì)于其它PS為0.1iig/綴合物)IM途徑免疫。PS18C被綴合至破傷風(fēng)類毒素,19F被綴合至白喉類毒素,19A被綴合至甲醛_解毒Ply,22F被綴合至PhtD,其它PS被綴合至PD。以22F直接綴合制備的13價(jià)疫苗的特征參見實(shí)施例2,表1以及表2下方的注釋。添加了A1P(V佐劑Al、佐劑A4或佐劑A5的四種制劑進(jìn)行對(duì)比。在42天采集并每組匯集的血清中測(cè)定抗_PS、Ply、PhtD和PDELISAIgG水平。對(duì)每種抗原計(jì)算以下比例以所測(cè)試新佐劑誘導(dǎo)的IgG水平/以A1P0J秀導(dǎo)的IgG水平。與經(jīng)典的A1P04制劑相比,所有測(cè)試的新型佐劑使得對(duì)血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和22F綴合物的免疫應(yīng)答均提高了至少2倍(圖7)。在本實(shí)驗(yàn)中,血清型23F未獲得可靠應(yīng)答。實(shí)施例14PhtD/解毒Ply組合在肺炎球菌猴肺炎模型中的保護(hù)效力將按照具有最低預(yù)先存在的抗-19F抗體水平選擇的6只恒河猴(3至8歲)的組在第0和28天用包含PS綴合物(即,1yg[糖的]PS1、3、5、6B、7F、9V、14和23F以及3iigPS4、18C和19F)或PhtD(10iig)+甲醛-解毒Ply(10iig)或PhtD/E融合蛋白(10iig)和甲醛-解毒Ply(10iig)或單獨(dú)的佐劑肌肉內(nèi)免疫。PS18C被綴合至破傷風(fēng)類毒素,19F被綴合至白喉類毒素,其它PS被綴合至PD。11價(jià)疫苗的特征參見實(shí)施例2,表1以及表2下方的注釋。所有制劑添加了佐劑C。在第42天于右肺中接種19F型肺炎球菌(5.108cfu)。在攻擊后第1、3和7天采集的支氣管肺泡灌洗液中對(duì)集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。所述結(jié)果表示為攻擊后7天每組死亡、肺部移生或清除的動(dòng)物數(shù)量。如圖8所示,與單獨(dú)佐劑組相比,ll價(jià)綴合物和PhtD+dPly組合獲得了接近統(tǒng)計(jì)顯著性(盡管所用動(dòng)物數(shù)量較少)的良好保護(hù)(P<0.12,F(xiàn)isher精確檢驗(yàn))。實(shí)施例15綴合化學(xué)對(duì)針對(duì)22F-PhtD綴合物誘導(dǎo)的4型攻擊的抗-PhtD抗體應(yīng)答和保護(hù)效力的影響20只雌性0F1小鼠的組在第0禾P14天用3iig的22F-PhtD(通過(guò)直接CDAP化學(xué)制備)或22F-AH-PhtD(ADH-衍生PS)或單獨(dú)的佐劑肌肉內(nèi)途徑免疫。兩種單價(jià)22F綴合物均通過(guò)實(shí)施例2的方法制備(也參見表1和表2)。每種制劑均添加佐劑C。在第28天采集的血清中檢測(cè)抗-PhtDELISAIgG水平。在第29天用5.106cfu的4型肺炎球菌鼻內(nèi)攻擊小鼠(即,未被所測(cè)試疫苗制劑中存在的PS所潛在涵蓋的肺炎球菌血清型)。監(jiān)測(cè)死亡率至攻擊后10天。圖9所示的結(jié)果證明了與22F-PhtD相比,22F_AH_PhtD誘導(dǎo)了明顯更高的抗-PhtDIgG應(yīng)答。如在圖10中所示反映,與22F-PhtD相比,對(duì)4型攻擊有更好的保護(hù)。實(shí)施例16在生成保護(hù)性免疫應(yīng)答中結(jié)合多糖和蛋白的益處在小鼠致命肺炎鏈球菌攻擊模型中評(píng)估了針對(duì)PhtD和莢膜多糖的免疫應(yīng)答之間的潛在協(xié)同作用。小鼠以PhtD肌肉內(nèi)免疫三次(第0、14和28天)。在細(xì)菌攻擊前一小時(shí),將抗多糖抗體被動(dòng)轉(zhuǎn)移至小鼠(IP,200iU)。在攻擊后8或11天通過(guò)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)致死率。這里對(duì)兩種肺炎鏈球菌菌株(血清型3和血清型1)存在保護(hù)的協(xié)同作用。肺炎鏈球菌3/43攻擊模型在此實(shí)驗(yàn)中,用吸附在AlP04上的PhtD免疫0Fl小鼠,并在用肺炎鏈球菌血清型3(Spn3/43)攻擊前1小時(shí)被動(dòng)轉(zhuǎn)移1.25yg抗-PS3豚鼠抗體。結(jié)果顯示于圖11。在僅接受PBS的小鼠中觀察到了70%的致死率。在接受抗-PS3抗體或以PhtD免疫的小鼠的組中觀察到了中等的保護(hù)。在結(jié)合了分別針對(duì)PhtD和PS3的主動(dòng)和被動(dòng)免疫的小鼠中得到了幾乎導(dǎo)致完全保護(hù)的協(xié)同作用。肺炎鏈球菌血清型1/57攻擊模型在此實(shí)驗(yàn)中,用添加了TH1佐劑的PhtD免疫0F1小鼠,并在用肺炎鏈球菌血清型l(Spn1/57)攻擊前一小時(shí)被動(dòng)轉(zhuǎn)移抗-PSl豚鼠抗體。結(jié)果顯示于圖12。在僅接受了TH1佐劑(主動(dòng)免疫)和PBS(被動(dòng)免疫)的對(duì)照組的小鼠中觀察到了較高的致死率。在接受抗-PSl抗體(55%存活)或以PhtD免疫(25%存活)的小鼠的組中觀察到了中等的保護(hù)。在結(jié)合了分別針對(duì)PhtD和PSl的主動(dòng)和被動(dòng)免疫的小鼠中得到了幾乎導(dǎo)致完全保護(hù)的協(xié)同作用。這些數(shù)據(jù)支持在針對(duì)肺炎鏈球菌感染的保護(hù)機(jī)制中針對(duì)肺炎鏈球菌蛋白(即PhtD)和莢膜多糖的免疫應(yīng)答的協(xié)同作用。實(shí)施例17肺炎球菌PS-TT和PS-DT綴合物對(duì)11價(jià)疫苗制劑中剩余的肺炎球菌PS-PD綴合物免疫應(yīng)答的影響含有11PS-PD綴合物的制劑與含有7PS-PD、2PS-TT(PS6B和23F)和2PS-DT(PS18C和19F)綴合物的制劑在小鼠和豚鼠免疫原性模型中比較。小鼠用疫苗人用劑量的1/10(0.1iigPS)肌肉內(nèi)免疫三次。在第42天采集血液樣本,通過(guò)ELISA測(cè)定針對(duì)每種多糖的免疫應(yīng)答。豚鼠用疫苗人用劑量的1/4(0.25iigPS)肌肉內(nèi)免疫三次。同時(shí)施用InfanrixHexa以模擬人的情形。在第42天采集血液樣本,通過(guò)ELISA測(cè)定針對(duì)每種多糖的免疫應(yīng)答。E:實(shí)驗(yàn)N。PN115(plms20040304)小鼠ELISA<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>含有與TT(PS6B和23F)和DT(PS18C和19F)綴合的兩種多糖的制劑與11-VPD制劑相比,在小鼠和豚鼠中均觀察到針對(duì)與PD綴合的大部分多糖的增加的免疫應(yīng)答。這些差異分別在小鼠和豚鼠中針對(duì)PS1、4、5、9V和14以及PS1、7F和14具有統(tǒng)計(jì)顯著性。權(quán)利要求包含至少7種肺炎鏈球菌莢膜糖綴合物的免疫原性組合物,所述肺炎鏈球菌莢膜糖綴合物包括來(lái)自血清型19A和19F的莢膜糖綴合物,其中19A與第一細(xì)菌類毒素綴合,19F與第二細(xì)菌類毒素綴合,而2-9種肺炎鏈球菌莢膜糖與蛋白D綴合。2.如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物,其中所述第一細(xì)菌類毒素是不同于所述第二細(xì)菌類毒素的蛋白。3.如權(quán)利要求1或2所述的免疫原性組合物,其中所述第一細(xì)菌類毒素選自破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、CRM197、百日咳類毒素、細(xì)菌溶細(xì)胞素以及肺炎球菌溶血素。4.如權(quán)利要求l-3任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中所述第二細(xì)菌類毒素選自破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、CRM197、百日咳類毒素、細(xì)菌溶細(xì)胞素和肺炎球菌溶血素。5.如權(quán)利要求l-4任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中所述第一細(xì)菌類毒素為肺炎球菌溶血素。6.如權(quán)利要求l-5任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中所述第二細(xì)菌類毒素為白喉7.如權(quán)利要求1-6任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其包含肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C和23F莢膜糖綴合物。8.如權(quán)利要求1-7所述的免疫原性組合物,其包含肺炎鏈球菌血清型1、5和7F莢膜糖綴合物。9.如權(quán)利要求1-8所述的免疫原性組合物,其包含肺炎鏈球菌血清型22F莢膜糖綴合物。10.如權(quán)利要求1-9所述的免疫原性組合物,其包含肺炎鏈球菌莢膜糖3綴合物。11.如權(quán)利要求1-10所述的免疫原性組合物,其包含肺炎鏈球菌莢膜糖6A綴合物。12.如權(quán)利要求1-11任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中所述莢膜糖中的第3、4或5型與蛋白D綴合。13.如權(quán)利要求7-12任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中所述血清型4莢膜糖與蛋白D綴合。14.如權(quán)利要求8-13任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中所述血清型5莢膜糖與蛋白D綴合。15.如權(quán)利要求8-14任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中所述血清型7F莢膜糖與蛋白D綴合。16.如權(quán)利要求7-15任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中所述血清型9V莢膜糖與蛋白D綴合。17.如權(quán)利要求7-16任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中所述血清型14莢膜糖與蛋白D綴合。18.如權(quán)利要求9-17任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中所述血清型22F莢膜糖與蛋白D綴合。19.如權(quán)利要求7-18任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中所述血清型23F莢膜糖與蛋白D綴合。20.如權(quán)利要求l-19任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中所述莢膜糖中的少數(shù)與蛋白D綴合。21.如權(quán)利要求1-20任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中3種不同的載體蛋白分別與至少3種不同的肺炎鏈球菌莢膜糖血清型綴合。22.如權(quán)利要求1-21任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中4種不同的載體蛋白分別與至少4種不同的肺炎鏈球菌莢膜糖血清型綴合。23.如權(quán)利要求l-22任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中5種不同的載體蛋白分別與至少5種不同的肺炎鏈球菌莢膜糖血清型綴合。24.如權(quán)利要求1-22任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中6種不同的載體蛋白分別與至少6種不同的肺炎鏈球菌莢膜糖血清型綴合。25.如權(quán)利要求21-24任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其包含了選自如下的3、4、5或6種載體蛋白破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、CRM197、肺炎球菌溶血素、蛋白D和PhtD或其融合蛋白。26.如權(quán)利要求l-25所述的免疫原性組合物,其包含與破傷風(fēng)類毒素綴合的肺炎鏈球菌莢膜糖18C。27.如權(quán)利要求l-26所述的免疫原性組合物,其包含與肺炎球菌溶血素綴合的肺炎鏈球菌莢膜糖19A。28.如權(quán)利要求l-27所述的免疫原性組合物,其包含與PhtD或其融合蛋白綴合的肺炎鏈球菌莢膜糖22F。29.如權(quán)利要求l-28所述的免疫原性組合物,其包含與肺炎球菌溶血素或流感嗜血桿菌蛋白,可選的蛋白D或PhtD或其融合蛋白綴合的肺炎鏈球菌莢膜糖6A。30.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的免疫原性組合物,其中19A莢膜糖直接與所述載體蛋白綴合。31.如權(quán)利要求l-29任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中19A莢膜糖通過(guò)接頭與所述載體蛋白綴合。32.如權(quán)利要求31所述的免疫原性組合物,其中所述接頭為ADH。33.如權(quán)利要求31或32所述的免疫原性組合物,其中所述接頭通過(guò)碳二亞胺化學(xué),可選地采用EDAC與所述載體蛋白連接。34.如權(quán)利要求30-33任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中所述19A糖與所述載體蛋白綴合或用CDAP化學(xué)與接頭綴合。35.如權(quán)利要求l-30任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中載體蛋白與19A糖的比例介于5:i禾pi:5、4:i禾pi:l或3.5:l禾P2.5:1(w/w)之間。36.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的免疫原性組合物,其中19F莢膜糖直接與所述載體蛋白綴合。37.如權(quán)利要求l-35任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中19F莢膜糖通過(guò)接頭與所述載體蛋白綴合。38.如權(quán)利要求37所述的免疫原性組合物,其中所述接頭為ADH。39.如權(quán)利要求37或38所述的免疫原性組合物,其中所述接頭通過(guò)碳二亞胺化學(xué),可選地采用EDAC與所述載體蛋白連接。40.如權(quán)利要求36-39任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中所述19F糖與所述載體蛋白綴合或通過(guò)CDAP化學(xué)與所述接頭綴合。41.如權(quán)利要求l-40任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中載體蛋白與19F糖的比例介于5:i禾卩i:5、4:i禾卩i:i或2:i禾卩i:1(w/w)之間。42.如權(quán)利要求1-41任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其包含與所述載體蛋白直接綴合的22F莢膜糖。43.如權(quán)利要求1-41任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其包含與所述載體蛋白通過(guò)接頭綴合的22F莢膜糖。44.如權(quán)利要求43所述的免疫原性組合物,其中所述接頭為ADH。45.如權(quán)利要求43或44所述的免疫原性組合物,其中所述接頭通過(guò)碳二亞胺化學(xué),可選地采用EDAC與所述載體蛋白連接。46.如權(quán)利要求42-45任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中所述22F糖與所述載體蛋白綴合或使用CDAP化學(xué)與所述接頭綴合。47.如權(quán)利要求1-46任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中載體蛋白與22F糖的比例介于5:i禾pi:5、4:i禾pi:i或2:i禾pi:i(w/w)之間。48.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的免疫原性組合物,其中19A糖的平均大小在100kDa以上。49.如權(quán)利要求48所述的免疫原性組合物,其中19A糖的平均大小介于110-700kDa、110-300、120-200、130-180或140-160kDa之間。50.如權(quán)利要求48或49所述的免疫原性組合物,其中所述19A糖為天然多糖或以不超過(guò)x5的因子進(jìn)行大小處理。51.如權(quán)利要求48、49或50所述的免疫原性組合物,其中所述19A糖已通過(guò)微射流進(jìn)行大小處理。52.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的免疫原性組合物,其中所述19A糖綴合物的劑量為介于1-10iig、2-8iig或3-7iig的糖之間。53.如權(quán)利要求52所述的免疫原性組合物,其中所述19A糖綴合物的劑量為5iig的糖。54.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的免疫原性組合物,其包含22F糖綴合物,其中所述22F糖的平均大小在100kDa以上。55.如權(quán)利要求54所述的免疫原性組合物,其中22F糖的平均大小介于110-700kDa、110-300、120-200、130-180或150-170kDa之間。56.如權(quán)利要求54或55所述的免疫原性組合物,其中22F糖為天然多糖或以不超過(guò)x5的因子進(jìn)行大小處理。57.如權(quán)利要求54、55或56所述的免疫原性組合物,其中22F糖已通過(guò)微射流進(jìn)行大小處理。58.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的免疫原性組合物,其包含22F糖綴合物,其中所述22F糖綴合物的劑量為介于1-10iig、2-8iig或3-7yg的糖之間。59.如權(quán)利要求58所述的免疫原性組合物,其中22F糖綴合物的劑量為5yg的糖。60.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的免疫原性組合物,其中所述糖的平均大小在50kDa以上。61.如權(quán)利要求60所述的免疫原性組合物,其包含平均糖大小介于300和400kDa之間的血清型1。62.如權(quán)利要求60和61所述的免疫原性組合物,其包含平均糖大小介于75和125kDa之間的血清型4。63.如權(quán)利要求60、61和62所述的免疫原性組合物,其包含平均糖大小介于350和450kDa之間的血清型5。64.如權(quán)利要求60-63任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其包含平均糖大小介于1000和1400kDa之間的血清型6B。65.如權(quán)利要求60-64任意300kDa之間的血清型7F。66.如權(quán)利要求60-65任意300kDa之間的血清型9V。67.如權(quán)利要求60-66任意250kDa之間的血清型14。68.如權(quán)利要求60-67任意1000kDa之間的血清型23F。69.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的免疫原性組合物,其包含作為天然糖的血清型5、6B和23F(以及可選的6A)。70.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的免疫原性組合物,其中所述莢膜糖綴合物的劑量為每種綴合物介于1-10yg、1-5iig或1-3iig的糖之間。71.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的免疫原性組合物,其包含每種綴合物的劑量為3yg糖的血清型4、18C和19F(以及可選的19A和22F)。72.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的免疫原性組合物,其包含每種綴合物的劑量為liig糖的血清型1、5、6B、7F、9V、14和23F(以及可選的6A和/或3)。73.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的免疫原性組合物,其進(jìn)一步包含血清型不同于綴合的血清型的未綴合肺炎鏈球菌糖,使得綴合和未綴合糖血清型的數(shù)量少于或等于23。74.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的免疫原性組合物,其進(jìn)一步包含一種或多種未綴合或綴合的肺炎鏈球菌蛋白。75.如權(quán)利要求74所述的免疫原性組合物,其包含一種或多種未綴合的肺炎鏈球菌蛋白。76.如權(quán)利要求74或75所述的免疫原性組合物,其中所述一種或多種肺炎鏈球菌蛋白選自聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、截短CbpX、LytX家族、截短LytX、截短CbpX-截短LytX嵌合蛋白、解毒肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Spl28、SplOl、Spl30、Spl25和Spl33。77.如權(quán)利要求74、75或76所述的免疫原性組合物,其包含肺炎球菌溶血素。78.如權(quán)利要求74-77任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其包含PhtX蛋白。79.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的免疫原性組合物,其包含作為游離或載體蛋白的肺炎球菌溶血素。80.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的免疫原性組合物,其包含作為游離或載體蛋白的PhtX蛋白。項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其包含平均糖大小介于200和項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其包含平均糖大小介于250和項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其包含平均糖大小介于200和項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其包含平均糖大小介于900和81.如權(quán)利要求80所述的免疫原性組合物,其中所述PhtX蛋白為PhtD,或者,PhtBD或PhtDE融合蛋白。82.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的免疫原性組合物,其進(jìn)一步包含佐劑。83.如權(quán)利要求82所述的免疫原性組合物,其中所述佐劑包含脂質(zhì)體載體。84.如權(quán)利要求83所述的免疫原性組合物,其中所述佐劑包含(每0.5mL劑量)O.l-10mg、0.2-7、0.3-5、0.4-2或0.5-lmg(如0.4-0.6、0.9-1.1、0.5或lmg)磷月旨(例如DOPC)。85.如權(quán)利要求83或84所述的免疫原性組合物,其中所述佐劑包含(每0.5mL劑量)0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25mg(如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25或0.125mg)固醇(例如膽固醇)。86.如權(quán)利要求83-85任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中所述佐劑包含(每0.5mL劑量)5-60、10-50或20-30iig(如5-15、40_50、10、20、30、40或50iig)脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL)。87.如權(quán)利要求83-86任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其中所述佐劑包含(每0.5mL劑量)5-60、10-50或20-30iig(如5-15、40_50、10、20、30、40或50iig)皂武(例如QS21)。88.如權(quán)利要求82所述的免疫原性組合物,其中所述佐劑包含水包油乳液。89.如權(quán)利要求88所述的免疫原性組合物,其中所述佐劑包含(每0.5mL劑量)O.5-15、l-13、2-ll、4-8或5-6mg(如2-3、5-6或10-llmg)可代謝的油(例如角鯊烯)。90.如權(quán)利要求88或89所述的免疫原性組合物,其中所述佐劑包含(每O.5mL劑量)0.1-10、0.3-8、0.6-6、0.9-5、l-4或2-3mg(如0.9-1.1、2_3或4-5mg)乳化齊U(例如Tween80)。91.如權(quán)利要求88-90所述的免疫原性組合物,其中所述佐劑包含(每0.5mL劑量)O.5-20、l-15、2-12、4-10、5-7mg(如11-13、5-6或2-3mg)母育酚(例如a生育酚)。92.如權(quán)利要求88-91所述的免疫原性組合物,其中所述佐劑包含(每0.5mL劑量)5-60、10-50或20-30iig(如5-15、40_50、10、20、30、40或50yg)脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL)。93.如權(quán)利要求88-92所述的免疫原性組合物,其中所述佐劑包含(每0.5mL劑量)0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25mg(如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25或0.125mg)固醇(例如膽固醇)。94.如權(quán)利要求88-93所述的免疫原性組合物,其中所述佐劑包含(每0.5mL劑量)5-60、10-50或20-30iig(如5-15、40_50、10、20、30、40或50iig)皂武(例如QS21)。95.如權(quán)利要求82所述的免疫原性組合物,其中所述佐劑包含金屬鹽和脂質(zhì)A衍生物。96.如權(quán)利要求95所述的免疫原性組合物,其中所述佐劑包含(每0.5mL劑量)100-750、200-500或300-400iig磷酸鋁形式的Al。97.如權(quán)利要求95或96所述的免疫原性組合物,其中所述佐劑包含(每0.5mL劑量)5-60、10-50或20-30iig(如5-15、40_50、10、20、30、40或50yg)脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL)。98.如權(quán)利要求1-97任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其至少或恰好包含與PhtD或其融合蛋白綴合的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或13種肺炎鏈球菌莢膜糖。99.如權(quán)利要求l-97任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其至少或恰好包含與肺炎球菌溶血素綴合的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或13種肺炎鏈球菌莢膜糖。100.疫苗試劑盒,其包含如權(quán)利要求l-97任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,并進(jìn)一步包含用于同時(shí)或依次施用的如權(quán)利要求83-99任意一項(xiàng)所定義的佐劑。101.疫苗,其包含如權(quán)利要求l-99任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物及藥學(xué)上可接受的賦形劑。102.制備如權(quán)利要求101所述的疫苗的方法,其包括將如權(quán)利要求1-99任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物與藥學(xué)上可接受的賦形劑相混合的步驟。103.對(duì)人類宿主進(jìn)行免疫以對(duì)抗肺炎鏈球菌感染引起的疾病的方法,其包括向所述宿主施用免疫保護(hù)劑量的如權(quán)利要求1-99任意一項(xiàng)所述的組合物或如權(quán)利要求101所述的疫苗。104.如權(quán)利要求103所述的方法,其中所述人類宿主為老年人,且所述疾病是肺炎或侵襲入性肺炎球菌性疾病(IPD)之一或兩者。105.如權(quán)利要求103或104所述的方法,其中所述人類宿主為老年人,且所述疾病是慢性阻塞性肺病(C0PD)的惡化。106.如權(quán)利要求103所述的方法,其中所述人類宿主為嬰兒,且所述疾病為中耳炎。107.如權(quán)利要求103或106所述的方法,其中所述人類宿主為嬰兒,且所述疾病為腦膜炎和/或菌血癥。108.如權(quán)利要求103、106或107所述的方法,其中所述人類宿主為嬰兒,且所述疾病為肺炎和/或結(jié)膜炎。109.如權(quán)利要求1-99所述的免疫原性組合物或如權(quán)利要求101所述的疫苗,其用于預(yù)防治療由肺炎鏈球菌感染引起的疾病。110.如權(quán)利要求1-99所述的免疫原性組合物或疫苗或如權(quán)利要求101所述的疫苗在生產(chǎn)用于治療或預(yù)防由肺炎鏈球菌感染引起的疾病的藥物中的用途。111.如權(quán)利要求iio所述的用途,其中所述疾病是老年人的肺炎或侵襲性肺炎球菌性疾病(IPD)之一或兩者。112.如權(quán)利要求110或111所述的用途,其中所述疾病是老年人慢性阻塞性肺病(C0PD)的惡化。113.如權(quán)利要求110所述的用途,其中所述疾病是人類嬰兒的中耳炎。114.如權(quán)利要求110或113所述的用途,其中所述疾病是人類嬰兒的腦膜炎和/或菌血癥。115.如權(quán)利要求110U13或114所述的用途,其中所述疾病是人類嬰兒的肺炎和/或結(jié)膜炎。116.在嬰兒體內(nèi)引發(fā)對(duì)抗中耳炎的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法,其包括作為單獨(dú)或組合成分相繼或同時(shí)施用(i)如權(quán)利要求l-99任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物或疫苗和(ii)來(lái)自流感嗜血桿菌的蛋白D,其中所述蛋白D可以是游離的和/或綴合的。117.通過(guò)施用任意前述權(quán)利要求的免疫原性組合物或疫苗在嬰兒體內(nèi)引發(fā)對(duì)抗肺炎鏈球桿菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法。118.引發(fā)老年患者對(duì)抗肺炎鏈球桿菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法,其通過(guò)相繼或同時(shí)聯(lián)合施用如下成分(i)如前述任意權(quán)利要求所述的免疫原性組合物或疫苗,(ii)選自PhtX家族和肺炎球菌溶血素的一種或多種肺炎鏈球菌表面蛋白。119.如權(quán)利要求1-99所述的免疫原性組合物或權(quán)利要求101所述的疫苗,其包含由至少所有如下血清型衍生的糖綴合物4、6b、9v、14、18c、19f、23f、1、5、7f,其中在人類疫苗接種者中針對(duì)一種或多種疫苗成分4、6b、9v、14、18c、19f和23f誘導(dǎo)的gmc抗體效價(jià)不明顯低于由Prevnai^疫苗誘導(dǎo)的gmc抗體效價(jià)。120.如權(quán)利要求119所述的免疫原性組合物,其中在人類疫苗接種者中針對(duì)血清型4誘導(dǎo)的gmc抗體效價(jià)不明顯低于由Prevnai^疫苗誘導(dǎo)的gmc抗體效價(jià)。121.如權(quán)利要求119或120所述的免疫原性組合物,其中在人類疫苗接種者中針對(duì)血清型6b誘導(dǎo)的gmc抗體效價(jià)不明顯低于由Prevnar⑧疫苗誘導(dǎo)的gmc抗體效價(jià)。122.如權(quán)利要求119-121所述的免疫原性組合物,其中在人類疫苗接種者中針對(duì)血清型9v誘導(dǎo)的gmc抗體效價(jià)不明顯低于由Prevnar⑧疫苗誘導(dǎo)的gmc抗體效價(jià)。123.如權(quán)利要求119-122所述的免疫原性組合物,其中在人類疫苗接種者中針對(duì)血清型14誘導(dǎo)的gmc抗體效價(jià)不明顯低于由Prevnai^疫苗誘導(dǎo)的gmc抗體效價(jià)。124.如權(quán)利要求119-123所述的免疫原性組合物,其中在人類疫苗接種者中針對(duì)血清型18c誘導(dǎo)的gmc抗體效價(jià)不明顯低于由Prevnai^疫苗誘導(dǎo)的gmc抗體效價(jià)。125.如權(quán)利要求119-124所述的免疫原性組合物,其中在人類疫苗接種者中針對(duì)血清型19f誘導(dǎo)的gmc抗體效價(jià)不明顯低于由Prevnai^疫苗誘導(dǎo)的gmc抗體效價(jià)。126.如權(quán)利要求119-125所述的免疫原性組合物,其中在人類疫苗接種者中針對(duì)血清型23f誘導(dǎo)的gmc抗體效價(jià)不明顯低于由Prevnai^疫苗誘導(dǎo)的gmc抗體效價(jià)。127.如權(quán)利要求119-126所述的免疫原性組合物,其包含血清型3糖綴合物。128.如權(quán)利要求119-127所述的免疫原性組合物,其包含血清型6a糖綴合物。129.如權(quán)利要求119-128所述的免疫原性組合物,其包含血清型19a糖綴合物。130.如權(quán)利要求119-129所述的免疫原性組合物,其包含血清型22f糖綴合物。131.如權(quán)利要求119-130所述的免疫原性組合物,其包含結(jié)晶填充劑,任選甘露糖醇。132.如權(quán)利要求131所述的免疫原性組合物,其包含糖,任選蔗糖。133.免疫原性組合物,其包含至少四種肺炎鏈球菌莢膜糖綴合物,其含有來(lái)自不同肺炎鏈球菌血清型的糖,其中至少一種糖綴合PhtD或其融合蛋白,且所述免疫原性組合物能夠引發(fā)針對(duì)PhtD的有效免疫應(yīng)答。全文摘要本發(fā)明披露了包含來(lái)自血清型19A和19F的肺炎鏈球菌莢膜糖綴合物(capsularsaccharideconjugates)的免疫原性組合物,其中19A與第一細(xì)菌類毒素綴合,19F與第二細(xì)菌類毒素綴合。本發(fā)明還描述了疫苗、制備疫苗的方法以及該疫苗的用途。文檔編號(hào)A61P31/04GK101784282SQ200880104210公開日2010年7月21日申請(qǐng)日期2008年6月24日優(yōu)先權(quán)日2007年6月26日發(fā)明者J·普爾曼,P·V·赫爾曼,R·L·比曼斯申請(qǐng)人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司
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